Summary
النيل الأحمر تلطيخ من الثابتة ايليجانس كاينورهابديتيس طريقة لقياس كمية الرواسب الدهنية محايدة، بينما النفط الأحمر يا تلطيخ يسهل تقييم نوعي لتوزيع الدهون بين الأنسجة.
Abstract
ايليجانس كاينورهابديتيس كائن نموذج استثنائي لدراسة الأيض الدهون والتوازن الطاقة فيه. العديد من الجينات الدهن يتم المحافظة عليها في البشر والمرتبطة بالمتلازمة الأيضية أو غيره من الأمراض. يمكن أن تنفذ دراسة تراكم الدهن في هذا الحي بالأصباغ مثبت أو أساليب خالية من التسمية. البقع مثبت مثل النيل الأحمر والنفط س الحمراء طرق غير مكلفة، ويمكن الاعتماد عليها لقياس مستويات الدهون كمياً ونوعيا مراقبة التوزيع الدهن عبر الأنسجة، على التوالي. وعلاوة على ذلك، تتيح هذه البقع الفرز الفائق من جينات الأيض الدهون ومسارات مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، طابعها مسعور يسهل الذوبان في الدهون ويقلل من التفاعل مع المحيط بالانسجة، ويمنع التفكك في المذيب. وعلى الرغم من هذه الأساليب الفعالة في دراسة محتوى الدهون عامة، أنها لا توفر معلومات مفصلة عن التركيب الكيميائي والتنوع من رواسب الدهون. لهذه الأغراض، خالية من تسمية أساليب مثل الفحص المجهري GC-MS والسيارات أفضل ملاءمة، تكاليفها على الرغم من.
Introduction
الدهون ضرورية للحياة. فعناصر لا تتجزأ من الأغشية والعمل كرسل الثانوية وإشارة محولات الطاقة ولها وظائف حيوية في تخزين الطاقة. عند دهن الأيض dysregulated فإنه يؤدي إلى أمراض مثل السمنة ومرض السكري من النوع الثاني، الذي يتم الضغط على شواغل الصحة العامة9. ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) كائن حي نموذجا ممتازا لدراسة الأيض الدهني لأنها لها دورة حياة قصيرة نسبيا وهيئة شفافة ونسب خلية معروفة وجينوم تسلسل الكامل. يسمح أساسا خنثي، C. ايليجانس الباحثين لرفع عدد كبير من الحيوانات اسوي باختصار فترات من الوقت للقيام الفائق شاشات الجينية إلى الأمام لدراسة طائفة واسعة من الجينات والمسارات الأيضية4. وقد كشف هذا النهج درجة عالية من الحفظ في C. ايليجانس 273 دهن الأيض الجينات بين البشر والفئران والجرذان والمورفولوجية. وعلاوة على ذلك، بما يزيد على 300 الدهن الجينات في C. ايليجانس أورثولوجويس البشرية المرتبطة بالأمراض التي لا علاقة لها بالمتلازمة الأيضية11. تقليديا، دراسة تخزين الدهون في C. ايليجانس معظمها يعتمد على فحوصات المسمى صبغ، التي توفر معلومات قوية حول تراكم الدهن. أقل شيوعاً وصف فيها تعريب الدهون وقياس الاختلافات في وفرة الدهن عبر الأنسجة. ومع ذلك، كشفت الأعمال الأخيرة أن توزيع الدهن يمكن أن تكون هامة مثل تراكم الدهن6.
في الآونة الأخيرة، وقد بدأت دراسات إدماج أساليب مثل عالية الأداء السائل اللوني-قياس الطيف الكتلي ([هبلك]-مرض التصلب العصبي المتعدد)، الفصل اللوني للغاز-الكتلي (GC-MS)، ومتماسكة المضادة-ستوكس رامان مجهرية نثر (السيارات) للتصدي أوجه قصور نهج المستندة إلى وصمة عار بتحليل محتويات مقتطفات الدهن والدهن محددة الكسور ورواسب الدهن، على التوالي10،11مباشرة. وعلاوة على ذلك، كشفت مجهرية السيارات أن النيل الأحمر يمكن أن تصلح كوكيل لتراكم الدهون عند استخدامها كصبغة مثبت، لاستعماله وصمة عار حيوية يؤدي إلى تلطيخ خارج الهدف للسيارات-فلوري العضيات10فقط. بيد أن الخبرة الفنية المطلوبة والتكاليف المرتبطة بهذه اللوني وأساليب الفحص المجهري يجعل استخدامها لا يمكن الدفاع عنها للعديد من الأسئلة البحثية. في هذه المقالة، نحن نناقش أسلوب مناسب وموثوق بها يحملق ووصمة عار رواسب الدهون محايدة في C. ايليجانس استخدام النيل الأحمر والنفط س الأحمر التمييز بين وفرة الدهون في الحيوانات كلها وفي أنسجة محددة.
النيل الأحمر، 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one، هو صبغة بينزوفينوكسازوني سهولة يذوب في المذيبات العضوية المختلفة، بل هو في الغالب غير قابلة للذوبان في الماء. فهو صبغ ليسوتشرومي ممتازة تستخدم لوصمة عار الدهون محايدة مثل الشحوم أو استرات الكوليسترول نظراً لأنه يتميز بلون قوي، سولوبيليزيس كذلك في الدهون، أصبحت لا تذكر من التفاعل مع الأنسجة المحيطة، وهو أقل قابل للذوبان في المذيبات مما في الدهون. فقد ماكسيما الإثارة والانبعاثات من 450-500 و 520 نانومتر، على التوالي1. عندما يتم عرض النيل C. ايليجانس ملطخة بالأحمر الفلورية الخضراء، هيئات منفصلة في الدهون يمكن مراعاتها في جميع أنحاء الأمعاء والأنسجة الأخرى أما في مجموعات أو موزعة بالتساوي، تبعاً للنمط الوراثي للحيوان أو العلاج التجريبي 7.
O النفط الأحمر هو ليسوتشرومي، وتذوب صبغة تستخدم لوصمة عار الشحوم والبروتينات الدهنية. ويسمى صبغة الآزو لبنيتها الكيميائية تحتوي على مجموعتين الآزو يعلق على الحلقات العطرية الثلاثة. من الصعب أن تتأين، مما يجعلها عالية قابلة للذوبان في الدهون. أحمر لونه وصمة عار وامتصاص الضوء في أقصى 518 شمال البحر الأبيض المتوسط 3. C. ايليجانس ملطخة بالزيت يا الحمراء تظهر قطرات الدهن الحمراء التي تبرز ضد جسم الحيوان شفافة، مما يسهل تقييم نوعي لتوزيع الدهون بين أنسجة مختلفة6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-النيل تلطيخ الأحمر (NR) من الدهون
- إعداد 5 ملغ/مل NR الأسهم الحل
- في زجاجة 500 مل، إضافة 100 ملغ مسحوق NR إلى 200 مل الأسيتون 100%.
- وتغطي الزجاجة برقائق الألومنيوم لتجنب أي التعرض للضوء.
- قبل الاستخدام، يحرك الحل بالنسبة ح 2 في الظلام.
- لاستخدامها على المدى الطويل، تخزين حل الأسهم NR في زجاجة مختومة محكم دون أي التعرض للضوء. حجم المجلة الحل الأسهم وفقا للاحتياجات البحثية. ضمان أن يستخدم نفس الحل الأسهم عبر تجارب تلطيخ NR للحصول على تلطيخ والتصوير نتائج متسقة.
- إعداد NR العامل الحل
- لكل 1 مل من الكحول 40% (v/v)، إضافة 6 ميليلتر من حل الأسهم NR.
- إعداد 600 ميليلتر NR العامل الحل لكل عينة.
ملاحظة: جعل NR الطازجة العامل حق الحل قبل التلوين. اعتماداً على احتياجات الحل الأسهم NR، تخرج استخدام 15 مل أو 50 مل الأنبوبة المخروطية.
- إعداد الديدان لتلطيخ الدهني NR
- تنمو الديدان إلى مرحلة مبكرة L4 في 20 درجة مئوية في نمو السلكية المتوسطة (NGM) المصنف مع الراحل سجل OP50 كولاي.
- أغسل الديدان قبالة اللوحة مع 1 مل 1 × مخزنة الفوسفات المالحة + 0.01 ٪ Triton X-100 (ببست) الحل ووضع تعليق دودة 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب.
- إزالة الديدان في 560 x ز للحد الأدنى 1 المادة طافية وتكرار هذه الخطوة حتى كولاي يتم مسح من تعليق للطرد المركزي.
- إضافة 100 ميليلتر من الايزوبروبانول 40% إلى بيليه دودة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
- الطرد المركزي الديدان في 560 x ز لمدة 1 دقيقة وإزالة المادة طافية دون تعطيل بيليه دودة.
ملاحظة: استخدام كميات أعلى من ببست لغسل الديدان قبالة اللوحات إذا استخدام لوحات أكبر أو تلطيخ الديدان أكثر للوحة الواحدة. عدم غسل الديدان في ببست أكثر من 15 دقيقة قبل تثبيت عينة. أداء يغسل إضافية إذا كان لا يتم مسح المادة طافية من البكتيريا. الاضطلاع في الحضانة في الايزوبروبانول 40% باستخدام نوتاتور أو الروك. دوماً على مراقبة هذه الأنابيب للتأكد من حدوث الانفعالات عينة كاملة.
- دهن تلطيخ مع NR
- في الظلام، وإضافة 600 ميليلتر NR العامل الحل لكل عينة. عكس الأنابيب ثلاث مرات ومزيج تماما الديدان في حل NR.
- قم بتدوير العينة في الظلام في درجة حرارة الغرفة ح 2.
- وعقب الحضانة، الطرد المركزي الديدان في 560 x ز لمدة 1 دقيقة وإزالة المادة طافية.
- إضافة 600 ميليلتر من ببست، واحتضان هذه العينات في الظلام لمدة 30 دقيقة لإزالة الزائدة NR وصمة.
- الطرد المركزي في العينات من 560 x ز لمدة 1 دقيقة وإزالة كافة ولكن حوالي 50 ميليلتر من المادة طافية.
ملاحظة: لا تتطلب الحضانة NR الانفعالات. تسوية من الديدان شائع أثناء هذه الخطوة.
- إعداد شرائح للتصوير بالمجهر
- ريسوسبيند بيليه دودة في المادة طافية المتبقية.
- ضع 5 ميليلتر من تعليق دودة على شريحة مجهر ووضع ساترة على بعناية لتجنب تصيد أي فقاعات الهواء.
- ختم ساترة مع طلاء الأظافر قبل التصوير الديدان.
- إعداد شرائح زوجين فقط في وقت واحد. وهذا يضمن تصوير NR لا تزال مستمرة عبر العينات. يقلل جودة الصور الملطخة بالمجلة بعد حاء 6 قطرات الدهن منفصلة يصعب مراقبة ويزيد fluorescence الخلفية، الذي يتداخل مع الكشف عن إشارة NR.
- التصوير الملون NR الديدان
- صورة الديدان في 5 X التكبير لالتقاط العديد من الحيوانات في مجال الرؤية.
- قم بالتبديل إلى 10 X التكبير للقياس الكمي أفضل من الديدان الفردية.
- استخدام قناة فيتك/التجارة والنقل للصورة الملطخة NR الديدان، وحاول مرات التعرض المختلفة لتحديد الشروط المثلى للقياس الكمي.
- حفظ الملفات في تنسيق TIF لتجنب فقدان البيانات بسبب الضغط.
ملاحظة: الأوقات التعرض نموذجية تتراوح من السيدة 100-1000 بعد وقت تعرض أمثل، استخدامه لجميع العينات للحفاظ على تناسق التصوير.
- NR المصبوغة صورة القياس الكمي
- تحميل ميكروجرافس إلى إيماجيج. في القائمة المنسدلة الإضافات، استخدم الدالة بيو-تنسيقات إذا لم يتم التعرف على ملف الصورة.
