Summary
פיתחנו שיטה לביטוי בשיתוף מספר חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט בצמחים כדי להתגבר על הקשיים של שיטות קונבנציונליות. זה לוקח את היתרון שבשימוש של פלסמיד ביטוי יחיד המכיל מספר חלבון פונקציונלית עצמאית המבטאת קלטות כדי להשיג חלבון ביטוי משותף.
Abstract
מידע על localization(s) subcellular זמן-מרחבי של חלבון חיוני להבין את פונקציות פיזיולוגיים בתאים. חלבונים פלורסנט והפקת חלבונים פיוז'ן פלורסנט בפראות שימשו ככלי יעיל ישירות להמחיש את החלבון לוקליזציה ואת הדינמיקה של תאים. זה שימושי במיוחד להשוות אותם עם סמנים אברון ידועים לאחר ביטוי משותף עם החלבון של עניין. יחד עם זאת, גישות קלאסיות להבעה שיתוף חלבון צמחי בדרך כלל כרוכים פלסמידים מרובים ביטוי עצמאי, לכן יש חסרונות הכוללים יעילות נמוכה ביטוי משותף, ביטוי ברמת וריאציה ושעת גבוהה ההוצאה לשירותים חציית וסינון גנטי. במחקר זה, אנו מתארים שיטה חזקות רומן ביטוי משותף של מספר חלבונים פלורסנט chimeric בצמחים. זה מתגבר על המגבלות של השיטות המקובלת באמצעות וקטור ביטוי יחיד המורכבת מספר קלטות לביטוי עצמאיות-למחצה. שכל קלטת ביטוי חלבון מכילה אלמנטים ביטוי חלבון פונקציונלי משלו, ולכן זה יכול להיות גמישה מותאם כדי לעמוד בביקוש ביטוי מגוונים. בנוסף, זה נוחה וקלה לביצוע ההרכבה, מניפולציה של ה-DNA קטעים בתוך פלסמיד הביטוי על-ידי שימוש לתגובה בשלב אחד אופטימיזציה ללא עיכול נוספים וצעדים מצדו. יתר על כן, זה תואם באופן מלא עם הנוכחי חלבון פלואורסצנטי נגזר הדמיה טכנולוגיות ויישומים, כמו סריג ו BiFC. כמו אימות של השיטה, אנחנו מועסקים מערכת חדשה זו כדי קולטן מיון vacuolar אקספרס שיתוף fluorescently התמזגו, מנשא הפרשה קרום חלבונים. התוצאות מציגות הגרסא המקומית subcellular הפרספקטיבה שלהם. הם כמו מחקרים קודמים על ידי ביטוי ארעי והן שינוי גנטי בצמחים.
Introduction
Chimeric פיוז'ן פלורסנט חלבונים התייחסו כמו כלים שימושיים ללמוד dynamics תאיים ולוקליזציה subcellular ולהבין יותר פונקציות פיזיולוגיים שלהם ואת העבודה מנגנונים1,2, 3 , 4. זה מועיל במיוחד אקספרס שיתוף אברון ידועים כתב חלבונים עם החלבון המדובר כדי להמחיש טוב יותר את הרציונל ייתכן הפצה, function(s) בתוך מערכת endomembrane תאים4 , 5 , 6 , 7 , 8.
חלבון chimeric פיוז'ן פלורסנט יכולה להתבטא צמחים באמצעות הבעה ארעי, שינוי גנטי יציב, אשר יש מגבלות9,10,11והיתרונות המתאימות שלהן. הביטוי ארעית של חלבון היא גישה נוחה הכוללת הפגזה biolistic-, פוליאתילן גליקול (PEG)-, או בתיווך אלקטרופורציה אן ארעי ביטוי protoplasts, Agrobacterium-מתווכת עלה בחדירת בתאי צמח שלם, כפי שמוצג באיור 1A, B12,13,14,15,16. עם זאת, ביטוי משותף של מספר חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט בתא צמח דורש תערובת של מספר פלסמידים ביטוי עצמאי. כך, החסרונות של העסקת פלסמידים מרובים להבעה שיתוף חלבון צמחי הם ביטוי שיתוף התחתונות עקב הסיכוי מופחת באופן דרמטי של פלסמידים כמה בו זמנית נכנסים לאותם התאים בהשוואה פלסמיד יחיד, ו וריאציות של רמות ביטוי החלבון הנגרם על ידי הכמות אקראי ללא שליטה של כל סוגי פלסמיד מועבר לתוך התא17,18. בנוסף, זה מאתגר מבחינה טכנית להציג מספר פלסמידים ביטוי עצמאי לתוך יחידה Agrobacterium חלבון ביטוי שיתוף9,10,11. לכן, Agrobacterium-חלבון בתיווך ביטוי ארעי על-ידי הסתננות של טבק עוזב הוא רק מסוגל לבטא פלסמיד אחד בכל פעם, כפי שמוצג באיור 1B. לעומת זאת, דור של הצמחים הטרנסגניים המבטאים חלבונים פיוז'ן פלורסנט בדרך כלל מושגת על ידי Agrobacterium שנושאת וקטור טרנספורמציה בינארי. אולם, הווקטור בינארי המעביר את העברה גנטית ואת הכניסה לתוך הגנום הצמח הוא רק מסוגל לבטא של פיוז'ן ניאון יחיד חלבון (איור 1B)9,10,12. יצירת צמח מהונדס אשר מבטא חלבונים פלורסנט chimeric שונים בו זמנית דורש מספר סבבי ומעבר ההקרנה, אשר יכול לקחת חודשים עד שנים בהתאם המספרים של הגנים. להיות שותף ביטוי גנטי.
העבודה שוקטור ביטוי יחיד עבור ביטוי משותף של מספר חלבונים בצמח דווחה על-ידי מספר הקודם מחקרים19,20,21. עם זאת, מספר סיבובים של עיכול אנזימטי ו- DNA מצדו של מולקולות DNA ווקטורים עמוד השדרה נדרשים בדרך כלל לדור של פלסמיד סופית הביטוי שיתוף חלבון או לביטוי יתר. . הנה, פיתחנו שיטה חדשות ואיתנות לביטוי בשיתוף מספר חלבונים פלורסנט chimeric בצמחים. זה שיטה נוחה ויעילה מאוד משיגה חלבון מרובים שותף ביטוי בצמחים הן ביטוי ארעי וטרנספורמציה יציב בצורה ששורשיה. היא מעסיקה וקטור יחידה מכיל מספר קלטות ביטוי חלבון פונקציונלית עצמאית לביטוי שיתוף חלבון, ובכך גובר על החסרונות של שיטות קונבנציונליות. יתר על כן, זה מערכת רב תכליתי בדנ א איזה מניפולציות והרכבה מושגות על ידי תגובה פשוט צעד אחד אופטימיזציה ללא שלבים נוספים של ה-DNA לעיכול, מצדו. עקרון הפעולה מודגם באיור2. יתר על כן, זה תואם באופן מלא עם הסלולר מולקולרית, ביוכימיה לגישות המבוססות על חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פריימר עיצוב אסטרטגיה ו- DNA הגברה
- לעצב את צבעי יסוד שיבוט מולקולרי שברי DNA. תחל מהווים רצף גנים ספציפיים איגוד bp 20, 20 עד 25 bp 5'-סוף הסככה רצפים, המהווים רצף חופפים משלימים של מולקולות הדנ א סמוכים (ראה טבלה 1 לדוגמה).
הערה: הרכבה עוקבות של כל ה-DNA שברים, הצמדה של קלטות ביטוי חלבונים שונים, ותלויות אינטגרציה עם וקטור ביטוי הסופי כל זיהוי של הרצף חופפים סמוכים. - להגביר את ה-DNA שברים, לרבות יזם, כתב פלורסנט, ג'ין יעד שליחות קטלנית, הכרחי לבנייה של הקלטות ביטוי חלבון עצמאיות-למחצה ידי תגובות PCR סטנדרטי עם תחל המקביל שלהם, גבוהה נאמנות פולימראז.
הערה: התבניות השתמשו במחקר זה עבור ה-DNA הגברה נגזרות מחקרים קודמים15,22,23. טמפרטורה מחזק, הארכת זמן של תגובות PCR הם פריימר הגנים התלויים.
2. DNA פרגמנט הרכבה ובנייה של קלטות ביטוי חלבון
- לבחון את איכות המוצרים PCR בסיבוב הראשון על ידי אלקטרופורזה DNA ולכמת מאת ספקטרופוטומטרים. בדוק אם הדנ א ואת הזיהום התרחשו על-ידי 1% agarose בג'ל. OD260/OD280 של מוצרי ה-PCR צריך להיות בין 1.6 ו- 1.8.
- לערבב שברים דנ א שונים (0.05 - 0.1 pmol עבור כל שבר) לתוך צינור PCR לאמצעי הסופי של 5 µL.
הערה: מולקולות DNA מיקס מיועד בקלטת באותו ביטוי חלבון יחד בצינור אחד ה-PCR. הימנעות מערבוב DNAs של ביטוי שונה קלטת יחד, מאז זה יהיה להפחית את היעילות של DNA הרכבה בשל המספרים גדל והולך של מולקולות הדנ א צריך להיות מקושר.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. - הכנת מאגר מניות x ISO 5: 500 מ מ טריס-HCl, pH 7.5; MgCl 50 מ מ2; 1 מ מ deoxynucleotide (dNTP); dithiothreitol 50 מ מ; 25% פוליאתילן גליקול (PEG) 8000; 5 מ מ nicotinamide אדנין dinucleotide (NAD).
- להפוך 1 מ"ל 2 x תערובת בסיס מ 400 µL 5 x מאגר מניות ISO, 7.5 יחידות של אקסונוקלאז T5, יחידות 62.5 של אמינות גבוהה DNA פולימראז, 5,000 יחידות של אנזימים (ראה טבלה של חומרים), כפול סטיריליים מזוקק H2O.
הערה: זה מותאמת הקודם מחקרים24,25,26; אמצעי אחסון אלה צריך להיות מותאם. - Aliquot 100 µL של 2 x תערובת הבסיס לכל שפופרת וחנות ב-20 ° C.
התראה: תכופים הקפאה והפשרה של תערובת בסיס x 2 יכול לגרום יעילות נמוכה של הרכבה הדנ א. - להוסיף 15 µL של 2 x תערובת הבסיס לתערובת הדנ א של µL 5, דגירה ב 50 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
3. בנייה של וקטור ביטוי משותף של מספר חלבונים Chimeric פיוז'ן פלורסנט בצמחים
- להגביר את הקלטת ביטוי חלבון עצמאיות-למחצה כולו על ידי ה-PCR הסיבוב השני שימוש במוצר (0.5 - 1.0 µL) מן התגובה הרכבה איזותרמי בסיבוב הראשון וגם את התבנית של תחל החיצוני ביותר (למשל, 1-FP35S, 1-RNOS עבור ביטוי קלטת 1).
- שימוש 1 יחידה של דיוק גבוה פולימראז באמצעי אחסון התגובה 50 µL ואחריו מחזורים (94 ° C ל 30 s, 55 ° C ל 30 s, ו- 68 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות), ואחריו סיומת הסופי ב 68 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- Linearize את החלבון הסופי הביטוי המרכזי (backbone) וקטורים pUC18 ואת pCAMBIA1300, אשר תוכננו עבור הביטוי ארעי חלבון ושינוי גנטי, בהתאמה, על-ידי הוספת 4 יחידות Sma אני לאמצעי אחסון התגובה 10 µL הסופי, ומוכנסות עבור 1 - בית 2-25 º C. בטל את אנזים הגבלה על-ידי המקננת ב 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- מערבבים equimolar במולקולות דנ א של קלטות ביטוי חלבון, וקטור הסופי ליניארית לאמצעי אחסון התגובה האחרונה של 5 µL. לאחר מכן, לבצע רקומבינציה DNA את הסיבוב השני על ידי ערבוב עם 15 µL 2 x מאגר ראשי המקננת ב 50 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
- השתמש המוצרים הסופיים של התגובה רקומבינציה איזותרמי הסיבוב השני כדי להפוך המוסמכת e. coli תאים (למשל, DH5α) על פי נהלי27. בדוק היטב מושבות חיובי על ידי רצף ה-PCR ו- DNA המושבה. לחלץ את פלסמידים חיובית e. coli באמצעות ערכת חילוץ פלסמיד מיני ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
התראה: לאחסון לטווח ארוך, פלסמידים מומס טה מאגר או זוגי מזוקקים H2O יציבים יותר מאחרות ב e. coli זנים.
4. Biolistic-הפגזה מתווכת ארעי ביטוי משותף של מספר חלבונים Chimeric פיוז'ן פלורסנט בצמחים
- להכין טבק ב- 2 השעיה תאים וצמחים לנוער תודרנית הפגזה.
- התרבות ב- 2 תאים בינוני Murashige ו- Skoog (MS) על ידי subculturing פעמיים בשבוע 25 ° c ב שייקר לקבוע סל ד 130. לסנן לאסוף 30-mL בתלת-ממד תרבותי תאים ב- 2 על גבי פיסת נייר סינון בלוק 70 מ מ ויה משאבת ואקום על-ידי הגדרת הלחץ ואקום 40 mbar.
- כדי למנוע את התאים מתייבשים במהלך השלבים הבאים, להוסיף מספר טיפות של מדיום תרבותית נוזלי תא ב- 2 בצלחת פטרי לפני הנחת נייר הסינון (השלב הבא).
- העברת נייר הסינון עם התאים ב- 2 על זה צלחת פטרי חדש (85 מ מ x 15 מ"מ).
- משטח לעקר את הזרעים תודרנית לבנה (Col-0) על ידי vortexing תערובת עם אתנול 70% (v/v) המכילה 0.05% 20 Tween למשך 10 דקות.
- ספין למטה הזרעים באמצעות צנטריפוגה העליון ספסל על מהירות מקסימלית עבור 2 s, להסיר את תגובת שיקוע ולשטוף את הזרעים עם 100% אתנול פעם על פיפטה ס' 30 החוצה הזרעים על גבי עיתון חדש מסנן סטרילי בשכונה סטרילי. לאחר מכן, מילה נהדרת את הזרעים, מורחים אותם על גבי פלטות אגר ½ MS.
- חנות את הלוחיות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפני העברתן לתא צמיחה צמח עם ההגדרות הבאות: 16 h אור כהה 8 שעות עם 120-150 מיקרומטר ז-2 s-1 עוצמה, 22 ° C.
- העברת צמחים לדוגמה 7 - בן יום לתוך עיגול בקוטר 30 מ מ במרכזה של צלחת בינונית ½ MS חדשה כדי להגביר את היעילות של הפגזה.
זהירות: הימנעו חופפים את הצמחים בעת העברת ומניח אותם על צלחת ½ MS חדש. - הוסף מספר טיפות של ½ MS בינוני נוזלי על פני השטח של צמחים או רקמות כדי לשמר לחות ומניעת ייבוש הצמחים בחוץ במהלך השלבים הבאים.
- מעיל חלקיקי זהב עם פלסמיד ה-DNA.
- פתרון microcarrier זהב מערבולת ביסודיות, במשך 3 דקות להכין צינור 1.5 מ.
- ברצף להוסיף את הפתרונות הבאים לתוך שפופרת ואת מערבולת: 25 µL (1.5 מ ג) זהב חלקיקים, מערבולת 10 s; µL 10 של 25.46 mg/L spermidine, סופרן מערבולת 10; 5 µL של 1µg/µL פלסמיד ה-DNA, מערבולת 3 דקות; 25 µL של פתרון2 CaCl 277.5 mg/L, מערבולת 1 דקות.
התראה: לשמור על vortexing במהלך שלב זה. - ספין למטה microcarriers זהב באמצעות צנטריפוגה העליון ספסל על מהירות מקסימלית עבור s 5 ובזהירות פיפטה החוצה תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. לשטוף עם 200 µL של כוהל מוחלט והשהה מחדש בגדר על ידי מערבולת לסיבוב ס' 5-10 למטה במהירות מקסימלית עבור 5 s והסר האתנול.
- מחדש להשעות את חלקיקי זהב ב 18 µL של אתנול מוחלטת, ההשעיה חלקיקים µL 6 aliquot אל אמצע macrocarriers שלוש. לתת להם אויר יבש.
- העברת DNA לתוך צמחים באמצעות חלקיקים הפגזה.
- להגדיר את המערכת משלוח חלקיקים כדלקמן: 1100 psi, 28-mm Hg ואקום, המרחק 1 ס"מ, מרחק הטיסה חלקיקים 9-ס מ.
- להפציץ הצמחים/התאים בצלחת בינוני אגר במשך שלוש פעמים-שלוש עמדות שונות, ואז לשמור התאים/הצמחים בחושך מיד לאחר ההפצצה.
התראה: משקפיים הבטיחות בהפעלה מערכת משלוח חלקיקים בגלל האגודה של גז בלחץ גבוה, חלקיקים מהירות גבוהה עם המערכת.
- לשמור תאים/צמחים מופגז בחושך בבית הבליעה צמיחה צמח 6 עד 72 שעות לפני התצפית של אותות פלואורסצנט. להגדיר את התא צמיחה של צמח כהה 24 שעות, 22 ° C.
התראה: הביטוי היעילות ואת עוצמת האות פלורסנט הם יחצ ן-, ג'ין-צמח/רקמות-תלוי.
5. דור של יציבה תודרנית הטרנסגניים משותפת להביע מספר חלבונים פלורסנט Chimeric על ידי Agrobacterium-מתווכת טרנספורמציה.
- הפשרת התאים המוסמכת Agrobacterium (PMP90) על קרח, לחכות 30 דקות, לאחר מכן להוסיף 2 µL בינארי וקטור (100-200 ng) (להכין לעיל) לתוך התאים המוסמכת. שבו את התערובת על קרח למשך 10 דקות.
- להעביר את התערובת לתוך cuvette אלקטרופורציה ס מ 0.1 מראש צוננת. הוספת cuvette לתוך מערכת אלקטרופורציה ולבצע אלקטרופורציה עם ההגדרות הבאות: 1.6 kV, 600 אוהם, 25 µF.
- להוסיף 1 מ"ל של המדיום הנוזלי SOC cuvette מיד לאחר אלקטרופורציה pipette התאים לתוך צינור 1.5 mL החדש, דגירה ב 28 ° C ב שייקר מסלולית אופקי ב 200 rpm עבור 120 דקות.
- Centrifuge התאים ב g x 2,348 בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות לבטל את רוב תגובת שיקוע, בעדינות מחדש להשעות את התאים pelleted עם טיפ פיפטה, מורחים אותם על צלחת LB המכיל 50 mg/L Hygromycin B, דגירה-28 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.
- תודרנית לבנה צמחים Col-0 עם Agrobacterium, אשר מכיל את pCAMBIA1300 וקטור בינארי משולב עם מספר קלטות ביטוי חלבון, בשיטת28 מטבל פרחוני כפי שתואר קודם לכן כדי להפוך צור הצמחים הטרנסגניים יציב.
- לעקר את פני השטח של הזרעים תודרנית הטרנסגניים על ידי ערבוב עם אתנול 70% (v/v) המכילה 0.05% Tween 20. מערבולת במשך 10 דקות ספין למטה הזרעים באמצעות צנטריפוגה העליון ספסל על מהירות מקסימלית עבור 2 s, להסיר את תגובת שיקוע, ולשטוף את הזרעים עם 100% אתנול פעם ב-30 s.
- פיפטה החוצה הזרעים על גבי נייר סינון סטרילי בשכונה סטרילי. לאחר מכן, אוויר יבש, מורחים אותם על גבי פלטות אגר ½ MS המכיל Hygromycin B לסינון progenies חיובי.
- דגירה הלוחות ב 4 מעלות צלזיוס במשך יומיים. לאחר מכן, להעביר אותם לתוך תא לגידול הצמח ואת תרבות במשך 7 ימים.
- בחר 7 - בן יום הישרדות לנוער צמחים על-ידי בדיקה אותות פלואורסצנט במיקרוסקופ פלואורסצנטי ולאחר מכן להעביר את הצמחים לתוך האדמה לסינון נוסף של צמחים homozygous.
6. תרופות טיפולים
- עבור טיפולים תרופות, לדלל כל תרופה נוזלית בינוני MS שלה ריכוזי עבודה המתאימה לפני הדגירה עם תאים או צמחים.
- טיפול Wortmannin: להכין 1 מ מ פתרונות מניות של wortmannin על ידי המסת אבקה wortmannin ב דימתיל סולפוקסיד ולאחסן את המניות ב-20 ° C. העברת תאי צמחים או צמחים לנוער לתוך האמצעי MS נוזלי המכיל wortmammin מיקרומטר 16.5, תקופת דגירה של 30-45 דקות לפני הדמיה.
- טיפול Brefeldin A (BFA): להכין 1 מ מ פתרונות מניות של BFA על ידי המסת אבקה BFA ב דימתיל סולפוקסיד ולאחסן את המניות ב-20 ° C. העברת תאי צמחים או צמחים לנוער לתוך האמצעי MS נוזלי המכיל 10 µg/mL BFA למשך 30-45 דקות לפני הדמיה.
7. מיקרוסקופ קונפוקלי הדמיה וניתוח לוקליזציה שותף Subcellular של חלבון
- להעביר את הצמחים לנוער או ההשעיה התאים על זכוכית קונבנציונאלי ולשים בעדינות שקופית הכיסוי העליון עבור הדמיה על ידי סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי הרגיל. השתמש בהגדרות הבאות: 63 X מים אובייקטיבי (N.A 1.4) 0 רקע, רווח 700, גודל הפיקסל 0.168 מ מ, האופטיקה צינור גלאי. לרגש מתויג GFP חלבונים-485 nm לזהות קרינה פלואורסצנטית ב 525 ננומטר. מתויג RFP חלבונים, לרגש-514 nm ולגלות -575 ננומטר.
- לחשב את יחס משותף לוקליזציה של אותות פלואורסצנט באמצעות תוכנה תמונה J (https://imagej.nih.gov/ij/) עם המתאם (PSC) פירסון-ספירמן התוספת כפי שתואר לעיל8שיתוף הלוקליזציה. מקדמי מתאם פירסון או מקדמי המתאם דרגה של ספירמן מוצגות בתוצאות (איור 4). ערכי r המיוצר יהיה מ-1 ל- 1. 0 מדגים שאין מתאם לזיהוי של שני אותות, ואילו +1-1 מראים קורלציה מלאה חיוביים ושליליים, בהתאמה, של שני אותות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פיתחנו שיטה חזקה ויעילה מאוד עבור הביטוי משותף של מספר חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט בצמחים. זה יפרוץ את המחסומים של המקובל גישות להשתמש פלסמידים מרובים מופרדים לביטוי שיתוף חלבון, כפי שמוצג באיור 1A, B באמצעות ביטוי ארעי או שינוי גנטי יציב. בשיטה חדשה זו, אנחנו מייצרים וקטור ביטוי יחיד המורכבת מספר קלטות ביטוי חלבון כדי להשיג חלבון שותף ביטוי בבת אחת (איור 1Cיח). חלבון ביטוי קלטת הפונקציות independently למחצה עם אלמנטים DNA הנחוץ משלו עבור ביטוי חלבון. לכן, כל קלטת ביטוי חלבון יכול להיות מותאם אישית באופן עצמאי על פי דרישות מגוונות עבור ביטוי חלבון. באשר הווקטור שותף ביטוי החלבון הסופי, הקלטות ביטוי חלבון זה לתפקד כמו אלמנטים בסיסיים "לגו" אשר ניתן לשנות, נבנה מחדש. ולהניחו מחדש בנוחות. יתר על כן, פשוט מושגת אסטרטגיית חלופי להרכבה מולקולת ה-DNA, הצמדה של מספר קלטות ביטוי חלבון, וכן על שילוב של קטעי DNA עם וקטור היעד הסופי עבור שותף ביטוי של חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט באמצעות אופטימיזציה איזותרמי במבחנה רקומבינציה לתגובה ללא שלבים נוספים עוד יותר של ה-DNA לעיכול, interlinkage. עקרון הפעולה של התגובה רקומבינציה איזותרמי במבחנה מודגם באיור2. ניגודים במולקולות דנ א מרובות (לדוגמה, שלושת ה-DNA נציג קטעים באיור 1-3 איור 2) ושילוב שלהם עם וקטור ביטוי הסופי בפשטות וביעילות מושגות על ידי התגובה בשלב אחד (ראה איור 2 ). שזה מותאם ממחקרים קודמים מאת רקומבינציה חופפים של מולקולות DNA משולבת עם חופפים רצפים קצרים כדי להשיג היתוך שברי DNA ובנייה של פלסמידים25,26.
בתור מבחן של השיטה, בחרנו הקולטן מיון vacuolar (VSR) ואת החלבון הממברנה המוביל הפרשה (שובב), אשר כתב שני חלבונים המשתתפים חלבון הפרשה אנדוציטוזה מסלולים, בהתאמה6,22 ,23,29,30. VSRs הם סוג-אני רגישה חלבוני ממברנלי אינטגרלי המתווכות חלבון biosynthetic הוחלף נגזר התנועה בשביל הפרשה חלולית, בעיקר בתאים prevacuolar (Pvc) צמחים6,22,23. לעומת זאת, המוביל הפרשה קרום חלבונים (הפרחחים) הם סוג-IV קרום חלבונים להשתתף המעבר endocytic של הצמח. זה רגישה קרום פלזמה (PM), טרנס-רשתות גולג'י (TGNs), אשר לשמש מוקדם endosomes22,29,30. ואנחנו נבנה שתי קלטות ביטוי חלבון לארח את fusions chimeric של תודרנית VSR2 (AtVSR2) ועם RFP תודרנית SCAMP4 (AtSCAMP4) עם ה-GFP, כפי שמוצג באיור3. כדי להבטיח שניתן יהיה לתרגם RFP-AtVSR2 המיון, פפטיד אות (SP) נוסף לפני RFP, כמו קודם לכן דיווח6,31. הקלטות הביטוי שני חלבונים בודדים הם קשורים נוספים, מאתרים ומפסיקים עם החלבון הסופי ביטוי וקטור pUC18 או pCAMBIA1300 עבור ביטוי שיתוף חלבון או באמצעות חלבון ארעי או לשתול טרנספורמציה יציבה, כפי שמוצג איור 3. AtVSR2, AtSCAMP4 היו בהצלחה משותפת מתבטאות טבק ב- 2 תאים באמצעות חלקיקים הפגזה, הראה נכונות הגרסא המקומית (איור 4A). RFP-AtVSR2 הראו דפוס punctate, אשר היה נבדל לוקליזציה קרום פלזמה של AtSCAMP4-GFP עם כמה נקודות punctate cytosolic. יתר על כן, תודרנית הצמחים הטרנסגניים המבטאים משותף AtSCAMP4-GFP, RFP-AtVSR2 היו שנוצר באמצעות Agrobacterium-מתווכת טרנספורמציה. הגרסא המקומית subcellular משותפת להביע RFP-AtVSR2 ו- AtSCAMP4-GFP בתאים שורש, שורש השיער היו באיור איור 4B ו- 4E. התוצאות ביטוי משותף של RFP-AtVSR2 ו- AtSCAMP4-GFP המתקבל הטרנסגניים תודרנית היו מסכים עם אלה ב- 2 תאים. בנוסף, הטרנסגניים תודרנית שטופלו wortmannin BFA במשך 30 דקות Wortmmanin גרם RFP-AtVSR2 עם תוויות Pvc ויוצרים מבנה טבעתי קטן ואני BFA המושרה AtSCAMP-GFP שכותרתו מצבור TGN, כפי שמוצג באיור 4C , D, F, G. בנוסף, השדר autofluorescent הקטן יכול להיות זוהה טבק ב- 2 תאים ותאים תודרנית שורש והשיער השורש על-ידי החלת הגדרות זהות של אוסף תמונות כמו באיור 4 (משלימה איור 1).
איור 1: מערכת חזקה עבור ביטוי משותף של מספר חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט בצמחים. (א) גישות קונבנציונליות ארעי ביטוי משותף של מספר חלבונים כתב פלורסנט בצמחים מושגת באמצעות אלקטרופורציה הפגזה של חלקיקים, שינוי בתיווך פג על ידי ערבוב מספר ביטוי עצמאי וקטורים. (B) השיטה המקובלת עבור שינוי גנטי הצמח על ידי Agrobacterium עם וקטור ביטוי חלבון יחיד פיוז'ן פלורסנט. לבטא משותפת חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט מרובים בצמח מהונדס, נוסף מעבר גנטי, מספר סיבובים של ההקרנה נדרשים להשגת homozygous progenies. (ג) ו- (ד) שהשיטה החלופית חלבון חדש ביטוי משותף. היא מנצלת וקטור ביטוי יחיד, אשר מורכב של מספר קלטות ביטוי חלבון והוא מסוגל לבטא משותפת חלבונים כתב פלורסנט chimeric שונים של צמחים דרך ארעי הן ביטוי ושינוי גנטי. הפרטים של דמות זו פורסמו לראשונה בכתב Zhong. et al. 201736 (הודפס מחדש באישור; זכויות יוצרים גבולות במדעי הצמח). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הפגנה של עקרון הפעולה של צעד אחד DNA הרכבה שיטה התגובה רקומבינציה איזותרמי. שברי DNA ואת פלסמיד ליניארית עם חפיפה רצפים (OSs) המחוברים על ידי קיצוץ הבסיס בין 5'-הסככה חופפים אזורים, הרחבת על ידי ה-DNA פולימראז וקישור על-ידי ליגאז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: האסטרטגיה של בניית של פלסמיד יחיד לביטוי בשיתוף מספר חלבונים פיוז'ן פלורסנט chimeric. התרשים מדגים את האסטרטגיה לבניית של פלסמיד ביטוי יחיד עבור הביטוי משותף של מספר חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט או ביטוי ארעי או שינוי יציב בצמחים. הווקטור ביטוי מורכב שתי קלטות ביטוי חלבון, שכל אחד מהם מכיל משלו אלמנטים הדרושים עבור ביטוי חלבון ופונקציות לבטא את חלבון כימרי פלורסנט chimeric בודדים למחצה independently. Interlinkage של כל מולקולות DNA והאסיפה מושגות בנוחות על ידי אופטימיזציה איזותרמי במבחנה רקומבינציה שיטה משולבת עם שברי DNA חופפים. הפרטים של דמות זו פורסמו לראשונה בכתב Zhong. et al. 201736 (הודפס מחדש באישור; זכויות יוצרים גבולות במדעי הצמח). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: תמונות נציג של שותף ביטוי chimeric פיוז'ן פלורסנט VSR, שובב בתאי צמח.
(א) שותף ביטוי של RFP-AtVSR2, AtSCAMP4-GFP באמצעות חלקיקים הפגזה בתאים ההשעיה טבק ב- 2. (B) תמונת הנציגה של שורש תודרנית הטרנסגניים התא שותף לביטוי RFP-AtVSR2 AtSCAMP4-GFP. (ג) ו- (ד) שורשים הטרנסגניים תודרנית משותפת להביע RFP-AtVSR2 ו- AtSCAMP4-GFP טופלו עם wortmannin ו- BFA למשך 30 דקות בהתאמה. (ה) תמונת הנציגה של שערה הטרנסגניים תודרנית שורש משותף לבטא RFP-AtVSR2 ו- AtSCAMP4-GFP. שערות השורש (F) ו- (ז) הטרנסגניים תודרנית RFP לביטוי משותפת-AtVSR2 ו- AtSCAMP4-GFP טופלו עם wortmannin ו- BFA במשך 30 דקות חצים (ד) ו- (ז) מצביעים על חלבון הנוצרות על-ידי BFA צבירה. rp = מקדם המתאם של פירסון; rs = המתאם דרגה של ספירמן. סרגל קנה מידה ב- (א)-(ד) הוא 50 מיקרומטר, (ה)-(G) הוא 30 מיקרומטר. פרטים דמות זו פורסמו לראשונה בכתב Zhong. et al. 201736 (הודפס מחדש באישור; זכויות יוצרים גבולות במדעי הצמח). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| הביטוי קלטת 1 | ||
| 1-FP35S | GAATTCGAGCTCGGTACCC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 1-RP35S | AGGACGCGGGCGTGGGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 1-FRFP | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCCCACGCCCGCGTCCT | |
| 1-RRFP | ATTATCCATATCACTCCCCA GGCGCCGGTGGAGTGGCGGC | |
| 1-FAtVSR2 | GCCGCCACTCCACCGGCGCC TGGGGAGTGATATGGATAAT | |
| 1-RAtVSR2 | AAATGTTTGAACGATCGGGA TTACAACTCTAGTTGAGAAG | |
| 1-FNOS | CTTCTCAACTAGAGTTGTAA TCCCGATCGTTCAAACATTT | |
| 1-RNOS | GAGAATGGATGCGAGTAATG TCTAGTAACATAGATGACAC | |
| הביטוי קלטת 2 | ||
| 2-FP35S | CATTACTCGCATCCATTCTC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 2-RP35S | TTAGGATCGTGTCGTGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 2-FAtSCAMP4 | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCACGACACGATCCTAA | |
| 2-RAtSCAMP4 | TCCTCGCCCTTGCTCACCAT TAGTGCACGCATCAAGGTCG | |
| 2-FGFP | CGACCTTGATGCGTGCACTA ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA | |
| 2-RGFP | TAAAACCAAAATCCAGTGAC TTACTTGTACAGCTCGTCCA | |
| 2-FT35S | TGGACGAGCTGTACAAGTAA GTCACTGGATTTTGGTTTTA | |
| 2-RT35S | GTCGACTCTAGAGGATCCCC GTCCGCAAAAATCACCAGTC | |
טבלה 1: פריימר עיצוב האסטרטגיה, רצפים השתמשו במחקר זה. השם של כל פריימר ניתנת בלוח השמאלי. רצפי חופפים משלימים תחל מסומנות בקו תחתון. פרטים על השולחן הזה פורסמו לראשונה בכתב Zhong. et al. 201736 (הודפס מחדש באישור; זכויות יוצרים גבולות במדעי הצמח).
משלימה איור 1: להחליפן בתמונות של autofluorescence ב- 2 תאים, שורשים תודרנית ואת שערות השורש. (א) autofluorescence של פראי סוג ב- 2 תאים זוהה בתנאים הדמיה אותן עם תאי טרנספורמציה. (B) ו- (ג) תודרנית שיער השורש ותאים שורש התגלו מתחת לאותם תנאים הדמיה עם תאי תודרנית טרנספורמציה. סרגל קנה מידה ב- (א)-(ג) הוא 20 מיקרומטר. DIC, התערבות דיפרנציאלית חדות. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנחנו הדגים שיטה להביע robustly משותפת chimeric פיוז'ן פלורסנט חלבונים בצמחים. זה יכול לשמש הן ביטוי ארעי ושינוי גנטי והוא תואם עם הנוכחי פלורסנט חלבון מבוססת הדמיה מולקולרית, ביוכימיה יישומים וטכנולוגיות9,10,13 . בנוסף, הכלי מתגבר את הקשיים של השיטות המקובלת המשתמשות מספר פלסמידים ביטוי בודדים עבור הביטוי שיתוף חלבון. לעומת זאת, היא מעסיקה וקטור ביטוי יחיד המכיל מספר קלטות ביטוי חלבון עם משלהם היזמים בודדים, תגיות פלורסנט, חלבונים היעד של terminators. יתר על כן, בקלטת ביטוי חלבון יכול להיות מנוהלים באופן עצמאי כדי לעמוד בדרישות ביטוי מגוונים, כגון השימוש מקדם ספציפיים ו- N - או C-מסוף הפיוז'ן chimeric של חלבון פלואורסצנטי עם חלבון המטרה. לכן, הפונקציות קלטת של ביטוי חלבון כמו ביסוד "לגו" שעובד באופן עצמאי למחצה פלסמיד. יתר על כן, זה גם מערכת רב תכליתי בגן איזה עריכה, החלפת, ואת מכלול כל יכולה להיות מושגת בקלות על ידי תגובת רקומבינציה איזותרמי צעד אחד מבלי תהליכים נוספים של אנזימים לעיכול, מצדו. לנו יש אופטימיזציה את היעילות של רקומבינציה איזותרמי התגובה ממחקרים קודמים, כפי שמתואר בשלב 2.4, על-ידי בדיקת ריכוזים שונים של אקסונוקלאז T5, Phusion DNA פולימראז. אנזימים. בנוסף, ריכוז הדנ א כל קטעים עבור התגובה רקומבינציה איזותרמי בשלב אחד הוא הציע להיות בין 0.05 0.1 pmol כדי להשיג יעילות מרבית מצדו.
ביטוי יתר transgene על ידי החלפת שלה אנדוגני יזם עם חזק, מקדם רציף, כגון יזם אוביקוויטין-10 (UBQ10), היכרות עם עותקים נוספים של הגן היא גישה בפראות בשימוש ללמוד את הפונקציות הסלולר שלה, מנגנון העבודה הבסיסית ב תאים15,32. עם זאת, לא צפוי עיכוב למטה-תקנה וחזק בביטוי הגן לעיתים נמצא גם33,34. האחוז של ג'ין לא צפוי להשתיק נע בין 2 ל- 100% תחת מצבים אלה,33,35. יתר על כן, ג'ין להחרשת יש סיכוי גבוה יותר יקרה בביטוי של מספר גנים בו זמנית, טרנספורמציה של עותקים גבוהה של ה-DNA, עליות משמעותיות של הגן ברמת תעתיק9,33,24 ,35. על מנת למזער את המופע של ג'ין להשתיק ב החזקה מרובים פיוז'ן חלבון ביטוי שיתוף מערכת, בחרנו היזמים פעיל אחר לנהוג הקלטות ביטוי חלבונים שונים, כאשר שיתוף המבטאים חלבונים פיוז'ן מרובים. יתר על כן, אנחנו נמנע ללא הרף באמצעות ייצוג המקדם אותו עבור ביטוי שונה קלטות. בנוסף, עוד פוטנציאל מגבלה של פרוטוקול זה הוא יעילות מופחתת בשלב אחד DNA איזותרמי רקומבינציה הנגרמת על ידי המספרים גדל והולך של חלבון קלטת ביטוי המשנה להבעה. יתר על כן, מספר הקלטות ביטוי זה יכול להיות אירח את פלסמיד ביטוי הסופי בעיקר מסתמך על replicon של25,3524,פלסמיד המרכזי (backbone).
יחדיו, פיתחנו מערכת חזקה לביטוי בשיתוף מספר חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט בנוחות ב צמחים36. הוא מתגבר על המגבלות של השיטות קלאסית, מנצל לתגובה הרכבה DNA אופטימיזציה בשלב אחד לבנייה DNA interlinkage, פלסמיד ששורשיה אופנה. מראש טכני זה אומת על-ידי AtVSR2, AtSCAMP4 ביטוי לעבודה במפעל תאים באמצעות ביטוי ארעי והן שינוי גנטי. לכן, הוא מדגים שיטה משכנע הרומן על היבטים שונים של התגליות המדעיות על ידי שותף ביטוי של חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט בצמחים. בנוסף, הקונספט ואת עקרון שיתוף ביטוי של חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט מרובים באמצעות וקטור ביטוי יחיד הם תואם באופן מלא עם טכנולוגיות ביטוי יתר CRISPR-Cas9, RNAi וחלבון ללמוד את הפונקציות, אינטראקציות של גנים מרובים בצמחים-37,-38,-39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים חברי המעבדה וואנג מועיל דיונים והערות. עבודה זו נתמכת של הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (NSFC, מענק מס 31570001) קרן מדעי הטבע של בפרובינצית גואנג-דונג ואת בעיר גואנגג'ואו (מענק מס 2016A030313401 ו- 201707010024) כדי ה. ו
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
References
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
- Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
- Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
- Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
- Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
- Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
- Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).
- Li, S., et al. Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean. Front Plant Sci. 8, 246 (2017).
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
- Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
- Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
- Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).
- Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
- Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
- Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
- Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
- Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
- Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
- Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
- Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
- Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
- Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
- Bruening, G. Plant gene silencing regularized. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).
- Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
- Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
- Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).
- Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
- Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
- Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).
