Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Canalostomy som en kirurgisk tilnærming til lokale stoffet levering indre ører voksne og Neonatal mus

Published: May 25, 2018 doi: 10.3791/57351
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Shanghai First People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University

Summary

Her beskriver vi canalostomy prosedyren som gir lokale stoffet levering indre ører voksne og neonatal musene gjennom halvsirkelformet kanalen med minimal skade til høring og vestibular funksjon. Denne metoden kan brukes til å vaksinere viral vektorer, farmasi og små molekyler i musen indre øret.

Abstract

Lokal leveranse av terapeutiske narkotika i det indre øret er en lovende terapi for indre øret sykdommer. Injeksjon gjennom halvsirkelformede kanalene (canalostomy) har vist seg å være en nyttig tilnærming til lokale narkotika-leveranser til det indre øret. Målet med denne artikkelen er å beskrive i detalj, kirurgiske teknikker involvert i canalostomy i både voksne og neonatal mus. Som indikert av fast-grønn farge og adeno-assosiert virus serotype 8 med grønne fluorescerende protein genet, canalostomy tilrettelagt bred distribusjon av injisert reagenser i cochlea og vestibular slutten-organer med minimal skade hørselen og Vestibular funksjon. Operasjonen ble implementert i både voksne og neonatal mus; flere operasjoner kan faktisk utføres hvis nødvendig. I konklusjonen, canalostomy er en effektiv og sikker tilnærming til narkotika-leveranser indre ører voksne og neonatal mus og kan brukes til å behandle menneskelige indre øret sykdommer i fremtiden.

Introduction

Sensorineural hørselen tap og vestibular dysfunksjon påvirker et betydelig antall pasienter og er nært knyttet til indre øret lidelser. Leveringen av terapeutiske narkotika inn i det indre øret viser løftet for behandling av indre øret lidelser. En systemisk eller lokale tilnærming kan brukes til å levere narkotika i det indre øret. Noen indre øret sykdommer er behandlet med systemisk narkotika administrasjonen, som idiopatisk plutselig hørselstap, som er vanligvis behandlet med systemisk steroid1. I tillegg viste Lentz et al. at systemisk administrasjon av antisense oligonucleotide klarte å forbedre hørselen og balansere funksjoner i Ush1c mutant mus modell2. Men en stor del av indre øret sykdommer ikke effektivt behandles av systemisk narkotika administrasjon på grunn av blod-labyrint barriere, som begrenser narkotika tilgang til indre øret3,4. I kontrast, kan lokale stoffet levering strategier behandle indre øret lidelser mer effektivt. Faktisk er det indre øret potensielt en ideal mål for lokale stoffet levering; Det er fylt med væske, som forenkler formidling av stoffet etter ett område diffusjon eller injeksjon, og det er relativt isolert fra nærliggende organer, som begrenser bivirkninger5,6.

Lokal levering narkotikastrategier inkluderer intratympanic og intralabyrinthine. Effektiviteten av intratympanic ruten er i stor grad avhengig av narkotika permeabilitet gjennom runde vinduet membranen (RWM) og oppholdstiden stoffet på RWM3,4,7,8. Således, det er ikke egnet for levering av narkotika eller reagensene som ikke kan trenge gjennom RWM. Intralabyrinthine metoder omfatter vaksinasjon av narkotika direkte inn i det indre øret, som resulterer i en høy dose og alminnelig utbredt distribusjon. Men intralabyrinthine metoder krever delikate operasjoner og er invasiv, fører til skade indre øret-funksjonen. Foreløpig brukes intralabyrinthine injeksjon av narkotika bare i dyrestudier som det ikke er blitt påvist for å være tilstrekkelig sikker for bruk i mennesker9. Derfor kirurgiske prosedyrer må være forenklet, og risikoen for skader redusert oversette intralabyrinthine tilnærminger i klinikken.

Flere intralabyrinthine tilnærminger har vurdert i dyr ved injeksjon gjennom RWM5,10,11 og inn i scala media12,13,14, scala Pauker 15 , 16, scala vestibylen17, halvsirkelformet kanaler16,18,19,20og endolymphatic sac21. Hver av disse metodene har fordeler og ulemper6. Levering gjennom RWM er atraumatiske i neonatal mus5,22. Men er en mild hørselstap observert i voksen mus etter RWM injeksjon23, muligens på grunn av mellomøret effusjon etter kirurgi24. Scala media injeksjon, noe som innebærer injeksjon av reagensen direkte inn i endolymphatic rommet inneholder sensoriske epitel, oppnår en høy reagens konsentrasjon i målet slutten-organer12,14, 25 , 26. men dette krever en komplisert prosedyre og resulterer i betydelig heving av hørselen terskel hvis utført senere enn postnatal dag 5 (P5)25,27, som begrenser anvendelsen.

Sammenlignet med de ovennevnte intralabyrinthine tilnærmingene, forårsaker canalostomy minimal skade det indre øret, spesielt i voksen mus16,18,28,29,30, som er viktig for vurdering av beskyttende effekter og translasjonsforskning aspekter. Videre i gnagere ligger halvsirkelformede kanaler utenfor bulla, som forenkler kirurgiske prosedyrer og unngår forstyrrelser av mellomøret under operasjonen. I klinikken brukes halvsirkelformet kanalen operasjoner for intractable godartet paroxysmal posisjonelle vertigo31,32,33, tyder klinisk muligheten for canalostomy. Siden den først ble beskrevet av Kawamoto et al. 16 i 2001 canalostomy er brukt til å levere ulike reagenser, som viral vektorer, siRNA, stamceller og aminoglycoside, i de murine indre øre18,19,28,29 ,34,35,36,37. Vaksinering av adeno-assosiert virus (AAV) vektorer av canalostomy aktiverer overuttrykte eksogene gener i Sensorisk epitel og primære neurons sneglehuset og vestibular slutten-organer18,28, 29,30. Whirlin gene terapi av canalostomy gjenoppretter balanse funksjonen og forbedrer høring i en musemodell av menneskelig Usher syndrom19, antyder at canalostomy er nyttig for studier av genterapi for genetiske cochleovestibular sykdommer. Transplantasjon av stamceller ved canalostomy resulterer i reorganiseringen av cochlea fibrocytes og høre gjenoppretting i en rotte modell av akutt sensorineural hørselen tap35. I tillegg canalostomy kan brukes til å introdusere aminoglycosides i det indre øret å etablere vestibular lesjoner18,34,38, og flere injeksjoner kan utføres ved behov18 , 34.

I denne artikkel beskriver vi, i detalj, canalostomy teknikker i voksne og neonatal mus. Vi inokulert ulike reagenser, inkludert fast-grønn farge og AAV serotype 8 (AAV8), sammen med grønne fluorescerende protein (GFP) genet (AAV8-GFP) og streptomycin, inn i musen indre øret å evaluere de umiddelbare og langsiktige resultatene etter canalostomy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer og dyr operasjoner ble utført i henhold til retningslinjene i Animal Care og bruk komité i hovedstaden Medical University of China.

1. enheten forberedelser

  1. For å gjøre injeksjon kanyle (figur 1A), koble polyimid (pi) rør (indre diameter 114.3 µm, ytre diameter 139,7 µm, lengde ~ 3 cm) til polyetylen rør (indre diameter 280 µm, ytre diameter 640 µm, lengde ~ 40 cm). Med superglue, sel forbindelse med minst tre programmer. Sterilisere injeksjon kanyle med etylenoksid.
    Merk: Når tetting slangen, hindre superglue å polyimid (pi) slangen, som kan resultere i en blokkering av kanyle. Forsegle slangen på minst tre ganger, fordi gass sterilisering kan føre til lekkasje på tilkoblingen.
  2. Bruker en 30 G nål, koble slutten av polyetylen slangen til en 1 cc syringe med vanlig saltvann. Fyll kanyle med vanlig saltvann ved injeksjon med 1-cc sprøyten kontrollere for lekkasje eller blokkering på forbindelsen mellom polyimid (pi) rør og polyetylen rør.
    Merk: Hvis det er en lekkasje eller blokkering av forbindelsen, kanyle kan ikke brukes i følgende prosedyrer.
  3. Evakuere 10 µL mikro-sprøyter med vanlig saltvann og koble den til nevnte 30 G nålen med injeksjon kanyle. Installere mikro-sprøyten på en microinjection pumpe (figur 1B). Angi injeksjon hastigheten til 0,5 µL/min og volum til 1 µL for rask-grønn farge og AAV8-GFP eller 2 µL for streptomycin.
    Merk: Anbefalt område for injeksjon hastighet er 0.1−0.5 µL/min anbefalte injeksjon volum er 0.5−2 µL.
  4. Trekk tilbake mikro-sprøyten til 1 µL og ekstra injeksjon reagensen. En luftspalte vil danne mellom normal saline og injisert reagensen (figur 1 c).
  5. Eventuelt merke plasseringen av gass-væske grensen på polyetylen slangen bruke markør penn. Dette kan brukes til å overvåke reagens flyt under injeksjon.

2. Canalostomy i voksen mus

  1. Bedøve en voksen mus (kvinnelige FVB/N, 5 til 6 uker gamle) ved intraperitoneal injeksjon av ketamin HCl (120 mg/kg) og xylazine HCl (7 mg/kg). Vent i 5−10 min til dyret har ingen respons på smertefulle stimuli (toe-klype refleks). Plassere dyret på en forvarmet elektrisk pute etter anestesi. En analgesic, har meloksikam (1 mg/kg), ble brukt subcutaneously før operasjonen.
  2. Dekk dyrets øyne med øye ointment. Barbere venstre etter auricular regionen med en elektrisk dyr avklipt og rense huden tre ganger med 75% etanol.
  3. Plassere dyret på en forvarmet elektrisk pad. Still inn temperaturen av elektrisk puten til ~ 37° C. Plassere dyret i helt sideleie å lette kirurgi på venstre øre.
  4. Lage en 1-1,5 cm etter auricular snitt ~ 3 mm fra venstre retroauricular sporet (figur 2A).
  5. Posisjonering bakre halvsirkelformet kanalen (PSC) og lateral halvsirkelformet kanalen (Lexmarks Løsningssenter): Når roten av høydepunkt (fet prikken i figur 2B) er definert som opprinnelsen og flyet parallelt med calvarium som 3 til 9 o'clock, PSCEN og Lexmarks Løsningssenter er vanligvis ligger ~ 3 mm fra roten av høydepunkt mellom 2-3 (figur 2B).
  6. Rett ut dissekere muskelen dekker temporal bein med mikro-tang til å avsløre PSC og Lexmarks Løsningssenter, der marginene er klart synlig som mørke striper i temporal benet (figur 2C). Lexmarks Løsningssenter er en ca 30° vinkel fra fly parallelt med calvarium og PSCEN er loddrett Lexmarks Løsningssenter (figur 2C). Samle en liten bit av muskel med mikro-tang og la det tørke. I følgende trinn, vil denne muskelen brukes til å tette hullet.
    Merk: Unngå overdreven rive av vev å minimere skade på musklene. Unngå ødeleggende tilstøtende fartøyet når utsette PSCEN (figur 2D).
  7. Lage et lite hull i den midtre delen av PSCEN bruker en 26 G nål (figur 2D). Væske lekkasje gjennom hullet angir suksessfulle penetrasjon av benete veggen av PSCEN. Forstørre hullet til en passende størrelse, litt større enn diameteren på polyimid (pi) slangen.
    Merk: Bore og forstørre hullet gradvis og forsiktig å unngå brudd i PSCEN.
  8. Rengjør effusjon rundt åpningen på PSCEN med bomull pellets.
  9. Sett tuppen av polyimid (pi) slangen forsiktig inn PSCEN mot crus kommunen til en dybde 1−2 mm (figur 2E). Start injeksjon ved å trykke på "Kjør"-knappen på pumpen.
  10. Etter injeksjon, vente ~ 2 minutter å tillate reagensen å spre. Trim lite stykke muskel samlet i trinn 2.6 med mikro-saks. Deretter fjerne injeksjon kanyle og umiddelbart plassere muskelen i hullet i PSCEN.
    Merk: Se etter noe væske lekker fra hullet etter koble for å sikre at hullet er fullstendig forseglet.
  11. Returner den separerte muskler og subkutant vev. Sutur av såret med en 5-0 Sutur. Desinfiser regionen snitt med povidon jod.
    Merk: Alle de ovennevnte kirurgiske prosedyrene ta ca 25 min.
  12. Plassere dyret på en elektrisk pad forvarmet til ~ 37 ° C. Plassere dyret i den helt sideleie for utvinning.
  13. Utføre auditiv hjernestammen svar (ABR) målinger og svømming tester en uke etter kirurgi18.
  14. Om nødvendig kan du utføre gjentatte injeksjoner i et annet område av PSC eller Lexmarks Løsningssenter.

3. Canalostomy i Neonatal mus

  1. Bruk nedkjøling å indusere og opprettholde sedasjon i neonatal mus (FVB/N) postnatal dager 1 til 2 (P1-2). Plass pup på en plast-wrap-dekket seng knust is for ~ 4 min. Deretter lå pup på en is-fylt plattform. Desinfiser kirurgiske feltet tre ganger med 75% etanol.
    Merk: Kontroller at leder av pup er av isen. Utføre hele operasjonen med programmet på en is-fylt plattform.
  2. Følgende forskjellige neonate forhold til voksen mus.
    1. Gjøre en ~ 3 mm postauricular snitt fra ~ 2 mm bakenfor auricular Press (figur 3A -B).
    2. Forsiktig gjør en åpning i myk PSCEN bruker en 26 G nål. Sett kanyle inn PSCEN uten forstørre åpningen (Figur 3 c -E).
    3. Etter injeksjon, bruke muskel å dekke, snarere enn plugg, åpningen som sistnevnte kan føre til brudd i myk PSCEN (figur 3F).
    4. Lukk huden med en 6-0 Sutur.
    5. Utføre ABR målinger og svømming tester P3030.
  3. Foreldrekontroll kannibalisme er et vanlig problem etter neonatal kirurgi. Følgende redusere sannsynligheten for foreldre kannibalisme.
    1. Rydde opp i blodet rundt innsnitt med alkohol wipes etter operasjonen.
    2. Kontroller at neonate kan bevege seg fritt før tilbake til demningen.
    3. Smøre nyfødte med skitne sengetøy fra mors bur og sted nyfødte tilbake i kullet.
    4. Noen som ikke gjennomgår kirurgi bør få en lignende postauricular snitt og Sutur.
    5. Skille mannlige fra avl buret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fast-grønn farge ble sprøytet inn PSCEN voksen og neonatal mus å evaluere umiddelbar distribusjon i det indre øret. Fargestoff ble oppdaget i sneglehuset, vestibylen og halvsirkelformede kanalene umiddelbart etter kirurgi (Figur 4).

For å vurdere sikkerheten og effektiviteten av canalostomy for indre øret gen levering, ble AAV8-GFP injisert i det indre øret voksen og neonatal mus. Alle dyr utstilt normal ABR terskler og svømming test score etter AAV8-GFP injeksjon18,30. Immunohistology avdekket at i auditiv sensoriske epitel, indre hår cellene (IHCs) og noen ytre hår (OHCs) ved basale viste robust GFP uttrykk30. I vestibulærsystemet sensoriske epitel, ble GFP uttrykk oppdaget i utricle, saccule og ampullae30. Både vestibular hår cellene (figur 5) og støtte var transduced med høy effektivitet18,30.

Infusjon av streptomycin av canalostomy induserer alvorlig hår celle tap i utricle18,34,38. For å teste muligheten for flere injeksjoner via canalostomy, fikk mus streptomycin gjennom Lexmarks Løsningssenter fulgte 7 dager senere av AAV8-GFP suspensjoner gjennom PSCEN. Dette eksperimentet ble designet for å evaluere signaltransduksjon egenskapene til AAV8-GFP i den lesioned utricle, som var nyttig for gene terapi studier i skadet indre øret etter HC tap18. GFP ble distribuert gjennom de lesioned utricle (figur 6). Mange GFP-positive celler var negativ for myosin VIIA, som indikerer at de var transduced SCs. Noen HCs (myosin VIIa-positive celler) med umodne hår bunter også uttrykt GFP.

Figure 1
Figur 1: enhet forberedelse. (A) polyimid (pi) slangen (i) og polyetylen rør (ii) er forseglet for å gjøre en injeksjon kanyle (iii). (B) i kanyle er koblet til en 10-µL mikro-sprøyte med en 30 G nål og deretter installeres på en pumpe. Pilen viser kanyle spissen. (C) injeksjon reagens og normal saline er atskilt med en luftspalte. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Canalostomy i en voksen mus. (A) en post auricular snitt (pil). (B) muskler dekker temporal benet er utsatt. Hvis vi definerer roten av høydepunkt (fet dot) som opprinnelsen og flyet parallell til calvarium som 3/9 o'clock, bakre halvsirkelformet kanalen (PSC) og lateral halvsirkelformet kanalen (Lexmarks Løsningssenter) vanligvis ligger i området mellom 2-3 (pentagram) , ~ 3 mm fra opprinnelse. Innfelt: lavere forstørrelse bilde av retningen. Den stiplede linjen angir calvarium flyet. (C) The PSC og Lexmarks Løsningssenter er eksponert (prikkede linjer). Innfelt: Lexmarks Løsningssenter er en ca 30° vinkel fra fly parallelt med calvarium og PSCEN er loddrett Lexmarks Løsningssenter. (D) et lite hull er laget i PSCEN. (E) spissen av kanyle inn i PSCEN og reagens injiseres. (F) hullet er forseglet med et lite stykke muskel. Skala i A er 5 mm, som i B 1 mm (B til B-F), som i rammemargen b er 1 cm, og som i rammemargen c er 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Canalostomy i en neonatal mus. (A) en post auricular snitt (pil). (B) muskler dekker temporal benet er utsatt, og bakre halvsirkelformet kanalen (PSC) er ~ 2 mm fra roten av høydepunkt (fet dot) på 2-3: 00 (pentagram). Retningen er identisk i voksen mus (figur 2B). (C) The PSC og lateral halvsirkelformet kanalen (Lexmarks Løsningssenter) er eksponert (prikkede linjer). (D) en liten åpning er laget i PSCEN. (E) kanyle settes inn i PSCEN. (F) en liten bit av muskel brukes til å dekke åpningen etter injeksjon. Skalere barer i A og B innfelt er 5 mm, det i B er 1 mm, og C er 1 mm (C til C-F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Stereo mikroskopiske bilder av de indre voksen (AA ') og neonatal mus (B-B') administrerte fast-grønn farge via canalostomy. Prøvene ble samlet umiddelbart etter operasjonen. (A og B) Extracranial overflaten. (A' og B') Intrakranielt overflaten. Fast-grønn farge distribuerer i sneglehuset, vestibylen og halvsirkelformede kanaler. Skala barer er 1 mm (A' for AA 'og B' for B-B'). PSC, bakre halvsirkelformet kanalen. Løsningssenteret ved lateral halvsirkelformet kanalen. SSC, overlegen halvsirkelformet kanalen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: representant AC confocal bilder av hele monterer sneglehuset (AA") og utricle (B-B") av voksen mus, forberedt 30 dager etter AAV8-GFP injeksjon via canalostomy. Eksempler er farget med antistoffer for GFP (grønn) og myosin VIIa (rød). (A-A) GFP uttrykkes i mest indre hårcellene (IHC). (B-B ") På fokalplanet av cuticular plate av utricle uttrykke mange hårcellene GFP (piler). GFP, grønne fluorescerende protein. OHC, ytre hårcellene. Skala barer er 25 µm (A"for A-A", B "for B-B"). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: representant AC confocal bilder av en traumatiserte utricle fått 30 dager etter AAV8-GFP injeksjon via canalostomy. En voksen mus ble injisert med streptomycin via lateral halvsirkelformet kanalen og 7 dager senere injisert med AAV8-GFP via bakre halvsirkelformet kanalen. GFP (grønn), myosin VIIa (rød) og utgangen (blå). Pilspisser angi representant støtte celler transduced med AAV8-GFP (GFP / myosin VIIa-celler), og pilene angir representant hårcellene transduced med AAV8-GFP (GFP / myosin VIIa + celler) med umodne hår bunter. Skala er 20 µm (D for A-D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne studien viste vi at narkotika-leveranser av canalostomy resulterte i alminnelig utbredt distribusjon av reagensen i cochlea og vestibular slutten-organer. Som en indre øret genet leveringsmetode resulterte canalostomy i GFP uttrykk i indre ørene for voksne og neonatal mus med minimal skade til høring og vestibular funksjon. Videre kan flere injeksjoner enkelt utføres i samme dyret.

En av de største styrkene til canalostomy er at den forårsaker minimal skade indre øret funksjon, særlig i voksen mus16,18,28,29,30, hvilke er betydelig for den vurdering av beskyttende effekter og translasjonsforskning aspekter. Flere grupper har brukt canalostomy for å levere ulike reagenser, som viral vektorer, siRNA, stamceller og aminoglycoside, i de murine indre øre18,19,28,29, 34,35,36,37. I denne studien beskrevet vi trinn for trinn, detaljert kirurgiske teknikker for canalostomy i voksne og neonatal mus. Sammenlignet med tidligere studier, gir vår studie tilleggsinformasjon om plasseringen av halvsirkelformede kanalene, som er en viktig prosedyre for vellykket operasjon. Som vist i figur 2B og C, var PSC og Lexmarks Løsningssenter vanligvis plassert ~ 3 mm fra roten av høydepunkt på 2-3 o'clock. Lexmarks Løsningssenter var på en ca 30° vinkel fra fly parallelt med calvarium, og PSCEN var loddrett Lexmarks Løsningssenter. Videre vi forenklet kirurgiske prosedyrer og kortere kirurgisk tid til ca 25 min med sammenlignbare resultater29.

Under canalostomy er det viktig å unngå på injeksjonsstedet, og blokkering av kanyle. Før du bytter på pumpen, er det viktig å sikre at spissen av kanyle settes i halvsirkelformet kanalen og at kanyle ikke bøyd eller blokkert. Tørr muskel bør brukes når tetting hullet i halvsirkelformet kanalen voksen mus fordi, i nærvær av halvsirkelformet kanalen væske, det utvider og plugger hullet (se trinn 2.6 og 2.10). Veggen av halvsirkelformet kanalen neonatal mus er myk og skjør, skal åpningen tettes av dekker med gjestfrihet muskel eller medisinsk lim30. Vi har også fjernet kanyle uten dekker åpningen med muskel; resultatene avdekket sammenlignbare AAV signaltransduksjon effektiviteten i det indre øret (data ikke vist), indikerer at åpningen i PSCEN neonatal mus ble avsluttet tilfredsstillende.

En annen fordel med canalostomy er muligheten for flere prosedyrer, som gjør gjentatte søknader av samme eller forskjellige reagenser (figur 6). Fordi fibrotiske og korning vev finnes ofte på forrige kirurgiske områder, og halvsirkelformet kanalen kan bli hindret etter kirurgi34, anbefales det å utføre injeksjoner under gjentatte operasjoner i et annet område av sideveis og/eller bakre halvsirkelformede kanalene18.

Den viktigste begrensningen av canalostomy er vanskeligheten med å bestemme om injeksjon kanyle settes inn i perilymphatic eller endolymphatic plass. Etter administrasjon av adenoviral vektorer i indre øret16 via canalostomy, ble mest transduced celler plassert i perilymphatic rom, antyder at injeksjon var sannsynlig i det området. Lav molekylvekt forbindelser (f.eks AAV streptomycin og siRNA) kan passere gjennom barrieren mellom perilymph og endolymph og nå sensoriske epitel etter injeksjon i perilymphatic eller endolymphatic18,19 ,34. Men etter injeksjon i perilymph, kan reagenser forbli i feltet perilymphatic hvis de ikke trenge barrieren mellom perilymph og endolymph16,39,40. Derfor bør permeabilitet av injisert reagensene vurderes før du bruker canalostomy.

Avslutningsvis resulterer canalostomy i en bred distribusjon av reagenser i cochlea og vestibyle med minimal forstyrrelse av hørsel og vestibular funksjon. Operasjonen er lett implementert i voksne og neonatal mus, og flere prosedyrer kan utføres hvis nødvendig. Canalostomy er en effektiv og sikker tilnærming for narkotika-leveranser til det indre øret av gnagere og kan i fremtiden brukes klinisk å behandle mennesker cochleovestibular sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen konflikter av interesse er deklarert.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (grant tall 81570912, 81771016, 81100717).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polymide Tubing A-M Systems 823400
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/1
10μl Microsyringe Hamilton Company 80001
Xylazine HCL Sigma-Aldrich Co. Llc. X-1251
Operating Miroscope Carl Zeiss Optical LLC. Pico
Micro Forceps Dumont Dumostar 10576
Fast-green Dye Sigma-Aldrich Co. Llc. F7252
AAV8-GFP BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) 20161101 Titer: 2×10e12 vg/mL
Streptomycin Sulfate Sigma-Aldrich Co. Llc. S9137
Microinjection Pump Stoelting Co. 789100S
Electric Pad Pet Fun 11072931136
1 cc Syringe Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) 2011-3151258
Ketamine HCL Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) H35020148
Electric Animal Clipper Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) CP-8000
Cotton Pellet Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) Yu-2008-1640081
Suture Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) Hu-2013-2650207
Eye Ointment Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) H11021270

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stachler, R. J., et al. Clinical practice guideline: sudden hearing loss. Otolaryngol Head Neck Surg. 146 (3 Suppl), S1-S35 (2012).
  2. Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19 (3), 345-350 (2013).
  3. Rivera, T., Sanz, L., Camarero, G., Varela-Nieto, I. Drug delivery to the inner ear: strategies and their therapeutic implications for sensorineural hearing loss. Curr Drug Deliv. 9 (3), 231-242 (2012).
  4. El Kechai, N., et al. Recent advances in local drug delivery to the inner ear. Int J Pharm. 494 (1), 83-101 (2015).
  5. Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane. J Vis Exp. (97), e52187 (2015).
  6. Ahmed, H., Shubina-Oleinik, O., Holt, J. R. Emerging Gene Therapies for Genetic Hearing Loss. J Assoc Res Otolaryngol. 18 (5), 649-670 (2017).
  7. Murillo-Cuesta, S., et al. A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection. J Vis Exp. (121), e54951 (2017).
  8. Stevens, S. M., Brown, L. N., Ezell, P. C., Lang, H. The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration. J Vis Exp. (105), e53131 (2015).
  9. Salt, A. N., Plontke, S. K. Principles of local drug delivery to the inner ear. Audiol Neurootol. 14 (6), 350-360 (2009).
  10. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
  11. Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35 (3), 264-272 (2017).
  12. Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
  13. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
  14. Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Mol Med. 7 (8), 1077-1086 (2015).
  15. Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. A method for intracochlear drug delivery in the mouse. J Neurosci Methods. 150 (1), 67-73 (2006).
  16. Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The functional and structural outcome of inner ear gene transfer via the vestibular and cochlear fluids in mice. Mol Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
  17. Bowers, W. J., et al. Neurotrophin-3 transduction attenuates cisplatin spiral ganglion neuron ototoxicity in the cochlea. Mol Ther. 6 (1), 12-18 (2002).
  18. Wang, G. P., et al. Adeno-associated virus-mediated gene transfer targeting normal and traumatized mouse utricle. Gene Ther. 21 (11), 958-966 (2014).
  19. Isgrig, K., et al. Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25 (3), 780-791 (2017).
  20. Gassner, D., Durham, D., Pfannenstiel, S. C., Brough, D. E., Staecker, H. Canalostomy as a surgical approach for cochlear gene therapy in the rat. Anat Rec (Hoboken). 295 (11), 1830-1836 (2012).
  21. Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner ear transgene expression after adenoviral vector inoculation in the endolymphatic sac. Hum Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
  22. Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene transfection in neonatal mice using adeno-associated viral vector: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
  23. Chien, W. W., McDougald, D. S., Roy, S., Fitzgerald, T. S., Cunningham, L. L. Cochlear gene transfer mediated by adeno-associated virus: Comparison of two surgical approaches. Laryngoscope. 125 (11), 2557-2564 (2015).
  24. Zhu, B. Z., Saleh, J., Isgrig, K. T., Cunningham, L. L., Chien, W. W. Hearing Loss after Round Window Surgery in Mice Is due to Middle Ear Effusion. Audiol Neurootol. 21 (6), 356-364 (2017).
  25. Wang, Y., et al. Early postnatal virus inoculation into the scala media achieved extensive expression of exogenous green fluorescent protein in the inner ear and preserved auditory brainstem response thresholds. J Gene Med. 15 (3-4), 123-133 (2013).
  26. Lee, M. Y., et al. Survival of human embryonic stem cells implanted in the guinea pig auditory epithelium. Sci Rep. 7, 46058 (2017).
  27. Ishimoto, S., Kawamoto, K., Kanzaki, S., Raphael, Y. Gene transfer into supporting cells of the organ of Corti. Hear Res. 173 (1-2), 187-197 (2002).
  28. Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33 (4), 655-659 (2012).
  29. Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).
  30. Guo, J. Y., et al. Cochleovestibular gene transfer in neonatal mice by canalostomy. Neuroreport. 28 (11), 682-688 (2017).
  31. Beyea, J. A., Agrawal, S. K., Parnes, L. S. Transmastoid semicircular canal occlusion: a safe and highly effective treatment for benign paroxysmal positional vertigo and superior canal dehiscence. Laryngoscope. 122 (8), 1862-1866 (2012).
  32. Naples, J. G., Eisen, M. D. The History and Evolution of Surgery on the Vestibular Labyrinth. Otolaryngol Head Neck Surg. 155 (5), 816-819 (2016).
  33. Hamilton, L., Keh, S., Spielmann, P. M., Hussain, S. S. How we do it: locating the posterior semicircular canal in occlusion surgery for refractory benign paroxysmal positional vertigo: a cadaveric temporal bone study. Clinical Otolaryngology. 41 (2), 190-193 (2016).
  34. Jung, J. Y., et al. siRNA targeting Hes5 augments hair cell regeneration in aminoglycoside-damaged mouse utricle. Mol Ther. 21 (4), 834-841 (2013).
  35. Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. Am J Pathol. 171 (1), 214-226 (2007).
  36. Pfannenstiel, S. C., Praetorius, M., Plinkert, P. K., Brough, D. E., Staecker, H. Bcl-2 gene therapy prevents aminoglycoside-induced degeneration of auditory and vestibular hair cells. Audiol Neurootol. 14 (4), 254-266 (2009).
  37. Kawamoto, K., Izumikawa, M., Beyer, L. A., Atkin, G. M., Raphael, Y. Spontaneous hair cell regeneration in the mouse utricle following gentamicin ototoxicity. Hear Res. 247 (1), 17-26 (2009).
  38. Wang, G. P., et al. Notch signaling and Atoh1 expression during hair cell regeneration in the mouse utricle. Hear Res. 267 (1-2), 61-70 (2010).
  39. Pietola, L., et al. HOX-GFP and WOX-GFP lentivirus vectors for inner ear gene transfer. Acta Otolaryngol. 128 (6), 613-620 (2008).
  40. Han, J. J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).

Tags

Denne måneden i JoVE problemet 135 Canalostomy cochlea vestibyle hair celle lokale stoffet levering halvsirkelformet kanalen neonatal
Canalostomy som en kirurgisk tilnærming til lokale stoffet levering indre ører voksne og Neonatal mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, J. Y., He, L., Qu, T. F., Liu,… More

Guo, J. Y., He, L., Qu, T. F., Liu, Y. Y., Liu, K., Wang, G. P., Gong, S. S. Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice. J. Vis. Exp. (135), e57351, doi:10.3791/57351 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter