Summary
ここで我々 は聴覚と前庭の機能に最小限のダメージで半規管を介して成人および新生児マウスの内耳への薬剤の局所投与を可能にする canalostomy の手順をについて説明します。このメソッドは、マウス内耳へのウイルスのベクトル、医薬・小分子を接種する使用ことができます。
Abstract
内耳に治療薬の局所投与は、内耳疾患に対する有望な治療法です。半規管 (canalostomy) を注入は、内耳への薬剤の局所投与に有用なアプローチをする示されています。この記事の目的は、について、詳しく説明、成人と新生児の両方のマウスの canalostomy に関与する手技です。蝸牛と前庭のエンドの聴覚に損傷が少なく臓器で注入された試薬の広範な分布を容易に、canalostomy として高速グリーン色素と緑色蛍光タンパク質遺伝子をアデノ随伴ウイルス血清型 8 によって示されると前庭の機能。成人および新生児マウス; 手術が実施されました確かに、必要な場合は、複数の手術を実行でした。結論としては、canalostomy は成人および新生児マウス内耳に薬物送達への効果的かつ安全なアプローチで、将来的に人間の内耳疾患を治療に使用することがあります。
Introduction
難聴と前庭機能障害に影響を与える患者の相当な数を密接に感音難聴内耳障害に関連付けられています。内耳への治療薬の配達は、内耳障害の治療のための約束を示しています。全身またはローカル アプローチは、内耳に薬を提供する使用できます。いくつかの内耳疾患は、突発性難聴、全身ステロイド1と扱われる一般的などの全身性の薬物投与による正常に扱われます。さらに、レンツらはアンチセンス オリゴヌクレオチドの全身投与は難聴を改善し、バランスの Ush1c 突然変異体マウス モデル2で機能することを示した。ただし、内耳疾患の大部分が効果的に扱われません全身投与による内耳の3,4薬へのアクセスを制限する血液迷路障壁のため。対照的に、局所薬物配送戦略は内耳障害をより効率的に扱うことができます。確かに、内耳は潜在的薬剤の局所投与; の理想的なターゲット1 サイトの拡散や注射後薬の普及を促進する液体でみたされている、それは比較的孤立した隣接臓器から副作用5,6を制限します。
局所薬物配送戦略鼓と intralabyrinthine のメソッドがあります。鼓の経路の有効性は大きく薬物透過 RWM3,4,7,8薬の滞留時間と丸い窓膜 (RWM) に依存します。したがって、薬物や、RWM を突き通すことができない試薬の配信に適したはありません。Intralabyrinthine 方法は、薬の高用量との広範な分布の結果、内耳に直接接種を含みます。ただし、intralabyrinthine 方法は繊細な手術を必要とし、侵略的、内耳機能へのダメージに 。現在、人間9で使用するため十分に安全であることは実証されていないと、intralabyrinthine 注射薬は動物実験でのみ使用されます。したがって、手術の手順を簡略化する必要がありますと怪我のリスク低減、クリニックに intralabyrinthine アプローチを翻訳します。
RWM5,10、11 scala メディア12,13,14スカラー座索注入による動物のいくつかの intralabyrinthine アプローチが評価され15,16、スカラー座附17、18,16,2019,半規管、および内リンパ嚢21。それぞれのアプローチには長所と短所6。RWM による配信は、新生児マウス5,22の非外科的です。ただし、軽度の聴力損失は RWM 注入23、中耳手術24後胸水のため後成体マウスで観察されます。感覚上皮を含む内の空間に直接試薬の注入が含まれます、Scala 媒体注入ターゲット エンド臓器12,14,の高い試薬濃度を実現します。25,26。 このアプローチ複雑な手順が必要ですし、生後 5 (P5) よりも後に実行された場合、聴覚閾値の有意な上昇の結果25,は27、そのアプリケーションを制限します。