- في القائمة المنسدلة صورة، ضمن الدالة المكدسات، استخدام الصور إلى المكدس لإنشاء رصة صورة عند مقارنة عدة ميكروجرافس.
- في نفس القائمة المنسدلة، ضبط السطوع/النقيض المكدس الصورة ونشر التغييرات إلى كافة الصور بواسطة النقر فوق تطبيق.
- تستخدم أداة التحديد المضلع لترسم كل دودة المصورة واستخدام الدالة التدبير ضمن القائمة المنسدلة تحليل لقياس كثافة fluorescence المنبعثة من NR.
- لكل صورة، وقياس خمسة مواقع خلفية وحساب كثافة fluorescence خلفية متوسط.
- طرح شدة الأسفار الخلفية من كل دودة المصورة باستخدام الصيغة N = ز-(أ × ب)، حيث يقف ن للأسفار، ز لصف الإجمالي، وألف للمساحة الإجمالية دودة وب للأسفار خلفية متوسط صافي.
- لتطبيع شدة الأسفار حسب حجم الدودة، تقسيم الأسفار صافي كل دودة بأن المساحة الإجمالية. وترد النتائج ككثافة الأسفار، في وحدات التعسفي (a.u.)، كل بكسل.
ملاحظة: تجنب تصدير الصور بتنسيق JPEG. بينما يجعل ضغط الملفات أكثر سهولة لتخزين، للخطر سلامة البيانات بهذا الشكل. تأكد من أن كافة الصور تعديل وتحليل مطابق تماما. تذكر أن تقوم بتضمين شريط مقياس لتقييم حجم في تكبير مختلفة بشكل صحيح. أفضل تصور الاختلافات في كثافة الأسفار باستخدام إيماجيج، تبديل نوع الصورة من RGB إلى 8-بت وحدد النار من قائمة الجداول (لوط) البحث عن الصورة. وهذا يخلق صورة خريطة حرارة في أي لون زيادة السطوع يرتبط بالأسفار زيادة كثافة.
2-النفط تلطيخ س أحمر (أورو) من الدهون
- إعداد حل الأسهم أورو
- في زجاجة 250 مل، إضافة 500 ملغ مسحوق أورو إلى 100 مل الكحول 100% ومزجها جيدا.
- وبمجرد إعداد، تخزين الحل مختومة محكم مع لا التعرض للضوء.
- إعداد حل العامل أورو
- تمييع الحل أورو الأسهم في الماء (3:2) إلى 60% الايزوبروبانول.
- قبل الاستخدام، تصفية الحل أورو العامل عن طريق عامل تصفية المحاقن معقمة خلات السليولوز 0.2 ميكرون.
ملاحظة: لأفضل نوعية الحل، ويعد العامل أورو الحل قبل يوم واحد، والسماح لها مزيج بين عشية وضحاها. ومع ذلك، إذا كان الحل المطلوب في اليوم نفسه، تمييع ومزيج الحل أورو في الروك على الأقل 2 ح قبل استخدام. قبل هزاز، التفاف الأنبوبة المخروطية في الشريط البارافين لتجنب تسرب حل أورو.
- إعداد الديدان لتلطيخ الدهني أورو
- تنمو الديدان عند 20 درجة مئوية في نمو السلكية المتوسطة (NGM) المصنف مع الراحل سجل OP50 كولاي إلى مرحلة الحياة المرجوة.
- أضف 1 مل من محلول ببست اللوحة ودوامه حتى الديدان جميع قبالة اللوحة. إمالة اللوحة وغسله مع 1 مل ببست. نقل تعليق دودة 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب.
- إزالة الديدان في 560 x ز للحد الأدنى 1 المادة طافية دون الإخلال ببيليه وتكرار الغسيل خطوة مع 1 مل ببست ثلاث مرات للطرد المركزي. قم بإزالة كافة ميليلتر طافية لكن 100.
- إضافة 600 ميليلتر من الايزوبروبانول 40% إلى بيليه دودة والصخرة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
- الطرد المركزي الديدان في 560 × ز 30 ثانية وإزالة جميع طافية لكن 100 ميليلتر دون تعطيل بيليه دودة.
ملاحظة: استخدم كميات أعلى من ببست لغسل الديدان قبالة لوحات إذا القيام بتلوين الفائق. عدم غسل الديدان في ببست أكثر من 15 دقيقة قبل تثبيت عينة. هل يغسل إضافية إذا كان لا يتم مسح المادة طافية من البكتيريا. القيام بالحضانة في الايزوبروبانول 40% باستخدام نوتاتور أو الروك. دائماً رصد أنابيب للتأكد من حدوث الانفعالات عينة كاملة.
- دهن تلطيخ مع أورو
- إضافة 600 ميليلتر أورو العامل الحل لكل عينة. عكس الأنبوب ثلاث مرات ومزيج الديدان جيدا في أورو.
- قم بتدوير العينات 30 لفة في الدقيقة ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي في العينات من 560 x ز لمدة 1 دقيقة والقضاء على كل ميليلتر طافية لكن 100.
- ريسوسبيند العينات في 600 ميليلتر من ببست وتدوير أنابيب 30 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة لإزالة وصمة عار أورو الزائدة.
- الطرد المركزي عينات من 560 x ز لمدة 1 دقيقة والقضاء على كافة ولكن 50 ميليلتر من المادة طافية.
- لتمييز أفضل موقع germline للحيوان والخلايا المعوية، وصمة عار الأنوية بإضافة 1 ميليلتر من (2-(4-amidinophenyl)-1 ح-اندول-6-كاربوكساميديني) (DAPI) لكل 1 مل من حل عملي أورو. القيام بتلوين أورو ح 2 مع إضافة DAPI قبل تركيب الشرائح للتصوير. أنوية المعوية أكبر في الحجم وتتميز الغدد التناسلية بالخلايا الجرثومية النامية.
ملاحظة: بعد أورو تلطيخ، قد تنضم إلى جانبي [ميكروفوج] أنابيب وتفشل لتشكيل بيليه ملحوظ الديدان. إذا حدث هذا، الطرد المركزي الديدان مرة أخرى أو السماح للديدان بتسوية بالجاذبية لمالا يقل عن 10 دقيقة.
- إعداد الشرائح للدودة التصوير
- ريسوسبيند الديدان في المادة طافية المتبقية ويخلط الحل جيدا.
- وضع 5 ميليلتر من تعليق دودة على شريحة مجهر ومكان ساترة بعناية، ضمان أن فقاعات الهواء لا نموذج.
- ختم ساترة مع طلاء الأظافر والديدان الصورة.
ملاحظة: بعد تحديد وتلطيخ، يمكن الديدان جامدة جداً ومن الصعب على "الماصة؛". للالتفاف على هذا، جعل الماصات على صعيد تحمل بقطع هذه النصائح. - تخزين الشرائح في رف الصغير-الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة إذا لم التصوير مباشرة بعد تلطيخ.
- التصوير الملون أورو الديدان
- استخدم كاميرا قادرة على لون الصورة الملطخة أورو الديدان.
- استخدم التكبير X 5 للديدان عدة في حقل واحد لعرض الصورة.
- قم بالتبديل إلى 10 X التكبير لدراسة أفضل للديدان الفردية.
- تصدير الصور في تنسيق TIF لتجنب فقدان البيانات بسبب الضغط.
ملاحظة: إذا تلطيخ مع أورو + DAPI، تبديل الكاميرا قادرة على لون واحد التي يمكن التقاط الأسفار.
- تحليل الصور الملطخة باورو الديدان
- تحميل micrograph(s) إلى إيماجيج. في القائمة المنسدلة الإضافات، استخدم الدالة بيو-تنسيقات إذا لم يتم التعرف على ملف الصورة.
- في القائمة المنسدلة صورة، ضمن الدالة المكدسات، استخدام الصور إلى المكدس لإنشاء رصة صورة عند مقارنة عدة ميكروجرافس.
- ضبط السطوع/تحت نفس القائمة المنسدلة تحسين رؤية قطرات الدهن.
