Summary
Nile rode kleuring van vaste Caenorhabditis elegans is een methode voor kwantitatieve meting van neutrale lipide deposito's, terwijl kwalitatieve beoordeling van lipide verdeling over weefsels olie rood O kleuring vergemakkelijkt.
Abstract
Caenorhabditis elegans is een uitzonderlijke modelorganisme waarin lipide metabolisme en energie homeostase te studeren. Veel van de lipide-genen zijn bewaard in mens en metabool syndroom of andere ziekten zijn gekoppeld. Lipide accumulatie in dit organisme kunnen worden onderzocht door kleefpoeders kleurstoffen of etiket-vrije methoden. Kleefpoeders vlekken zoals Nile rode en rode O olie zijn goedkope, betrouwbare manieren te kwantitatief meten van lipide niveaus en kwalitatief observeren lipide distributie in de weefsels, respectievelijk. Deze vlekken is bovendien voorzien van high-throughput screening van verschillende lipide metabolisme genen en trajecten. Bovendien hun hydrofobe natuur vergemakkelijkt lipide oplosbaarheid, interactie met de omringende weefsels vermindert en voorkomt dissociatie in het oplosmiddel. Al deze methoden effectief zijn in het onderzoeken van algemene vetgehalte, bieden ze geen gedetailleerde informatie over de chemische samenstelling en de diversiteit van lipide deposito's. Voor deze doeleinden, label-vrije methoden zoals microscopie van GC-MS en auto's zijn beter geschikt, hun kosten niettegenstaande.
Introduction
Vetten zijn essentieel voor het leven. Ze vormen integrerende bestanddelen van membranen, fungeren als secundaire boodschappers signaal transductoren en cruciale functies hebben in de energie-opslag. Wanneer lipide metabolisme dysregulated is, leidt het tot ziekten als obesitas en diabetes type II, die zijn indrukken van de volksgezondheid betreft9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een uitstekend model-organisme in te studeren lipide metabolisme omdat het heeft een relatief korte levenscyclus, een transparante body, een bekende cel afkomst en een volledig gesequenceerd genoom. Voornamelijk een hermafrodiet, C. elegans kunnen onderzoekers te verhogen van grote aantallen isogene dieren in korte perioden naar eroptoetezien high-throughput voorwaartse genetische schermen te bestuderen van een breed scala aan metabole genen en trajecten4. Deze aanpak is gebleken dat een hoge mate van instandhouding in 273 C. elegans lipide metabolisme genen tussen mens, muizen, ratten en drosophila. Bovendien hebben meer dan 300 lipide genen in C. elegans menselijke orthologues die gekoppeld aan ziekten die niets met metabool syndroom11 zijn. Traditioneel heeft onderzoek van lipide-opslag in C. elegans meestal waarop de kleurstof-geëtiketteerden testen, die robuuste informatie om lipide accumulatie bieden. Minder voorkomende is een beschrijving van waar lipiden lokaliseren en gemeten verschillen in lipide overvloed over weefsels. Recent werk is echter gebleken dat lipide distributie zo belangrijk als lipide accumulatie6 zijn kan.
Lately, studies zijn begonnen met het integreren van methoden zoals hoge prestatie vloeibare chromatografie-massaspectrometrie (HPLC-MS), gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), en coherente anti-stokes Raman microscopie van de verstrooiing (auto's) wil de tekortkomingen van vlek gebaseerde benaderingen door direct het analyseren van de inhoud van lipide extracten, specifieke lipide breuken, en lipide deposito's, respectievelijk10,11. Auto's microscopie is bovendien gebleken dat Nile rood alleen als een proxy voor vet accumulatie dienen kan wanneer gebruikt als een kleefpoeders kleurstof, voor het gebruik ervan als een vitale vlek leidt tot uit-target kleuring van auto-belichting fluorescerende organellen10. Echter, de vereiste technische deskundigheid en kosten in verband met deze chromatografie en Microscopie methodes benutten hun onhoudbaar voor veel onderzoeksvragen. In dit artikel bespreken we een handige en betrouwbare methode om te fixeren en neutrale lipide deposito's in C. elegans met behulp van de Nijl rode vlekken en rode O om te onderscheiden van lipide overvloed bij hele dieren en bij specifieke weefsels olie.
Nile rood, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, is een benzophenoxazone kleurstof die gemakkelijk in verschillende organische oplosmiddelen oplost, maar meestal slecht in water oplosbaar is. Het is een uitstekende lysochrome kleurstof gebruikt om neutrale lipiden zoals triglyceriden vlek of cholesterol esters omdat het beschikt over een sterke kleur, Lost goed in lipiden, heeft verwaarloosbare interactie met de omringende weefsels en is minder oplosbaar in het oplosmiddel dan in lipiden. Het heeft een excitatie en emissie-maxima van 450-500 en 520 nm, respectievelijk1. Wanneer Nile rood gebeitste C. elegans voor groene fluorescentie wordt bekeken, kunnen discrete lipide organen worden waargenomen in de darm en andere weefsels of in clusters of gelijkmatig verspreid, afhankelijk van het genotype van het dier of de experimentele behandeling 7.
Olie rood O is een lysochrome, vet oplosbare kleurstof gebruikt om vlek triglyceriden en lipoproteïnen. Het is een azo-kleurstof genoemd, omdat de chemische structuur twee azo groepen gekoppeld aan drie aromatische ringen bevat. Het is moeilijk te ioniseren, waardoor het zeer goed oplosbaar in lipiden. De vlek kleur is rood en de lichte absorptiemaximum 518 nm 3. C. elegans gekleurd met olie rood O Toon rode lipide druppels die opvallen tegen transparant lichaam van het dier, dat vergemakkelijkt de kwalitatieve beoordeling van lipide verdeling over de verschillende weefsels en6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nijl rood (NR) kleuring van lipiden
- Bereiding van de stockoplossing NR 5 mg/mL
- In een fles van 500 mL, voeg 100 mg poeder NR tot 200 mL 100% aceton.
- Dekking van de fles met aluminiumfolie om te voorkomen dat de eventuele blootstelling aan licht.
- Roer de oplossing gedurende 2 uur in het donker voor gebruik.
- Voor langdurig gebruik, bewaar de stockoplossing van NR in een strak verzegelde fles zonder eventuele blootstelling aan licht. Schaal NR stockoplossing volgens onderzoeksbehoeften. Zorg ervoor dat het dezelfde stockoplossing over NR-kleuring experimenten wordt gebruikt om consistente kleuring en imaging resultaten te verkrijgen.
- Voorbereiding van NR werkoplossing
- Voor elke 1 mL van 40% isopropanol (v/v), voeg 6 µL van de stockoplossing NR.
- Bereiden 600 µL NR werkende oplossing voor elk monster.
Opmerking: Zorg verse NR werken oplossing recht vóór de kleuring. Afhankelijk van de behoeften van de stockoplossing van NR, een 15 mL of conische tube van 50 mL studeerde aan gebruiken.
- Voorbereiding van wormen NR lipide kleuring
- Groeien wormen te vroeg stadium van de L4 bij 20 ° C op de nematode groeimedium (NGM) bezaaid met laat-log OP50 E. coli.
- Wassen van de wormen uit de plaat met 1 mL 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing + 0,01% Triton X-100 (PBST) oplossing en zet de opschorting van de worm in een 1,5 mL microfuge buis.
- Centrifuge die de wormen bij 560 x g gedurende 1 min. Verwijder de bovendrijvende vloeistof en herhaal deze stap tot en met E. coli is uitgeschakeld van schorsing.
- Voeg 100 µL van 40% isopropanol naar de worm pellet en na het bebroeden bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
- Centrifugeer de wormen bij 560 x g gedurende 1 minuut en schenk de bovendrijvende vloeistof verwijderen zonder het verstoren van de worm-pellet.
Opmerking: Gebruik hogere volumes PBST te wassen de wormen uit de platen als met behulp van grotere platen of kleuring meer wormen per plaat. De wormen in PBST meer dan 15 min voordat de monster fixatie niet wassen. Voer extra wast als het supernatant niet van bacteriën gewist wordt. Voeren de incubatietijd in 40% isopropanol met behulp van een nutator of rocker. Altijd controleren de buizen om ervoor te zorgen volledige monster agitatie plaatsvindt.
- Lipide kleuring met NR
- Voeg in het donker, 600 µL NR werkoplossing aan elk monster. De buizen drie keer omkeren en volledig Meng de wormen in NR oplossing.
- Het monster in het donker bij kamertemperatuur gedurende 2 uur roteren.
- Na de incubatie, centrifugeer de wormen bij 560 x g gedurende 1 minuut en verwijder de bovendrijvende substantie.
- Voeg 600 µL van PBST en de monsters in het donker gedurende 30 minuten voor het verwijderen van overtollige NR vlek uit te broeden.
- Centrifugeer de monsters bij 560 x g gedurende 1 minuut en alle ongeveer 50 µL van de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
Opmerking: NR-incubatie vereist geen agitatie. Beslechting van wormen is gebruikelijk tijdens deze stap.
- Voorbereiding van dia's voor Microscoop imaging
- Resuspendeer de pellet worm in de resterende supernatant.
- Plaats van 5 µL van worm schorsing op een microscoopglaasje en zet een dekglaasje aan op zorgvuldig om te voorkomen dat alle luchtbellen overvullen.
- Zegel van het dekglaasje aan met nagellak voor imaging wormen.
- Alleen een paar dia's tegelijk te bereiden. Dit zal ervoor zorgen NR imaging in verschillende steekproeven constant blijft. De kwaliteit van beelden NR gebeitste vermindert na 6 h. Discrete lipide druppels moeilijk zijn te observeren en achtergrond fluorescentie toeneemt, die interfereert met NR signaal detectie.
- Beeldvorming van NR gebeitste wormen
- Het imago van de wormen bij 5 X vergroting te vangen verschillende dieren per gezichtsveld.
- Overschakelen naar 10 X vergroting voor betere kwantificering van individuele wormen.
- Gebruikmaken van FITC/GFP channel beeld NR gebeitste wormen en proberen verschillende belichtingstijden te bepalen van de optimale omstandigheden voor kwantificering.
- Bestanden opslaan in de TIF-indeling om te voorkomen dat het verlies van gegevens als gevolg van compressie.
Opmerking: Typische blootstelling tijden variëren van 100-1000 ms. met een optimale belichtingstijd, gebruiken voor alle monsters imaging consistentie wordt gehandhaafd.
- NR kleuring afbeelding kwantificering
- Upload microfoto aan ImageJ. In het pull-down menu van Plugins, door de Bio-formaten-functie te gebruiken als het afbeeldingsbestand niet wordt herkend.
- In de afbeelding pull-down menu, onder de stapels-functie, kunt beelden-naar-Stack een afbeeldingsstapel maken wanneer verschillende microfoto worden vergeleken.
- Pas helderheid/Contrast van de afbeelding stack in het zelfde pull-down menu, en propageren van wijzigingen in alle afbeeldingen door te klikken op toepassen.
- Dienst van het gereedschap Veelhoek af te bakenen elk verbeelde worm en gebruik van de functie onder het analyse pull-down menu te kwantificeren van de intensiteit van de fluorescentie die wordt uitgestoten door NR.
- Voor elke afbeelding, meten van de vijf locaties van de achtergrond en de intensiteit van de fluorescentie gemiddelde achtergrond te berekenen.
- Aftrekken van de intensiteit van de fluorescentie achtergrond van elk verbeelde worm met de formule N = G - (A x B), waarbij N staat voor netto fluorescentie, G voor bruto fluorescentie, A voor totale worm gebied en B voor gemiddelde achtergrond fluorescentie.
- Verdelen om de intensiteit van de fluorescentie normaliseren door de grootte van de worm, van elk worm net fluorescentie door haar totale oppervlakte. De resultaten worden gerapporteerd als intensiteit van de fluorescentie, in willekeurige eenheden (a.u.), per pixel.
Opmerking: Vermijd het exporteren van afbeeldingen in JPEG-indeling. Terwijl compressie bestanden gemakkelijker te beheren om op te slaan maakt, wordt gegevensintegriteit gecompromitteerd door deze verkoopvorm. Zorg ervoor dat alle afbeeldingen worden bewerkt en geanalyseerd identiek. Vergeet niet om een bar schaal om de grootte in verschillende vergrotingen correct kan bepalen. Om de verschillen in de intensiteit van de fluorescentie met behulp van ImageJ beter te visualiseren, afbeelding schakelaartype van RGB naar 8-bits en selecteer brand in het Afbeeldingsmenu lookup tabellen (LUT). Hierdoor ontstaat een warmte-kaart beeld in welke verhoogde kleur helderheid met verhoogde fluorescentie intensiteit correleert.
2. olie kleuring rode O (ORO) van lipiden
- Bereiding van de stockoplossing van ORO
- In een fles van 250 mL, voeg 500 mg van ORO poeder tot 100 mL voor 100% isopropanol en meng het goed.
- Zodra voorbereid, slaan de oplossing strak verzegeld met geen blootstelling aan licht.
- Voorbereiding van de ORO werkoplossing
- Verdun ORO stockoplossing in 60% isopropanol en water (3:2).
- Vóór gebruik, de werkoplossing ORO wordt gefiltreerd door een 0,2 µm celluloseacetaat steriele injectiespuit filter.
Opmerking: Voor de beste oplossing kwaliteit ORO werkoplossing eergisteren voorbereiden, en laat het 's nachts mengen. Echter als oplossing nodig dezelfde dag, verdunnen en mengen van ORO oplossing op een rocker gedurende ten minste 2 uur vóór gebruik. Wikkel voordat schommelen, conische buis in paraffine tape om te voorkomen lekkage van ORO oplossing.
- Voorbereiding van wormen ORO lipide kleuring
- Groeien de wormen bij 20 ° C op de nematode groeimedium (NGM) met laat-log OP50 E. coli naar gewenste leven fase agarvoedingsbodem.
- Voeg 1 mL PBST oplossing aan de plaat en swirl totdat alle wormen uit de plaat zijn. Kantelen van de plaat en wassen met 1 mL PBST. Breng de worm een 1,5 mL microfuge buis.
- Centrifuge die de wormen bij 560 x g gedurende 1 min. Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de pellet en herhaal het wassen stap met 1 mL PBST driemaal. Verwijder alle supernatant maar 100 µL.
- 600 µL van 40% isopropanol toevoegen aan de worm pellet en rock bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
- Centrifugeer de wormen op 560 x g voor 30 s en verwijder alle supernatant maar 100 µL zonder de worm pellet te verstoren.
Opmerking: Gebruik hogere volumes PBST te wassen wormen uit platen als doet high-throughput kleuring. Wormen in PBST meer dan 15 min vóór monster fixatie niet wassen. Doen extra wast als supernatant niet van bacteriën gewist wordt. Incubation in 40% isopropanol met behulp van een nutator of rocker verrichten. Altijd controleren buizen om ervoor te zorgen volledige monster agitatie plaatsvindt.
- Lipide kleuring met ORO
- 600 µL ORO werkoplossing aan elk monster toevoegen. De buis drie keer omkeren en meng de wormen goed in ORO.
- Draaien van de monsters bij 30 omwentelingen per minuut gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer de monsters bij 560 x g gedurende 1 minuut en elimineren alle supernatant maar 100 µL.
- Resuspendeer de monsters in 600 µL van PBST en draai de buizen bij 30 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten voor het verwijderen van overtollige ORO vlek.
- Centrifugeer steekproeven bij 560 x g gedurende 1 minuut en elimineren alle maar 50 µL van de bovendrijvende substantie.
- Om een beter onderscheid de locatie van het dier germline en intestinale cellen, te beitsen kernen door toevoeging van 1 µL van (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-indole-6-carboxamidine) (DAPI) voor elke 1 mL van de werkoplossing ORO. Verrichten ORO kleuring voor 2 h met het toevoegen van de DAPI vóór montage van dia's voor imaging. Intestinale kernen zijn groter in omvang en de gonaden onderscheidt zich door de ontwikkelingslanden geslachtscellen.
Opmerking: Na ORO kleuring, wormen kunnen houden aan de zijkanten van de microfuge buis en niet een merkbaar pellet vormen. Als dit gebeurt, de wormen nogmaals centrifugeren of toestaan van wormen te regelen door de zwaartekracht voor minstens 10 min.
- Voorbereiding van de dia's van worm imaging
- Resuspendeer de wormen in het resterende supernatant en meng de oplossing goed.
- 5 µL van worm schorsing op een microscoopglaasje zetten en plaats een dekglaasje aan zorgvuldig, ervoor te zorgen dat geen lucht belletjes vorm.
- Zegel van het dekglaasje aan met nagellak en afbeelding wormen.
Opmerking: Na vaststelling en kleuring, wormen kunnen worden zeer rigide en moeilijk te Pipetteer. Om te omzeilen dat, wide-boring pipetten te maken door het afsnijden van hun tips. - De dia's opslaan in een micro-centrifuge rek bij 4 ° C gedurende maximaal 24 uur als niet onmiddellijk na de kleuring imaging.
- Beeldvorming van ORO gebeitste wormen
- Gebruik een kleur-compatibele camera naar afbeelding ORO gebeitste worms.
- 5 X vergroting gebruiken om het imago van de verschillende wormen in één gezichtsveld.
- Overschakelen naar 10 X vergroting voor betere behandeling van individuele wormen.
- Afbeeldingen in de TIF-indeling om te voorkomen dat gegevens verloren gaan als gevolg van compressie exporteren.
Opmerking: Als de kleuring met ORO + DAPI, de kleur-compatibele camera kunnen overschakelen naar één die fluorescentie vangen kan.
- Beeldanalyse van ORO gebeitste worms
- Upload micrograph(s) naar ImageJ. In het pull-down menu van Plugins, door de Bio-formaten-functie te gebruiken als het afbeeldingsbestand niet wordt herkend.
- In de afbeelding pull-down menu, onder de stapels-functie, kunt beelden-naar-Stack een afbeeldingsstapel maken wanneer verschillende microfoto worden vergeleken.
- Aanpassen Helderheid/Contrast onder het zelfde pull-down menu om de zichtbaarheid van lipide druppels te verbeteren.
- De beelden volgens lipide accumulatie in hele lichaam van het dier of in specifieke weefsels te categoriseren.
- Voor betere evaluatie van lipide lokalisatie en voor de identificatie van niet-specifieke afbeelding artefacten met behulp van ImageJ, selecteert u de functie van de kleur onder het beeld pull-down menu en klik op Stack naar RGB te tonen van de signalen van elke component RGB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SKN-1 is een bZip, cytoprotective transcriptiefactor dat homologie deelt met zoogdieren NRF2 en oxidatie van de vetzuren is gebleken. Afhankelijk van de concentratie van glucose in hun dieet Toon worms met een constitutively geactiveerd skn-1 allel verschillende lipidengehalte wanneer gekleurd met Nile rood7. Figuur 1A -C toont geactiveerd skn-1 dieren onderhevig zijn aan invloeden die leiden tot een toename van lipide niveaus. NR fluorescentie gevangen met behulp van een FITC/GFP-kanaal is prominent langs de darm, maar is minder scherp in de kop, staart en intestinale lumen. Zoals lipide-niveaus te verhogen, zijn discrete NR gebeitste deeltjes moeilijker te onderscheiden, die lagere blootstelling tijden kunnen vergen. Hoewel deze methode maakt gebruik van intensiteit van de fluorescentie als een kwantitatieve proxy voor lipide accumulatie, is onvoldoende bij aspecifieke kleuring van cellulaire structuren die niet vetreserves te onderscheiden en is gevoelig voor interferentie van intestinale auto signaal fluorescentie. Daarom, alternatieve label en niet-label methoden moeten worden gebruikt in parallel te kwantificeren ondubbelzinnig neutrale lipiden in de dierlijke10.
Leeftijd-afhankelijke somatische uitputting van Fat (Asdf), is een fenotype dat zich voordoet in leeftijd wormen waarbij dieren weer gedaald aantal somatische cellen lipiden, terwijl geslachtscellen lipiden blijven onveranderd6. Olie rood O kleuring is niet een methode die betrouwbaar kwantificeert lipide niveaus, maar is uitstekend voor het visualiseren van lipide lokalisatie en is handig voor het bepalen van vet uitputting fenotypen zoals Asdf in de worm. Terwijl het is gemakkelijk om te categoriseren de wormen volgens de aanwezigheid of afwezigheid van Asdf, kan het moeilijk zijn om dieren te identificeren met tussenliggende vetverlies (figuur 2A). In vergelijking met niet-Asdf dieren, die het vertonen van heldere rode vlekken door het hele lichaam met weinig doorzichtige gebieden (figuur 2B), vertonen Asdf wormen merkbaar vet uitputting in intestinale cellen (figuur 2C). Dieren bezig Asdf (figuur 2D) vaak Toon doorschijnende vlekken waar uiteindelijk de meeste vetverlies optreedt. Bovendien Asdf wormen kunnen nog steeds zijn voorzien van heldere rode vlekken in de kop en staart regio's omdat het fenotype is niet gedefinieerd door volledige somatische vet verlies, maar door uitgebreide vet uitputting ten opzichte van niet-verouderde (niet-Asdf) dieren. Het gebruik van olie rood O kleuring, dus zorgt voor kwalitatieve bepaling van lipide lokalisatie en de identificatie van fenotypen die wezenlijk vette stortingen in de worm veranderen.
Figuur 1: kleuring van lipiden door Nile red. Nile rode kleuring van geactiveerd skn-1 mutanten onder voorwaarden die verhoogde lipide accumulatie (A-C). De winst van functie skn-1 stam (lax188) herbergt een E237K aminozuur vervanging SKN-1 constitutively actief maakt. L4-fase wormen werden blootgesteld aan 0, 15 en 30 J/m2 UV-licht, gevolgd door een 12-h herstelperiode op unseeded NGM platen voordat NR-kleuring en beeldvorming. Beelden getoond zijn representatief voor het fenotype. Lipide kwantificering werd uitgevoerd zoals vermeld in sectie 1.7. Vuur is een ImageJ look up table (LUT) gebruikt voor het maken van een thermografie waarin fluorescentie intensiteit verschillen tussen afbeeldingen. Samenvoegen toont FITC/GFP en DIC beelden gecombineerd. Kwantificering van de intensiteit van de fluorescentie voor elke afbeelding wordt weergegeven aan de onderkant van de beeld-montage. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: rode O. kleuring van lipiden door olie Olie rood O kleuring van geactiveerd skn-1 mutanten (lax188) weergegeven: de aanwezigheid of afwezigheid van het Asdf fenotype (A-D). A & D Toon dieren met tussenliggende Asdf fenotypen. B & C-beeldscherm tegenovergestelde ORO-kleuring. B weliswaar niet-Asdf, toont C aanzienlijke somatische vet uitputting met erop vooruitgaat in germline vet accumulatie, waarin het Asdf fenotype. De wormen waren bevlekt met ORO gevolgd door imaging 144 hafter L1-gesynchroniseerde dieren werden geplaatst op NGM media bezaaid met OP50 bacteriën. Beelden getoond zijn representatief voor dieren met of zonder het Asdf fenotype. Inzet cartoons zijn van Lynn, et al. gewijzigd 6 en vertegenwoordigen de afwezigheid (B) of (C) aanwezigheid van somatische vet uitputting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De toename van zwaarlijvigheid en stofwisselingsziekte tarieven maakt C. elegans een geschikt model te bestuderen van de mechanismen die vet accumulatie in cellen en weefsels regelen. Recent bewijs suggereert dat de veranderingen in lipide-niveaus zijn gecorreleerd met cellulaire processen variërend van insuline8, de activering van hormoon receptoren2, tot voortplantingsresultaat5signalering. In vergelijking tot label-vrije microscopie en chromatografie methoden, Nijl rode en olie rood O zijn relatief goedkope kleurstoffen gebruikt om neutrale lipiden in de worm consequent vlek en reproducibly10,12,13. De eerste voorziet de kwantificering van totale lipide-niveaus, terwijl de tweede de beoordeling van lipide verdeling over weefsels zoals het hypodermis, darm en de kiembaan vergemakkelijkt. Wanneer gebruikt in combinatie, NR en ORO in staat stellen de onderzoekers om te bepalen hoe genotype en veranderingen in het milieu lipide accumulatie beïnvloeden en waar in de worm deze wijzigingen zich voordoen.
Deze kleurstoffen, niettemin, doen niet direct beoordelen lipide accumulatie op dezelfde niet-invasieve wijze evenals auto's microscopie12. Dus, ze zijn gevoelig voor fouten tijdens de fixatie en kleuring, die kunnen compromis meting nauwkeurigheid13. Bovendien, deze kleurstoffen per ongeluk kunnen interageren met de lipofuscin en intestinale korrels, resulterend in fluorescentie niet verwant aan intracellulaire neutrale vet opgeslagen10,14. Bovendien, in gevallen waar de lipide niveaus laag, lijken NR en ORO kleuring kan geen onderscheid maken als de uitkomst uit permeabiliteit kwesties voortvloeit of vet ophoping verminderd. De gevoeligheid van deze vlekken aan het licht vereist bovendien speciale maatregelen tijdens opslag en actieve behandeling die grens de afbraak en de foto's bleken. Echter als voorzichtigheid wordt betracht bij het uitvoeren van en het trekken van conclusies uit label-gebaseerd testen, NR en ORO kleuring uitstekend middel van voorwaartse genetische schermen te bestuderen van lipide metabolisme trajecten en hun interacties met andere fysiologische onderzoeken functies. Het gebruik van daf-2 en vet-6 wormen is aanbevolen relatieve om vergelijkingen te maken van verhoogde en verminderde lipide accumulatie, respectievelijk. Het wassen en fixering van stappen voor NR en ORO kleuring zijn vergelijkbaar. Daarom kunnen beide worden uitgevoerd op dezelfde dag. Echter kunnen alleen de dia's met ORO gebeitste wormen worden opgeslagen voor later imaging omdat onsamenhangend NR kleuring na 6 uur is. Tijdens het wassen is het van cruciaal belang om op te nemen van Triton 100-X niet alleen om de permeabiliteit NR en ORO, maar ook om te voorkomen dat het verlies van de worm als gevolg van buitensporige aanhankelijkheid aan plasticware. Bovendien moeten op de wormen minder dan 30 minuten vóór de kleuring om ervoor te zorgen maximale doorlatend zijn voor elke vlek worden gewassen. Terwijl NR en ORO incubatie keer mag worden verminderd tot 1 uur en 30 min, respectievelijk, wordt het aangemoedigd om het volgen van de tijd die in dit artikel voor meer consistente kleuring en imaging resultaten worden voorgesteld. Langdurige blootstelling van NR oplossing aan licht en mislukking voor het filteren van ORO oplossing voordat gebruik achtergrond fluorescentie tijdens beeldvorming zal toenemen. Uitvoeren van deze kleuring protocollen vereist 3-4 h naast imaging tijd. Hoewel vlek incubatie hooguit 2 h van pauze tussen stappen biedt, het is raadzaam dat de protocollen worden uitgevoerd met zo weinig onderbrekingen mogelijk om de vele bronnen van fout die inherent zijn aan alle kleurstof gebaseerde methoden van lipide kwantificering en examen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd mogelijk gemaakt door de NIH-subsidie: R01GM109028 (S.P.C.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imager.M2m Microscope | Zeiss | n/a | Fluorescence microscope |
| ERC5s camera | Axiocam | n/a | Color-capable |
| MRm camera | Axiocam | n/a | Fluorescence-capable |
| Nile red | Thermo Fisher | N1142 | Lipid Stain |
| Oil red O | Alfa Aesar | A12989 | Lipid Stain |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | DNA stain |
| Isopropyl Alcohol | BDH | BDH1133-1LP | Fixative solution |
| 0.2 µm seterile syringe filter | VWR | 28145-477 | Cellulose acetate filter |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5428000015 | Centrifuge |
| Shaker Rotisserie | Lab Quake | 400110Q | Shaker |
| Tube Rotator | VWR | 10136-084 | Rotator |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 7758-11-4 | NGM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | NGM |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 7786-30-3 | NGM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | NGM |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NGM |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGM |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | NGM |
| Agar | Teknova | L9110 | NGM |
| LB media | Sigma-Aldrich | L3147 | Bacterial growth |
References
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).
- Horobin, R. W., Kiernan, J. A. Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. , BIOS Scientific Publishers. (2002).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis. Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).
- Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans. P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).
- Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation. Nat Commun. 5, (2014).
- Saltiel, A. R., Kahn, C. R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).
- Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans. Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).
- Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PloS One. 5 (9), e12810 (2010).
- Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 14 (1), 164 (2013).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (73), (2013).
- O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).
