Summary
Nil sabit Caenorhabditis elegans boyama kırmızı tarafsız lipid mevduat, nicel ölçüm için bir yöntem ise petrol kırmızı O boyama doku arasında lipid dağıtım nitel değerlendirilmesi kolaylaştırır.
Abstract
Caenorhabditis elegans hangi lipid metabolizması ve enerji homeostazı çalışmaya bir olağanüstü model organizmadır. Birçok onun lipit genlerin insanlarda korunmuş ve metabolik sendrom veya diğer hastalıklar ile ilişkili. Bu organizma lipid birikimi incelenmesi sabitleştirici boyalar veya etiket içermeyen yöntemleri tarafından yürütülen olabilir. Sabitleştirici lekeleri gibi Nil kırmızı ve kırmızı O petrol ucuz, güvenilir yolu kantitatif lipid düzeyleri ölçmek için ve niteliksel lipid dağıtım dokular arasında sırasıyla gözlemlemek için vardır. Ayrıca, bu lekelerin çeşitli lipid metabolizma genler ve yolları yüksek üretilen iş tarama için izin verir. Ayrıca, hidrofobik doğaları lipid çözünürlük kolaylaştırır, dokuları çevreleyen ile etkileşim azaltır ve ayrılma çözücü içine önler. Bu yöntemler genel lipid içeriğin incelenmesi etkili olmasına rağmen onlar kimyasal bileşimi ve lipid mevduat çeşitliliği hakkında ayrıntılı bilgi vermeyin. Bu amaçlar, GC-MS ve araçların mikroskobu gibi yöntemler etiket içermeyen daha iyi için uygundur, maliyetlerini rağmen.
Introduction
Lipidler yaşam için gerekli. Membranlar ayrılmaz bileşeni vardır, ikincil haberci hareket ve güç çeviriciler sinyal ve enerji depolama alanında çok önemli işlevlere sahiptir. Lipid metabolizma dysregulated olduğunda, obezite ve tip II diyabet, halk sağlığı sorunları9tuşuna basarak gibi hastalıklara yol açar. Caenorhabditis elegans (C. elegans) hangi nispeten kısa bir yaşam döngüsü, şeffaf bir beden, bilinen hücre soy ve tam sıralı genom olduğundan lipid metabolizma çalışmaya bir mükemmel model organizmadır. Öncelikle bir hermafrodit, C. elegans araştırmacılar isogenic hayvanlar çok sayıda kısa süreler metabolik genler ve yollar4geniş bir dizi çalışmaya carryout yüksek üretilen iş ileri genetik filtrelerine yükseltmek için izin verir. Bu yaklaşım koruma genlerdeki 273 C. elegans lipid metabolizma insanlar, fare, sıçan ve drosophila arasında yüksek derecede ortaya koymuştur. Ayrıca, metabolik sendrom11' e ilgisi olmayan hastalıklar ile ilişkili olan insan orthologues C. elegans 300'den fazla lipid genlerinde var. Geleneksel olarak, lipid depolama incelenmesi C. elegans içinde çoğunlukla lipid birikimi hakkında sağlam bilgi boya etiketli deneyleri üzerinde güvendi. Daha az ortak bir nerede lipidler yerelleştirilmesine ve lipid bereket ölçülen farklılıkları dokular arasında açıklamasıdır. Ancak, son iş lipid dağıtım olarak lipid birikimi6önemli olabilir ortaya koymuştur.
Son zamanlarda, çalışmaları gibi yüksek performanslı sıvı Kromatografi-Kütle spektrometresi (HPLC-MS), Gaz Kromatografi-Kütle spektrometresi (GC-MS) yöntemlerle entegre başlamıştır ve tutarlı anti-Raman saçılması (CARS) mikroskopi adresine stokes eksiklikleri doğrudan lipid özleri, belirli lipid fraksiyonları ve lipid mevduat, sırasıyla10,11içeriğini analiz tarafından leke tabanlı yaklaşımlar. Ayrıca, arabalar mikroskobu Nil kırmızı yalnızca hedef kapalı otomatik floresan organelleri10/ boyama için hayati bir leke yol açar gibi bir sabitleştirici boya kullanımı için kullanıldığında yağ birikimi için bir proxy olarak hizmet verebilir ortaya koymuştur. Ancak, gerekli teknik uzmanlık ve maliyetleri bu Kromatografi ile ilişkili ve mikroskopi yöntemleri bunların kullanımı için birçok araştırma soruları savunulamaz yapabilirsiniz. Bu makalede, biz rahat ve güvenilir bir yöntem bağlamak ve Nil kırmızı kullanarak C. elegans yataklarında tarafsız lipid leke ve lipid bereket bütün hayvanlar ve belirli dokuları ayırt etmek için kırmızı O petrol tartışıyorlar.