Canalostomy は特に成体マウス16,18,28,29,30である内側の耳に与えるダメージを最小限を引き起こす intralabyrinthine の上記のアプローチと比較して、保護効果と並進の側面の評価にとって重要です。さらに、齧歯類では半規管は肺嚢胞手術を容易にし、手術中に中耳の障害を回避する以外にあります。クリニック、半規管の手術では、難治性良性発作性頭位めまい症31,32,33, canalostomy の臨床的可能性を示唆しているが使用されます。以来、まず、河本らによって記述されていた。マウス内耳18,19,28,29 にウイルスのベクトル、siRNA、幹細胞は、アミノグリコシド系などの様々 な試薬を提供する16年では、canalostomy が使用されています ,34,35,36,37。Canalostomy によるアデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターの接種感覚上皮における外来遺伝子の過剰発現と蝸牛と前庭エンドの臓器18,28,の一次ニューロンの特性を有効にする29,30。Canalostomy による遺伝子治療を有バランス機能を復元し、人間アッシャー症候群19、その canalostomy が cochleovestibular の遺伝的疾患に対する遺伝子治療の研究に有用のマウスモデルで聴覚を向上させます。Canalostomy による間葉系幹細胞の移植は、蝸牛線維細胞と急性の感音難聴の聴力損失35のラットモデルにおける聴力回復の再編成の結果します。また、前庭神経病変18,34,38, を確立する内耳にアミノグリコシド系抗生物質を導入する canalostomy を使用できます、18を必要な場合、複数の注射を実行できます。,34。
本稿で述べる、成人および新生児マウスにおける canalostomy 技術。緑色蛍光タンパク質 (GFP) 遺伝子 (AAV8-GFP) とストレプトマイシン、高速グリーン色素と AAV 血清型 8 (AAV8) などを含むさまざまな試薬を接種したマウス内耳 canalostomy 後即時および長期的な成果を評価するために。
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Protocol
動物愛護と中国の首都医科大学の利用委員会のガイドラインによるとすべてのプロシージャと動物の手術を行った。
1. デバイスの準備
- 注入カニューレ (図 1 a) をするためには、ポリイミド チューブを接続 (内径 114.3 μ m、外径 139.7 μ m、長さ 3 ~ cm) ポリエチレン チューブに (内径 280 μ m、外径 640 μ m、長さ ~ 40 cm)。瞬間接着剤を使用して、少なくとも 3 つのアプリケーションとの接続をシールします。酸化エチレンと注入カニューレを消毒します。
注: 管を密閉する際は、ポリイミド チューブ、カニューレの閉塞になることができますを入力してから瞬間接着剤を防止します。ガス滅菌は、接続時の漏洩を引き起こす可能性があります少なくとも 3 回でチューブをシールします。 - 30 G の針を使用して、食塩を含む 1 cc シリンジにポリエチレン管の端を接続します。通常生理食塩水で漏洩またはポリエチレン チューブ、ポリイミド チューブと接続で閉塞をチェックする 1 cc のシリンジでの注入によるカニューレを埋めます。
注: 漏れや接続の閉塞、カニューレが次の手順で使用できません。 - 通常生理食塩水で 10 μ L のマイクロ注射器を避難し、注入カニューレと前述の 30 G 針に接続します。インジェクション ポンプ (図 1 b) にマイクロ シリンジをインストールします。射出速度を 0.5 μ L/分と高速グリーン色素と AAV8-GFP、1 μ L にボリュームまたはストレプトマイシンの 2 μ L を設定します。
注: 射出速度の推奨範囲は 0.1−0.5 μ L/分、および注入量の推奨範囲は 0.5−2 μ L。 - 1 μ L にマイクロ シリンジを引き戻すし、試薬の注入を抽出します。通常の生理食塩水と注射剤 (図 1) の間に空気の隙間が形成されます。
- 必要に応じてマーカーペンを使ってポリエチレン チューブのガス-液境界線の位置にラベルを付けます。これは、注入中に試薬の流れを監視する使用ことができます。
2。 成体マウスの Canalostomy
- 成体マウスの麻酔 (女性、FVB/N、5、6 週齢) ケタミン塩酸 (120 mg/kg 腹腔内投与による、キシラジン塩酸 (7 mg/kg)。動物が痛みを伴う刺激 (つま先ピンチ反射) への応答を示さないまで 5−10 分間待ちます。麻酔後、予熱した電気パッドに動物を配置します。メロキシカム (1 mg/kg)、鎮痛薬は、手術の前に皮下に適用されました。
- 眼軟膏と動物の目をカバーします。電気動物クリッパーと左後耳介領域を剃るし、75% エタノールで 3 回皮膚を消毒します。
- 予熱した電気パッドに動物を配置します。~ 37 ° c. に電気パッドの温度を設定します。左耳の手術を容易にするために右側臥位に動物を配置します。
- 1 1.5 cm 後耳介切開 〜 3 mm 左着けた溝 (図 2 a) を作る。
- 位置決め (PSC) 後半規管、外側半規管 (LSC): PSC と LSC、通常 9 に 3 として原点と、calvarium に平行な平面として耳介 (図 2 bで大胆なドット) のルートを定義するとき〜 3 mm 2 と 3 (図 2 b) 耳介のルートをあります。
- にべもなく PSC と余白がはっきりと側頭骨 (図 2) の暗い縞として見える LSC を公開するマイクロ鉗子で頭骨を覆う筋肉を解剖します。LSC では、calvarium に平行な平面から角度を約 30 ° と PSC は、LSC (図 2) に垂直。マイクロ鉗子で筋肉の小片を収集し、乾燥させてください。次の手順でこの筋肉が穴をシールに使用されます。
注: は、筋肉への損傷を最小限にするために組織の過剰なテアリングを回避します。PSC (図 2 D) を公開するとき隣接する船の損傷を防ぐ。 - 26 G 針 (図 2 D) を使用して PSC の真ん中の部分に小さな穴を作る。穴から液漏れは、PSC の骨の壁の成功浸透を示します。適切なサイズ、ポリイミド チューブの直径よりわずかに大きい穴を拡大します。
注: ドリルし、優しく、徐々 に穴を拡大、PSC の破壊を避けるために。 - 胸水綿ペレットを使用して PSC の穴の周囲をクリーンアップします。
- 1−2 mm (図 2 e) の深さに cru コミューンに向かって PSC に優しくポリイミド チューブの先端を挿入します。ポンプの '実行' ボタンを押して注射を開始します。
- 注入後の拡散試薬 〜 2 分を待ちます。マイクロはさみで 2.6 ステップで収集され筋肉の小さな部分をトリミングします。次に、注入カニューレを削除し、すぐに PSC の穴に筋肉を配置します。
注: は、穴が完全に密封されていることを確認する接続した後穴から漏れる液体を確認します。 - 区切られた筋肉と皮下組織を返します。5-0 縫合糸を使用して切開部を縫合します。ポビドン ヨードと切開の地域を消毒します。
注: 上記すべての手術は、約 25 分かかります。 - ~ 37 ° C に予熱した電気パッド上に動物を配置します。右側臥位の回復のために動物を配置します。
- 聴性脳幹反応 (ABR) の測定を行い、水泳のテスト18手術後 1 週間。
- 必要な場合は、PSC や LSC の別の領域に繰り返し注射を実行します。
3. 新生児マウス Canalostomy
- 低体温症を誘導し、生後 1、2 (P1-2) で新生児マウス (FVB/N) で鎮静を維持に使用してください。~ 4 分の砕いた氷のプラスチックのラップで覆われたベッドの上には、子犬を配置します。次に、氷で満たされたプラットフォームで子犬を置きます。75% エタノールで 3 回手術野を消毒します。
注: は、子犬の頭が氷のことを確認します。氷で満たされたプラットフォームで子犬と全体の手術を行います。 - 次の手順で異なる大人のマウスと比較して新生児の。
- 耳介の折り目に後方から ~ 2 mm 〜 3 mm 耳介後部切開を作る (図 3 a -B)。
- 優しく 26 G 針を使用してソフトの PSC に開口部を作る。開口部を拡大せずに、PSC にカニューレを挿入 (図 3 -E)。
- 注入後、ソフト PSC (図 3 f) の破壊につながることができます、後者として、開口部を接続するのではなく、カバー、筋の部分を使用します。
- 6-0 縫合糸を使って皮膚を閉じます。
- ABR の測定を行い、P3030水泳のテスト。
- 親の共食いは新生児手術後一般的な問題です。次の手順は、親の共食いの可能性を減らします。
- 周囲のアルコール綿を使用して切開手術後血をクリーンアップします。
- 新生児がダムに戻る前に自由に移動できることを確認します。
- 新生児を母親のケージと新生児がゴミの真ん中に戻って配置から汚れた寝具に汚します。
- 似たような耳介後部切開や縫合手術を受けるしないいずれかが表示されます。
- 飼育ケージから男性を分離します。
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Representative Results
