Summary
Dieses Protokoll analysiert Navigations Verhalten von Drosophila Larve in Reaktion auf die gleichzeitige optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen. 630 nm Wellenlänge wird verwendet, um einzelne olfaktorischen Neuronen mit dem Ausdruck einer rot-verschoben Kanal Rhodopsin zu aktivieren. Larval Bewegung gleichzeitig verfolgt, digital erfasst und mit individuell geschriebenen Software analysiert.
Abstract
Die Fähigkeit der Insekten zu navigieren in Richtung Geruch Quellen basiert auf die Aktivitäten von ihr erster Ordnung olfaktorischen Rezeptor Neuronen (ORNs). Während eine beträchtliche Menge an Informationen über ORN Antworten auf Geruchsstoffe generiert wurde, bleibt die Rolle der spezifischen ORNs in Fahrt Verhaltensreaktionen schlecht verstanden. Komplikationen bei Verhalten Analysen entstehen durch verschiedene Volatilitäten von Geruchsstoffen, die einzelnen ORNs, mehrere ORNs durch einzelne Riechstoffe und die Schwierigkeit bei der Replikation natürlich beobachteten zeitlicher Variationen in olfaktorische Reize mit aktiviert aktivieren konventionelle Geruch-Liefermethoden im Labor. Hier beschreiben wir eine Protokoll, die Drosophila Larven Verhalten in Reaktion auf die gleichzeitige optogenetische Stimulation von seiner ORNs analysiert. Die hier verwendete optogenetische-Technologie ermöglicht Spezifität der ORN Aktivierung und präzise Steuerung der zeitlichen Muster der ORN Aktivierung. Entsprechenden Larven Bewegung wird nachverfolgt, digital erfasst und mit individuell erstellten Software analysiert. Geruch-Reize durch Lichtreize ersetzen, ermöglicht diese Methode für eine präzisere Steuerung der einzelnen ORN Aktivierung um ihre Auswirkungen auf die Larven Verhalten zu studieren. Unsere Methode konnte weiter ausgebaut werden, um die Auswirkungen von zweiter Ordnung Projektion Neuronen (PNs) sowie lokale Neuronen (LNs) auf Larven Verhalten zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht somit eine umfassende Dissektion der olfaktorischen Schaltung Funktion und Ergänzung Studien wie olfaktorischen Neuronen Aktivitäten übersetzen im Verhalten Antworten.
Introduction
Olfaktorische Informationen in eine Drosophila Larve Umgebung ist von nur 21 funktional unterschiedliche ORNs, die Aktivitäten spürte davon letztlich Larven Verhalten1,2,3,4bestimmen. Jedoch ist relativ wenig über die Logik bekannt durch die sensorischer Informationen an den Aktivitäten der diese 21 ORNs codiert ist. Es muss somit die funktionale Beiträge jedes Larven ORN Verhalten experimentell zu messen.
Obwohl das sensorische Reaktionsschema des gesamten Repertoires von Drosophila Larven ORNs in Detail1,4,5, die Beiträge der einzelnen ORNs, die olfaktorische Schaltung und damit untersucht worden Navigations Verhalten bleiben weitgehend unbekannt. Schwierigkeiten im Larvenstadium Verhalten Studien bisher aufgrund der Unfähigkeit, räumlich und zeitlich einzelne ORNs aktivieren. Ein Gremium von Geruchsstoffen, die speziell 19 der 21 Drosophila Larven ORNs aktivieren wurde kürzlich beschriebenen1. Jeder Geruchsstoff im Bereich bei niedrigen Konzentrationen löst eine physiologische Reaktion nur von seinen Verwandten ORN. Jedoch bei höheren Konzentrationen, die normalerweise für konventionelle Verhalten Assays verwendet werden, löst jeder Geruchsstoff physiologische Reaktionen von mehreren ORNs1,5,6. Darüber hinaus haben Geruchsstoffe in diesem Panel Volatilitäten variiert, die Interpretation von Verhalten Studien erschweren, die Bildung von stabilen Geruch Gradienten7,8abhängen. Zu guter Letzt müssen natürlich auftretenden Geruch Reize eine zeitliche Komponente, die schwer unter Laborbedingungen nachzuahmen ist. Es ist daher wichtig, eine Methode zu entwickeln, die Larven Verhalten messen kann, während gleichzeitig individuelle ORNs in einer räumlichen und zeitlichen Weise aktivieren.
Hier zeigen wir, dass eine Methode, die Vorteile gegenüber den zuvor beschriebenen Larven Tracking hat1,8Proben. Der Tracking-Test in Gershow Et Al. beschrieben verwendet weiterhin ein stabiles Gefälle von Geruch im Verhalten Arena8elektronisch gesteuerte Ventile. Aufgrund der komplexen Technik beteiligt, die Geruch Reiz Einrichtung zu bauen, ist diese Methode jedoch schwierig, in anderen Labors zu replizieren. Weitere, ungelöste Fragen zur Verwendung von Geruchsstoffen, gezielt einzelne ORNs aktivieren. Die Tracking-Assay in Mathew Et Al. beschrieben verwendet ein einfacheres Geruch-Delivery-System, aber die resultierende Geruch Steigung ist abhängig von der Volatilität der Test Geruchsstoff und ist instabil für lange Laufzeiten der Assay-1. So Geruch Impulse durch Lichtreize ersetzen, unsere Methode hat die Vorteile der Spezifität und präzise zeitliche Steuerung der ORN Aktivierung und richtet sich nicht auf die Bildung von Geruch Gradienten in verschiedenen stärken.
Unsere Methode ist einfach einzurichten und eignet sich für Forscher interessiert Aspekte der Drosophila Larven Navigation zu messen. Diese Technik könnte zu Fremdsystemen Modell angepasst werden, vorausgesetzt, dass die Forscher in der Lage, die Expression von CsChrimson in ihre Lieblings-System Neuron(s) Wahl zu fahren ist. CsChrimson ist ein rot-verschoben Version des Kanals Rhodopsin. Die Aktivierung erfolgt bei Wellenlängen, die für die Larve Phototaxis System unsichtbar sind. Wir sind daher in der Lage, die Aktivität der Neuronen mit Genauigkeit, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit9zu manipulieren. Durch Ändern der individuell erstellten Software um Größenänderungen der Themen Rechnung zu tragen, könnte diese Methode leicht kriechende Larven von anderen Insektenarten angepasst werden.
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Protocol
1. Aufbau einer Verhalten-Arena und Vorbereitung Hardware optogenetische Stimulation im Bereich Verhalten aktivieren
- Um eine Licht-beraubt Verhalten-Arena zu bauen, bauen eine Box mit einer Dimension von 89 x 61 x 66 cm3 (35" L x 24" W x 26" H) machte der schwarze farbige Plexiglas Acrylplatten (3 mm dick) (siehe Tabelle der Materialien). Materialien zu bauen so eine Box sollte bei lokalen Baumärkten erhältlich. Legen Sie dieses Feld auf eine Tischplatte im Verhalten Raum (Abb. 1A).
- Berg eine monochrome USB-3.0-CCD-Kamera mit IR-lang-Pass 830 nm Filter und eine 8 mm F1. 4 C-Mount-Objektiv ausgestattet (siehe Tabelle der Materialien), die Mitte der Decke der Black Box. Platz zwei Infrarot-LED-Streifen (siehe Tabelle der Materialien) auf der Tischplatte um die Larven in die dunkle Arena (Abb. 1A) zu beleuchten.
- Um die LED-Plattform zu erstellen, erhalten Sie eine 22 cm × 22 cm quadratische Aluminiumplatte (vorzugsweise spritzlackiert mit einem schwarzen Mattende keine Reflexionen zu beseitigen). Schneiden Sie in der Mitte der Platte, mit einem Metall Cutter ein Loch, das groß genug ist, um die CCD-Kamera passen.
- Decken Sie die Metallplatte mit roten LED-Lichtleisten (siehe Tabelle der Materialien). Solder LED Lichtleiste Drähte in Serie und füttern die Streifen Drähte in einem Optokoppler-Relais von einem Raspberry Pi 2 b Mikroprozessor gesteuert (siehe Tabelle der Materialien) (Abbildung 1B und 2).
- Installieren und Konfigurieren von Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux-basierten Betriebssystem auf dem Raspberry Pi-Prozessor vor dem Verbinden der Optokoppler-Relais mit LED-Streifen. Schließen Sie ein Netzteil zur Stromversorgung der LED-Streifen und der Optokoppler (Abbildung 2) (siehe Tabelle der Materialien). Montieren Sie die LED-Plattform rund um die CCD-Kamera (Abbildung 1B).
Hinweis: Betriebssystem Ubuntu Mate v16.04 ist frei verfügbar. Eine Reihe von einfachen Python basierte Befehle kann einfach Programm Muster der LED Lichtreize angepasst (siehe Datei Syntax). - Homogene Bestrahlungsstärke an verschiedenen Punkten im Bereich Verhalten zu gewährleisten. Messen Sie die absolute Bestrahlungsstärke an der Oberfläche der Arena mit Hilfe eines Spektrometers und bestimmen Sie es ~1.3 W/m2 in der gesamten Oberfläche der Arena zu sein.
Hinweis: Bei dieser Intensität wurden keine wesentlichen Änderungen in der Temperatur im Laufe der Experimente beobachtet. Eine andere Studie10 verwendet eine höhere Bestrahlungsstärke von ~1.9 W/m2 und keine Änderungen in der Temperatur im Laufe der Experimente beobachtet.
2. Vorbereitung der Drosophila Larven Verhalten Analysen
- Die fliegen auf standard fliegen Nahrung zu erhalten (siehe Tabelle der Materialien) bei 25 ° C, 50-60 % RH und ein 12 h/12 h hell/dunkel-Zyklus.
-
Um CsChrimson in ein einzelnes Paar von ORNs auszudrücken, überqueren jungfräuliche Weibchen aus einer FH-IVS-CsChrimson -Linie für Männer aus einer OrX Gal4 -Linie ("X" entspricht einer der 21 Larven Geruch Rezeptor (oder) Gene, die in jedem eindeutig ausgedrückt werden von 21 Paaren von ORNs)9,11.
- Abwechselnd, um CsChrimson in allen 21 Larven ORNs auszudrücken, Kreuz jungfräulichen Weibchen aus einem FH-IVS-CsChrimson Linie zu Männchen aus einer Orco-Gal4 -Linie ("Orco" ist die Ko-Rezeptor, der in allen 21 ORNs zum Ausdruck kommt).
- Verwenden Sie FH-IVS-CsChrimson Linie selbst als ein Steuerelement in diesen Experimenten.
Hinweis: Die Fliege Bestände hier aufgeführten stehen alle in Bloomington Drosophila Stock Center (siehe Tabelle der Materialien).
-
Übertragen Sie männliche und weibliche fliegen in ein Kreuz dürfen zu Paaren und Eier für 48 h, Erwachsene zu einem frischen Fläschchen.
- Fügen Sie an die Oberfläche der Lebensmittel Durchstechflasche mit Eiern 400 µL ein Gemisch mit 400 µM All-Trans Retinal (ATR) aufgelöst in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und 89 mM Saccharose in destilliertem Wasser gelöst.
Hinweis: Die kleine Menge von Saccharose fördert Larven Fütterung der ATR-Lösung. ATR ist ein Cofaktor für heraufregulierende CsChrimson Ausdruck9,10erforderlich. ATR ist lichtempfindlich. - Sobald die Nahrung Ampullen mit Eiern ATR hinzugefügt wird, brüten Sie die Fläschchen in der Dunkelheit für weitere 72 h.
Hinweis: Während dieser Studie und die oben genannten zwei Studien keine Auswirkungen auf die Larven Verhalten aufgrund von ATR Fütterung beobachtet haben, empfiehlt es controlling für die Auswirkungen der ATR Fütterung von Testlinien zu unterwerfen, um die gleiche Menge an die oben genannte Mischung, die nicht ATR enthält.
- Fügen Sie an die Oberfläche der Lebensmittel Durchstechflasche mit Eiern 400 µL ein Gemisch mit 400 µM All-Trans Retinal (ATR) aufgelöst in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und 89 mM Saccharose in destilliertem Wasser gelöst.
- Dritte Instar Larven (~ 120 h nach der Eiablage) von der Oberfläche der Fliege Nahrung zu extrahieren, schweben sie mit einer hohen Dichte (15 %) Saccharose-Lösung. Mit einem P1000 Mikropipette trennen die Larven schwimmt auf der Oberfläche der Saccharose-Lösung in einem 1000-mL-Becherglas.
- Waschen Sie Larven 3 – 4 Mal durch den Austausch von 800 mL frisches destilliertes Wasser in das Becherglas jedes Mal. Können Sie Larven, 10 min. ruhen, bevor sie das Verhalten Assay unterwerfen.
3. Verhalten Assay
- Einheitliche Temperatur (zwischen 22-25 ° C) und Luftfeuchtigkeit (zwischen 50 und 60 % RH) Verhalten.
-
Bereiten Sie Larven kriechen Medium durch strömenden 150 mL geschmolzene Agarose (1,5 %) in eine 22 cm x 22 cm quadratische Petrischale. Eine Petrischale wird für jeden Versuch des Assays, 8 – 10 Versuche pro Experiment gegossen. Agarose zu festigen und cool für 1 – 2 Std. in den Petrischalen vor der Verwendung in der Verhaltens-Test zu ermöglichen.
- Übertragen Sie nicht mehr als 20 der vorbereitet dritte Instar Larven zum Zentrum der Petrischale (Abbildung 1C). Petrischale mit Deckel abdecken. Legen Sie die Petrischale im Bereich Verhalten unter der CCD-Kamera.
Hinweis: Je nach dem Experiment Verhalten Assays in der Regel für 3 – 5 Minuten erfolgen. Wird ein Geruchsstoff in der Probe Anleitung Hinweise liefern zur, wurde es beobachtet, dass der entstehende Geruch Farbverlauf für ca. 5 min1stabil bleibt. Längere Assay-Zeiten sind nicht zu empfehlen. Schädliche Auswirkungen auf die Larven durch Austrocknung oder von 630 nm Rotlicht-über längere Zeit sind nicht in diese Zeitpunkte beobachtet worden.
- Übertragen Sie nicht mehr als 20 der vorbereitet dritte Instar Larven zum Zentrum der Petrischale (Abbildung 1C). Petrischale mit Deckel abdecken. Legen Sie die Petrischale im Bereich Verhalten unter der CCD-Kamera.
- Schalten Sie ON the 850 nm Infrarot-LED-Lichtquelle, Larven in dem Video zu visualisieren. Starten Sie die CCD-Kamera um Larven Bewegung aufzuzeichnen.
- Mit Hilfe der Software Entwicklungsgerät Raspberry Pi, Programm des Verfahrens entsprechende Muster der Rotlicht-Stimulation zu verwalten.
Hinweis: Eine Reihe von einfachen Python basierte Befehle kann einfach Programm Muster der LED Lichtreize angepasst (siehe Datei Syntax).
4. Datenverarbeitung und-Analyse
- Importieren Sie das aufgenommene Video von jeder Prüfung in jeder verfügbaren Programmier-Software wie Matlab.
- Erhalten Sie XY-Koordinaten von jeder Larve in einem Film als Funktion der Zeit. Basierend auf Grenzen der Tracking-Software, können 15 – 20 dritte Instar Larven in einem einzigen Film1,8verfolgt werden.
Hinweis: Eine einfache Matlab-Codes ("Tracklarva"), die können leicht geeignete Bedingungen angepasst werden (siehe Datei Syntax) wird zur Verfügung gestellt. Dieses Programm vereint alle Prüfungen in einem Experiment und Ausgänge die XY-Koordinaten von jeder Larve für die gesamte Dauer des Tests (siehe Codesyntax unten). Alternativ könnte man mehrere OpenSource-basierte Programme verwenden, die für Forscher frei verfügbar sind. Z.b. JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12. -
Verwenden Sie die generierten XY-Koordinaten, Larven Trajektorien zu plotten und Larven Fortbewegung weiter zu analysieren.
- Verwenden Sie für Verhalten Analysen Navigations Statistiken wie Geschwindigkeit, Weg Krümmung, Richtung Winkel, um einzelne Larven Trajektorien segment in wechselnden Sequenzen von Abfahrten und Kurven.
- Abfahrten sind definiert als kontinuierliche Perioden der Vorwärtsbewegung. Wendungen zu trennen aufeinanderfolgenden Läufen. Wendungen sind gekennzeichnet, wenn Änderungen an Flugbahn Orientierung Winkel waren > 45° (siehe Datei Syntax).
- Durchschnittswerte für Laufgeschwindigkeit, laufen Länge, Laufrichtung und andere Parameter nach Bedarf zu berechnen.