Nil, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, kolayca çeşitli organik çözücüler çözülür, ama çoğunlukla suda çözünmeyen bir benzophenoxazone boya kırmızıdır. Trigliserit gibi nötr lipitler leke için mükemmel lysochrome boya kullanılan ya da kolesterol esterleri güçlü bir renk kullandığından de lipidler solubilizes, dokuları çevreleyen ile ihmal edilebilir etkileşim ve çözücü içinde daha az çözünür lipidler. 450-500 ve 520 nm, sırasıyla1uyarma ve emisyon maxima vardır. C. elegans kırmızı lekeli Nil için yeşil Floresans görüntülenirken, ayrık lipid organları bağırsak ve diğer dokuların içinde her iki kümeleri gözlenen olabilir veya eşit dağınık, hayvanın genotip veya deneysel tedavi bağlı olarak 7.
Yağ kırmızı O bir lysochrome, trigliserid ve lipoproteinler leke için kullanılan yağda çözünen boya olduğunu. Azo boya denir, çünkü onun kimyasal yapısı üç aromatik yüzük için bağlı iki azo grubu içerir. Hangi yağlar içinde yüksek oranda çözünür işler iyonize zordur. Leke rengi kırmızı ve onun ışık emilimi en fazla 518 nm 3. C. elegans yağ kırmızı O göstermek farklı dokuların6arasında lipid dağıtım nitel değerlendirilmesi kolaylaştırır hayvanın şeffaf vücut karşı öne kırmızı lipid damlacıkları ile lekeli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nil kırmızı (NR) lipitler boyama
- 5 mg/mL NR hisse senedi çözüm hazırlanması
- 500 mL şişe NR tozu 100 mg 200 mL % 100 aseton ekleyin.
- Işık için herhangi bir maruz önlemek için alüminyum folyo ile şişe kapağı.
- Önce kullanma, belgili tanımlık eriyik için 2 h karanlıkta karıştırın.
- Uzun süreli kullanım için NR hisse senedi çözüm olmadan herhangi bir ışık pozlama sıkıca kapalı bir şişede saklayın. Ölçek NR hisse senedi araştırma gereksinimlerinize uygun bir çözüm. Aynı hisse senedi çözüm NR boyama deneyler tutarlı boyama ve sonuçları görüntüleme elde etmek için kullanıldığından emin olun.
- NR çalışma çözüm hazırlanması
- % 40 isopropanol (v/v) her 1 mL için 6 µL NR hisse senedi çözüm ekleyin.
- NR çalışma çözüm 600 µL her örnek için hazırlayın.
Not: taze NR boyama önce çözüm değil çalışma yapmak. NR hisse senedi çözüm ihtiyaçlarınıza bağlı olarak, kullanım 15 mL veya 50 mL konik tüp mezun oldu.
- NR lipid boyama için hazırlanması solucanlar
- Solucanlar için erken L4 sahneye geç günlük OP50 E. coliile seribaşı nematodunun büyüme orta (NGM) 20 ° C'de büyümek.
- 1 mL 1 x fosfat tamponlu tuz + % 0,01 Triton X-100 (PBST) çözüm ile plaka kapalı solucanlar yıkama ve 1.5 mL microfuge tüpte solucan süspansiyon koymak.
- Santrifüj 560 x g 1 dk. de süpernatant ve tekrar bu adım E. coli kadar temizlenir süspansiyon solucanlarını.
- % 40 isopropanol 100 µL solucan Pelet ekleyin ve 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Santrifüj kapasitesi 560 x g 1 dk. için de kurt ve solucan Pelet aksatmadan süpernatant kaldırın.
Not: Eğer solucanlar plakaları kapalı yıkamayı PBST kullanımı daha yüksek hacimli büyük tabak kullanarak veya plaka başına daha fazla solucanlar boyama. Solucanlar örnek fiksasyon önce 15 dk içinde PBST daha yıkama yok. Süpernatant bakteri temizlenmez ise ek yıkama yapar. Bir nutator veya rocker kullanarak % 40 isopropanol kuluçka yerine getirir. Her zaman tam örnek ajitasyon oluştuğunu emin olmak için tüpler monitör.
- Lipid NR ile boyama
- Karanlıkta, her örnek için 600 µL NR çalışma çözüm ekleyin. Tüpler üç kez ters çevir ve tam solucanlar NR çözüm içinde karıştırın.
- Örnek 2 h için oda sıcaklığında karanlıkta döndürün.
- Kuluçka, solucanlar, 560 x g 1 dk. için santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
- PBST 600 µL ekleyin ve aşırı NR leke kaldırmak 30 dk için karanlıkta örnekleri kuluçkaya.
- 560 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi ve tüm yaklaşık 50 µL süpernatant, kaldırın.
Not: NR kuluçka ajitasyon gerektirmez. Kurtlardan yerleşme bu adımı sırasında yaygındır.
- Slaytların hazırlanması için mikroskop düşsel
- Solucan Pelet kalan süpernatant resuspend.
- Solucan süspansiyonun 5 µL mikroskop slayt üzerinde yerleştirin ve bir coverslip dikkatli herhangi bir hava kabarcıkları yakalama önlemek için koymak.
- Coverslip tırnak cilası ile solucanlar Imaging önce kapatın.
- Sadece birkaç slayt teker teker hazırlayın. Bu NR görüntüleme örnekler üzerindeki sabit kalır garanti eder. NR lekeli görüntü kalitesini 6 h. ayrık lipid damlacıkları gözlemlemek zor ve arka plan Floresans artar, hangi NR sinyal algılama ile müdahale sonra azalır.
- NR lekeli Worms görüntüleme
- Görüş alanı başına birkaç hayvan yakalamak için 5 X büyütme, solucanlar görüntü.
- Bireysel Worms daha iyi miktar için 10 X büyütme geçin.
- NR lekeli solucanlar görüntü ve miktar için en uygun koşulları belirlemek için farklı pozlama kez denemek için FITC/GFP kanal kullanın.
- Dosyaları sıkıştırma nedeniyle veri kaybını önlemek için TIF biçiminde kaydedin.
Not: Tipik pozlama bir en uygun pozlama süresi sahip 100-1000 Bayan arasında değişen zaman, tüm örnekleri için görüntüleme tutarlılığı korumak için kullanın.
- NR boyama görüntü miktar
- Filmler ImageJ için yükleyin. Eğer belgili tanımlık imge eğe değil tanınan Eklentiler aşağı açılır menüsünden biyo-biçimleri işlevini kullanın.
- Yığın fonksiyonu altında görüntü aşağı açılır menüde resim yığını birkaç Filmler karşılaştırıldığında görüntü yığını oluşturmak için kullanın.
- Aynı aşağı açılır menüde parlaklık/kontrast görüntü yığını olarak ayarlayın ve Uygula tıklayarak tüm görüntüleri değişiklikleri yaymak.
- Her görüntülü solucan betimlemek ve floresan yoğunluğu NR tarafından yayılan ölçmek için Analysis açılan menü altında ölçü işlevini kullanın için Çokgen seçim aracını kullanır.
- Her resim için beş arka plan yerlerde ölçmek ve ortalama arka plan floresan yoğunluğu hesaplayın.
- Arka plan floresan yoğunluğu formül N kullanarak her görüntülü solucan üzerinden çıkarma = G - (A B x), N net Floresan, brüt floresan için G, toplam solucan alan için A ve B için ortalama arka plan Floresans nerede anlamına gelir.
- Floresan yoğunluğu solucan boyutuna göre normalize etmek her solucan'ın net Floresans Rumeli tarafından bölün. Sonuçlar floresan yoğunluğu, rasgele birimleri (yapıyordum), piksel başına olarak rapor edilir.