高速グリーンの色素は、成人および新生児マウス内耳における即時分布を評価するための PSC に注入されました。手術 (図 4) 直後後、蝸牛、前庭、半規管の中で染料が検出されました。
安全性と内耳遺伝子送達用 canalostomy の効率を評価するには、AAV8 GFP は成人および新生児マウス内耳に注入されました。すべての動物は、通常 ABR 閾値と AAV8 GFP 注入18,30後のテストの点数を水泳を展示しました。Immunohistology は、聴覚の感覚上皮、内有毛細胞 (Ihc) と、いくつか外有毛細胞 (内耳) 堅牢な GFP 発現30を示した基底のターンで、明らかにしました。前庭感覚上皮の卵形嚢、球形嚢、およびロレンチーニ30GFP 発現が検出されました。(図 5) 前庭有毛細胞と支持細胞の高効率18,30増殖型でした。
Canalostomy によるストレプトマイシンの注入は、卵形嚢18,34,38深刻な有毛細胞の損失を誘発します。Canalostomy を介して複数の注射の有効性をテストするには、マウスは PSC を通じて AAV8 GFP を懸濁液で 7 日間を後 LSC を通じてストレプトマイシンを与えられました。この実験は、HC 損失18後破損した内耳の遺伝子治療研究有用と考えられた AAV8 GFP の破壊の卵形嚢での伝達特性を評価するも設計されました。GFP は、破壊の卵形嚢 (図 6) 全体に分散されました。多数の GFP 陽性細胞はミオシン VIIA、彼らが導入されたことを示す陰性 SCs。未熟な毛束をいくつか HCs (ミオシン VIIa 陽性細胞) は、GFP を表明しました。
図 1: デバイスの準備。(A)ポリイミド チューブ (i) と (ii) ポリエチレン チューブを作るために、注入カニューレ (iii) 密封します。(B)カニューレは 30 G 針と 10 μ L マイクロ注射器に接続し、ポンプのインストールします。矢印は、カニューレの先端を示しています。(C)注入試薬、生理食塩水入り空気ギャップで区切られます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: アダルト マウスで Canalostomy。(A)後耳介切開 (矢印)。(B)側頭骨を覆う筋肉が公開されます。原点と平面として耳介 (大胆なドット) のルートを定義し、後半規管 (PSC) 3/9 としての並列、calvarium する時、外側半規管 (LSC) 2 と 3 (五芒星) の間の領域であります。、原点から 〜 3 mm。方向の挿入: 低倍率画像。点線は、calvarium 面を示します。(C) 、PSC、LSC が露出 (点線) です。Inset: LSC は、calvarium に平行な平面から角度を約 30 ° と PSC は、LSC に垂直。(D)小さな穴は、PSC で行われます。(PSC に E) カニューレの先端を挿入し、その試薬を注入します。(F)穴は筋肉の小片と密封されます。A スケール バーは 5 mm、B で 1 mm (B f B)、B にはめ込み式では 1 cm で、C にはめ込み、5 ミリメートルこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 3: 新生児マウス Canalostomy.(A)後耳介切開 (矢印)。(B)は側頭骨を覆う筋肉は公開されて、後半規管 (PSC) は 2-3 (五芒星) で耳介 (大胆なドット) のルートから ~ 2 mm。向きは、成体マウス (図 2 b) と同じです。(C) 、PSC、外側半規管 (LSC) が公開されている (点線) です。(D)小さな開口部は、PSC で行われます。(E) カニューレは、PSC に挿入されます。(F)注入後に開口部をカバーする筋の小片を使用します。A のバーと B インセットが B で 1 ミリメートル、5 ミリメートル C は 1 mm (C C f) をスケールします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 大人の内側の耳のステレオ顕微鏡画像 (-') と新生児マウス (B B') canalostomy を介して高速グリーン色素を投与した。手術後すぐに採取しました。(A と B)頭蓋外表面。(A' と B')頭蓋表面。