Summary
在这里, 我们描述了 canalostomy 程序, 允许当地药物传递到成年和新生小鼠的内耳通过半圆形运河, 对听力和前庭功能的最小损害。该方法可用于将病毒载体、药物和小分子接种到小鼠内耳内。
Abstract
局部向内耳提供治疗药物是治疗内耳疾病的一种有前景的疗法。通过半圆渠道注射 (canalostomy) 已被证明是一种有用的方法, 以当地药物传递到内耳。本文的目的是详细描述 canalostomy 在成年和新生小鼠中所涉及的外科手术技术。正如绿色荧光蛋白基因的快速绿色染料和腺相关病毒8型所示, canalostomy 促进了在耳蜗和前庭端器官中广泛分布的注射试剂, 对听力的损伤最小,前庭功能。成功地实现了成人和新生小鼠的手术;事实上, 如果需要, 可以执行多项手术。总之, canalostomy 是一种有效、安全的方法, 将药物传递到成年和新生小鼠的内耳, 并可用于治疗人内耳疾病的未来。
Introduction
感音性听力丧失和前庭功能障碍影响大量患者, 并与内耳紊乱密切相关。将治疗药物送进内耳, 对内耳疾病的治疗有一定的保证。系统的或局部的方法可以用来向内耳输送药物。一些内耳疾病成功地治疗与系统性药物管理, 如特发性突然听力损失, 这是通常治疗全身类固醇1。此外, 蓝兹et 等表明, 系统管理反义寡核苷酸能够改善听觉和平衡功能的 Ush1c 突变鼠模型2。然而, 由于血液迷宫障碍, 导致内耳疾病的很大一部分无法有效地治疗, 因为它限制了对内耳的药物访问3,4。相反, 局部药物传递策略可以更有效地治疗内耳疾病。事实上, 内耳可能是当地药物传递的理想目标;它充满了液体, 这有助于药物的传播后, 一个站点的扩散或注射, 它是相对孤立的邻近器官, 这限制副作用5,6。
当地的药物传递战略包括鼓室和 intralabyrinthine 方法。鼓室路线的有效性主要依靠药物渗透性通过圆的窗口膜 (RWM) 和药物的停留时间在 RWM3,4,7,8。因此, 它不适合提供不能穿透 RWM 的药物或试剂。Intralabyrinthine 方法包括直接将药物接种到内耳内, 导致高剂量和广泛分布。然而, intralabyrinthine 方法需要精细的手术和侵入, 导致内耳功能受损。目前, intralabyrinthine 注射药物仅用于动物研究, 因为它没有被证明是足够安全的用于人类的9。因此, 必须简化手术程序, 并减少受伤的风险, 将 intralabyrinthine 方法转化为临床。
通过 RWM5、10、11并进入 scala 媒体12、13、14、scala 索, 在动物中进行了几种 intralabyrinthine 方法的评估15,16、scala 前庭、17、半圆运河16、18、19、20和淋巴 sac21。每种方法都有优缺点6。通过 RWM 传递的是非创伤性的新生老鼠5, 22.然而, 在成年小鼠 RWM 注射后出现轻度听力减退23, 可能是由于手术后的中耳积液24。Scala 介质注射, 包括直接注射试剂进入含有感官上皮的淋巴空间, 达到目标端器官的高试剂浓度12,14,25,26. 但是, 这种方法需要一个复杂的过程, 并在比产后 5 (P5)25、27(限制其应用程序) 的后期执行时, 导致听力阈值显著升高。
与上述 intralabyrinthine 方法相比, canalostomy 会对内耳造成最小的损伤, 尤其是成年小鼠16,18,28,29,30, 这是对评估保护效果和平移方面很重要。此外, 在啮齿类动物中, 半圆形的运河位于泡之外, 这有利于外科手术, 避免了中耳在手术过程中的干扰。在临床上, 半圆形运河手术用于顽固性良性阵发性位置眩晕31,32,33, 提示 canalostomy 的临床可行性。因为它最初是由 Kawamoto et描述的。16 2001年, canalostomy 已被用来提供各种试剂, 如病毒载体, siRNA, 干细胞和氨基糖苷, 进入小鼠内耳18,19,28,29 ,34,35,36,37。canalostomy 腺相关病毒 (AAV) 载体的接种使耳蜗和前庭末端器官的感觉上皮和原发神经元的外源基因表达18,28, 29,30。Whirlin 基因治疗的 canalostomy 恢复平衡功能和改善听力的小鼠模型的人引种综合征19, 表明 canalostomy 是有用的基因治疗的遗传 cochleovestibular 疾病的研究。canalostomy 骨髓间充质干细胞移植治疗急性感音性聋大鼠耳蜗纤维细胞和听力恢复的重组研究 35.此外, canalostomy 可用于将氨基糖苷类引入内耳, 以建立前庭病变18, 34, 38, 如果需要, 可以执行多个注射18,34。
在本篇文章中, 我们详细描述了 canalostomy 技术在成年和新生小鼠。我们接种了各种试剂, 包括快速绿色染料和 AAV 血清 8 (AAV8), 连同绿色荧光蛋白 (GFP) 基因 (AAV8-GFP) 和链霉素, 进入小鼠内耳, 以评估直接和长期的结果后 canalostomy。
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Protocol
所有的程序和动物手术都是按照中国首都医科大学动物保育和使用委员会的指导方针进行的。
1. 设备的准备工作
- 要制造注射套管 (图 1A), 请将聚酰亚胺油管 (内径114.3 µm, 外径139.7 µm, 长度 ~ 3 厘米) 与聚乙烯油管 (内径280µm, 外径640µm, 长度 ~ 40 厘米) 连接。使用超强力胶水, 密封连接至少三个应用程序。用环氧乙烷消毒注射套管。
注: 当密封油管, 防止超强力胶水进入聚酰亚胺油管, 这可能导致堵塞的套管。密封油管至少三次, 因为气体灭菌可能会导致泄漏的连接。 - 使用30克针, 将聚乙烯油管的末端连接到含有生理盐水的1毫升注射器。用1毫升注射器用生理盐水填充套管, 检查聚酰亚胺油管和聚乙烯油管的连接是否有渗漏或堵塞。
注: 如果连接有泄漏或堵塞, 则不能在以下过程中使用套管。 - 疏散10µL 微注射器与正常生理盐水, 并连接到上述30克针与注射套管。在微注射泵上安装微型注射器 (图 1B)。将注射速度设置为0.5 µL/分钟, 体积为1µL, 用于快速绿色染料和 AAV8-GFP, 或2µL 为链霉素。
注: 推荐的注塑速度范围为0.1−0.5 µL/分钟, 推荐的注射容积范围为0.5−2µL。 - 将微注射器拉回1µL 并提取注射试剂。在生理盐水和注射试剂之间会形成空气间隙 (图 1C)。
- 可以选择用标记笔标记聚乙烯油管上的气液边界位置。这可用于监测注射过程中的试剂流量。
2. 成年小鼠的 Canalostomy
- 麻醉一只成年老鼠 (女性, FVB/N, 5 至6周) 通过腹腔注射氯胺酮盐酸盐 (120 毫克/千克) 和甲苯噻嗪盐酸 (7 毫克/千克)。等待5−10分钟, 直到动物对疼痛刺激 (脚趾捏反射) 没有反应。麻醉后将动物放在预热过的电垫上。镇痛, Meloxicam (1 毫克/千克), 在手术前皮下应用。
- 用眼膏遮住动物的眼睛。用电动动物剪刀将左后耳区剃掉, 用75% 乙醇对皮肤进行三次消毒。
- 把动物放在一个预热的电垫上。将电垫的温度设置为 ~ 37°c。将动物放置在右侧的侧位, 以促进左耳的手术。
- 从左耳后凹槽 (图2A) 中发出1-1 英寸5厘米的耳后切口 ~ 3 毫米。
- 定位后半圆管 (PSC) 和侧半圆管 (): 当耳廓的根 (图 2B中的粗点) 被定义为原点和平面平行于颅骨为3到9点时, PSC 和位于3毫米从耳廓的根在2和3点之间 (图 2B)。
- 坦率地解剖用微钳覆盖颞骨的肌肉, 以暴露 PSC 和边缘, 在颞骨 (图 2C) 中, 其边距明显可见为深色条纹。在与颅骨平行的平面上, 所测得的距离约为30°角, PSC 垂直于该 (图 2C)。用微钳收集一小块肌肉, 让它干。在接下来的步骤中, 这种肌肉将被用来密封孔。
注意: 避免过度撕裂组织, 以尽量减少对肌肉的伤害。在暴露 PSC 时避免损坏相邻的容器 (图 2D)。 - 使用 26 G 针 (图 2D) 在 PSC 的中间部分制作一个小孔。通过该孔的流体泄漏表明 PSC 的骨壁成功穿透。将孔放大到适当的尺寸, 稍大于聚酰亚胺管的直径。
注: 钻头轻轻地加大钻孔, 避免 PSC 断裂。 - 使用棉花丸清洁 PSC 孔周围的积液。
- 将聚酰亚胺油管的尖端轻轻插入 PSC, 向1−2毫米 (图 2E) 的深度。按泵上的 "运行" 按钮开始注射。
- 注射后, 等待2分钟, 让试剂传播。用微剪刀修剪步骤2.6 中收集的小块肌肉。接下来, 取出注射套管, 立即将肌肉放到 PSC 的孔中。
注: 在堵塞后检查孔内是否有液体泄漏, 以确保孔完全密封。 - 返回分离的肌肉和皮下组织。用5-0 缝线缝合切口。用聚维酮碘对切口区域进行消毒。
注: 以上手术步骤约25分钟。 - 将动物放置在电垫上预热至摄氏37摄氏度。将动物置于正确的侧向位置以进行恢复。
- 在手术后一周执行听觉脑干反应 (ABR) 测量和游泳测试18。
- 如果需要, 在 PSC 的不同区域执行重复注射。
3. 新生小鼠的 Canalostomy
- 使用低温诱导和维持新生鼠 (FVB/N) 产后1至 2 (P1-2) 的镇静。把小狗放在被压碎的冰层覆盖的塑料床上4分钟。接下来, 把小狗放在一个充满冰的平台上。用75% 乙醇消毒手术场三次。
注意: 确保幼崽的头部脱离冰层。完成整个手术与幼犬在一个充满冰的平台上。 - 与成年小鼠相比, 新生儿的以下步骤有所不同。
- 使3毫米耳后切口从2毫米后到耳折痕 (图3A -B)。
- 使用26克针轻轻地在软 PSC 中打开一个开口。将套管插入 PSC 而不扩大打开 (图 3C -E)。
- 注射后, 使用一块肌肉覆盖, 而不是插入, 因为后者可能导致软 PSC 的断裂 (图 3F)。
- 用6-0 缝合线关闭皮肤。
- 在 P3030上执行 ABR 测量和游泳测试。
- 父母共食是新生儿手术后常见的问题。以下步骤减少了父母同类相食的可能性。
- 手术后用酒精湿巾清理切口周围的血液。
- 确保新生儿在返回大坝之前可以自由移动。
- 把婴儿从母亲的笼子里弄脏的被褥涂上, 把新生儿放回垃圾的中间。
- 任何不接受手术的人都应接受类似的耳后切口和缝合。
- 把雄性从饲养笼中分离出来。
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Representative Results
将快速绿色染料注入成人和新生小鼠的 PSC 中, 以评估其在内耳中的即刻分布。在手术后立即检测到整个耳蜗、前庭和半圆形运河的染料 (图 4)。
为评价 canalostomy 对内耳基因传递的安全性和有效性, AAV8-GFP 在成年和新生小鼠内耳内注射。所有动物在 AAV8-GFP 注射后显示正常的 ABR 阈值和游泳测试分数18,30。Immunohistology 透露, 在听觉感觉上皮, 内毛细胞 (IHCs) 和一些外毛细胞 (OHCs) 的基底轮显示健壮的 GFP 表达式30。在前庭感觉上皮中, 在囊、囊和 ampullae30中检测到 GFP 表达式。前庭毛细胞 (图 5) 和支持单元格均转基因高效1830。
在囊18,34,38中, 通过 canalostomy 注入链霉素会导致严重的毛细胞丢失。为了检验通过 canalostomy 进行多次注射的可行性, 在7天后通过 PSC 通过 AAV8-GFP 悬浮剂, 小鼠被给予链霉素。本实验还旨在评价损伤囊中 AAV8-GFP 的转导特性, 对于 HC 损失后内耳损伤的基因治疗研究具有重要意义18。GFP 分布在整个损伤囊 (图 6) 中。许多 GFP 阳性细胞为肌球蛋白 VIIA 阴性, 表明它们是转基因。一些 HCs (肌球蛋白 VIIa 阳性细胞) 与未成熟的发束也表达了 GFP。
图 1: 设备准备。(A)聚酰亚胺油管 (i) 和聚乙烯管材 (ii) 密封以制造注射套管 (iii)。(B)套管连接到10µL 微型注射器, 用30克针, 然后安装在泵上。箭头指示套管尖端。(C)注射试剂和生理盐水由空气间隙隔开。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 成人鼠标中的 Canalostomy。(a)耳后切口 (箭头)。(B)覆盖颞骨的肌肉暴露。如果我们将耳廓的根 (粗点) 定义为起源和平行于颅骨的平面为3/9 点, 则后半圆管 (PSC) 和外侧半圆管 () 通常位于2至3点之间的区域 (五角星)。, 距原点3毫米。插入: 方向的低放大图像。虚线表示颅骨平面。(C)将公开 PSC 和分隔线 (虚线)。嵌入: 在与颅骨平行的平面上, 所测得的距离约为30°角, 而 PSC 垂直于该边距。(D)在 PSC 中进行了一个小孔。(E) 套管尖端插入 PSC, 并注射试剂。(F)孔用一小块肌肉密封。刻度条在 A 是5毫米, 那在 b 是1毫米 (b 为 b F), 那在插入到 b 是 1 cm, 并且那在插入到 C 是5毫米.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 新生儿鼠标中的 Canalostomy.(A)耳后切口 (箭头)。(B)覆盖颞骨的肌肉暴露, 后半圆管 (PSC) 从耳廓 (黑体点) 的根部到2-3 点 (五角星) 的2毫米左右。方向与成年小鼠的定位相同 (图 2B)。(C)公开了 PSC 和侧半圆管 (点划线)。(D)在 PSC 中进行小的打开。(E) 套管插入 PSC。(F)一小块肌肉用于覆盖注射后的开口。A 和 B 中的刻度条为5毫米, 即 b 为1毫米, c 为1毫米 (c F)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 成人 (a) 和新生小鼠内耳的立体显微图像 (b-b) 通过 canalostomy 管理快速绿色染料.手术后立即采集标本。(A 和 B)颅外表面。(A ' 和 B ')颅内表面。快速绿色染料分布在耳蜗、前庭和半圆形运河中。刻度条是1毫米 (a ' 为 a ' 和 b ' 为 b ')。PSC, 后半圆管。外侧半圆管。SSC, 优越的半圆形运河。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 成年小鼠耳蜗 (a a) 和囊 (b b) 的整体装入的代表共焦图像, 在 AAV8-GFP 注射液通过 canalostomy 后30天内制备.样品染色荧光蛋白 (绿色) 和肌球蛋白 VIIa (红色) 的抗体。(a a)GFP 在大多数内毛细胞 (IHC) 中表达。(b b)在囊表皮板的焦平面上, 许多毛细胞表达 GFP (箭头)。绿色荧光蛋白。OHC, 外毛细胞。刻度条为25µm (a a a, b "为 b b")。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 在 AAV8-GFP 注射液通过 canalostomy 后30天获得外伤性囊的代表性共焦图像.一只成年小鼠通过外侧半规管注射链霉素, 7 天后通过半圆形导管注射 AAV8-GFP。GFP (绿色), 肌球蛋白 VIIa (红色), 和肌动蛋白 (蓝色)。箭头表示有代表性的支持细胞转基因与 AAV8-GFP (gfp +/肌球蛋白 VIIa 细胞), 和箭头表示有代表性的毛细胞转基因与 AAV8-GFP (gfp +/肌球蛋白 VIIa + 细胞) 与未成熟的发束。刻度条为20µm (d)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在本研究中, 我们表明 canalostomy 的药物传递导致了整个耳蜗和前庭端器官的试剂的广泛分布。作为内耳基因传递方法, canalostomy 导致在成年和新生小鼠内耳内的 GFP 表达, 对听力和前庭功能的损伤最小。此外, 在同一动物中可以很容易地进行多次注射。
canalostomy 最大的优点之一是它会对内耳功能造成最小的损害, 尤其是成年小鼠16,18,28,29,30, 这对于评估保护效果和翻译方面。几个小组使用 canalostomy 提供各种试剂, 如病毒载体, siRNA, 干细胞和氨基糖苷, 进入小鼠内耳18,19,28,29, 34,35,36,37。在目前的研究中, 我们描述了一步一步, 详细的手术技术 canalostomy 在成年和新生小鼠。与以前的研究相比, 我们的研究提供了关于半圆形运河定位的更多细节, 这是成功手术的关键步骤。如图 2B和 C 中所示,在2-3 点, PSC 和耳廓通常位于3毫米的根上。在与颅骨平行的平面上, 该离轴的距离约为30°角, PSC 垂直于该线。此外, 我们简化了手术程序, 将手术时间缩短到25分钟左右, 结果可比29。
在 canalostomy 期间, 必须避免注射部位渗漏和套管堵塞。在切换泵之前, 重要的是要确保套管的尖端插入到半圆管中, 并且套管没有弯曲或堵塞。建议在封闭成年小鼠半圆管孔时使用干肌, 因为在半圆管液的存在下, 它会膨胀并堵塞孔 (见步骤2.6 和 2.10)。由于新生小鼠半圆管壁柔软易碎, 开口应用自体肌肉或医用胶水覆盖30进行密封。我们也去掉了套管, 不覆盖开口与肌肉;结果显示, 内耳的 AAV 转导效率可比性高 (数据未显示), 表明新生小鼠 PSC 的开放度已令人满意。
canalostomy 的另一个优点是多个过程的可行性, 它允许重复应用相同或不同的试剂 (图 6)。由于在以前的外科手术部位经常发现纤维化和肉芽组织, 而半圆形运河在手术后可能会受阻34, 建议在另一侧的不同区域进行反复手术时进行注射。和/或后半圆运河18。
canalostomy 的主要局限性是在确定注射套管是否插入淋巴或淋巴空间中的难点。在通过 canalostomy 将腺病毒载体管理到内耳16后, 大多数转基因细胞位于淋巴空间, 这表明注射可能在该区域进行。低分子量化合物 (例如, AAV、链霉素和 siRNA) 可以穿过外淋巴液和 endolymph 之间的屏障, 并在注入淋巴或淋巴空间18, 19 中到达感觉上皮. ,34。但是, 在注入外淋巴液后, 如果无法穿透外淋巴液和 endolymph 16、39、40之间的屏障, 则试剂可能会留在淋巴空间中.因此, 在使用 canalostomy 前应考虑注入试剂的渗透性。
总之, canalostomy 结果在耳蜗和前庭的试剂广泛分布, 听力和前庭功能的干扰最小。这项手术很容易在成年和新生小鼠中实施, 如果需要, 可以执行多个程序。Canalostomy 是一种有效和安全的方法, 以药物传递到啮齿目动物的内耳, 并可能在将来用于临床治疗人类 cochleovestibular 疾病。
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Disclosures
不声明利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金 (批准号 81570912, 81771016, 81100717) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polymide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | |
| 10μl Microsyringe | Hamilton Company | 80001 | |
| Xylazine HCL | Sigma-Aldrich Co. Llc. | X-1251 | |
| Operating Miroscope | Carl Zeiss Optical LLC. | Pico | |
| Micro Forceps | Dumont Dumostar | 10576 | |
| Fast-green Dye | Sigma-Aldrich Co. Llc. | F7252 | |
| AAV8-GFP | BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) | 20161101 | Titer: 2×10e12 vg/mL |
| Streptomycin Sulfate | Sigma-Aldrich Co. Llc. | S9137 | |
| Microinjection Pump | Stoelting Co. | 789100S | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| 1 cc Syringe | Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) | 2011-3151258 | |
| Ketamine HCL | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) | H35020148 | |
| Electric Animal Clipper | Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) | CP-8000 | |
| Cotton Pellet | Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) | Yu-2008-1640081 | |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) | Hu-2013-2650207 | |
| Eye Ointment | Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) | H11021270 |
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