Summary
Wir entwickelten eine neuartige Methode zur Co mehrere Chimären fluoreszierende Fusionsproteine in Anlagen zur Überwindung der Schwierigkeiten von konventionellen Methoden zum Ausdruck zu bringen. Es nutzt die Vorteile der Verwendung einer einzigen Ausdruck Plasmid, das enthält mehrere funktionell unabhängig Protein mit dem Ausdruck Kassetten um Co Proteinexpression zu erreichen.
Abstract
Informationen über die raumzeitlichen subzellulären Localization(s) eines Proteins ist entscheidend für seine physiologischen Funktionen in den Zellen zu verstehen. Fluoreszierende Proteine und Generierung von fluoreszierenden Fusionsproteine wurden Wild als ein wirksames Instrument zur Protein-Lokalisierung und Dynamik in den Zellen direkt sichtbar zu machen. Es ist besonders nützlich, um sie mit bekannten Organelle Marker nach Co Ausdruck mit dem Protein des Interesses zu vergleichen. Dennoch klassische Ansätzen für Co Proteinexpression in Pflanzen gewöhnlich mehrere unabhängige Ausdruck Plasmide, und daher haben Nachteile, die geringe Co-Expression Effizienz, Ausdruck-Ebene Variation und höchste Zeit enthalten Ausgaben in genetische Kreuzung und screening. In dieser Studie beschreiben wir eine robuste und neuartige Methode zur Co Ausdruck mehrere Chimären fluoreszierende Proteine in Pflanzen. Es überwindet die Grenzen der herkömmlichen Methoden mithilfe einer einzigen Expressionsvektor, die aus mehreren semi-unabhängige mit dem Ausdruck ihrer Kassetten besteht. Jedes Protein Expressionskassette enthält eine eigene funktionsfähiges Protein-Expression-Elemente, und daher kann flexibel eingestellt werden um diverse Ausdruck Nachfrage gerecht zu werden. Auch, es ist einfach und bequem die Montage durchführen und Manipulation von DNA-Fragmenten in das expressionsplasmid durch den Einsatz einer optimierten einstufigen Reaktion ohne weitere Verdauung und Ligation Schritte. Darüber hinaus ist es kompatibel mit aktuellen fluoreszierenden Proteins abgeleitet Bio-Imaging-Technologien und Anwendungen, z. B. Bund und BiFC. Als eine Validierung der Methode haben wir dieses neue System Co Express eindringmittel verschmolzen vacuolar Sortier-Rezeptor und sekretorischen Träger Membranproteine beschäftigt. Die Ergebnisse zeigen, dass ihre Perspektive subzelluläre Lokalisierungen die gleichen wie in früheren Studien durch transiente Expression und genetische Transformation in Pflanzen sind.
Introduction
Chimären fluoreszierende Fusionsproteine gelten als nützliche Werkzeuge zur intrazellulären Dynamik und subzelluläre Lokalisation zu studieren und noch besser zu verstehen, ihre physiologischen Funktionen und funktionierende Mechanismen1,2, 3 , 4. es ist besonders vorteilhaft für Co Express bekannten Organelle Reporter Proteine mit dem Protein in Frage besser zu veranschaulichen, die räumlich-zeitliche Logik, Verteilung und Funktion(en) innerhalb des Endomembrane Systems in Zellen4 , 5 , 6 , 7 , 8.
Eine Chimäre fluoreszierende Fusionsprotein kann ausgedrückt werden in Pflanzen durch transiente Expression und stabile genetische Veränderung, die ihre jeweiligen Vorteile und Einschränkungen9,10,11haben. Transiente Expression eines Proteins ist ein passender Ansatz, der biolistischen Bombardement-, Polyethylenglykol (PEG) enthält-, oder Elektroporation-vermittelte DNA transiente Expression in Protoplasten und Agrobakterium-vermittelten Blatt-Infiltration in intakten Pflanzenzellen, wie in Abbildung 1A, B12,13,14,15,16gezeigt. Co Ausdruck von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in einer einzigen Pflanzenzelle erfordert jedoch eine Mischung aus mehreren unabhängigen Ausdruck Plasmide. Somit sind die Nachteile des Einsatzes mehrere Plasmide für Co Proteinexpression in Pflanzen geringerer CO Ausdruck durch die deutlich geringere Chance auf mehrere Plasmide, die gleichzeitig in den gleichen Zellen im Vergleich zu einem einzigen Plasmid und die Variationen des Ausdrucks proteingehalte verursacht durch die unkontrolliert zufällige Menge jeder Art von Plasmid übertragen in der Zelle17,18. Darüber hinaus ist es technisch schwierig, mehrere unabhängige Ausdruck Plasmide in eine einzelne Agrobacterium für Protein Co9,10,11einzuführen. Daher Agrobakterium-vermittelten Protein transiente Expression durch Infiltration des Tabaks verlässt ist nur fähig auszudrücken ein Plasmid zu einem Zeitpunkt, wie in Abbildung 1 bgezeigt. Generation von transgenen Pflanzen, fluoreszierende Fusionsproteine erreichen dagegen in der Regel durch Agrobacterium , die eine binäre transformationsvektor trägt. Die binären Vektor, der Gentransfer und Einfügung in das Genom der Pflanze vermittelt ist jedoch nur in der Lage, mit dem Ausdruck einer einzigen fluoreszierende Fusion Protein (Abbildung 1 b)9,10,12. Generieren einer transgenen Pflanze, die mehrere Chimären fluoreszierende Proteine gleichzeitig zum Ausdruck bringt, erfordert mehrfache Umläufe der genetische Kreuzung und Abschirmung, die Monate bis Jahre abhängig von der Anzahl der Gene ergreifen kann, um Co ausgedrückt werden.