高速グリーンの色素は、蝸牛、前庭、半規管の中で配布しています。スケール バーは、1 mm (A' の A A 'と B' B b')。PSC は、後半規管。LSC、外側半規管。SSC は、優れた半規管。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 蝸牛 (A") と成体マウスの卵形嚢 (B」) の全体のマウントの代表的な共焦点画像準備 canalostomy AAV8 GFP 注入後 30 日.サンプルと汚れる抗体 (緑) GFP とミオシン VIIa (赤)。(A")GFP は、最も内側の有毛細胞 (IHC) で表されます。(B」)卵形嚢のクチクラ プレートの焦点の面では、数多くの有毛細胞は GFP (矢印) を表現します。緑色蛍光タンパク質 GFP。OHC、外有毛細胞。スケール バーは 25 μ m (A"の A A」、B「B」の).この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: トラウマの卵形嚢の代表的な共焦点画像 canalostomy AAV8 GFP 注入後 30 日を取得します。大人のマウスは外側半規管、後半規管を介して AAV8 GFP を注入後の 7 日間でストレプトマイシンを注射されました。GFP (緑)、ミオシン VIIa (赤)、およびアクチン (青)。AAV8 GFP 導入した代表的な支持細胞を示す矢印 (GFP + ミオシン VIIa 細胞)、矢印を示す代表的な有毛細胞に AAV8 GFP 導入と (GFP + ミオシン VIIa + 細胞) 未熟な毛束と。スケール バーは、20 μ m (A ~ D の D)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本研究で我々 は canalostomy による薬物が蝸牛と前庭エンドの臓器全体で試薬の広範な分布の結果を示した。内耳遺伝子配達方法として canalostomy は、聴覚と前庭の機能に最小限のダメージで成人と新生児マウスの内側の耳の GFP 発現をもたらした。さらに、同じ動物の複数の注射を簡単に実行できます。
Canalostomy の最大の強みの 1 つは、成体マウス16,18,28,29,30のために重要である、特に内耳機能に与えるダメージを最小限を引き起こすということです、保護効果の評価については並進。いくつかのグループは、マウス内耳18,19,28,29にウイルスのベクトル、siRNA、幹細胞は、アミノグリコシド系などの様々 な試薬を提供するのに canalostomy を使用しています。 34,35,36,37。現在の研究では、成人および新生児マウスにおける canalostomy の手順を追って、詳細な手術手技について説明しました。前の調査と比較して、我々 の研究は、手術の成功のキーの手順である半規管の位置の追加詳細をします。図 2 bとCに示すように、PSC と LSC は 2-3 で耳介のルートから一般に 〜 3 mm でした。LSC は昨日、約 30 °、calvarium に平行な平面から角度し、PSC は、LSC に垂直。さらに、手術の手順を簡略化し、同等の結果29と約 25 分に手術時間を短縮します。
Canalostomy、中に、注射部位とカニューレの閉塞で漏れを避けるために不可欠です。ポンプに切り替え、前に、カニューレの先端が半規管に挿入されていると、カニューレの曲げまたはブロックされていないことを確認することが重要です。乾燥筋肉お勧めしますので、拡張し、プラグ穴半規管液の存在下で成体の半規管の穴をシールする際 (2.6 と 2.10 の手順を参照してください)。新生仔マウスの半規管の壁が柔らかく、壊れやすい、開口部をシールで覆って自家筋または医療接着剤30。我々 はまた筋肉; と開口部をカバーすることがなくカニューレを削除結果明らかに匹敵する AAV 伝達効率 (データは示されていない)、内耳には、新生仔マウスの PSC の開口部が十分に閉じられたことを示します。
Canalostomy の別の利点は、同じまたは別の試薬 (図 6) の反復的なアプリケーションを可能にする、複数のプロシージャの可能性です。線維化と肉芽組織は頻繁に以前の手術のサイトで見られると手術34後半規管が阻害されることがあります、横方向の別の領域に繰り返し手術中に注射を実行するお勧めおよび/または後部の半円形運河18。
Canalostomy の主な制限は、タイトジャンクショや内リンパ腔注入カニューレを挿入するかどうかを決定するの困難です。Canalostomy を介して内耳16にアデノ ウイルスのベクトルの投与後最も導入された細胞はタイトジャンクショ スペース、注射は、その領域で実行可能性がありますが示唆されたに位置していた。低分子量化合物 (例えば、AAV、ストレプトマイシン、siRNA) することができます外リンパと内リンパとの間の障壁を通過し、タイトジャンクショまたは内スペースの18,19 注入後感覚上皮に到達 ,34。ただし、外リンパへの注入後、外リンパと内リンパの16,,3940間の障壁を突き通すことができない場合、試薬はタイトジャンクショ空間に残ることがあります。したがって、canalostomy を使用する前に挿入された試薬の透過性を見なす必要があります。
結論としては、canalostomy は、聴覚と前庭の機能の影響を最小限と蝸牛と前庭の試薬の広範な分布の結果します。手術は成人と新生児マウスで簡単に実装し、必要に応じて、複数のプロシージャを実行することができます。Canalostomy 齧歯動物の内耳への薬剤投与の有効で安全なアプローチは、将来、人間 cochleovestibular 疾患を治療するために臨床的に使用される可能性があります、.
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
この作品は、中国の国家自然科学基金 (許可番号 81570912、81771016、81100717) によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polymide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | |
| 10μl Microsyringe | Hamilton Company | 80001 | |
| Xylazine HCL | Sigma-Aldrich Co. Llc. | X-1251 | |
| Operating Miroscope | Carl Zeiss Optical LLC. | Pico | |
| Micro Forceps | Dumont Dumostar | 10576 | |
| Fast-green Dye | Sigma-Aldrich Co. Llc. | F7252 | |
| AAV8-GFP | BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) | 20161101 | Titer: 2×10e12 vg/mL |
| Streptomycin Sulfate | Sigma-Aldrich Co. Llc. | S9137 | |
| Microinjection Pump | Stoelting Co. | 789100S | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| 1 cc Syringe | Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) | 2011-3151258 | |
| Ketamine HCL | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) | H35020148 | |
| Electric Animal Clipper | Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) | CP-8000 | |
| Cotton Pellet | Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) | Yu-2008-1640081 | |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) | Hu-2013-2650207 | |
| Eye Ointment | Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) | H11021270 |
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