Hinweis: Eine Reihe von einfachen Syntax, "fährt" und "hält" aus Larven Trajektorien zu extrahieren wird bereitgestellt (siehe Datei Syntax). Einfache Matlab oder Excel Funktionen auf die extrahierten Daten zum Berechnen von Werten für "Lauf-Geschwindigkeit" auch können, "run Length" etc.. - Daten für jedes Verhaltens Metrik zu vertreten, da ± SEM bedeuten
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Representative Results
Um die Besonderheit der ORN Aktivierung zu demonstrieren, unsere Methode wurde erfolgreich angewandt, um die Auswirkungen von zwei verschiedenen ORN (ORN::7a & ORN::42a) bestimmen (ORNs auszudrücken, entweder Or7a oder Or42a) Aktivierung auf Larven Verhalten (Abbildung 3). Neuere Studien, dass einzelne Larven ORNs entsprechen funktional unterschiedliche1,10,13, unsere repräsentativen Daten zeigt, dass als ORN::7a mit dem Ausdruck CsChrimson durch Licht angeregt wurde, gab es eine deutlichen Rückgang im Vergleich zu Kontrolltieren Lauflänge. Umgekehrt, wenn Sie ORN::42a mit dem Ausdruck CsChrimson durch Licht angeregt wurde, gab es eine deutliche Steigerung in Auflagenhöhe im Vergleich zu Kontrolltieren (Abbildung 3). Die kollektive Daten analysiert von ~ 100-120 Larven Spuren stammen aus (n = 8) erprobt für jeden Genotyp. Die Fehlerbalken darzustellen SEM Während wir hier nur einen einzigen Verhalten Parameter (Lauflänge) beschreiben, merken wir, dass jede Larven Spur weiter analysiert werden, kann um Parameter für Geschwindigkeit, Weg Krümmung, berechnen und Körper beugt sich1,8,13, 14,15. Weitere Parameter im Zusammenhang mit Direktionalität z. B. Überschrift Winkel, Auflagenhöhe und Laufgeschwindigkeit in Richtung und entfernt Gerüche können erhalten werden, wenn eine Geruch-Quelle auf der einen Seite der Arena1,8,13vorgesehen ist.
Um unsere Methode Fähigkeit, die zeitlichen Muster der ORN Aktivierung zu ändern zu demonstrieren, vielfältig wir unsere Impulse abwechselnd Lichter ein-und. Wir unterzogen Larven UAS -CsChrimson in ORN::42a auf drei verschiedenen zeitlichen Muster der Lichtreize während der Lichter ON (0,04 Hz, 1 Hz und konstante) zum Ausdruck zu bringen. Wir messen dann Änderungen in behavioral Parameter, die in Lights OFF → ON Phase und während der Lichter auf → OFF Phase geschehen. Wir fanden, dass für ORN::42a, verschiedene zeitliche Muster von Lichtstimulation verschiedene Verhaltensreaktionen (Abbildung 4) ausgelöst. Solche Änderungen wurden nicht in Kontrolle Larven beobachtet, die UAS-CsChrimson in jedem ORNs. nicht ausdrücken Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung zu verstehen, wie zeitliche Muster der ORN Aktivierung dazu beitragen, das Verhalten der Tiere.
Abbildung 1 : Verhalten Arena und Larven kriechen Medium. (A) Frontansicht der Blackbox-Verhalten-Arena. Die offene Tür der Arena zeigt eine CCD-Kamera an der Decke der Box aufgehängt. (B) Untersicht einer Metallplattform mit roten LED-Lichtstreifen für optogenetische Stimulationen verwendet wird um die CCD-Kamera montiert. (C) Draufsicht des larvalen kriechenden Mediums in den Assay verwendet. Vor Beginn der Aufnahme der Larven Bewegung ~ 20 gewaschene Larven entlang der Mitte der 22 cm x 22 cm Petrischale gelegt werden mit 1,5 % Agarose geschichtet. Die Petrischale mit Larven befindet sich in der Mitte der Arena unter der CCD-Kamera und zwischen zwei Infrarot-LED-Lichtstreifen, die als Lichtquelle für die Kamera verwendet werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Optogenetik Setup. Eine Infografik zeigt die elektronische Anordnung für die Optogenetik Setup. Kurz, LED-Licht (630 nm) Streifen sind in Reihe geschaltet und Drähte aus dem Streifen sind ein Optokoppler angeschlossen an ein Raspberry PI 2 b Mikroprozessor zugeführt. Die LED-Lichtleisten und den Optokoppler werden von einem Netzteil versorgt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Auswirkungen der leichten Aktivierung der einzelnen ORNs auf Larven Verhalten. Auflagenhöhe von Larven, die mit dem Ausdruck CsChrimson in ORN::7a und ORN::42a unterschiedlich betroffen waren im Vergleich zu Larven bei leichten Aktivierung steuern. Jeder Balken steht für durchschnittliche RI ± SEM (n = 8). Lauflänge der Larven als ORN::7a aktiviert wurde, lag deutlich unter Kontrolle. Lauflänge der Larven als ORN::42a aktiviert wurde war signifikant höher als die Kontrolle. Balken stehen für Mittelwert ± SEM (n = 8, Student t-Test; "*" p < 0,05, "**" p < 0,001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Auswirkungen der verschiedenen zeitlichen Muster der ORN Aktivierung auf Larven Verhalten. (A) drei zeitlichen Muster der Reize, die für die Aktivierung ORNs verwendet. Impulse a: 1 min konstante Licht während Stimulus b: 0,04 Hz Lichtstimulation, Stimulus c: 1 Hz Lichtstimulation LED ON Zeitraum in Minute 2. (B) Larven wurden drei unterschiedliche Muster der Lichtreize in A. beschriebenen unterzogen Jeder Punkt steht für die Veränderung der Larven Verhalten unter jedes Muster der Lichtreize, wenn leichte Aktivierung von ON auf OFF geschaltet ist. Ändern "run Length" (AV. Auflagenhöhe (OFF) - AV Auflagenhöhe (ON)) ist auf der X-Achse aufgetragen. Ändern 'Laufgeschwindigkeit' (AV. Laufgeschwindigkeit (OFF) - AV Laufgeschwindigkeit (ON)) ist auf der Y-Achse aufgetragen. Das linke Diagramm (graue Punkte) stellt Messungen von Kontrolle Larven und die Grafik Rechte (rote Punkte) dar Messungen von Larven, die mit dem Ausdruck CsChrimson in ORN::42a. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Zusätzliche Datei Syntax: eine Reihe von einfachen Matlab-Codes ("Tracklarva"), die an entsprechenden Gegebenheiten problemlos angepasst werden kann. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Wir hier eine Methode, die für die Messung von Drosophila Larven Verhalten als Reaktion auf gleichzeitige optogenetische Aktivierung der olfaktorischen Neuronen ermöglicht. Zuvor beschriebenen Larven tracking Methoden1,8 verwenden verschiedene Geruch-Delivery-Technologie um ORNs zu aktivieren. Jedoch können diese Methoden für die Spezifität oder zeitlichen Muster der ORN Aktivierung nicht kontrollieren. Unsere Methode überwindet diese Defizite durch Geruch Reize Lichtreize anstelle von für eine genauere Steuerung der ORN Aktivierung.
Die Materialien benötigt, um das Verhalten Arena bauen erhalten Sie problemlos im örtlichen Baumarkt und erfordert minimalen Aufwand bei Montage. Die Elektronik benötigt, um die Optogenetik Modul vorzubereiten sind auch leicht verfügbar und konstruiert. Die beschriebene Methode verwendet hier Rotlicht, um eine rot-verschoben Kanal Rhodopsin zu aktivieren (CsChrimson) in spezifischen Neuronen zum Ausdruck gebracht. Das resultierende Larven Verhalten als Reaktion auf die entsprechenden ORN Aktivierung wird aufgezeichnet, mit Hilfe einer CCD-Kamera und mit benutzerdefinierten geschriebenen Software, der bereitgestellt wird hier gemessen. Unsere Methode erlaubt es den Forschern, Antworten auf verschiedene Fragen stellen, die nicht vorher möglich waren: 1) Was ist die Auswirkung der verschiedenen olfaktorische Reizmuster auf das Tier Fähigkeit, auf einen Geruch zu navigieren? (2) gibt ähnlich wie bei ON-Center und OFF-Center Ganglienzellen in Säugetieren Netzhaut16, es ORNs, die speziell auf eine Abnahme der olfaktorische Reize neben ORNs reagieren, die zu einem Anstieg der olfaktorische Reize reagieren? Unsere Methode erlaubt schließlich eine Vielzahl von zukünftigen Anwendungen, einschließlich der Messung der Auswirkungen der nachgeschalteten Neuronen in der olfaktorischen Kreislauf (PNs und LNs) Larven Navigation.
Zwar gibt es einige Vorteile, unsere Methode, erkennen wir gewisse Einschränkungen. Es ist unklar, ob Konzentration Effekte beobachtet mit Riechstoffen leicht repliziert werden können mit diesem System. Während unserer gegenwärtigen Einrichtung dies nicht zulässt, könnte die Optogenetik Modul leicht angepasst werden erhöht oder verringert die Intensität der Lichtreiz. In Zukunft werden wir überprüfen, ob wechselnde Intensität der Lichtreiz Konzentration Effekte von Geruchsstoffen imitiert. Einfache Fliege genetische Techniken können verwendet werden, CsChrimson von ORNs (mit Orco-Gal4) entweder alle 21 paarweise oder in ein einzelnes Paar von ORNs (mit einzelnen oder Gal4s) zum Ausdruck bringen. Jedoch komplizierte Genetik wäre erforderlich, um CsChrimson in 1 express < n < 21' Neuronen. Aus diesem Grund wäre es schwierig, mit Geruch Mischungen wo einzelne Komponenten des Gemisches Antworten von mehr als einem ORN entlocken beobachteten Wirkungen zu replizieren. Auch wenn Larven Navigations Verhalten ein niedrig dimensionalen Verhalten gilt, wir anerkennen, dass unsere Larven Tracking-Programm weiter in der Zukunft verbessert werden könnte, indem man zusätzliche Verhaltensstörungen Deskriptoren basierend auf Tier Haltung (z.B. Wahrscheinlichkeit Kopf dreht, Körper Kurven etc.)8,17. Unsere Studie beschränkte sich auf erste Bestellung sensorischen Neuronen in der Larve. Weitere Untersuchung ist erforderlich, bevor unsere Methode angewendet werden kann, zum zweiten Auftrag Projektion Neuronen und lokale Neuronen, die in der Region des Gehirns Lappen des Gehirns18eingebettet sind.
Zusammenfassend lässt sich sagen bietet unsere Methode die Möglichkeit, die Funktion von jedem ORN in der einfachen, gefügig olfaktorische Schaltung von Drosophila Larve zu sezieren. Auf diese Weise wird unsere Methode Entwicklung präziser Berechnungsmodelle ermöglichen, die beschreiben, wie Geruch Signale in verschiedene Verhaltensstörungen Ausgänge übersetzt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Startup-Fonds von der University of Nevada, Reno und NIGMS des National Institute of Health unter Grant-Nummer P20 GM103650 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Video camera to capture larval movement | |||
| CCD Camera | Edmund Optics | 106215 | |
| M52 to M55 Filter Thread Adapter | Edmund Optics | 59-446 | |
| 2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses | Edmund Optics | 59-445 | |
| RG-715, 2" Sq. Longpass Filter | Edmund Optics | 46-066 | |
| Electronics for optogenetic setup | |||
| Raspberry Pi 2B | RASPBERRY-PI.org | RPI2-MODB-V1.2 | |
| 3 Channel programmable power supply | newegg.com | 9SIA3C62037092 | |
| 8 Channel optocoupler relay | amazon.com | 6454319 | |
| 630nm Quad-row LED strip lights | environmentallights.com | red3528-450-reel | |
| 850nm LED strips | environmentallights.com | wp-4000K-CC5050-60x2-kit | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks Inc. | ||
| Ubuntu MATE v16.04 | Nubuntu | https://github.com/yslo/nubuntu | |
| Other items | |||
| Plexiglass black acrylic | Home Depot | MC1184848bl | |
| Fly food and other reagents | |||
| Nutrifly fly food | Genesee Scientific | 66-112 | |
| Agarose powder | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 22cm X 22cm square petri-dish | VWR Inc. | 25382-327 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| All trans-retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | |
| Flies | |||
| UAS-IVS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55134 | |
| Orco-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 26818 | |
| Or42a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 9970 | |
| Or7a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 23907 |
References
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