Die Beschäftigung, die ein einzelner Ausdruck Vektor für Co Ausdruck mehrere Proteine im Werk von mehreren früheren gemeldet wurde untersucht19,20,21. Mehrfache Umläufe der enzymatischen Verdauung und DNA-Ligation von DNA-Molekülen und Rückgrat Vektoren sind jedoch für die Erzeugung des endgültigen Plasmids für Co Proteinexpression oder Überexpression in der Regel erforderlich. Hier haben wir eine neue und robuste Methode zur Co Ausdruck mehrere Chimären fluoreszierende Proteine in Pflanzen entwickelt. Es ist eine höchst effiziente und komfortable Methode, die mehrere Co Proteinexpression in Anlagen für sowohl transiente Expression und stabile Transformation in eine altehrwürdige Weise erreicht. Es beschäftigt einen einzigen Vektor, der enthält mehrere funktionell unabhängig Protein Expressionskassetten für Co Proteinexpression und überwindet damit die Nachteile der herkömmlichen Methoden. Darüber hinaus ist es ein sehr vielseitiges System in die, das DNA Manipulationen und Montage durch eine einfache ein-Schritt optimiert Reaktion ohne zusätzliche Schritte des DNA-Verdauung und Ligation erreicht werden. Das Funktionsprinzip ist in Abbildung 2dargestellt. Darüber hinaus ist es kompatibel mit aktuellen zellulären, molekularen und biochemischen Ansätze, die auf Chimären fluoreszierende Fusionsproteine basieren.
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Protocol
1. Primer Designstrategie und DNA Verstärkung
- Entwerfen Sie die Primer für Molekulare Klonierung von DNA-Fragmenten. Die Primer umfassen 20 bp gen spezifische Bindung Sequenzen und 20 bis 25 bp 5'-Ende Überhang Sequenzen, die die ergänzenden überlappenden Reihenfolge der angrenzenden DNA-Moleküle sind (siehe Tabelle 1 zum Beispiel).
Hinweis: Die anschließende Montage jedes DNA-Fragmente, Verknüpfung der verschiedenen Protein Expressionskassetten und Integration mit dem endgültigen Expressionsvektor alle abhängig von Anerkennung der angrenzenden überlappenden Sequenzen. - DNA-Fragmente, einschließlich der Projektträger, fluoreszierende Reporter und Zielgen Terminator, die für den Bau der halb-unabhängigen Protein Expressionskassetten durch standard-PCR-Reaktionen mit den entsprechenden Primern und qualitativ zu verstärken Fidelity Polymerase.
Hinweis: In dieser Studie für DNA Verstärkung verwendeten Vorlagen stammen aus früheren Studien15,22,23. Die Anlasstemperatur und Verlängerung der PCR-Reaktionen sind Grundierung und Gen abhängig.
2. DNA Fragment Montage und Errichtung von Protein Expressionskassetten
- Prüfen Sie die Qualität der Erstrunden-PCR Produkte durch DNA Elektrophorese und Quantifizierung von Spektralphotometer. Überprüfen Sie, ob die DNA-Schädigung und Kontamination von 1 % Agarose-Gelelektrophorese aufgetreten sind. Die OD260/OD280 der PCR Produkte sollte zwischen 1,6 und 1,8.
- Mischen Sie verschiedene DNA-Fragmente (0.05 - 0.1 Pmol für jedes Fragment) in eine neue PCR-Röhrchen zu einem Endvolumen von 5 µL.
Hinweis: Mix DNA-Moleküle entwickelt für das gleiche Protein Expressionskassette zusammen in ein PCR-Röhrchen. Vermeiden Sie DNAs aus verschiedenen Expressionskassette vermischen, da es verringert die Effizienz der DNA Montage durch die steigende Zahl der DNA-Moleküle, die verknüpft werden müssen.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - 5 X ISO Lager Puffer vorzubereiten: 500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2; 1 mM Deoxynucleotide (dNTP); 50 mM Dithiothreitol; 25 % Polyethylenglykol (PEG) 8000; und 5 mM Nicotinamid adenin Dinucleotide (NAD).
- 1 mL 2 x Meister Mischung aus 400 µL 5 x ISO Lager Puffer, 7,5 Einheiten von T5 Exonuclease, 62,5 Einheiten der High-Fidelity-DNA-Polymerase, 5.000 Einheiten der Taq Polymerase zu machen (siehe Tabelle der Materialien), und sterilisiert doppelt destilliert H2O.
Hinweis: Dies ist aus früheren Studien24,25,26angepasst; Diese Mengen sollten optimiert werden. - Aliquoten 100 µL 2 x Meister Mischung pro Rohr und Store bei-20 ° C.
Achtung: Häufiges Einfrieren und Auftauen der 2 X Meister Mischung können geringen DNA Montage Effizienz führen. - Die 5 µL DNA Mischung 15 µL 2 X Meister Mischung hinzu und bei 50 ° C für 60 min inkubieren.
3. Aufbau des Vektors für Co Ausdruck von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in Pflanzen
- Die gesamte halb-unabhängigen Protein Expressionskassette durch einen Zweitrunden-PCR, die Verwendung des Produkts zu verstärken (0,5 - 1,0 µL) aus der Isothermen Montage Erstrunden-Reaktion als die Vorlage und die Regionen in äußerster Primer (z. B. 1 FP35S und 1-RNOS für Ausdruck Kassette 1).
- 1 Gerät der High Fidelity Polymerase in einem 50 µL Reaktionsvolumen gefolgt von 30 Zyklen (94 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s und 68 ° C für 2 min), gefolgt von eine letzte Verlängerung bei 68 ° C für 5 Minuten.
- Die endgültige Protein Ausdruck Rückgrat Vektoren pUC18 und pCAMBIA1300, die für transiente Proteinexpression und genetische Transformation bzw. durch Zugabe von 4 Einheiten Sma ausgelegt sind zu linearisieren ich in eine endgültige 10 µL Reaktionsvolumen und Inkubation für 1 - 2 h bei 25 ° C. Deaktivieren Sie das Restriktionsenzym durch Inkubation bei 65 ° C für 20 Minuten.
- Eine endgültige Reaktionsvolumen von 5 µL untermischen Sie äquimolaren DNA-Moleküle Protein Expressionskassetten und linearisierten letzte Vektor. Führen Sie dann die Zweitrunden-DNA Rekombination durch Mischen mit 15 µL 2 x master Puffer und bei 50 ° C für 60 min Inkubation.
- Verwenden Sie die Endprodukte der Reaktion Zweitrunden-Isothermen Rekombination, um kompetente E. Coli zu verwandeln Zellen (z. B. DH5α) nach Standardverfahren27. Fen Sie, indem Sie Kolonie-PCR und DNA-Sequenzierung positiven Kolonien. Positive Plasmide aus E. Coli mit einem Mini-Plasmid Extraktion Kit extrahieren und speichern bei-80 ° C.
Achtung: Für die langfristige Lagerung, Plasmide in TE-Puffer gelöst oder doppelt destilliertem H2O sind stabiler als in E. Coli -Stämme zu halten.
4. biolistischen-Bombardement vermittelte transiente Co Expression von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in Pflanzen
- Bombardement Tabak BY-2 Aussetzung Zellen und Arabidopsis juvenile Pflanzen vorbereiten.
- Kultur-BY-2 Zellen in Murashige und Skoog (MS) Medium durch inkubationsschale zweimal pro Woche bei 25 ° C in einem Shaker mit 130 u/min eingestellt. Filtern Sie sammle 30 mL 3-d kultiviert BY-2 Zellen auf ein Stück 70 mm autoklaviert Filterpapier über eine Vakuumpumpe nach Einstellung der Unterdruck bis 40 Mbar.
- Zur Vermeidung der Zellen vor dem Austrocknen während der folgenden Schritte hinzufügen einige Tropfen der BY-2 Zelle flüssigen kulturelles Medium in einer Petrischale vor dem Filterpapier (nächster Schritt).
- Übertragen Sie das Filterpapier mit BY-2 Zellen darauf auf eine neue Petrischale (85 mm x 15 mm).
- Oberfläche zu sterilisieren Arabidopsis Thaliana (Col-0) Samen durch Vortexen eine Mischung mit 70 % (V/V) Ethanol mit 0,05 % Tween 20 für 10 Minuten.
- Spin-down der Samen mit einer Sitzbank Top Zentrifuge bei max. Geschwindigkeit für 2 s, überstand zu entfernen und die Samen mit 100 % igem Ethanol für 30 S. Pipette, die Samen auf eine neue sterile Filterpapier in einem sterilen Haube einmal waschen. Dann an der Luft Trocknen der Samen und verteile sie auf ½ MS Agarplatten.
- Speichern Sie die Platten bei 4 ° C für 48 Stunden vor der Übertragung in eine Pflanze Wachstum Kammer mit den folgenden Einstellungen: 16 h Licht dunkel 8 h mit 120-150 µm m-2 s-1 Intensität, 22 ° C.
- 7 - Tage alten Probe Pflanzen in einem 30 mm Durchmesser Kreis in der Mitte einer neuen ½ MS mittlere Platte zur Steigerung der Effizienz der Bombardierung zu übertragen.
Achtung: Vermeiden Sie überlappende die Pflanzen bei der Übertragung und legte sie auf die neue Platte ½ MS. - Fügen Sie einige Tropfen flüssigen Medium ½ MS auf der Oberfläche der Pflanzen oder Gewebe zu erhalten Feuchtigkeit und verhindert Austrocknen der Pflanzen, während die folgenden Schritte.
- Goldpartikel mit Plasmid DNA zu beschichten.
- Vortex gold Microcarrier Lösung gründlich, 3 min. Vorbereiten für eine neue 1,5 mL Tube.
- Fügen Sie nacheinander folgenden Lösungen in die Röhre und Wirbel: 25 µL (1,5 mg) gold-Partikel, Vortex 10 s; 10 µL 25,46 mg/L Spermidine, Vortex 10 s; 5 µL 1µg/µL Plasmid DNA, Vortex 3 min; 25 µL 277,5 mg/l CaCl2 -Lösung, Vortex 1 min.
Achtung: Halten Sie Vortexen während dieses Schritts. - Spin-down der gold Microcarriers mit einer Bank Top Zentrifuge bei max. Geschwindigkeit für 5 s und sorgfältig Pipette aus der Überstand ohne zu stören das Pellet. Waschen mit 200 µL von absoluten Ethanol und wieder auszusetzen das Pellet durch Wirbel für 5-10 S. Spin unten mit max. Geschwindigkeit für 5 s und entfernen das Ethanol.
- Wieder aussetzen der Goldpartikel in 18 µL des absoluten Ethanol und aliquoten 6 µL Partikel Suspension auf der Mitte der drei Macrocarriers. Lassen sie an der Luft trocknen.
- Übertragen von DNA in Pflanzen über Teilchen-Bombardement.
- Das Partikelsystem Lieferung wie folgt festgelegt: 1100 Psi, 28 mm Hg Vakuum und 1 cm Abstand 9 cm Teilchen Flugstrecke.
- Bombardieren Sie die Zellen/Anlagen auf die mittlere nährbodenplatte dreimal an drei verschiedenen Positionen zu, und halten Sie dann die Zellen/Anlagen in Dunkelheit unmittelbar nach der Bombardierung.
Achtung: Tragen Sie Schutzbrille, wenn die Partikel-Delivery-System wegen der Assoziation von Hochdruck-Gasleitungen und High-Speed-Teilchen mit dem System in Betrieb.
- Halten Sie bombardiert Zellen/Pflanzen in der Dunkelheit in der Pflanze Wachstum Kammer für 6 bis 72 Stunden vor der Beobachtung der fluoreszierenden Signale. Legen Sie die Pflanze Wachstum Kammer 24 h dunkel und 22 ° C.
Achtung: Der Ausdruck Effizienz und fluoreszierende Signalintensität sind Promotor - gen- und Anlage/Gewebe-abhängige.
5. Generation von stabilen transgenen Arabidopsis Co Ausdruck mehrere Chimären fluoreszierende Proteine durch Agrobacterium-vermittelten Transformation.
- Tauen Sie Agrobacterium kompetenten Zellen (PMP90) auf dem Eis auf und 30 min. warten Sie, dann fügen Sie 2 µL binären Vektor (100-200 ng) (vorbereitet oben) in die zuständigen Zellen. Setzen Sie die Mischung für 10 min auf Eis.
- Übertragen Sie die Mischung in eine vorgekühlt 0,1 cm Elektroporation Küvette. Küvette in die Elektroporation System einfügen und ausführen Elektroporation mit folgenden Einstellungen: 1,6 kV, 600 Ohm, 25 µF.
- Fügen Sie 1 mL des flüssigen Mediums SOC in die Küvette sofort nach der Elektroporation, die Zellen zu einem neuen Schlauch 1,5 mL pipette und bei 28 ° C in einem horizontalen Orbitalschüttler bei 200 u/min für 120 min inkubieren.
- Anhalten Sie die Zellen bei 2.348 x g bei Raumtemperatur für 5 min zentrifugieren, verwerfen die Mehrheit des Überstands, sanft wieder die gebeizte Zellen mit einer PIPETTENSPITZE, auf eine LB-Platte mit 50 mg/L Hygromycin B verteilen Sie und 2-3 Tage bei 28 ° C inkubieren.
- Arabidopsis Thaliana Col-0 Pflanzen mit der Agrobacterium, enthält die binären Vektor pCAMBIA1300 integriert mit mehreren Protein Expressionskassetten durch die floralen Dip28 Methode wie oben beschrieben zu verwandeln stabile transgene Pflanzen zu erzeugen.
- Sterilisieren Sie die Oberfläche der transgenen Saatguts Arabidopsis durch Mischen sie mit 70 % (V/V) Ethanol mit 0,05 % Tween 20. Wirbel für 10 min. Drehen Sie die Samen mit einer Sitzbank Top Zentrifuge bei max. Geschwindigkeit für 2 s, den überstand zu entfernen und waschen Sie die Samen mit 100 % Ethanol einmal für 30 s.
- Pipette, die Samen auf ein steriles Filterpapier in eine sterile Kapuze. Danach an der Luft trocknen und verteile sie auf ½ MS Agarplatten mit Hygromycin B für das screening positiver Stammarten.
- 2 Tage inkubieren Sie die Platten bei 4 ° C. Übertragen Sie sie anschließend in die Pflanze Wachstum Kammer und Kultur für 7 Tage.
- 7 - Tag überleben juvenile Altanlagen fluoreszierende Signale unter dem Fluoreszenz-Mikroskop gesucht, wählen, indem übertragen Sie die Pflanzen in Boden für weitere screening von homozygot Pflanzen zu.
6. Pharmazeutische Behandlungen
- Verdünnen Sie für pharmazeutischen Behandlungen jedes Medikament in flüssigen MS Medium für die entsprechenden Arbeiten-Konzentrationen vor der Inkubation mit Zellen oder Pflanzen.
- Wortmannin Behandlung: Vorbereitung 1 mM Stammlösungen der Wortmannin durch Wortmannin Pulver in DMSO auflösen und speichern die Bestände bei-20 ° C. Übertragen Sie Pflanzenzellen oder juvenile Pflanzen in der MS-Flüssigmedium mit 16,5 µM Wortmammin und inkubieren Sie für 30-45 min vor Bildgebung.
- Brefeldin A (BFA) Behandlung: Vorbereitung 1 mM Stammlösungen der BFA durch BFA Pulver in DMSO auflösen und speichern die Bestände bei-20 ° C. Pflanzenzellen oder juvenile Pflanzen in das flüssige MS Medium mit 10 µg/mL BFA für 30-45 min vor Bildgebung zu übertragen.
(7) confocal Mikroskop Bildgebung und Protein subzelluläre Lokalisation Co-Analyse
- Die juvenile Pflanzen oder Aussetzung Zellen auf einem herkömmlichen Objektträger übertragen und legte sanft eine Cover-Folie auf der Oberseite für die Bildgebung von standard konfokale Laser-scanning-Mikroskopie. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 63 X Wasser Ziel (N.A 1.4), 0 Hintergrund, 700 Gain, 0,168 mm Pixelgröße und Photomultiplier-Röhren-Detektor. Begeistern GFP-markierten Proteine bei 485 nm und erkennen Fluoreszenz bei 525 nm. RFP-markierten Proteine begeistern bei 514 nm und erkennen bei 575 nm.
- Berechnen Sie das Verhältnis Co Lokalisierung von fluoreszierenden Signale mit Bild J-Software (https://imagej.nih.gov/ij/) mit der Spearman-Pearson Korrelation (PSC) Co Lokalisierung plug-in als zuvor beschriebenen8. Pearson Korrelationskoeffizienten oder Spearmans Rang Korrelationskoeffizienten entnehmen Sie bitte die Ergebnisse (Abbildung 4). Die produzierten R-Werte werden von-1 bis 1. 0 zeigt keinen nachweisbaren Zusammenhang zweier Signale, während + 1 und-1 volle positive und negative Korrelation, bzw. von zwei Signalen zeigen.
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Representative Results
Wir haben eine robuste und sehr effiziente Methode für den Co Ausdruck von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in Pflanzen entwickelt. Es durchbricht die Schranken des herkömmlichen Ansätze verwenden mehrere getrennte Plasmide für Co Proteinexpression, wie in Abb. 1A, B, über transiente Expression oder stabile gentechnische Transformation. Bei dieser neuen Methode generieren wir einen einzelnen Ausdruck Vektor, der besteht aus mehreren Protein Expressionskassetten Co Proteinexpression gleichzeitig (Abbildung 1D) zu erreichen. Der Ausdruck Kassette Proteinfunktionen Semi-independently eigene DNA-Elemente für Protein-Expression. Daher kann jedes Protein Expressionskassette unabhängig nach vielfältigen Anforderungen für Protein-Expression angepasst werden. Für die endgültige Protein Co Expressionsvektor funktionieren die Protein Expressionskassetten drin wie grundlegende "Lego" Elemente, die geändert werden können, neu gebaut. und bequem neu platziert. Darüber hinaus wird eine alternative Strategie für DNA-Molekül Montage, Verknüpfung von mehreren Protein Expressionskassetten und Integration von DNA-Fragmenten mit der endgültigen Bestimmungsort Vektor für Co Ausdruck von Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen einfach erreicht über eine optimierte Isothermen in-vitro- Rekombination Reaktion ohne weitere zusätzliche Schritte des DNA-Verdauung und Vernetzung. Das Prinzip der Isothermen in-vitro- Rekombination Reaktion ist in Abbildung 2dargestellt. Die Verknüpfung von mehreren DNA-Moleküle (z. B. die drei Vertreter DNA Fragmente 1-3 dargestellt in Abbildung 2) und deren Integration mit dem endgültigen Expressionsvektor sind einfach und effizient erreicht, durch die ein-Schritt-Reaktion (siehe Abbildung 2 ). Es ist aus früheren Studien durch überlappende Rekombination von DNA-Molekülen vermittelt mit überlappenden kurze Sequenzen zu Fusion von DNA-Fragmenten und Bau von Plasmiden25,26angepasst.
Als Test der Methode wählten wir den vacuolar Sortier-Rezeptor (VSR) und der sekretorischen Trägerprotein der Membran (SCAMP), die beiden Reporter Proteine Protein sekretorischen und Endozytose Wege, bzw.6,22 beteiligt sind ,23,29,30. LTS sind Typ-ich integraler Membranproteine, die biosynthetische Protein Verkehr in den sekretorischen Weg in die Vakuole und vor allem vermitteln lokalisiert in prevacuolar Fächern (PVCs) in Pflanzen6,22,23. Im Gegensatz dazu sind sekretorischen Träger Membranproteine (Schurken) Typ-IV-Membranproteine, die Teilnahme an der Pflanze endocytic Weg. Es lokalisiert in der Plasmamembran (PM) und Trans-Golgi-Netzwerken (TGNs), dienen als frühen Endosomen22,29,30. Wir konstruierten zwei Protein Expressionskassetten, die als der Chimären Verschmelzungen von Arabidopsis VSR2 Host (AtVSR2) mit RFP und Arabidopsis SCAMP4 (AtSCAMP4) mit GFP, wie in Abbildung 3dargestellt. Um sicherzustellen, dass ER RFP-AtVSR2 übersetzt werden kann, wird eine Signalpeptid (SP) vor RFP, wie bisher gemeldeten6,31hinzugefügt. Die zwei einzelne Protein Expressionskassetten weiter miteinander und verbinden mit dem endgültigen Protein Ausdruck Vektor pUC18 oder pCAMBIA1300 für Co Proteinexpression entweder über Protein transiente oder stabile Transformation zu Pflanzen, wie in gezeigt Abbildung 3. AtVSR2 und AtSCAMP4 wurden erfolgreich Co ausgedrückt in Tabak BY-2 Zellen über Partikel Bombardement und zeigte richtige Lokalisierungen (Abb. 4A). RFP-AtVSR2 zeigten eine punktförmige Muster, die unterscheidet sich von der Plasmamembran Lokalisierung der AtSCAMP4-GLP mit einigen cytosolischen punctata Punkten war. Darüber hinaus Arabidopsis transgene Pflanzen, die AtSCAMP4-GFP und RFP-AtVSR2 Co Ausdrücken wurden durch Agrobacteriumgeneriert-vermittelten Transformation. Die subzellulären Lokalisierungen Co auszudrücken RFP-AtVSR2 und AtSCAMP4-GFP in Wurzel und Wurzelhaare Zellen wurden in Abbildung 4 b und 4Egezeigt. Co Ausdrucksergebnisse RFP-AtVSR2 und AtSCAMP4-GFP aus transgenen Arabidopsis gewonnen wurden in Übereinstimmung mit denen aus BY-2-Zellen. Darüber hinaus die transgenen Arabidopsis wurden mit Wortmannin behandelt und BFA für 30 min. Wortmmanin verursacht RFP-AtVSR2 mit der Bezeichnung PVCs bilden eine kleine ringförmige Struktur und BFA induzierte AtSCAMP-GFP TGN Aggregation, beschriftet, wie in Abbildung 4 dargestellt , D, F, G. Darüber hinaus kann kleine Autofluorescent Signal in Tabak BY-2 und Arabidopsis Wurzel und Wurzelhaare Zellen durch Anwenden der gleichen Einstellungen der Bildersammlung wie Abbildung 4 (ergänzende Abbildung1) erkannt werden.
Abbildung 1: ein robustes System für Co Ausdruck von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in Pflanzen. (A) herkömmliche Ansätzen der transient Co Ausdruck mehrere Reporter fluoreszierende Proteine in Pflanzen erreicht über Elektroporation, Teilchen-Bombardement und PEG-vermittelten Transformation durch das Mischen von mehreren unabhängigen Ausdruck Vektoren. (B) der konventionellen Methode für genetische Pflanzentransformation durch Agrobacterium mit einem einzigen fluoreszierende Fusion Protein Ausdruck Vektor. Um mehrere Chimären fluoreszierende Fusionsproteine in einer transgenen Pflanze Co auszudrücken, sind weitere genetische Kreuzung und mehrfache Umläufe des Screenings Führerscheinausbildung homozygote Stammarten. (C) und (D) das neue Protein Co Ausdruck Alternativmethode. Es nutzt ein einzelner Ausdruck Vektor, der besteht aus mehreren Protein Expressionskassetten und mehrere Chimären fluoreszierende Reporter Proteine in Pflanzen über Co äußern beide Transient Ausdruck und genetische Transformation. Details zu dieser Abbildung wurden erstmals in Zhong Et Al. veröffentlicht. 201736 (Nachdruck mit freundlicher Genehmigung; Urheberrecht Grenzen in Plant Science). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Demonstration der das Prinzip der einstufigen DNA Montageverfahren durch Isothermen Rekombination Reaktion. Die DNA-Fragmente und linearisierten Plasmid mit sich überschneidenden Sequenzen (OSs) sind mit base Pairing zwischen des 5'-Überhangs überlappende Regionen, um DNA-Polymerase verlängert und Verknüpfung durch Ligase befestigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: die Strategie für den Bau einer einzigen Plasmid für Co Ausdruck mehrere Chimären fluoreszierende Fusionsproteine. Das Diagramm zeigt die Strategie für den Bau einer einzigen Ausdruck Plasmid für den Co Ausdruck von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen entweder für transiente Expression oder stabile Transformation in Pflanzen. Der Expressionsvektor besteht aus zwei Protein Expressionskassetten, von denen jeder seinen eigenen notwendigen Elemente für die Proteinexpression und Funktionen im Ausdruck seiner individuellen Chimären fluoreszierende Fusionsproteins Semi-independently enthält. Montage und Vernetzung der DNA-Moleküle werden durch eine optimierte Isothermen in-vitro- Rekombination Methode vermittelt mit den überlappenden DNA-Fragmente bequem erreicht. Details zu dieser Abbildung wurden erstmals in Zhong Et Al. veröffentlicht. 201736 (Nachdruck mit freundlicher Genehmigung; Urheberrecht Grenzen in Plant Science). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Repräsentative Bilder Co Meinungsäußerung Chimären fluoreszierende Verschmelzung von VSR und SCAMP in pflanzlichen Zellen.
(A) Co Ausdruck des RFP-AtVSR2 und AtSCAMP4-GFP über Teilchens Bombardierung im Tabak BY-2 Aussetzung Zellen. (B) ein repräsentatives Bild der transgenen Arabidopsis Wurzel Zelle zusammen mit dem Ausdruck Ihrer RFP-AtVSR2 und AtSCAMP4-GFP. (C) und (D) transgenen Arabidopsis Wurzeln zusammen mit dem Ausdruck RFP-AtVSR2 und AtSCAMP4-GFP wurden mit Wortmannin und BFA für 30 min. behandelt. (E) ein repräsentatives Bild von einer transgenen Arabidopsis Wurzelhaare RFP-AtVSR2 und AtSCAMP4-GFP Co zum Ausdruck zu bringen. (F) und (G) transgenen Arabidopsis Wurzelhaare, die zusammen mit dem Ausdruck Ihrer RFP-AtVSR2 und AtSCAMP4-GLP für 30 min. Pfeile in (D) und (G) mit Wortmannin und BFA behandelt wurden zeigen BFA-induzierte protein Aggregation. Rp = Pearson-Korrelationskoeffizient; Rs = der Spearman Rangkorrelation. Maßstabsleiste in (A)-(D) beträgt 50 µm, (E)-(G) ist 30 µm. Details dieser Figur erschienen zuerst in Zhong Et Al. 201736 (Nachdruck mit freundlicher Genehmigung; Urheberrecht Grenzen in Plant Science). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Expressionskassette 1 | ||
| 1-FP35S | GAATTCGAGCTCGGTACCC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 1-RP35S | AGGACGCGGGCGTGGGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 1-FRFP | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCCCACGCCCGCGTCCT | |
| 1-RRFP | ATTATCCATATCACTCCCCA GGCGCCGGTGGAGTGGCGGC | |
| 1-FAtVSR2 | GCCGCCACTCCACCGGCGCC TGGGGAGTGATATGGATAAT | |
| 1-RAtVSR2 | AAATGTTTGAACGATCGGGA TTACAACTCTAGTTGAGAAG | |
| 1-FNOS | CTTCTCAACTAGAGTTGTAA TCCCGATCGTTCAAACATTT | |
| 1-RNOS | GAGAATGGATGCGAGTAATG TCTAGTAACATAGATGACAC | |
| Expressionskassette 2 | ||
| 2-FP35S | CATTACTCGCATCCATTCTC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 2-RP35S | TTAGGATCGTGTCGTGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 2-FAtSCAMP4 | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCACGACACGATCCTAA | |
| 2-RAtSCAMP4 | TCCTCGCCCTTGCTCACCAT TAGTGCACGCATCAAGGTCG | |
| 2-FGFP | CGACCTTGATGCGTGCACTA ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA | |
| 2-RGFP | TAAAACCAAAATCCAGTGAC TTACTTGTACAGCTCGTCCA | |
| 2-FT35S | TGGACGAGCTGTACAAGTAA GTCACTGGATTTTGGTTTTA | |
| 2-RT35S | GTCGACTCTAGAGGATCCCC GTCCGCAAAAATCACCAGTC | |
Tabelle 1: Primer Designstrategie und Sequenzen, die in dieser Studie verwendeten. Name jede Grundierung wird auf der linken Seite gegeben. Die ergänzende überlappenden Sequenzen der Primer sind unterstrichen. Details zu dieser Tabelle wurden erstmals in Zhong Et Al. veröffentlicht. 201736 (Nachdruck mit freundlicher Genehmigung; Urheberrecht Grenzen in Plant Science).
Ergänzende Abbildung1: Repräsentative Bilder der Autofluoreszenz in BY-2 Zellen und Arabidopsis Wurzeln und Wurzelhaare. (A) der Autofluoreszenz der Wildtyp BY-2 Zellen unter den gleichen Bedingungen der Bildgebung mit der transformierten Zellen erkannt wurde. (B) und (C) Arabidopsis Wurzelhaare und Wurzelzellen wurden unter den gleichen Bedingungen der Bildgebung mit der transformierten Zellen Arabidopsis nachgewiesen. Maßstabsleiste in (A)-(C) beträgt 20 µm DIC, differential Interferenz-Kontrast. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Hier haben wir eine neuartige Methode auszudrücken, robust Chimären fluoreszierende Schmelzverfahren Proteine in Pflanzen Co demonstriert. Es kann für transiente Expression und genetische Transformation verwendet werden und ist kompatibel mit aktuellen fluoreszierende Protein-basierten Bio-Imaging, Molekulare und biochemische Anwendungen und Technologien9,10,13 . Darüber hinaus überwindet es die Schwierigkeiten von den herkömmlichen Methoden, mit denen mehrere individuelle Ausdruck Plasmide für Co Proteinexpression. Im Gegensatz dazu beschäftigt einen einzelnen Ausdruck Vektor, der mehrere Protein Expressionskassetten mit ihren eigenen einzelnen Projektträger, fluoreszierende Tags Zielproteine und Terminatoren enthält. Darüber hinaus kann die Protein-Expressionskassette unabhängig verwaltet werden, vielfältigen Ausdruck zu erfüllen, wie z. B. die Verwendung eines spezifischen Promotors und der N - oder C-terminalen Chimären Fusion eines fluoreszierenden Proteins mit dem Zielprotein. Daher mag der Proteinfunktionen Ausdruck Kassette ein grundlegendes "Lego"-Element, das in das Plasmid Semi-unabhängig arbeitet. Darüber hinaus ist auch ein äußerst vielseitige System in welchem gen bearbeiten, Ersatz, und Montage alle leicht erreicht werden durch eine einstufige Isothermen Rekombination Reaktion ohne zusätzliche Prozesse des Enzym Verdauung und Unterbindung. Wir wurden optimiert, die Effizienz der Isothermen Rekombination Reaktion aus früheren Studien, wie in Schritt 2.4, durch verschiedene Konzentrationen von T5 Exonuclease, Phusion-DNA-Polymerase und Taq Polymerase Tests beschrieben. Darüber hinaus Fragmente die Konzentration jedes DNA-für die einstufige Isothermen Rekombination Reaktion vorgeschlagen wird, soll zwischen 0,05 und 0,1 Pmol Ligation maximale Effizienz zu erreichen.
Überexpression des Transgens durch Austausch seiner endogenen Veranstalter mit einem starken und kontinuierlichen Promoter wie Ubiquitin-10 Promotor (UBQ10), und die Einführung von zusätzlichen Kopien des Gens ist ein wild verwendeten Ansatz für die Zellfunktionen zu studieren und zugrunde liegende Wirkmechanismus in Zellen15,32. Jedoch fand unerwartete Down-Regulierung und starke Hemmung der Genexpression manchmal auch33,34. Der Prozentsatz der unvorhersehbaren gen-silencing reicht von 2 bis 100 % unter diesen Situationen33,35. Darüber hinaus gen-silencing hat eine höhere Chance bei Expression von mehreren Genen gleichzeitig passieren Transformation von hohen Kopien der DNA und deutliche Steigerungen des Gens transkriptioneller Ebene9,33,24 ,35. Um das Auftreten von Gen-silencing in den robusten mehrere Fusion Protein Co Expressionssystems zu minimieren, haben wir verschiedene aktive Promotoren, die verschiedenen Protein Expressionskassetten fahren, wenn mehrere Fusionsproteine Co zum Ausdruck zu bringen. Darüber hinaus vermeiden wir ständig mit der gleichen Promoter für verschiedene Expressionskassetten. Darüber hinaus ist eine weitere mögliche Einschränkung dieses Protokolls die geringere Effizienz der einstufigen DNA Isothermen Rekombination durch die steigende Zahl von Protein Expressionskassette für Co Ausdruck verursacht. Darüber hinaus setzt die Anzahl der Expressionskassetten, die hauptsächlich in den endgültigen Ausdruck Plasmid gehostet werden können auf die Replicon Rückgrat Plasmid24,25,35.
Zusammengenommen haben wir ein leistungsfähiges System für Co Ausdruck mehrere Chimären fluoreszierende Fusionsproteine bequem in Pflanzen36entwickelt. Es überwindet die Grenzen der klassischen Methoden und eine optimierten einstufigen DNA Montage Reaktion für DNA-Vernetzung und Plasmid Bau in einer altehrwürdigen Weise nutzt. Dieser technische Fortschritt wurde validiert durch AtVSR2 und AtSCAMP4 Co Ausdruck in pflanzlichen Zellen über transiente Expression und genetische Transformation. Daher zeigt es eine überzeugende und neuartige Methode für verschiedene Aspekte der wissenschaftlichen Entdeckungen durch Co Ausdruck von Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in Pflanzen. Darüber hinaus das Konzept und Prinzip der Co Ausdruck mehrere Chimären fluoreszierende Fusionsproteine über einen einzelnen Ausdruck Vektor sind voll kompatibel mit CRISPR-Cas9, RNAi und Protein Überexpression Technologien, die Funktionen studieren und Wechselwirkungen von mehreren Genen in Pflanzen37,38,39.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken die Mitgliedern des Wang Labors für hilfreiche Diskussionen und Kommentare. Diese Arbeit wird unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant Nr. 31570001) und der naturwissenschaftlichen Grundlage der Provinz Guangdong und Guangzhou City (grant Nr. 2016A030313401 und 201707010024), h.w.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
References
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