Not: resimleri JPEG formatında dışa aktarma kaçının. Sıkıştırma dosyaları depolamak için daha kolay yönetilebilir yapar iken, veri bütünlüğü bu biçim tarafından güvenilir değil. Tüm görüntüleri değiştirilmiş ve aynı şekilde analiz emin olun. Düzgün farklı büyüklüklerde boyutta değerlendirmek için bir ölçek çubuğu eklemeyi unutmayın. ImageJ kullanarak floresan yoğunluğu farklılıkları daha iyi görselleştirmek için 8-bit RGB görüntü türünden geçiş ve yangın görüntü arama tabloları (LUT) menüsünden seçin. Bu artan hangi renk parlaklığı artmış floresan yoğunluğu ile ilişkili olan bir ısı haritası görüntü oluşturur.
2. yağ kırmızı O (ORO) lipidler boyama
- ORO hisse senedi çözüm hazırlanması
- 250 mL şişe ORO toz 500 mg 100 mL % 100 isopropanol ekleyin ve iyice karıştırın.
- Bir kez hazırlanan, hiçbir ışık pozlama ile sıkı kapalı çözüm saklayın.
- ORO çalışma çözüm hazırlanması
- Su (3:2) için % 60 isopropanol ORO hisse senedi çözümde sulandırmak.
- Kullanmadan önce çalışan ORO çözüm 0.2 µm selüloz asetat steril enjektör filtre ile filtre.
Not: En iyi çözüm kalite için çalışan ORO çözüm önceki gün hazırlamak ve gecede karışımı sağlar. Ancak, çözüm gerekli aynı gün ise seyreltik ve ORO çözüm üzerinde bir rocker kullanmadan önce en az 2 h için karıştırın. Sallanan önce parafin kaseti ORO çözüm kaçağı önlemek için konik tüp sarın.
- Solucanlar ORO lipid boyama için hazırlanması
- 20 ° C'de solucanlar nematodunun büyüme orta (NGM) günlük geç OP50 E. coli için istenilen hayat sahne ile seribaşı büyümek.
- 1 mL PBST çözeltisi plakasına eklemek ve tüm solucanlar tabağını olana girdap. Plaka eğim ve PBST 1 mL ile yıkayın. Solucan süspansiyon 1.5 mL microfuge tüp aktarın.
- Santrifüj 560 x g 1 dk. de süpernatant Pelet ve çamaşır adım PBST 1 mL ile üç kez tekrar rahatsız etmeden solucanlarını. Tüm süpernatant ama 100 µL kaldırın.
- % 40 isopropanol 600 µL solucan Pelet ekleyin ve 3 dakika oda sıcaklığında salla.
- G 30 s ve Kaldır tüm süpernatant ama 100 µL x 560, solucanlar solucan Pelet aksatmadan santrifüj kapasitesi.
Not: Eğer yüksek üretilen iş Boyama yaparken solucanlar plakaları kapalı yıkamak için PBST daha yüksek miktarda kullanın. Solucanlar örnek fiksasyon önce 15 dk içinde PBST daha yıkama yok. Süpernatant bakteri temizlenmez ek yıkama yapın. Kuluçka nutator veya rocker kullanarak % 40 isopropanol içinde yerine getirir. Her zaman tam örnek ajitasyon oluştuğunu emin olmak için tüpler monitör.
- Lipid ORO ile boyama
- 600 µL ORO çalışma çözüm her örnek için ekleyin. Tüp üç kez ters çevir ve de ORO de solucan karıştırın.
- Örnekleri için oda sıcaklığında 2 h 30 RPM döndürme.
- 560 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi ve tüm süpernatant ama 100 µL ortadan kaldırmak.
- Örnekleri PBST 600 µL içinde resuspend ve tüpler aşırı ORO leke kaldırmak 30 dk 30 RPM döndürün.
- 560 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi ve tüm 50 µL süpernatant, ortadan kaldırmak.
- Hayvan germline ve bağırsak hücreleri konumunu daha iyi ayırt etmek için leke çekirdeği 1 µL ekleyerek (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-indol-6-carboxamidine) (DAPI) her 1 mL ORO çalışma çözeltisi için. Slayt görüntüleme için montaj öncesinde DAPI ekleyerek 2 h için ORO boyama dışarı taşımak. Bağırsak çekirdek boyutu daha büyük ve erbezi gelişmekte olan germ hücreleri tarafından ayırt edilir.
Not: boyama ORO sonra solucan microfuge tüp taraf için uygun ve göze çarpan bir Pelet oluşturmak başarısız. Bu durumda, solucanlar tekrar santrifüj kapasitesi ve solucanlar yerçekimi tarafından en az 10 dakikadır yerleşmek izin vermeyin.
- Imaging solucan için slaytların hazırlanması
- Solucanlar kalan süpernatant içinde resuspend ve çözüm karıştırın.
- Solucan süspansiyonun 5 µL mikroskop slayt üzerinde koymak ve bir coverslip dikkatle, havasız formu kabarcıklar sağlanması yer.
- Coverslip tırnak cilası ve görüntü solucanlar ile kapatın.
Not: sabitleme ve boyama sonra solucanlar çok sert ve pipet zor olabilir. Bu sorunu çözecek, onların ipuçları keserek wide-geçişli Pipetler olun. - Hemen boyama sonra görüntüleme değil Eğer bir mikro-santrifüj raf için en fazla 24 Saat 4 ° C'de slaytları saklayın.
- ORO lekeli Worms görüntüleme
- Bir renk özellikli kamera görüntü ORO lekeli solucanlar için kullanın.
- 5 X büyütme bir görüş alanı içinde çeşitli solucanları görüntü için kullanın.
- Bireysel solucanlar daha iyi incelenmesi için 10 X büyütme geçin.
- Sıkıştırma nedeniyle veri kaybını önlemek için TIF biçimdeki görüntüleri dışa aktarın.
Not: boyama ORO + DAPI, renk özellikli kamera Floresans yakalayabilir bir geçiş.
- Worms ORO lekeli görüntü analizi
- Micrograph(s) ImageJ için yükleyin. Eğer belgili tanımlık imge eğe değil tanınan Eklentiler aşağı açılır menüsünden biyo-biçimleri işlevini kullanın.
- Yığın fonksiyonu altında görüntü aşağı açılır menüde resim yığını birkaç Filmler karşılaştırıldığında görüntü yığını oluşturmak için kullanın.
- Parlaklık/Kontrast lipid damlacıkları görünürlüğünü artırmak için aynı açılan menü altında ayarlayın.
- Görüntüleri lipid birikimi hayvanın vücut boyunca veya belirli dokulara göre kategorize.
- Lipid yerelleştirme daha iyi değerlendirilmesi ve belirsiz görüntü eserler ImageJ kullanarak tanımlanması için görüntü aşağı açılır menüsünden renk işlevi seçin ve yığın RGB sinyalleri her RGB bileşeninin göstermek için tıklatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BZip, cytoprotective transkripsiyon faktörü homoloji memeli NRF2 ile paylaşan ve yağ asidi oksidasyon arabuluculuk göstermiştir SESN-1 dir. Onların yiyecek glikoz konsantrasyonu bağlı olarak yapısal aktif skn-1 gen kurtlarla ne zaman Nil kırmızı7ile lekeli farklı lipid düzeyleri göster. Şekil 1A -c aktif skn-1 hayvanlar lipid düzeyleri artan yol koşullarına maruz gösterir. NR Floresans FITC/GFP kanal kullanılarak yakalanan bağırsak önemli, ama baş, kuyruk ve intestinal Lümen dimmer. Lipid düzeyleri arttıkça, ayrık parçacıklar NR lekeli hangi düşük pozlama süreleri gerekli ayırt etmek daha zordur. Bu yöntemde floresan yoğunluğu nicel bir proxy olarak lipid birikimi için kullanılır rağmen belirsiz yağ depoları olmayan hücresel yapıları boyama ayırt etme yetersiz ve bağırsak otomatik müdahalelerden sinyal eğilimli Floresan. Bu nedenle, alternatif etiket ve etiket olmayan yöntemleri paralel olarak belirsizliğe yer bırakmadan hayvan10nötr lipitler ölçmek için kullanılmalıdır.
Yaş bağımlı somatik tükenmesi Fat (Asdf), germ hücreli lipidler değişmeden6kalırken somatik hücre lipidler, yaşlı kurt sayede hayvanlar görüntülemek oluşur bir fenotip azalma var. O yağ kırmızı boyama güvenilir lipid düzeyleri, quantifies ama lipid yerelleştirme görüntülenmesi için mükemmel ve solucan içinde Asdf gibi şişman tükenmesi fenotipleri belirlemek için yararlıdır bir yöntem değildir. Solucanlar Asdf olup göre kategorize etmek kolay olmakla birlikte, hayvan ara yağ kaybı (şekil 2A) ile tanımlamak zor olabilir. Parlak kırmızı kaç saydam alanları (şekil 2B) ile vücuda boyama göstermek, Asdf olmayan hayvanlar için karşılaştırıldığında Asdf solucanlar bağırsak hücreleri (şekil 2C) fark şişman tükenmesi sergi. Hayvanlar genellikle Asdf (şekil 2B) geliştirme sürecinde yarı saydam noktalar sonunda çoğu yağ kaybı oluştuğu göster. Ayrıca, Asdf solucanlar hala fenotip tam somatik yağ kaybı, ancak geniş yağ tükenmesi göre yaşlı olmayan (non-Asdf) hayvanlar tarafından tanımlı olmadığı için parlak kırmızı kafa ve kuyruk bölgelerde boyama özelliği olabilir. Yağ kırmızı O boyama, böylece, lipid yerelleştirme nitel belirlenmesi ve önemli ölçüde yağ mevduat solucan değiştirmek fenotipleri tanımlaması için sağlar.
Şekil 1: Nil red. tarafından lipidler boyama Nil kırmızı, boyama skn-1 mutantlar artan lipid birikimi (A-C) temin koşullar altında aktif. İşlev skn-1 zorlanma ve kazanç (lax188) SKN-1 yapısal etkin işleyen bir E237K amino asit ikame limanlar. L4-sahne solucanlar 0, 15 ve 30 J/m2 UV ışık ardından bir 12-h kurtarma nokta seribaşı NGM Tabaklarda NR boyama ve görüntüleme önce maruz bırakıldı. Gösterilen resimler fenotip temsilcisi vardır. Lipid miktar 1.7 bölümünde belirtildiği gibi gerçekleştirildi. Floresan görüntü arasında yoğunluk farkları gösterir bir termal görüntü oluşturmak için kullanılan tablo (LUT) bir ImageJ aramak ateştir. Birleştirme kombine FITC/GFP ve DIC görüntüleri gösterir. Floresan yoğunluğu her resim için miktar görüntü montaj alt kısmında gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: lipidler tarafından boyama yağ kırmızı O. Ve O yağ kırmızı boyama Asdf fenotip (A-D) olup gösterilen skn-1 mutantlar (lax188) aktif. A & D Haritayı ara Asdf fenotipleri hayvanlarla. B & C ters ORO-boyama görüntüle. B sigara Asdf olmakla birlikte, C Asdf fenotip tanımlayan germline yağ birikimi, önemli somatik şişman tükenmesi ile eşlik eden artış gösterir. Solucanlar 144 Imaging tarafından takip ORO ile lekeli L1 senkronize hafter hayvanlara OP50 bakteri ile seribaşı NGM medyada yerleştirildi. Gösterilen resimler hayvanlar ile ya da ezelî Asdf fenotip temsilcisi vardır. İç metin karikatürler Lynn, et al. değiştirilir 6 ve devamsızlık (B) veya somatik yağ azalması (C) varlığı temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Obezite ve metabolik hastalık oranları artış C. elegans hücre ve dokuların yağ birikimi düzenleyen mekanizmalar çalışmaya uygun bir model haline getirir. Son kanıtlar lipid düzeyleri değişiklikleri8, hormon reseptörleri2, üreme çıktı5aktivasyonu sinyal insülin arasında değişen hücresel süreçleri ile ilişkili gösteriyor. Etiket içermeyen mikroskobu ve Nil kırmızı ve petrol Kromatografi yöntemleri ile karşılaştırıldığında kırmızı O solucan nötr lipitler sürekli leke için kullanılan nispeten ucuz boyalar ve tekrarlanarak10,12,13vardır. İkinci hypodermis, bağırsak ve germ hattı gibi dokularda arasında lipid dağıtım değerlendirilmesi kolaylaştırır sürece ilk toplam lipid düzeyleri, miktar için sağlar. Birlikte kullanılan, NR ve ORO genotip ve çevresel değişiklikler lipid birikimi etkilemesi ve solucan içinde oluştuğu bu değişiklikleri belirlemek araştırmacılar etkinleştirin.
