Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Canalostomy כמו הגישה כירורגי של משלוח סמים מקומי לתוך האוזן הפנימית של עכברים בוגרים ו Neonatal

Published: May 25, 2018 doi: 10.3791/57351
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Shanghai First People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University

Summary

כאן נתאר canalostomy הליך המאפשר משלוח סמים מקומי לתוך האוזן הפנימית של עכברים בוגרים ו neonatal דרך תעלת semicircular במינימום נזקים לפונקציה שמיעה ואת שיווי המשקל. בשיטה זו ניתן לחסן וקטורים ויראלי, פרמצבטיקה, מולקולות קטנות לתוך האוזן הפנימית העכבר.

Abstract

מסירה מקומי של תרופות טיפוליות לתוך האוזן הפנימית הוא טיפול מבטיח למחלות האוזן הפנימית. הזרקה דרך תעלות semicircular (canalostomy) הוכח להיות הגישה שימושי של משלוח סמים מקומי לתוך האוזן הפנימית. מטרת המאמר היא לתאר, בפירוט, טכניקות ניתוחיות מעורב canalostomy בעכברים מבוגרים והן neonatal. כפי שצוין על-ידי צבע ירוק-מהיר וירוס adeno-הקשורים serotype 8 עם הגן חלבון פלואורסצנטי ירוק, canalostomy הקל הפצה רחב של ריאגנטים מוזרק שבלול ו סוף-אברי שיווי המשקל עם נזק מינימלי שמיעה ו פונקציית שיווי המשקל. הניתוח בוצע בהצלחה בעכברים מבוגרים והן neonatal; אכן, היתה אפשרות לבצע ניתוחים מרובים אם נדרש. לסיכום, canalostomy היא גישה יעילה ובטוחה משלוח סמים לתוך האוזן הפנימית של עכברים בוגרים ו neonatal, עשוי לשמש לטיפול במחלות האוזן הפנימית האדם בעתיד.

Introduction

Sensorineural שומע ואובדן של תפקוד שיווי המשקל משפיע על מספר ניכר של החולים ושל הם מקרוב הקשורים הפרעות באוזן הפנימית. מסירת תרופות טיפוליות לתוך האוזן הפנימית מראה הבטחה לטיפול של הפרעות באוזן הפנימית. בגישה מערכתית או מקומי יכול לשמש כדי לספק סמים לתוך האוזן הפנימית. כמה מחלות האוזן הפנימית מטופלים בהצלחה עם הממשל, סמים מערכתית, כגון אובדן שמיעה פתאומי אידיופטית, אשר מטופלת בדרך כלל עם סטרואידים מערכתית1. בנוסף, לנץ. et al. הראה כי ניהול מערכתי של antisense oligonucleotide היה מסוגל לשפר את השמיעה ולאיזון פונקציות במודל עכבר מוטציה Ush1c2. עם זאת, חלק גדול של מחלות האוזן הפנימית לא ביעילות מטופלים על ידי מערכתית והתרופות האמריקני בגלל מחסום דם-המבוך, אשר מגביל את הגישה סמים עד3,באוזן הפנימית4. לעומת זאת, אסטרטגיות משלוח סמים מקומי אפשר לטפל הפרעות באוזן הפנימית ביעילות רבה יותר. אכן, האוזן הפנימית הוא פוטנציאל מטרה אידיאלית עבור משלוח סמים מקומי; הוא מלא נוזל, המאפשרת הפצת התרופה אחרי אחד-אתר דיפוזיה או הזרקה, וזה יחסית מבודד איברים סמוכים, אשר מגביל את תופעות הלוואי-5,6.

אסטרטגיות משלוח סמים מקומי כוללים שיטות intratympanic intralabyrinthine. היעילות של המסלול intratympanic מסתמך במידה רבה על סמים חדירות דרך קרום חלון עגול (RWM) ואת הזמן מגורים של התרופה על7,84,3,RWM. לכן, היא לא מתאימה להעברת סמים או ריאגנטים לא יכול לחדור את RWM... שיטות intralabyrinthine לערב חיסון של סמים ישירות לתוך האוזן הפנימית, וכתוצאה מכך במינון גבוה והפצה נרחבת. עם זאת, שיטות intralabyrinthine לדרוש ניתוחים עדינים, הינם פולשניים, מוביל לפגיעה באוזן הפנימית הפונקציה. כיום, intralabyrinthine הזרקה של תרופות משמש רק במחקרים שנעשו בבעלי חיים זה לא הוכח כדי להיות מספיק בטוחים לשימוש בני9. לכן, עליך ניתן לפשט הליכים כירורגיים, הסיכון של פגיעה מופחתת לתרגם גישות intralabyrinthine לתוך המרפאה.

להיות מוערך מספר גישות intralabyrinthine בבעלי חיים על ידי הזרקה דרך ה5,RWM10,11 ולתוך סקאלה מדיה12,13,14, טימפני סקאלה 15 , 16, פרוזדור סקאלה17,19,2018,16,semicircular תעלות ו ה שק endolymphatic21. כל הגישות הללו יש יתרונות וחסרונות6. משלוח דרך RWM הוא atraumatic עכברים neonatal5,22. עם זאת, אובדן שמיעה קלה הוא ציין בעכברים בוגרים לאחר RWM הזרקת23, כנראה עקב תפליט באוזן התיכונה לאחר הניתוח24. סקאלה מדיה הזרקה, אשר מערבת את הזריקה מהתרכובת ישירות לתוך המרחב endolymphatic המכיל האפיתל חושית, משיגה ריכוז גבוה ריאגנט יעד סיום-איברים12,14, 25 , 26. עם זאת, גישה זו דורש הליך מורכב ותוצאות משמעותיות העלאת סף שמיעה אם הופיעה מאוחר יותר לאחר הלידה יום 5 (P5)25,27, אשר מגביל את היישום שלה.

לעומת הגישות intralabyrinthine הנ ל, canalostomy גורם נזק מינימלי האוזן הפנימית, במיוחד ב עכברים בוגרים16,18,28,29,30, אשר הוא חשוב להערכת ההשפעות המגנות והיבטים translational. יתר על כן, בחולדות, התעלות semicircular נמצאים מעבר בולה, אשר מקלה על ניתוחים, מונע הפרעה של האוזן התיכונה במהלך הניתוח. במרפאה, ניתוחים semicircular תעלת משמשים סורר פרוקסיזמלי פריפרי31,32,33, רומז היתכנות קליני canalostomy. מאז זה תוארה לראשונה על ידי Kawamoto et al. 16 בשנת 2001, canalostomy שימש להעברת נוגדנים שונים, כגון נגיפי וקטורים, siRNA, תאי גזע, aminoglycoside, לתוך האוזן הפנימית מאתר18,19,28,29 ,34,35,36,37. חיסון של וקטורים adeno-הקשורים וירוס (AAV) על ידי canalostomy לאפשר ביטוי של גנים אקסוגני האפיתל חושית נוירונים העיקרי של שבלול ו- end-אברי שיווי המשקל18,28, 29,30. Whirlin ריפוי גנטי על ידי canalostomy משחזר פונקציה מאזן ומשפר את הדיון במודל של עכברים של האדם אשר תסמונת19, מציע ש-canalostomy הזה הוא שימושי עבור מחקרים של טיפול גנטי למחלות גנטיות cochleovestibular. השתלת של גזע mesenchymal על ידי canalostomy תוצאות רה-ארגון של שבלולי fibrocytes שמיעה שחזור במודל של עכברים של אובדן שמיעה sensorineural35. בנוסף, ניתן להשתמש canalostomy כדי להציג את aminoglycosides לתוך האוזן הפנימית להקים נגעים שיווי המשקל18,34,38, ניתן לבצע זריקות מרובות אם נדרש18 , 34.

במאמר הנוכחי, אנו מתארים, בפירוט, טכניקות canalostomy בעכברים מבוגרים ו neonatal. אנחנו מחוסן נוגדנים שונים, כולל צבע ירוק-מהיר AAV serotype 8 (AAV8), יחד עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ג'ין (AAV8-GFP), סטרפטומיצין, לתוך האוזן הפנימית העכבר כדי להעריך את התוצאות בטווח המיידי ובטווח הארוך לאחר canalostomy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים וניתוחים בבעלי חיים נערכו על פי הנחיות ראש הוועדה חיה אכפת שימוש של אוניברסיטת קפיטל הרפואה של סין.

1. התקן ההכנות

  1. כדי להפוך את הצינורית הזרקה (איור 1 א'), מתחבר לצנרת פוליאימיד (הקוטר הפנימי 114.3 מיקרומטר, הקוטר החיצוני 139.7 מיקרומטר, אורך ~ 3 ס מ) כדי צינורות פוליאתילן (הקוטר הפנימי 280 מיקרומטר, הקוטר החיצוני 640 מיקרומטר, אורך ~ 40 ס מ). בעזרת דבק מגע, חותם את החיבור עם פחות שלושה יישומים. לחטא את הצינורית הזרקה עם אתילן אוקסיד.
    הערה: בעת איטום הצנרת, למנוע וודקה מלהיכנס הצנרת פוליאימיד, אשר עלולה לגרום סתימה של הצינורית. חותם את הצנרת בבית לפחות שלוש פעמים, כי עיקור גז עלולה לגרום לדליפת על הקשר.
  2. באמצעות מחט 30 גרם, להתחבר לסוף לאורך צינור פוליאתילן המזרק cc 1 המכיל תמיסת מלח. למלא את הצינורית עם תמיסת מלח על ידי זריקה עם המזרק 1-cc כדי לבדוק אם כל דליפה או חסימה על הקשר בין פוליאימיד צינורות פוליאתילן אבובים.
    הערה: אם יש דליפה או סתימה של החיבור, הצינורית אין אפשרות להשתמש בפרוצדורות הבאות.
  3. לפנות 10 µL מיקרו-מזרק עם תמיסת וחבר אותו המחט 30 G הנ עם הצינורית הזרקה. להתקין את המיקרו-המזרק משאבה microinjection (איור 1B). הגדר את מהירות הזרקת µL 0.5/min, לאמצעי האחסון µL 1 צבע ירוק-מהיר, AAV8-GFP, או µL 2 עבור סטרפטומיצין.
    הערה: מומלץ טווח מהירות הזרקת 0.1−0.5 µL/min, הטווח המומלץ של הזרקת האחסון הוא 0.5−2 µL.
  4. חיזרו המזרק המיקרו 1 µL ולחלץ הכימית הזרקה. מרווח אוויר יהוו בין את תמיסת מוזרק הכימית (איור 1C).
  5. אם תרצה להוסיף תווית מיקומו של הגבול גז-נוזל לאורך צינור פוליאתילן באמצעות עט מרקר. ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר הזרימה ריאגנט במהלך ההזרקה.

2. Canalostomy בעכברים מבוגרים

  1. עזים ומתנגד של העכבר למבוגרים (נקבה, FVB/N, 5 עד 6 בן שבועיים) על ידי הזרקת בקרום הבטן של קטמין HCl (120 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים HCl (7 מ"ג/ק"ג). חכו 5−10 דקות עד החיה תערוכות אין תגובה לגירויים כואבים (את הבוהן-קמצוץ רפלקס). במקום החיה על כרית חשמלית preheated לאחר הרדמה. מקבל, Meloxicam (1 מ"ג/ק"ג), הוחל subcutaneously לפני הניתוח.
  2. לכסות את העיניים של החיה עם משחה העין. גילוח באזור שלאחר אוריקולארית השמאלי עם קליפר חיה חשמלי ולחטא את העור שלוש פעמים עם 75% אתנול.
  3. במקום החיה על כרית חשמלית preheated. הגדר את הטמפרטורה של משטח חשמלי ~ 37 מעלות צלזיוס. מקם את החיה העמדה הימנית כדי להקל על ניתוח על האוזן השמאלית.
  4. עושים חתך פוסט-אוריקולארית 1-1.5-ס"מ ~ 3 מ מ החריץ retroauricular השמאלי (איור 2 א).
  5. מיקום semicircular האחורי התעלה (PSC) ועל semicircular לרוחב התעלה (ה-LSC): כאשר שורש פינה (מודגש נקודה ב איור 2B) מוגדר כמו המקור ואת המטוס במקביל החילונית 3 ל-9, PSC ו ה-LSC הם בדרך כלל מלון ~ 3 מ מ מהבסיס של פינה בין 2 ל-3 (איור 2B).
  6. בלשון בוטה לנתח את השריר מכסה הרקה עם מיקרו-מלקחיים לחשוף את PSC ואת ה-LSC, שאת שוליהן הם נראים בבירור כמו פסים כהים הרקה (איור 2C). ה-LSC הוא כ 30 מעלות זווית מהמטוס במקביל החילונית, PSC אנכית כדי ה-LSC (איור 2C). לאסוף את חתיכה קטנה של שריר עם מיקרו-מלקחיים ולתת לזה להתייבש. בשלב הבא, השריר הזה ישמש כדי לאטום את החור.
    הערה: הימנע מוגזמת קריעת רקמות כדי למזער את הפגיעה בשרירים. למנוע נזק הספינה סמוכים בעת חשיפת PSC (איור דו-ממדי).
  7. תעשה חור קטן בחלק האמצעי של PSC באמצעות מחט 26 G (איור דו-ממדי). זליגת נוזלים דרך החור מצביע על חדירה מוצלחת של הקיר הגרמי של PSC. להגדיל את החור לגודל המתאים, קצת יותר קוטר הצנרת פוליאימיד גדולה.
    הערה: תרגיל ולהגדיל את החור בעדינות ובהדרגה כדי למנוע שבר של PSC.
  8. נקה שהאולטרסאונד סביב החור של PSC באמצעות גלולה כותנה.
  9. הכנס את קצה הצנרת פוליאימיד בעדינות PSC לכיוון הקומונה מנ עומק 1−2 מ מ (2E איור). התחל את הזריקה על-ידי לחיצה על לחצן 'הפעל' על המשאבה.
  10. אחרי הזריקה, לחכות ~ 2 דקות כדי לאפשר הכימית להתפשט. לחתוך את פיסת שריר שנאספו בשלב 2.6 עם מיקרו-מספריים קטנים. בשלב הבא, להסיר את הצינורית הזרקת ומניחים מיד את השריר לתוך החור PSC.
    הערה: בדוק אם הנוזל דולף מתוך הבור לאחר חיבור כדי להבטיח כי החור נעולה לגמרי.
  11. להחזיר את הרקמות והשרירים מופרדים. תפר החתך באמצעות התפר 5-0. לחטא באזור החתך עם povidone יוד.
    הערה: כל ההליכים כירורגי לעיל לקחת בערך 25 דקות.
  12. הצב את החיה על רכיב pad חשמלי טרופה ל ~ 37 מעלות צלזיוס. מקם את החיה העמדה הימנית להתאוששות.
  13. לבצע מדידות התגובה (ABR) גזע המוח ושחייה בדיקות שבוע לאחר הניתוח18.
  14. אם נדרש, לבצע זריקות חוזרות ונשנות באיזור שונה של PSC או ה-LSC.

3. Canalostomy בעכברים Neonatal

  1. השתמש היפותרמיה זירוז ולשמור על הרגעה בעכברים neonatal (FVB/N) ימים לאחר הלידה 1 עד 2 (P1-2). במקום הכלבלב על מיטה גלישת-ציפוי פלסטיק של קרח כתוש ~ 4 דקות. בשלב הבא, שכב הכלבלב על פלטפורמת מלא קרח. לחטא את השדה הכירורגי שלוש פעמים עם 75% אתנול.
    הערה: ודא כי ראשו של הכלבלב מתוך הקרח. לבצע את הניתוח כולו עם הגורים פלטפורמה מלא קרח.
  2. השלבים הבאים נבדלים neonate בהשוואה לעכברים בוגרים.
    1. עושים חתך postauricular ~ 3 מ מ מ ~ 2 מ מ אחורי! תעיף אוריקולארית (איור 3 א -B).
    2. הופכים בעדינות בפתח PSC רכה באמצעות מחט 26 גרם. להכניס את הצינורית PSC ללא הגדלת הפתח (איור 3C -E).
    3. לאחר ההזרקה, השתמש חתיכה של השריר כדי לכסות, במקום לחבר, הפתח משום שהאחרון יכול לגרום שבר PSC רך (איור 3F).
    4. סגור את העור בעזרת בתפר 6-0.
    5. לבצע מדידות ABR ושחייה בדיקות במלון P3030.
  3. הורים קניבליזם הוא תופעה שכיחה לאחר ניתוח neonatal. השלבים הבאים להפחית את הסבירות של קניבליזם הורים.
    1. לנקות את הדם המקיפים את החתך עם מגבונים אלכוהוליים לאחר הניתוח.
    2. ודא כי neonate יכול לנוע בחופשיות לפני שחזר זה הסכר.
    3. כתם neonates עם תשתית המלוכלכים מן הכלוב של האם, ומקום ש-neonates חזרה באמצע הגורים.
    4. כל זה אינם עוברים ניתוח אמור לקבל חתך postauricular דומה בעלת תפרים.
    5. להפריד את הזכר מן הכלוב הרבייה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

צבע ירוק-מהיר היה מוזרק PSC של עכברים בוגרים ו neonatal כדי להעריך את תפוצתו מיידית באוזן הפנימית. לצבוע זוהה ברחבי שבלול, פרוזדור, תעלות semicircular מיד לאחר הניתוח (איור 4).

כדי להעריך את הבטיחות והיעילות של canalostomy למסירה גן באוזן הפנימית, AAV8-GFP היה מוזרק לתוך האוזן הפנימית של עכברים בוגרים ו neonatal. כל החיות הפגינו נורמלי ABR ספי ושחייה הציונים לאחר AAV8-GFP הזרקת18,30. פראפין המתגלה, האפיתל חושי השמיעה, תאים שיער הפנימי (IHCs) ותאים כמה החיצוני שיער (OHCs) של הפנייה הבזליים הראה GFP חזקים ביטוי30. בתוך האפיתל חושית שיווי המשקל, ביטוי GFP זוהה utricle, saccule ואמפולות30. תאים שיער שיווי המשקל (איור 5) והן תאים התומכים היו transduced עם יעילות גבוהה18,30.

אינפוזיה של סטרפטומיצין מאת canalostomy גורם איבוד תאים שיער חמורה utricle34,18,, או38. כדי לבדוק את הכדאיות של זריקות מרובות באמצעות canalostomy, העכברים ניתנו סטרפטומיצין דרך ה-LSC ואחריו 7 ימים מאוחר יותר AAV8-GFP המתלים דרך PSC. הניסוי הזה נועד גם להעריך את מאפייני התמרה חושית של AAV8-GFP ב utricle lesioned, אשר היה שימושי עבור ג'ין לימודי טיפול באוזן הפנימית פגום לאחר אובדן HC18. GFP הופץ ברחבי utricle lesioned (איור 6). תאים GFP-חיוביים רבים יצאו שליליות צולבות הקישור חוטים שרירן באמצעות, המציין כי הם היו transduced SCs. כמה HCs (צולבות הקישור חוטים שרירן חיובי באמצעות תאים) עם צרורות שיער ילדותי הביע GFP.

Figure 1
איור 1: הכנת התקן. (א) הצנרת פוליאימיד (i), לאורך צינור פוליאתילן (ii) חתומות כדי להפוך של הזרקת בצינורית (iii). (ב') הצינורית הוא מחובר 10-µL מיקרו-. מזרק עם מחט 30 G ולאחר מכן להתקין אותה על משאבה. החץ מצביע על קצה הצינורית. (ג) הזרקה ריאגנט של תמיסת מופרדים באמצעות פער אוויר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: Canalostomy עכבר למבוגרים. (א) חתך פוסט אוריקולארית (חץ). (B) השרירים מכסה הרקה חשופים. אם נגדיר את שורש פינה (נקודה מודגש) המקור ואת המטוס מקביל החילונית כמו 3/9 בשעה, תעלת semicircular האחורי (PSC) ו semicircular לרוחב התעלה (ה-LSC) ממוקמים בדרך כלל בין האזור שבין 2 ו-3 (כוכב מחומש) , ~ 3 מ מ המקור. שיבוץ: התמונה התחתונה-הגדלה כיוון. הקו המקווקו מציין המטוס קליפת הגולגולת. (ג) PSC ה-LSC הם חשופים (קווים מנוקדים). שיבוץ: ה-LSC הוא כ 30 מעלות זווית מהמטוס במקביל החילונית, PSC אנכית כדי ה-LSC. (ד) חור קטן עשוי ב PSC. (ה) קצה הצינורית מוכנס לתוך PSC, מוזרק הכימית. (נ) הבור נאטם עם חתיכה קטנה של שריר. סרגל קנה מידה A הוא 5 מ מ, כי ב' הוא 1 מ מ (B B-F), כי שיבוץ ב' 1 ס מ, וזה ב שיבוץ ל- C 5 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: Canalostomy ב עכבר neonatal. (א) שלאחר אוריקולארית חתך (חץ). (B) השרירים מכסה הרקה נחשפים, תעלת semicircular האחורי (PSC) ~ 2 מ מ מהבסיס של פינה (נקודה מודגש) ב- 3 בשעה 2 (כוכב מחומש). הכיוון הוא זהה לזו בעכברים מבוגרים (איור 2B). (ג) PSC semicircular לרוחב התעלה (ה-LSC) הם חשופים (קווים מנוקדים). (ד) פתח קטן עשוי ב PSC. (ה) בצינורית מוכנס לתוך PSC. (נ) חתיכה קטנה של השריר משמש כדי לכסות את הפתח לאחר ההזרקה. גודל ברים ב A ו B שיבוץ 5 מ מ, כי ב' הוא 1 מ מ, ויש כי ג' 1 מ"מ (C עבור C-F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: סטריאו תמונות מיקרוסקופיות של האוזן הפנימית של מבוגר (A-A') ועכברים neonatal (B-B') מנוהל צבע ירוק-מהיר via canalostomy. דגימות נאספו מיד לאחר הניתוח. (A ו- B) פני השטח extracranial. (A' ו- B') פני השטח תוך-גולגולתי. צבע ירוק-מהיר מפיץ ברחבי שבלול, פרוזדור, תעלות semicircular. סולם ברים הם 1 מ מ (A' עבור A-A 'ו ב' עבור B-B'). PSC, תעלת semicircular אחורי. ה-LSC, לרוחב התעלה semicircular. האס, תעלת semicircular. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: נציג תמונות קונאפוקלית של טעינות שלם של שבלול (A-A"), utricle (B-B") של עכברים בוגרים, מוכן 30 ימים לאחר הזרקת AAV8-GFP ויה canalostomy. דוגמאות מוכתמים נוגדנים GFP (ירוק), צולבות הקישור חוטים שרירן באמצעות (אדום). (A-A ") GFP מתבטא תאים שיער הפנימי ביותר (IHC). (B-B ") על המטוס מוקד של צלחת cuticular של utricle תאים שיער רבים מבטאים GFP (חיצים). ה-GFP, חלבון פלואורסצנטי ירוק. OHC, תאים שיער החיצוני. סולם ברים הם 25 מיקרומטר (א' עבור A-A ", B" עבור B-B"). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: נציג תמונות קונאפוקלית של utricle שעבר טראומה שהושג 30 ימים לאחר הזרקת AAV8-GFP ויה canalostomy. העכבר למבוגרים הזריקו סטרפטומיצין דרך תעלת semicircular הלטראלי 7 ימים לאחר מכן הזריק AAV8-GFP דרך תעלת semicircular אחורי. GFP (ירוק), צולבות הקישור חוטים שרירן באמצעות (אדום) ואקטין (כחול). ראשי חץ ציין נציג תאים התומכים transduced עם AAV8-GFP (GFP / צולבות הקישור חוטים שרירן באמצעות תאים), החצים מצביעים על נציג תאים שיער transduced עם AAV8-GFP (GFP / צולבות הקישור חוטים שרירן באמצעות + תאים) עם צרורות שיער ילדותי. סולם בר הוא 20 מיקרומטר (D עבור A-D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, הראינו כי משלוח סמים על ידי canalostomy, גרמו הפצה נרחבת של הכימית ברחבי שבלול סוף-אברי שיווי המשקל. כמו שיטת משלוח ג'ין באוזן הפנימית, canalostomy הביא בביטוי GFP לאוזניים הפנימיות של עכברים בוגרים ו neonatal במינימום נזקים לפונקציה שמיעה ואת שיווי המשקל. יתר על כן, זריקות מרובות ניתן לבצע בקלות בתוך אותה חיה.

אחד היתרונות הגדולים של canalostomy הוא שזה גורם נזק מינימלי לפונקציה באוזן הפנימית, במיוחד ב עכברים בוגרים16,18,28,29,30, אשר משמעותי הערכה של ההשפעות המגנות ועבור translational היבטים. מספר קבוצות השתמשו canalostomy כדי לספק נוגדנים שונים, כגון נגיפי וקטורים, siRNA, תאי גזע, aminoglycoside, לתוך האוזן הפנימית מאתר18,19,28,29, 34,35,36,37. במחקר הנוכחי, אנו המתואר טכניקות ניתוחיות, מפורט שלב אחר שלב של canalostomy בעכברים מבוגרים ו neonatal. לעומת מחקרים קודמים, המחקר שלנו מספק פרטים על מיקום של התעלות semicircular, אשר הינו הליך מפתח לניתוח מוצלח. כפי שמוצג באיור 2B ו- C PSC ואת ה-LSC היו בדרך כלל ממוקם ~ 3 מ מ מהבסיס של פינה-2-3 בלילה. ה-LSC היה בבית כ 30 מעלות זווית מהמטוס במקביל החילונית, PSC היה אנכי אל ה-LSC. יתר על כן, אנו פשוטה את הניתוחים, מקוצר זמן כירורגי בסביבות 25 דקות עם תוצאות דומות29.

במהלך canalostomy, זה הכרחי כדי למנוע דליפה ההזרקה, חסימה של הצינורית. לפני המעבר על המשאבה, חשוב להבטיח כי קצה הצינורית מוכנס בתוך התעלה semicircular, כי הצינורית אינו כפוף או חסום. שריר יבש מומלץ לשימוש בעת איטום החור בתוך התעלה semicircular של עכברים בוגרים כי, בנוכחות נוזל תעלת semicircular, היא מרחיבה, מחבר את החור (ראה שלבים 2.6 ו- 2.10). כיוון הקיר של התעלה semicircular של עכברים neonatal הוא רך ושברירי, הפתח צריך להחתם ע י כיסוי עם שרירים autogenous או דבק רפואי30. אנחנו גם להסיר את הצינורית בלי המכסה את הפתח עם שרירים; התוצאות חשף דומות AAV התמרה חושית היעילות באוזן הפנימית (נתונים לא מוצג), המציין כי הפתח PSC של עכברים neonatal נסגר באופן משביע רצון.

יתרון נוסף של canalostomy הוא הכדאיות של נהלים מרובים, אשר מאפשר ליישומים חוזרות של ריאגנטים זהים או שונים (איור 6). בגלל הצטלקות רקמות פרור נמצאים לעתים קרובות באתרי כירורגית הקודם, ואת תעלת semicircular עלולים להיות חסומים לאחר ניתוח34, מומלץ לבצע זריקות במהלך ניתוחים חוזרים ונשנים באזור שונה של הכביש הצדדי ו/או אחוריים בצורת חצי עיגול תעלות18.

המגבלה העיקרית של canalostomy הוא הקושי בקביעת אם הצינורית הזרקת מוכנס לתוך המרחב perilymphatic או endolymphatic. לאחר ניהול של וקטורים adenoviral לתוך האוזן הפנימית16 ויה canalostomy, תאים transduced ביותר היו ממוקמים בחלל perilymphatic, רומז כי הזרקת היה סביר שבוצעה באזור זה. תרכובות משקל מולקולרי נמוך (למשל, AAV סטרפטומיצין, siRNA) יכול לעבור דרך המחסום בין perilymph לבין endolymph ולהגיע האפיתל חושי לאחר ההזרקה לתוך החלל perilymphatic או endolymphatic18,19 ,34. עם זאת, לאחר ההזרקה לתוך perilymph, ריאגנטים עשויים להישאר בחלל perilymphatic, אם הם לא יכולים לחדור את המחסום בין perilymph ו- endolymph16,39,40. לכן, יש לשקול את החדירות של ריאגנטים מוזרק לפני השימוש canalostomy.

לסיכום, canalostomy תוצאות הפצה רחבה של ריאגנטים שבלול, פרוזדור עם הפרעה מינימלית של תפקוד שמיעה ואת שיווי המשקל. הניתוח מבוצע בקלות בעכברים מבוגרים ו neonatal, ניתן לבצע הליכים מרובים אם נדרש. Canalostomy היא לפיכך גישה יעילה ובטוחה עבור משלוח סמים לתוך האוזן הפנימית של מכרסמים והוא אולי, בעתיד, לשמש קלינית לטיפול במחלות cochleovestibular האנושי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי עניינים מוצהרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (גרנט מספרים 81570912, 81771016, 81100717).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polymide Tubing A-M Systems 823400
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/1
10μl Microsyringe Hamilton Company 80001
Xylazine HCL Sigma-Aldrich Co. Llc. X-1251
Operating Miroscope Carl Zeiss Optical LLC. Pico
Micro Forceps Dumont Dumostar 10576
Fast-green Dye Sigma-Aldrich Co. Llc. F7252
AAV8-GFP BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) 20161101 Titer: 2×10e12 vg/mL
Streptomycin Sulfate Sigma-Aldrich Co. Llc. S9137
Microinjection Pump Stoelting Co. 789100S
Electric Pad Pet Fun 11072931136
1 cc Syringe Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) 2011-3151258
Ketamine HCL Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) H35020148
Electric Animal Clipper Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) CP-8000
Cotton Pellet Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) Yu-2008-1640081
Suture Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) Hu-2013-2650207
Eye Ointment Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) H11021270

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stachler, R. J., et al. Clinical practice guideline: sudden hearing loss. Otolaryngol Head Neck Surg. 146 (3 Suppl), S1-S35 (2012).
  2. Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19 (3), 345-350 (2013).
  3. Rivera, T., Sanz, L., Camarero, G., Varela-Nieto, I. Drug delivery to the inner ear: strategies and their therapeutic implications for sensorineural hearing loss. Curr Drug Deliv. 9 (3), 231-242 (2012).
  4. El Kechai, N., et al. Recent advances in local drug delivery to the inner ear. Int J Pharm. 494 (1), 83-101 (2015).
  5. Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane. J Vis Exp. (97), e52187 (2015).
  6. Ahmed, H., Shubina-Oleinik, O., Holt, J. R. Emerging Gene Therapies for Genetic Hearing Loss. J Assoc Res Otolaryngol. 18 (5), 649-670 (2017).
  7. Murillo-Cuesta, S., et al. A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection. J Vis Exp. (121), e54951 (2017).
  8. Stevens, S. M., Brown, L. N., Ezell, P. C., Lang, H. The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration. J Vis Exp. (105), e53131 (2015).
  9. Salt, A. N., Plontke, S. K. Principles of local drug delivery to the inner ear. Audiol Neurootol. 14 (6), 350-360 (2009).
  10. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
  11. Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35 (3), 264-272 (2017).
  12. Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
  13. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
  14. Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Mol Med. 7 (8), 1077-1086 (2015).
  15. Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. A method for intracochlear drug delivery in the mouse. J Neurosci Methods. 150 (1), 67-73 (2006).
  16. Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The functional and structural outcome of inner ear gene transfer via the vestibular and cochlear fluids in mice. Mol Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
  17. Bowers, W. J., et al. Neurotrophin-3 transduction attenuates cisplatin spiral ganglion neuron ototoxicity in the cochlea. Mol Ther. 6 (1), 12-18 (2002).
  18. Wang, G. P., et al. Adeno-associated virus-mediated gene transfer targeting normal and traumatized mouse utricle. Gene Ther. 21 (11), 958-966 (2014).
  19. Isgrig, K., et al. Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25 (3), 780-791 (2017).
  20. Gassner, D., Durham, D., Pfannenstiel, S. C., Brough, D. E., Staecker, H. Canalostomy as a surgical approach for cochlear gene therapy in the rat. Anat Rec (Hoboken). 295 (11), 1830-1836 (2012).
  21. Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner ear transgene expression after adenoviral vector inoculation in the endolymphatic sac. Hum Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
  22. Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene transfection in neonatal mice using adeno-associated viral vector: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
  23. Chien, W. W., McDougald, D. S., Roy, S., Fitzgerald, T. S., Cunningham, L. L. Cochlear gene transfer mediated by adeno-associated virus: Comparison of two surgical approaches. Laryngoscope. 125 (11), 2557-2564 (2015).
  24. Zhu, B. Z., Saleh, J., Isgrig, K. T., Cunningham, L. L., Chien, W. W. Hearing Loss after Round Window Surgery in Mice Is due to Middle Ear Effusion. Audiol Neurootol. 21 (6), 356-364 (2017).
  25. Wang, Y., et al. Early postnatal virus inoculation into the scala media achieved extensive expression of exogenous green fluorescent protein in the inner ear and preserved auditory brainstem response thresholds. J Gene Med. 15 (3-4), 123-133 (2013).
  26. Lee, M. Y., et al. Survival of human embryonic stem cells implanted in the guinea pig auditory epithelium. Sci Rep. 7, 46058 (2017).
  27. Ishimoto, S., Kawamoto, K., Kanzaki, S., Raphael, Y. Gene transfer into supporting cells of the organ of Corti. Hear Res. 173 (1-2), 187-197 (2002).
  28. Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33 (4), 655-659 (2012).
  29. Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).
  30. Guo, J. Y., et al. Cochleovestibular gene transfer in neonatal mice by canalostomy. Neuroreport. 28 (11), 682-688 (2017).
  31. Beyea, J. A., Agrawal, S. K., Parnes, L. S. Transmastoid semicircular canal occlusion: a safe and highly effective treatment for benign paroxysmal positional vertigo and superior canal dehiscence. Laryngoscope. 122 (8), 1862-1866 (2012).
  32. Naples, J. G., Eisen, M. D. The History and Evolution of Surgery on the Vestibular Labyrinth. Otolaryngol Head Neck Surg. 155 (5), 816-819 (2016).
  33. Hamilton, L., Keh, S., Spielmann, P. M., Hussain, S. S. How we do it: locating the posterior semicircular canal in occlusion surgery for refractory benign paroxysmal positional vertigo: a cadaveric temporal bone study. Clinical Otolaryngology. 41 (2), 190-193 (2016).
  34. Jung, J. Y., et al. siRNA targeting Hes5 augments hair cell regeneration in aminoglycoside-damaged mouse utricle. Mol Ther. 21 (4), 834-841 (2013).
  35. Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. Am J Pathol. 171 (1), 214-226 (2007).
  36. Pfannenstiel, S. C., Praetorius, M., Plinkert, P. K., Brough, D. E., Staecker, H. Bcl-2 gene therapy prevents aminoglycoside-induced degeneration of auditory and vestibular hair cells. Audiol Neurootol. 14 (4), 254-266 (2009).
  37. Kawamoto, K., Izumikawa, M., Beyer, L. A., Atkin, G. M., Raphael, Y. Spontaneous hair cell regeneration in the mouse utricle following gentamicin ototoxicity. Hear Res. 247 (1), 17-26 (2009).
  38. Wang, G. P., et al. Notch signaling and Atoh1 expression during hair cell regeneration in the mouse utricle. Hear Res. 267 (1-2), 61-70 (2010).
  39. Pietola, L., et al. HOX-GFP and WOX-GFP lentivirus vectors for inner ear gene transfer. Acta Otolaryngol. 128 (6), 613-620 (2008).
  40. Han, J. J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).

Tags

החודש יופיטר גיליון 135 Canalostomy שבלול פרוזדור תא שיער מקומי סמים משלוח תעלת semicircular neonatal
Canalostomy כמו הגישה כירורגי של משלוח סמים מקומי לתוך האוזן הפנימית של עכברים בוגרים ו Neonatal
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, J. Y., He, L., Qu, T. F., Liu,… More

Guo, J. Y., He, L., Qu, T. F., Liu, Y. Y., Liu, K., Wang, G. P., Gong, S. S. Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice. J. Vis. Exp. (135), e57351, doi:10.3791/57351 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter