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Genetics

वयस्क और नवजात चूहों के भीतरी कानों में स्थानीय दवा वितरण के लिए एक शल्य दृष्टिकोण के रूप में Canalostomy

Published: May 25, 2018 doi: 10.3791/57351
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Shanghai First People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University

Summary

यहां हम canalostomy प्रक्रिया जो semicircular नहर के माध्यम से वयस्क और नवजात चूहों के भीतरी कानों में सुनवाई और vestibular समारोह के लिए ंयूनतम क्षति के साथ स्थानीय दवा वितरण की अनुमति देता है का वर्णन । इस विधि inoculate वायरल वैक्टर, फार्मास्यूटिकल्स, और माउस भीतरी कान में छोटे अणुओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

भीतरी कान में चिकित्सकीय दवाओं के स्थानीय वितरण भीतरी कान रोगों के लिए एक होनहार चिकित्सा है । semicircular नहरों (canalostomy) के माध्यम से इंजेक्शन भीतरी कान में स्थानीय दवा वितरण के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण होना दिखाया गया है । इस अनुच्छेद के लक्ष्य का वर्णन है, विस्तार में, शल्य चिकित्सा दोनों वयस्क और नवजात चूहों में canalostomy में शामिल तकनीक । के रूप में तेजी से हरे रंग की डाई और adeno-एसोसिएटेड वायरस सीरोटाइप 8 हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन के साथ संकेत दिया, canalostomy कोक्लीअ और vestibular अंत में इंजेक्शन रिएजेंट के व्यापक वितरण की सुविधा सुनवाई के लिए ंयूनतम क्षति के साथ अंगों और vestibular लिहितो. सर्जरी सफलतापूर्वक दोनों वयस्क और नवजात चूहों में लागू किया गया था; वास्तव में, कई सर्जरी यदि आवश्यक प्रदर्शन किया जा सकता है । अंत में, canalostomy वयस्क और नवजात चूहों के भीतरी कानों में दवा वितरण के लिए एक प्रभावी और सुरक्षित दृष्टिकोण है और भविष्य में मानव भीतरी कान रोगों के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

Sensorineural बहरापन और vestibular रोग रोगियों की एक पर्याप्त संख्या को प्रभावित और बारीकी से भीतरी कान विकारों के साथ जुड़े रहे हैं । भीतरी कान में चिकित्सकीय दवाओं के वितरण भीतरी कान विकारों के उपचार के लिए वादा दिखाता है । एक प्रणालीगत या स्थानीय दृष्टिकोण को भीतरी कान में दवाओं देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कुछ भीतरी कान रोगों को सफलतापूर्वक प्रणालीगत दवा प्रशासन के साथ इलाज कर रहे हैं, जैसे अज्ञातहेतुक अचानक सुनवाई हानि, जो सामांयतः प्रणालीगत स्टेरॉयड के साथ इलाज किया जाता है1। इसके अलावा, Lentz एट अल. दिखाया गया है कि antisense oligonucleotide के प्रणालीगत प्रशासन Ush1c उत्परिवर्ती माउस मॉडल2में सुनवाई और संतुलन कार्यों में सुधार करने में सक्षम था । हालांकि, भीतरी कान रोगों का एक बड़ा हिस्सा प्रभावी ढंग से रक्त भूलभुलैया बाधा है, जो भीतरी कान3,4के लिए दवा का उपयोग सीमा की वजह से प्रणालीगत दवा प्रशासन द्वारा इलाज नहीं कर रहे हैं । इसके विपरीत, स्थानीय दवा वितरण रणनीतियों आंतरिक कान विकारों और अधिक कुशलता से इलाज कर सकते हैं । दरअसल, भीतरी कान संभावित रूप से स्थानीय दवा वितरण के लिए एक आदर्श लक्ष्य है; यह तरल पदार्थ है, जो एक साइट प्रसार या इंजेक्शन के बाद दवा के प्रसार की सुविधा से भर जाता है, और यह अपेक्षाकृत पड़ोसी अंगों से अलग है, जो पक्ष प्रभाव5,6सीमा ।

स्थानीय दवा वितरण रणनीतियों intratympanic और intralabyrinthine तरीकों में शामिल हैं । intratympanic मार्ग की प्रभावशीलता के दौर खिड़की झिल्ली (RWM) और RWM पर दवा के निवास समय के माध्यम से दवा पारगम्यता पर निर्भर करता है3,4,7,8. इस प्रकार, यह दवाओं या रिएजेंट है कि RWM घुसना नहीं कर सकते के वितरण के लिए उपयुक्त नहीं है । Intralabyrinthine तरीकों सीधे भीतरी कान में दवाओं के टीका शामिल है, एक उच्च खुराक और व्यापक वितरण में जिसके परिणामस्वरूप । हालांकि, intralabyrinthine तरीकों नाजुक सर्जरी की आवश्यकता होती है और आक्रामक, भीतरी कान समारोह को नुकसान करने के लिए अग्रणी । वर्तमान में, दवाओं के intralabyrinthine इंजेक्शन केवल पशु के अध्ययन में प्रयोग किया जाता है के रूप में यह प्रदर्शित नहीं किया गया है के लिए पर्याप्त रूप से मनुष्यों में उपयोग के लिए सुरक्षित है9। इसलिए, शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं को सरल किया जाना चाहिए, और चोट के जोखिम को क्लिनिक में intralabyrinthine दृष्टिकोण का अनुवाद करने के लिए कम ।

कई intralabyrinthine दृष्टिकोण के माध्यम से इंजेक्शन द्वारा पशुओं में मूल्यांकन किया गया है RWM5,10,11 और scala मीडिया में12,13,14, scala tympani 15 , 16, scala बरोठा17, semicircular नहरों16,18,19,20, और endolymphatic सैक21। इन तरीकों में से प्रत्येक के फायदे और नुकसान6है । RWM के माध्यम से डिलिवरी नवजात चूहों में atraumatic है5,22. हालांकि, एक हल्के सुनवाई हानि RWM इंजेक्शन23, संभवतः सर्जरी24के बाद मध्य कान बहाव के कारण के बाद वयस्क चूहों में मनाया जाता है । Scala मीडिया इंजेक्शन, जो endolymphatic अंतरिक्ष संवेदी उपकला युक्त में सीधे एजेंट के इंजेक्शन शामिल है, लक्ष्य अंत में एक उच्च एजेंट एकाग्रता प्राप्त-अंगों12,14, 25 , 26. हालांकि, इस दृष्टिकोण एक जटिल प्रक्रिया की आवश्यकता है और सुनवाई दहलीज के महत्वपूर्ण उंनयन में परिणाम अगर जन्मोत्तर दिन 5 (P5)25,27है, जो अपने आवेदन की सीमा से बाद में प्रदर्शन किया ।

उपर्युक्त intralabyrinthine दृष्टिकोण की तुलना में, canalostomy भीतरी कान के लिए ंयूनतम क्षति का कारण बनता है, विशेष रूप से वयस्क चूहों में16,18,28,29,30, जो है सुरक्षात्मक प्रभाव और शोधों के पहलुओं के आकलन के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, semicircular नहरों bulla से परे स्थित हैं, जो शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की सुविधा और सर्जरी के दौरान मध्य कान की अशांति से बचा जाता है । क्लिनिक में, semicircular नहर सर्जरी असभ्य सौम्य कंपकंपी स्थिति चक्कर31,३२,३३, canalostomy के नैदानिक व्यवहार्यता का सुझाव के लिए उपयोग किया जाता है । चूंकि यह पहले Kawamoto एट अलद्वारा वर्णित किया गया था । 16 में २००१, canalostomy वायरल वैक्टर, सिरना, स्टेम सेल, और aminoglycoside के रूप में विभिंन रिएजेंट, देने के लिए इस्तेमाल किया गया है murine भीतरी कान में18,19,28,29 ,३४,३५,३६,३७. टीका adeno-एसोसिएटेड वायरस (AAV) वैक्टर exogenous और कोक्लीअ अंत अंगों के संवेदी उपकला और प्राथमिक न्यूरॉन्स में vestibular जीन के canalostomy सक्षम के द्वारा वेक्टर्स18,28, 29,30. canalostomy द्वारा Whirlin जीन थेरेपी शेष समारोह पुनर्स्थापित करता है और मानव श्रीगणेश सिंड्रोम19के एक माउस मॉडल में सुनवाई में सुधार, सुझाव है कि canalostomy आनुवंशिक cochleovestibular रोगों के लिए जीन थेरेपी के अध्ययन के लिए उपयोगी है । कॉकलियर fibrocytes के पुनर्गठन में canalostomy परिणाम और तीव्र sensorineural सुनवाई हानि३५के एक चूहे मॉडल में सुनवाई वसूली द्वारा mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के प्रत्यारोपण । इसके अतिरिक्त, canalostomy भीतरी कान में एमिनोग्लीकोसाइड्स शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है vestibular घावों को स्थापित करने के लिए18,३४,३८, और कई इंजेक्शन प्रदर्शन किया जा सकता है यदि आवश्यक18 , ३४.

वर्तमान लेख में, हम वर्णन, विस्तार में, वयस्क और नवजात चूहों में canalostomy तकनीक । हम फास्ट ग्रीन डाई और AAV सीरोटाइप 8 (AAV8), साथ में ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) जीन (AAV8-GFP) और streptomycin, माउस भीतरी कान में canalostomy के बाद तत्काल और लंबी अवधि के परिणामों का मूल्यांकन करने सहित विभिंन रिएजेंट, inoculated ।

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Protocol

चीन की राजधानी मेडिकल यूनिवर्सिटी की एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी के दिशानिर्देशों के अनुसार सभी प्रक्रियाओं और जानवरों की सर्जरी का आयोजन किया गया ।

1. डिवाइस की तैयारी

  1. इंजेक्शन प्रवेशनी (चित्र 1a) बनाने के लिए, polyimide टयूबिंग (भीतरी व्यास ११४.३ µm, बाहरी व्यास १३९.७ µm, लंबाई ~ 3 सेमी) पॉलीथीन टयूबिंग (भीतरी व्यास २८० µm, बाहरी व्यास ६४० µm, लंबाई ~ ४० सेमी) करने के लिए कनेक्ट करें । superglue का उपयोग करते हुए, कनेक्शन को कम से तीन अनुप्रयोगों के साथ सील करें । ईथीलीन ऑक्साइड के साथ इंजेक्शन प्रवेशनी निष्फल ।
    नोट: जब टयूबिंग सील, polyimide टयूबिंग, जो प्रवेशनी की एक रुकावट में परिणाम कर सकते है प्रवेश करने से superglue को रोकने के । ट्यूबिंग को कम से कम तीन बार सील करें, क्योंकि गैस नसबंदी कनेक्शन पर रिसाव हो सकता है ।
  2. एक 30 जी सुई का उपयोग करना, एक 1 प्रतिलिपि सामांय खारा युक्त सिरिंज को पॉलीथीन टयूबिंग के अंत से कनेक्ट । polyimide टयूबिंग और पॉलीथीन टयूबिंग के बीच संबंध में किसी भी रिसाव या रुकावट के लिए जांच करने के लिए 1-cc सिरिंज के साथ इंजेक्शन द्वारा सामान्य खारा के साथ प्रवेशनी भरें ।
    नोट: यदि कोई रिसाव या कनेक्शन की कोई रुकावट है, प्रवेशनी निंन कार्यविधियों में उपयोग नहीं किया जा सकता ।
  3. खाली एक 10 µ एल सूक्ष्म सामांय खारा के साथ सिरिंज और यह इंजेक्शन प्रवेशनी के साथ aforementioned 30 जी सुई से कनेक्ट । एक microinjection पंप पर माइक्रो सिरिंज स्थापित करें (चित्र 1b). इंजेक्शन की गति को ०.५ µ l/मिनट और वॉल्यूम को 1 µ l के लिए सेट करें फास्ट-ग्रीन डाई और AAV8-GFP, या µ के लिए 2 streptomycin l.
    नोट: इंजेक्शन की गति की सिफारिश की सीमा 0.1 − 0.5 µ l/मिनट है, और इंजेक्शन की मात्रा की सिफारिश की सीमा है 0.5 − 2 µ l
  4. वापस खींच माइक्रो-1 µ के लिए सिरिंज और इंजेक्शन एजेंट निकालने. एक हवा अंतर सामांय खारा और इंजेक्शन एजेंट के बीच फार्म का होगा (चित्रा 1C) ।
  5. वैकल्पिक रूप से एक मार्कर पेन का उपयोग कर पॉलीथीन टयूबिंग पर गैस द्रव सीमा की स्थिति लेबल । यह इंजेक्शन के दौरान रिएजेंट प्रवाह की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

2. वयस्क चूहों में Canalostomy

  1. Anesthetize एक वयस्क माउस (महिला, FVB/एन, 5 से 6 सप्ताह पुरानी) ketamine एचसीएल के intraperitoneal इंजेक्शन (१२० मिलीग्राम/) और xylazine एचसीएल (7 मिलीग्राम/ 5 − 10 मिनट तक के लिए प्रतीक्षा करें जब तक पशु दर्दनाक उत्तेजनाओं (पाँव-चुटकी पलटा) का कोई जवाब नहीं दिखाती । संज्ञाहरण के बाद एक गरम बिजली पैड पर पशु प्लेस । एक एनाल्जेसिक, Meloxicam (मिलीग्राम/kg), सर्जरी से पहले चमड़े के नीचे लागू किया गया था ।
  2. आंख मरहम के साथ पशु की आंखों को कवर । एक इलेक्ट्रिक पशु क्लिपर के साथ छोड़ दिया पोस्ट-auricular क्षेत्र दाढ़ी और ७५% इथेनॉल के साथ त्वचा तीन बार संक्रमित ।
  3. एक गरम बिजली पैड पर पशु प्लेस । ~ 37 डिग्री सेल्सियस के लिए बिजली के पैड के तापमान सेट करें । बाएं कान पर शल्य चिकित्सा की सुविधा के लिए सही पार्श्व स्थिति में पशु प्लेस ।
  4. एक 1-1.5-सेमी पोस्ट-auricular चीरा ~ 3 मिमी वाम retroauricular नाली (चित्रा 2a) से बनाओ ।
  5. पीछे semicircular नहर (पीएससी) और पार्श्व semicircular नहर (LSC) पोजिशनिंग: जब pinna की जड़ ( चित्रा बी2 में बोल्ड डॉट) मूल के रूप में परिभाषित किया गया है और विमान 3 से 9 बजे के रूप में calvarium के समानांतर, पीएससी और LSC आम तौर पर कर रहे है 2 और 3 बजे के बीच pinna की जड़ से ~ 3 मिमी स्थित (चित्रा 2 बी) ।
  6. माइक्रो संदंश के साथ अस्थाई हड्डी को कवर मांसपेशी काटना पीएससी और LSC, जिसका मार्जिन स्पष्ट रूप से अस्थाई हड्डी में अंधेरे धारियों के रूप में दिखाई दे रहे है (चित्रा 2c) को बेनकाब । LSC calvarium के समानांतर विमान से एक लगभग 30 ° कोण पर है, और पीएससी LSC (चित्रा 2c) के लिए खड़ी है । माइक्रो-संदंश के साथ मांसपेशी का एक छोटा सा टुकड़ा लीजिए और इसे सूखने दें । निंनलिखित चरण में, इस मांसपेशी छेद सील करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
    नोट: मांसपेशियों को चोट को कम करने के लिए ऊतकों के अत्यधिक फाड़ से बचें । पीएससी (चित्रा 2d) को उजागर करते समय निकटवर्ती पोत को नुकसान पहुंचाने से बचें ।
  7. एक 26 ग्राम सुई (चित्रा 2d) का उपयोग कर पीएससी के मध्य भाग में एक छोटा सा छेद बनाओ । छेद के माध्यम से द्रव रिसाव पीएससी के बोनी दीवार के सफल प्रवेश को इंगित करता है । एक उपयुक्त आकार के छेद में विस्तार, थोड़ा polyimide टयूबिंग के व्यास से भी बड़ा है ।
    नोट: ड्रिल और छेद धीरे और विस्तार पीएससी के फ्रैक्चर से बचने के लिए ।
  8. एक कपास गोली का उपयोग कर पीएससी के छेद आसपास के बहाव साफ ।
  9. polyimide टयूबिंग के टिप डालें धीरे पीएससी में अधोजानु सांप्रदायिक की ओर 1 − 2 मिमी (चित्रा 2E) की गहराई तक । पंप पर ' रन ' बटन दबाकर इंजेक्शन शुरू कर दीजिये ।
  10. इंजेक्शन के बाद, प्रतीक्षा ~ 2 मिनट के लिए एजेंट को फैलाने की अनुमति है । सूक्ष्म कैंची के साथ कदम २.६ में एकत्र की मांसपेशी के छोटे टुकड़े ट्रिम कर दीजिए । अगला, इंजेक्शन प्रवेशनी निकालें और तुरंत पेशी के छेद में पीएससी में जगह है ।
    नोट: किसी भी तरल के लिए जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि छेद पूरी तरह से बंद है plugging के बाद छेद से टपक ।
  11. अलग मांसपेशियों और चमड़े के नीचे ऊतक लौटें । एक 5-0 टांका का उपयोग कर चीरा टांका । povidone आयोडीन के साथ चीरा क्षेत्र को संक्रमित.
    नोट: उपरोक्त सभी शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के बारे में 25 मिनट ले ।
  12. एक इलेक्ट्रिक पैड पर पशु की स्थिति ~ ३७ ° c करने के लिए गरम । वसूली के लिए सही पार्श्व स्थिति में पशु प्लेस ।
  13. शल्य चिकित्सा brainstem प्रतिक्रिया (ABR) माप और तैराकी परीक्षण एक सप्ताह सर्जरी के बाद18प्रदर्शन ।
  14. यदि आवश्यक हो, पीएससी या LSC के एक अलग क्षेत्र में दोहराया इंजेक्शन प्रदर्शन ।

3. नवजात चूहों में Canalostomy

  1. हाइपोथर्मिया का प्रयोग करने के लिए प्रेरित और नवजात चूहों में बेहोशी बनाए रखने के लिए (FVB/N) जन्मोत्तर दिनों में 1 से 2 (P1-2) । एक प्लास्टिक पर पिल्ला प्लेस-लपेटो-कुचल बर्फ के बिस्तर कवर ~ 4 मिनट के लिए । अगले, एक बर्फ से भरे मंच पर पिल्ला रखना । सर्जिकल क्षेत्र ७५% इथेनॉल के साथ तीन बार संक्रमित ।
    नोट: यह सुनिश्चित करें कि पिल्ला के सिर बर्फ से बाहर है । एक बर्फ से भरे मंच पर पिल्ला के साथ पूरी सर्जरी प्रदर्शन करते हैं ।
  2. निंन चरणों का पालन वयस्क चूहों की तुलना में neonate में अलग है ।
    1. ~ 2 मिमी auricular क्रीज के पीछे से ~ 3 मिमी postauricular चीरा (चित्र 3 ए -बी) बनाओ ।
    2. धीरे मुलायम पीएससी में एक खोलने के एक 26 जी सुई का उपयोग कर । प्रवेशनी को पीएससी के विस्तार के बिना (चित्रा 3 सी -ई) में डालें ।
    3. इंजेक्शन के बाद, कवर करने के लिए मांसपेशियों के एक टुकड़े का उपयोग करें, बजाय प्लग के रूप में, उद्घाटन के रूप में नरम पीएससी (चित्रा 3F) के फ्रैक्चर के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
    4. एक 6-0 सीवन का उपयोग त्वचा बंद करो ।
    5. P30 पर ABR माप और तैराकी परीक्षण प्रदर्शन30।
  3. नवजात सर्जरी के बाद माता-पिता का नरभक्षी एक आम समस्या है । निम्न चरणों में माता-पिता का नरभक्षी होने की संभावना कम है.
    1. सर्जरी के बाद शराब पोंछे के साथ चीरा आसपास के खून को साफ ।
    2. सुनिश्चित करें कि neonate यह बांध के लिए लौटने से पहले स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित कर सकते हैं ।
    3. मां के पिंजरे से मिट्टी के बिस्तर के साथ धब्बा नवजात शिशुओं, और कूड़े के बीच में वापस नवजात शिशुओं जगह है ।
    4. किसी भी है कि सर्जरी से गुजरना नहीं है एक समान postauricular चीरा और टांका प्राप्त करना चाहिए ।
    5. नर को प्रजनन के पिंजरे से अलग कर ।

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Representative Results

तेज-हरे रंग के व्यस्क और नवजात चूहों के पीएससी में इंजेक्शन लगाने के लिए भीतरी कान में इसके तत्काल वितरण का मूल्यांकन किया गया. डाई कोक्लीअ, बरोठा, और semicircular नहरों के तुरंत सर्जरी के बाद भर में पता चला था (चित्रा 4) ।

आंतरिक कान जीन प्रसव के लिए canalostomy की सुरक्षा और दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए, AAV8-GFP वयस्क और नवजात चूहों के भीतरी कान में इंजेक्ट किया गया था । सभी जानवरों AAV8-GFP इंजेक्शन18,30के बाद सामान्य ABR थ्रेसहोल्ड और तैराकी परीक्षण के स्कोर का प्रदर्शन किया । Immunohistology से पता चला कि, श्रवण संवेदी उपकला में, भीतरी बाल कोशिकाओं (IHCs) और कुछ बाहरी बाल कोशिकाओं (OHCs) बेसल बारी की मजबूत GFP अभिव्यक्ति30दिखाया. vestibular संवेदी उपकला में, utricle, saccule, और ampullae में GFP अभिव्यक्ति का पता लगाया गया था30. दोनों vestibular बाल कोशिकाओं (चित्रा 5) और सहायक कोशिकाओं उच्च दक्षता18,30के साथ transduced थे ।

canalostomy द्वारा streptomycin के अर्क utricle18,३४,३८में गंभीर बाल कोशिका हानि लाती है । canalostomy के माध्यम से कई इंजेक्शन की व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए, चूहों को पीएससी के माध्यम से AAV8-GFP सस्पेंशन द्वारा 7 दिनों बाद LSC के माध्यम से streptomycin दिया गया । यह प्रयोग भी क्षतिग्रस्त utricle में AAV8-GFP की transduction विशेषताओं का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जो HC नुकसान18के बाद खराब भीतरी कान में जीन थेरेपी अध्ययन के लिए उपयोगी था । GFP घावों utricle (चित्रा 6) भर में वितरित किया गया था । कई GFP-सकारात्मक कोशिकाओं मायोसिन VIIA के लिए नकारात्मक थे, यह दर्शाता है कि वे transduced SCs थे । अपरिपक्व बालों के बंडलों के साथ कुछ HCs (मायोसिन VIIa-पॉजिटिव कोशिकाएँ) भी GFP व्यक्त की.

Figure 1
चित्र 1: डिवाइस तैयारी । (क) polyimide टयूबिंग (i) और पॉलीथीन टयूबिंग (द्वितीय) एक इंजेक्शन प्रवेशनी (iii) बनाने के लिए सील कर रहे हैं । (ख) प्रवेशनी एक 10-µ एल माइक्रो-एक 30 जी सुई के साथ सिरिंज और फिर एक पंप पर स्थापित करने के लिए जुड़ा हुआ है । तीर प्रवेशनी टिप को इंगित करता है । (ग) इंजेक्शन रिएजेंट और सामान्य खारा एक हवा के अंतर से अलग कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एक वयस्क माउस में Canalostomy । (क) एक पद-auricular चीरा (arrow). (ख) लौकिक हड्डी को कवर मांसपेशियों को उजागर कर रहे हैं । यदि हम pinna की जड़ को परिभाषित (बोल्ड डॉट) के रूप में मूल और calvarium के समानांतर विमान 3/9 बजे के रूप में, पीछे semicircular नहर (पीएससी) और पार्श्व semicircular नहर (LSC) आम तौर पर 2 और 3 के बीच के क्षेत्र में स्थित है (पेंटाग्राम) , ~ मूल से 3 मिमी । इनसेट: ओरिएंटेशन की लोअर-आवर्धन छवि । बिंदीदार रेखा calvarium विमान को इंगित करता है । (ग) पीएससी और LSC (चिन्हांकित लाइनें) सामने आ रही हैं । इनसेट: LSC के समानांतर विमान से लगभग 30 ° कोण पर है calvarium, और पीएससी LSC के लिए खड़ी है । (घ) पीएससी में एक छोटा सा छेद किया जाता है. (ङ) प्रवेशनी की नोक को पीएससी में सम्मिलित किया जाता है, और उसे रिएजेंट इंजेक्ट किया जाता है. (च) छेद मांसपेशी के एक छोटे से टुकड़े के साथ बंद है । एक में स्केल बार 5 मिमी है, कि बी में 1 मिमी है (बी के लिए बी-एफ), कि बी के लिए इनसेट में 1 सेमी, और है कि सी के इनसेट में 5 मिमी है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एक नवजात माउस में Canalostomy. (क) एक पद-auricular चीरा (arrow). (ख) लौकिक हड्डी को कवर मांसपेशियों को उजागर कर रहे हैं, और पीछे semicircular नहर (पीएससी) है ~ pinna (बोल्ड डॉट) की जड़ से 2 मिमी 2-3 बजे (पेंटाग्राम) । अभिविंयास वयस्क चूहों (चित्रा बी) में है कि समान है । (ग) पीएससी और पार्श्व semicircular नहर (LSC) (डॉटेड रेखाएँ) सामने आ रही हैं. (घ) पीएससी में एक छोटा-सा उद्घाटन किया जाता है. (ङ) प्रवेशनी को पीएससी में सम्मिलित किया जाता है. (च) पेशी का एक छोटा सा टुकड़ा इंजेक्शन के बाद खोलने को कवर करने के लिए प्रयोग किया जाता है । A और b इनसेट में स्केल बार्स 5 मिमी है, कि बी में 1 मिमी है, और है कि सी में 1 मिमी (सी के लिए सी-एफ) है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: वयस्क के भीतरी कानों के स्टीरियो माइक्रोस्कोपी छवियों (एक-एक ') और नवजात चूहों (बी बी ') canalostomy के माध्यम से फास्ट-ग्रीन डाई प्रशासित. सर्जरी के तुरंत बाद नमूने एकत्र किए गए । (A और B) extracranial सतह । (A ' और B ') intracranial सतह । फास्ट-ग्रीन डाई कोक्लीअ, बरोठा, और semicircular नहरों भर में वितरित करता है । स्केल सलाखों 1 मिमी (ए ' के लिए एक ' और बी के लिए बी ' बी ') हैं । पीएससी, पीछे semicircular नहर । LSC, पार्श्व semicircular नहर । एसएससी, सुपीरियर semicircular नहर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: कोक्लीअ के पूरे माउंट के प्रतिनिधि फोकल छवियों (एक-एक ") और utricle (बी बी") वयस्क चूहों की, तैयार 30 दिनों के बाद AAV8-GFP इंजेक्शन के माध्यम से canalostomy. नमूनों GFP (हरा) और मायोसिन VIIa (लाल) के लिए एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं । (a-a ") GFP अधिकांश भीतरी बाल कोशिकाओं (आइएचसी) में व्यक्त किया जाता है । (b-b ") utricle के cuticular प्लेट के फोकल विमान में, कई बाल कोशिकाओं एक्सप्रेस GFP (तीर) । GFP, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन । OHC, बाहरी बाल कोशिकाओं । स्केल पट्टियां 25 µm (a "के लिए a-a", b "b-b") होती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: एक आघात utricle के प्रतिनिधि फोकल छवियों AAV8-GFP इंजेक्शन के माध्यम से canalostomy के बाद 30 दिनों प्राप्त की । एक वयस्क माउस पार्श्व semicircular नहर के माध्यम streptomycin के साथ इंजेक्शन और 7 दिनों बाद AAV8 के साथ इंजेक्शन था-पीछे semicircular नहर के माध्यम से GFP । GFP (हरा), मायोसिन VIIa (लाल), और actin (नीला) । ऐरोहेड AAV8-GFP (GFP +/myosin VIIa-कोशिकाओं) के साथ प्रतिनिधि सहायक कोशिकाओं transduced इंगित करते हैं, और तीर transduced के साथ प्रतिनिधि बाल कोशिकाओं AAV8-GFP (GFP +/myosin VIIa + कोशिकाओं) अपरिपक्व बालों के बंडलों के साथ संकेत मिलता है । स्केल बार 20 µm (डी के लिए ए डी) है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस अध्ययन में, हमें पता चला कि canalostomy द्वारा दवा वितरण कोक्लीअ और vestibular अंत अंगों भर में रिएजेंट के व्यापक वितरण के परिणामस्वरूप । एक भीतरी कान जीन वितरण पद्धति के रूप में, canalostomy सुनवाई और vestibular समारोह के लिए ंयूनतम क्षति के साथ वयस्क और नवजात चूहों के भीतरी कानों में GFP अभिव्यक्ति में हुई । इसके अलावा, कई इंजेक्शन आसानी से एक ही जानवर में प्रदर्शन किया जा सकता है ।

canalostomy की सबसे बड़ी ताकत में से एक यह है कि यह भीतरी कान समारोह के लिए ंयूनतम क्षति का कारण बनता है, विशेष रूप से वयस्क चूहों में16,18,28,29,30है, जो के लिए महत्वपूर्ण है सुरक्षात्मक प्रभावों का आकलन और शोधों के पहलुओं के लिए । कई समूहों canalostomy का इस्तेमाल किया है जैसे वायरल वैक्टर, सिरना, स्टेम सेल, और aminoglycoside, के रूप में विभिंन एजेंट देने के लिए murine भीतरी कान में18,19,28,29, ३४,३५,३६,३७. वर्तमान अध्ययन में, हम कदम दर कदम, वयस्क और नवजात चूहों में canalostomy की विस्तृत शल्य चिकित्सा तकनीक का वर्णन किया । पिछले अध्ययनों की तुलना में, हमारे अध्ययन semicircular नहरों, जो सफल सर्जरी के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है की स्थिति पर अतिरिक्त विवरण प्रदान करता है । के रूप में चित्रा 2 बी और सी में दिखाया गया है , पीएससी और LSC आम तौर पर स्थित थे ~ 3 मिमी pinna के रूट से 2-3 बजे । LSC calvarium के समानांतर विमान से एक लगभग 30 ° कोण पर था, और पीएससी LSC करने के लिए खड़ी थी । इसके अलावा, हम शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं को सरलीकृत और लगभग 25 मिनट की तुलनीय परिणाम के साथ के लिए शल्य समय छोटा29।

canalostomy के दौरान इंजेक्शन साइट और प्रवेशनी की रुकावट पर रिसाव से बचने के लिए यह अनिवार्य है । पंप पर स्विचन से पहले, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि प्रवेशनी की नोक semicircular नहर में डाला जाता है और है कि प्रवेशनी तुला या अवरुद्ध नहीं है । शुष्क मांसपेशी इस्तेमाल किया जा करने के लिए सिफारिश की है जब वयस्क चूहों के semicircular नहर में छेद सील क्योंकि, semicircular नहर द्रव की उपस्थिति में, यह फैलता है और छेद प्लग (२.६ कदम और २.१० देखें) । क्योंकि नवजात चूहों के semicircular नहर की दीवार नरम और नाजुक है, खोलने autogenous मांसपेशी या चिकित्सा गोंद30के साथ कवर द्वारा बंद किया जाना चाहिए । हम भी पेशी के साथ खोलने को कवर किए बिना प्रवेशनी हटा दिया; परिणाम भीतरी कान में तुलनीय AAV transduction क्षमता का पता चला (डेटा नहीं दिखाया गया), यह दर्शाता है कि नवजात चूहों के पीएससी में खुलने की ड्यूटियां बंद कर दी गई थी ।

canalostomy का एक और लाभ एकाधिक प्रक्रियाओं की व्यवहार्यता है, जो एक ही या अलग रिएजेंट (चित्रा 6) के दोहराव अनुप्रयोगों में सक्षम बनाता है । क्योंकि fibrotic और दानेदार ऊतकों अक्सर पिछले शल्य साइटों पर पाए जाते हैं, और semicircular नहर सर्जरी के बाद बाधित हो सकता है३४, यह पार्श्व के एक अलग क्षेत्र में दोहराया सर्जरी के दौरान इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है और/या पीछे semicircular नहरों18।

canalostomy की मुख्य सीमा है कि इंजेक्शन प्रवेशनी perilymphatic या endolymphatic अंतरिक्ष में डाला जाता है निर्धारित करने में कठिनाई है । canalostomy के माध्यम से भीतरी कान में adenoviral वैक्टर के प्रशासन के बाद16 , सबसे transduced कोशिकाओं perilymphatic अंतरिक्ष में स्थित थे, सुझाव है कि इंजेक्शन की संभावना है कि क्षेत्र में प्रदर्शन किया गया था । कम आणविक वजन यौगिकों (जैसे, AAV, streptomycin, और सिरना) perilymph और endolymph के बीच बाधा के माध्यम से पारित कर सकते हैं और perilymphatic या endolymphatic अंतरिक्ष में इंजेक्शन के बाद संवेदी उपकला तक पहुँचने18,19 ,३४. हालांकि, perilymph में इंजेक्शन के बाद, एजेंट perilymphatic स्थान में रह सकता है यदि वे perilymph और endolymph16,३९,४०के बीच बाधा घुसना नहीं कर सकता । इसलिए, canalostomy का उपयोग करने से पहले इंजेक्ट किए गए एजेंट की पारगम्यता पर विचार किया जाना चाहिए.

अंत में, canalostomy कोक्लीअ में रिएजेंट के एक व्यापक वितरण में परिणाम और सुनवाई और vestibular समारोह के ंयूनतम अशांति के साथ बरोठा । सर्जरी आसानी से वयस्क और नवजात चूहों में लागू किया जाता है, और यदि आवश्यक हो तो कई प्रक्रियाओं प्रदर्शन किया जा सकता है । Canalostomy इस प्रकार एक प्रभावी और सुरक्षित दृष्टिकोण के भीतरी कान में कुतर और मई, भविष्य में, मानव cochleovestibular रोगों के इलाज के लिए चिकित्सकीय इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

हितों का कोई टकराव घोषित नहीं किया जाता.

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ऑफ चाइना (ग्रांट नंबर ८१५७०९१२, ८१७७१०१६, ८११००७१७) ने समर्थन दिया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polymide Tubing A-M Systems 823400
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/1
10μl Microsyringe Hamilton Company 80001
Xylazine HCL Sigma-Aldrich Co. Llc. X-1251
Operating Miroscope Carl Zeiss Optical LLC. Pico
Micro Forceps Dumont Dumostar 10576
Fast-green Dye Sigma-Aldrich Co. Llc. F7252
AAV8-GFP BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) 20161101 Titer: 2×10e12 vg/mL
Streptomycin Sulfate Sigma-Aldrich Co. Llc. S9137
Microinjection Pump Stoelting Co. 789100S
Electric Pad Pet Fun 11072931136
1 cc Syringe Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) 2011-3151258
Ketamine HCL Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) H35020148
Electric Animal Clipper Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) CP-8000
Cotton Pellet Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) Yu-2008-1640081
Suture Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) Hu-2013-2650207
Eye Ointment Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) H11021270

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