ARABALAR mikroskobu12olduğu gibi bu boya, yine de, doğrudan lipid birikimi aynı non-invaziv şekilde değerlendirmek değil. Bu nedenle, onlar sırasında fiksasyon için hatalar yatkındır ve boyama, hangi ölçüm doğruluğu13tehlikeye atabilir. Ayrıca, bu boyalar yanlışlıkla etkileşebilen lipofuscin ve bağırsak granülleri ile hücre içi nötr yağ için ilgisiz Floresans sonuçlanan10,14depolar. Buna ek olarak, sonuç geçirgenliği sorunlarından sonuçları veya yağ birikimi azaltılmış lipid düzeyleri düşük, görüntülendiği durumlarda NR ve ORO boyama ayırt edemez. Ayrıca, bu lekelerin ışığa karşı duyarlılığını özel önlemler bozulması ve ağartma fotoğraf depolama ve etkin bu sınırı işleme sırasında gerektirir. Ancak, dikkatli icra gerçekleştirme ve etiket tabanlı deneyleri, NR kararınızı ORO boyama lipid metabolizma yolları çalışma ve diğer fizyolojik ile ilişkileri incelemek için ileri genetik ekranlarının mükemmel anlamına gelir eğer ve fonksiyonlar. Daf-2 ve yağ-6 solucanlar kullanılması sırasıyla artan ve azalan lipid birikimi göreceli karşılaştırmalar yapmak tavsiye edilir. Çamaşır ve NR ve ORO için adımları sabitliyor boyama benzer. Bu nedenle, her ikisi de aynı günde yapılabilir. Ancak, yalnızca slaytları ORO lekeli solucanlarla NR boyama sonra 6 h aykırı olduğu için daha sonra görüntüleme için saklanabilir. Yıkama sırasında Triton 100-X sadece geçirgenliği NR ve ORO için geliştirmek için ama aynı zamanda plasticware aşırı bağlılığı nedeniyle solucan kaybını önlemek için dahil etmek önemlidir. Buna ek olarak, solucanlar az 30 dk her leke için maksimum geçirgenliği sağlamak için boyama önce yıkanmalıdır. NR ve ORO kuluçka süresi 1 saat 30 dk için sırasıyla azalabilir iken, daha tutarlı boyama ve sonuçları görüntüleme için bu makalede önerilen zaman izlemek için teşvik edilir. Işık ve kullanım görüntüleme sırasında arka plan Floresans artacaktır önce ORO çözüm filtrelemek için başarısızlık için uzun süreli pozlama NR çözüm. Bu boyama protokoller taşıyan 3-4 h ek olarak görüntüleme saat gerektirir. En az 2 h adımları arasında duraklama leke kuluçka sunar rağmen iletişim kuralları ile az kesinti hata tüm boya tabanlı yöntemler lipid miktar için doğasında birçok kaynaktan azaltmak için mümkün olduğunca yapılmaktadır ki önerilir ve sınav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.
Acknowledgments
Bu eser NIH grant tarafından mümkün yapıldı: R01GM109028 (S.P.C.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imager.M2m Microscope | Zeiss | n/a | Fluorescence microscope |
| ERC5s camera | Axiocam | n/a | Color-capable |
| MRm camera | Axiocam | n/a | Fluorescence-capable |
| Nile red | Thermo Fisher | N1142 | Lipid Stain |
| Oil red O | Alfa Aesar | A12989 | Lipid Stain |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | DNA stain |
| Isopropyl Alcohol | BDH | BDH1133-1LP | Fixative solution |
| 0.2 µm seterile syringe filter | VWR | 28145-477 | Cellulose acetate filter |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5428000015 | Centrifuge |
| Shaker Rotisserie | Lab Quake | 400110Q | Shaker |
| Tube Rotator | VWR | 10136-084 | Rotator |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 7758-11-4 | NGM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | NGM |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 7786-30-3 | NGM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | NGM |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NGM |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGM |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | NGM |
| Agar | Teknova | L9110 | NGM |
| LB media | Sigma-Aldrich | L3147 | Bacterial growth |
References
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).
- Horobin, R. W., Kiernan, J. A. Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. , BIOS Scientific Publishers. (2002).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis. Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).
- Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans. P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).
- Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation. Nat Commun. 5, (2014).
- Saltiel, A. R., Kahn, C. R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).
- Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans. Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).
- Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PloS One. 5 (9), e12810 (2010).
- Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 14 (1), 164 (2013).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (73), (2013).
- O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).