- تصنيف الصور حسب تراكم الدهن في أنحاء جسم الحيوان أو في أنسجة محددة.
- لإجراء تقييم أفضل للتعريب الدهن وتحديد هوية القطع الأثرية صورة غير محددة باستخدام إيماجيج، حدد الدالة اللون تحت القائمة المنسدلة صورة وانقر فوق مكدس إلى RGB لإظهار إشارات كل مكون من مكونات RGB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SKN-1 هو "bzip"، سيتوبروتيكتيفي عامل النسخ التي تشاطر التماثل مع NRF2 الثدييات، ولقد ثبت للتوسط في أكسدة الأحماض الدهنية. اعتماداً على تركيز الجلوكوز في نظامهم الغذائي، تظهر الديدان مع اليل مؤثرا المنشط skn-1 مستويات مختلفة من الدهون عندما ملطخة بالنيل الأحمر7. الشكل 1A ج- يظهر المنشط skn-1 الحيوانات المعرضة للظروف التي تؤدي إلى زيادة مستويات الدهون. الأسفار NR التقاطها باستخدام قناة فيتك/بروتينات فلورية خضراء بارزة على طول الأمعاء، ولكن باهتة في الرأس والذيل، والتجويف المعوي. زيادة مستويات الدهون، جزيئات منفصلة الملطخة بالمجلة أكثر من الصعب تمييز، مما قد يحتم انخفاض التعرض مرات. على الرغم من أن يستخدم هذا الأسلوب كثافة الأسفار كوكيل كمي لتراكم الدهون، وهي غير كافية في تمييز تلطيخ غير محدد من الهياكل الخلوية التي ليست مخازن الدهون وعرضه لإشارة تدخل من السيارات المعوية الأسفار. ولذلك، يجب استخدام التسمية البديلة والأساليب غير التسمية بالتوازي لقياس الدهون محايدة في الحيوان10لا لبس فيه.
تعتمد على سن "جسدية استنفاد للدهون" (قوات الدفاع الذاتي)، هو النمط الظاهري الذي يحدث في سن الديدان حيث تعرض الحيوانات انخفضت الدهون الخلية الجسمية، بينما الدهون الخلية الجرثومية يبقى دون تغيير6. النفط الأحمر يا تلطيخ ليس أسلوب موثوق يوضحها مستويات الدهون، لكن ممتاز لتصور التعريب الدهن وهي مفيدة لتحديد تعمل استنزاف الدهون مثل قوات الدفاع الذاتي الجوية في الدودة. وفي حين أنه من السهل تصنيف الديدان وفقا لوجود أو عدم وجود قوات الدفاع الذاتي الجوية، قد يكون صعباً لتحديد الحيوانات مع فقدان الدهون المتوسطة (الشكل 2A). الحيوانات من قوات الدفاع الذاتي الجوية، التي تبين أحمر تلطيخ في جميع أنحاء الجسم مع قليل من المناطق الشفافة (الشكل 2)، بالمقارنة مع قوات الدفاع الذاتي الجوية الديدان يحمل استنزاف الدهون ملحوظ في الخلايا المعوية (الشكل 2). الحيوانات عملية تطوير قوات الدفاع الذاتي الجوية (الشكل 2D) غالباً ما تظهر بقع شفافة حيث تحدث معظم فقدان الدهون في نهاية المطاف. وعلاوة على ذلك، قد لا تزال تتميز الديدان قوات الدفاع الذاتي الجوية تلطيخ أحمر مشرق في منطقتي رأس وذيل لأنه لم يتم تعريف النمط الظاهري خسارة الدهون جسدية كاملة، بل باستنزاف الدهون واسعة النطاق بالنسبة إلى الحيوانات غير المسنين (غير الذاتي). وهكذا، يتيح استخدام النفط الأحمر تلطيخ س، لتحديد نوعية من الدهن التعريب وتحديد تعمل إلى حد كبير في تغيير رواسب الدهون في الدودة.
رقم 1: تلوين للدهون التي احمرت النيل تلوين النيل الأحمر لتنشيط طفرات skn-1 الظروف التي تحظى بدهن زيادة تراكم (أ-ج). كسب سلالة skn-1 وظيفة (lax188) المرافئ استبدال الأحماض الأمينية E237K يجعل SKN-1 active مؤثرا. الديدان L4-المرحلة تعرضوا إلى 0, 15 و 30 ي/م2 تليها فترة نقاهة 12-ح على لوحات NGM المصنف قبل تلطيخ NR وتصوير ضوء الأشعة فوق البنفسجية. الصور المعروضة ممثل النمط الظاهري. تم إجراء القياس الكمي الدهن كما ورد في الفرع 1-7. النار هو نظرة ImageJ أعلى الجدول (لوط) المستخدمة لإنشاء صورة حرارية يظهر الأسفار حدة الاختلافات بين الصور. ويظهر دمج الصور فيتك/بروتينات فلورية خضراء ومدينة دبي للإنترنت جنبا إلى جنب. التحديد الكمي لشدة الأسفار لكل صورة يظهر في الجزء السفلي من مونتاج الصورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تلطيخ الدهون بزيت أحمر سين النفط الأحمر يا تلطيخ لتنشيط skn-1 طفرات (lax188) تبين وجود أو عدم وجود النمط الظاهري قوات الدفاع الذاتي الجوية (أ-د). أ ود تظهر الحيوانات مع وسيطة تعمل قوات الدفاع الذاتي الجوية. ب وج عرض تلطيخ أورو المعاكس. في حين ب غير قوات الدفاع الذاتي الجوية، يظهر ج استنزاف الدهون جسدية كبيرة مع ما يصاحب ذلك من زيادة في تراكم الدهون germline، الذي يحدد النمط الظاهري قوات الدفاع الذاتي الجوية. كانت ملطخة الديدان أورو متبوعاً بالتصوير 144 الحيوانات مزامنة L1 هافتير المفروضة على وسائل الإعلام NGM المصنف مع البكتيريا OP50. الصور المعروضة هي الممثل للحيوانات مع أو بدون النمط الظاهري قوات الدفاع الذاتي الجوية. يتم تعديل الرسوم اقحم من لين, et al. 6 ويمثل غياب (ب) أو وجود (ج) استنفاد الدهون جسدية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يجعل ارتفاع معدلات الأمراض الأيضية والسمنة C. ايليجانس نموذج مناسب دراسة الآليات التي تنظم تراكم الدهون في الخلايا والأنسجة. تشير الدلائل الأخيرة إلى أن التغيرات في مستويات الدهون ترتبط بالعمليات الخلوية التي تتراوح بين الأنسولين مما يشير إلى8، تنشيط هرمون مستقبلات2، لإخراج الإنجابية5. مقارنة بالفحص المجهري خالية من التسمية وأساليب اللوني، النيل الأحمر والنفط س الأحمر هي غير مكلفة نسبيا الأصباغ المستخدمة لوصمة عار الدهون محايدة في الدودة استمرار وتكاثر10،،من1213. الأول يسمح للتحديد الكمي لمستويات الدهون الإجمالية، بينما الثاني يسهل تقييم توزيع الدهون بين الأنسجة مثل اللحمة، والأمعاء، والسطر الجرثومية. عندما تستخدم بالاقتران، NR واورو تمكن الباحثون لتحديد كيفية التركيب الوراثي والتغيرات البيئية تؤثر على تراكم الدهن وأين تقع هذه التغييرات في الدودة.
هذه الأصباغ، ومع ذلك، لا مباشرة تقييم تراكم الدهون بنفس الطريقة غير الغازية كما يفعل السيارات مجهرية12. ولذلك فعرضه للأخطاء أثناء التثبيت وتلطيخ، التي قد تنال من قياس دقة13. بالإضافة إلى ذلك، قد تتفاعل هذه الأصباغ دون قصد مع ليبوفوسسين وحبيبات المعوية، أسفر عن الأسفار التي لا علاقة لها بالدهون محايدة داخل الخلايا تخزن10،14. بالإضافة إلى ذلك، في الحالات التي تظهر فيها مستويات الدهون منخفضة، NR واورو تلطيخ لا يميز إذا كانت النتائج النتائج من القضايا النفاذية أو تقليل تراكم الدهون. وعلاوة على ذلك، حساسية هذه البقع للضوء يتطلب اتخاذ تدابير خاصة أثناء التخزين والمناولة النشطة التي تحد بالتدهور وصور تبيض. ومع ذلك، إذا كان يتم الحذر عند أداء واستخلاص الاستنتاجات من التسمية على أساس فحوصات، NR وتلطيخ أورو وسيلة ممتازة للشاشات الوراثية إلى الأمام لدراسة مسارات الأيض الدهون ودراسة تفاعلها مع سائر الفسيولوجية وظائف. يوصي باستخدام الديدان داف-2 و الدهون-6 إجراء مقارنات نسبية من تراكم دهني زيادة ونقصان، على التوالي. الغسيل وفيكساتينج خطوات للمجلة واورو تلطيخ متشابهة. ولذلك، يمكن إجراء كليهما في نفس اليوم. ومع ذلك، يمكن تخزين الشرائح فقط مع الديدان الملون أورو للتصوير في وقت لاحق نظراً لتلطيخ NR غير متناسق بعد ح 6. أثناء الغسيل، من المهم أن تدرج تريتون العاشر-100 ليس فقط لزيادة نفاذية NR ووادي الذهب، ولكن أيضا لتجنب فقدان دودة بسبب التمسك المفرط بلاستيكواري. بالإضافة إلى ذلك، يجب غسلها الديدان أقل من 30 دقيقة قبل التلوين لضمان أقصى نفاذية لكل وصمة عار. بينما قد خفض أوقات الاحتضان NR واورو لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة، على التوالي، هي تشجع على اتباع الوقت اقترح في هذه المقالة لتلطيخ أكثر اتساقا والتصوير نتائج. التعرض لفترة طويلة لحل NR للضوء، وعدم تصفية الحل أورو قبل استخدام سوف تزيد من الأسفار الخلفية أثناء التصوير. ويتطلب تنفيذ هذه البروتوكولات المصبوغة ح 3-4 بالإضافة إلى وقت التصوير. على الرغم من أن يوفر الاحتضان وصمة عار على الأكثر 2 ح وقفه بين الخطوات، فمن المستحسن أن البروتوكولات تتم مع انقطاعات قليلة قدر الإمكان التقليل من مصادر كثيرة لخطأ متأصل في جميع أساليب القياس الكمي الدهن صبغي و الفحص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
هذا العمل ممكناً بمنح المعاهد الوطنية للصحة: R01GM109028 (S.P.C.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imager.M2m Microscope | Zeiss | n/a | Fluorescence microscope |
| ERC5s camera | Axiocam | n/a | Color-capable |
| MRm camera | Axiocam | n/a | Fluorescence-capable |
| Nile red | Thermo Fisher | N1142 | Lipid Stain |
| Oil red O | Alfa Aesar | A12989 | Lipid Stain |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | DNA stain |
| Isopropyl Alcohol | BDH | BDH1133-1LP | Fixative solution |
| 0.2 µm seterile syringe filter | VWR | 28145-477 | Cellulose acetate filter |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5428000015 | Centrifuge |
| Shaker Rotisserie | Lab Quake | 400110Q | Shaker |
| Tube Rotator | VWR | 10136-084 | Rotator |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 7758-11-4 | NGM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | NGM |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 7786-30-3 | NGM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | NGM |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NGM |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGM |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | NGM |
| Agar | Teknova | L9110 | NGM |
| LB media | Sigma-Aldrich | L3147 | Bacterial growth |
References
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).
- Horobin, R. W., Kiernan, J. A. Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. , BIOS Scientific Publishers. (2002).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis. Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).
- Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans. P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).
- Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation. Nat Commun. 5, (2014).
- Saltiel, A. R., Kahn, C. R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).
- Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans. Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).
- Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PloS One. 5 (9), e12810 (2010).
- Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 14 (1), 164 (2013).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (73), (2013).
- O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).
