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Chemistry

पौधों में एक कुशल तरीके में एकाधिक Chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की सह अभिव्यक्ति

Published: July 1, 2018 doi: 10.3791/57354
Automatic Translation
*1, *1, 1
1College of Life Sciences, South China Agricultural University
* These authors contributed equally

Summary

हम सह के लिए एक उपंयास विधि विकसित की है पौधों में कई chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त पारंपरिक तरीकों की कठिनाइयों को दूर करने के लिए । यह एक एकल अभिव्यक्ति प्लाज्मिड है कि कई कार्यात्मक स्वतंत्र प्रोटीन व्यक्त कैसेट प्रोटीन सह प्राप्त करने के लिए अभिव्यक्ति का उपयोग कर का लाभ लेता है ।

Abstract

एक प्रोटीन के spatiotemporal उपसेलुलर स्थानीयकरण (ओं) के बारे में जानकारी के लिए कोशिकाओं में अपने शारीरिक कार्यों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । फ्लोरोसेंट प्रोटीन और फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की पीढ़ी बेतहाशा एक प्रभावी उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है सीधे प्रोटीन स्थानीयकरण और कोशिकाओं में गतिशीलता कल्पना । यह विशेष रूप से उंहें अच्छी तरह से सह के बाद organelle मार्करों के साथ तुलना उपयोगी है ब्याज के प्रोटीन के साथ अभिव्यक्ति । फिर भी, पौधों में प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के लिए शास्त्रीय दृष्टिकोण आमतौर पर एक से अधिक स्वतंत्र अभिव्यक्ति plasmids शामिल है, और इसलिए कमियां है कि कम सह अभिव्यक्ति दक्षता, अभिव्यक्ति स्तर भिंनता, और उच्च समय शामिल है आनुवंशिक पार और स्क्रीनिंग में व्यय । इस अध्ययन में, हम सह के लिए एक मजबूत और उपंयास विधि का वर्णन पौधों में कई chimeric फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति । यह एक एकल अभिव्यक्ति वेक्टर कि कई अर्द्ध स्वतंत्र व्यक्त कैसेट से बना है का उपयोग करके पारंपरिक तरीकों की सीमाओं पर काबू । प्रत्येक प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट अपने स्वयं के कार्यात्मक प्रोटीन अभिव्यक्ति तत्व होते हैं, और इसलिए यह flexibly विविध अभिव्यक्ति की मांग को पूरा करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । इसके अलावा, यह आसान है और विधानसभा और अतिरिक्त पाचन और बंधाव कदम के बिना एक अनुकूलित एक कदम प्रतिक्रिया का उपयोग करके अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में डीएनए टुकड़ों में हेरफेर करने के लिए सुविधाजनक है । इसके अलावा, यह वर्तमान फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ पूरी तरह से संगत है जैव इमेजिंग प्रौद्योगिकियों और ऐसे झल्लाहट और BiFC के रूप में अनुप्रयोगों, व्युत्पंन । विधि के सत्यापन के रूप में, हम सह एक्सप्रेस फ्लोरोसेंट vacuolar छंटाई रिसेप्टर और स्रावी वाहक झिल्ली प्रोटीन से जुड़े इस नई प्रणाली कार्यरत हैं । परिणाम बताते है कि उनके परिप्रेक्ष्य उपसेलुलर स्थानीयकरण पिछले अध्ययनों में दोनों क्षणिक अभिव्यक्ति और पौधों में आनुवंशिक परिवर्तन के रूप में ही कर रहे हैं ।

Introduction

Chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन intracellular गतिशीलता और सेलुलर स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए उपयोगी उपकरण के रूप में माना गया है और आगे उनके शारीरिक कार्यों को समझने और1,2तंत्र काम कर रहे, 3 , 4. यह विशेष रूप से सह व्यक्त करने के लिए फायदेमंद है प्रश्न में प्रोटीन के साथ अच्छी तरह से जाना जाता organelle रिपोर्टर प्रोटीन के लिए बेहतर अपने spatiotemporal तर्क, वितरण, और समारोह (ओं) endomembrane प्रणाली में4 कोशिकाओं में वर्णन , 5 , 6 , 7 , 8.

एक chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन क्षणिक अभिव्यक्ति और स्थिर आनुवंशिक परिवर्तन है, जो उनके संबंधित लाभ और सीमाएं9,10,11के माध्यम से पौधों में व्यक्त किया जा सकता है । एक प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति एक सुविधाजनक तरीका है कि, जो भी शामिल है--, पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी)-, या electroporation मध्यस्थता डीएनए protoplasts और एग्रोबेक्टीरियम-मध्यस्थता पत्ता घुसपैठ में परिवर्तनीय अभिव्यक्ति बरकरार संयंत्र कोशिकाओं, के रूप में चित्र 1a, बी12,13,14,15,16में दिखाया गया है । हालांकि, सह एक संयंत्र सेल में एकाधिक chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति कई स्वतंत्र अभिव्यक्ति plasmids का एक मिश्रण की आवश्यकता है । इस प्रकार, पौधों में प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के लिए एकाधिक plasmids रोजगार की कमियां कम सह अभिव्यक्ति के कारण कई plasmids के नाटकीय रूप से कम मौका एक साथ एक ही कोशिकाओं में प्रवेश करने के लिए एक ही प्लाज्मिड की तुलना में, और प्लाज्मिड के प्रत्येक प्रकार के बेकाबू यादृच्छिक राशि की वजह से प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर के रूपांतरों सेल17,18में स्थानांतरित किया जा रहा है । इसके अलावा, यह प्रोटीन सह अभिव्यक्ति9,10,11के लिए एक एकल एग्रोबेक्टीरियम में कई स्वतंत्र अभिव्यक्ति plasmids शुरू करने के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है । इसलिए, तंबाकू के पत्तों की घुसपैठ द्वारा एग्रोबेक्टीरियममध्यस्थता प्रोटीन क्षणिक अभिव्यक्ति केवल एक समय में एक प्लाज्मिड व्यक्त करने में सक्षम है, जैसा कि चित्र 1bमें दिखाया गया है । इसके विपरीत, ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त संयंत्रों की पीढ़ी आमतौर पर एग्रोबेक्टीरियम है कि एक द्विआधारी परिवर्तन वेक्टर किया जाता द्वारा प्राप्त की है । हालांकि, द्विआधारी वेक्टर है कि संयंत्र जीनोम में जीन हस्तांतरण और प्रविष्टि मध्यस्थता केवल एक फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन (आंकड़ा 1b)9,10,12व्यक्त करने में सक्षम है । एक ट्रांसजेनिक संयंत्र जो कई chimeric फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त एक साथ उत्पादन आनुवंशिक पार और स्क्रीनिंग, जो महीनों से जीन की संख्या के आधार पर साल से ले जा सकते है सह व्यक्त की कई दौर की आवश्यकता है ।

रोजगार के लिए एक एकल अभिव्यक्ति वेक्टर सह के लिए संयंत्र में कई प्रोटीन की अभिव्यक्ति पिछले अध्ययन द्वारा सूचित किया गया है19,20,21। हालांकि, एंजाइमी पाचन और डीएनए अणु और रीढ़ वैक्टर के डीएनए बंधाव के कई दौर आम तौर पर प्रोटीन सह अभिव्यक्ति या अधिक अभिव्यक्ति के लिए अंतिम प्लाज्मिड की पीढ़ी के लिए आवश्यक हैं । यहां, हम सह के लिए एक नया और मजबूत विधि विकसित की है पौधों में कई chimeric फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त । यह एक उच्च कुशल और सुविधाजनक तरीका है कि एक समय संमानित फैशन में परिवर्तनीय अभिव्यक्ति और स्थिर परिवर्तन दोनों के लिए पौधों में कई प्रोटीन सह अभिव्यक्ति प्राप्त है । यह एक वेक्टर है कि प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के लिए कई कार्यात्मक स्वतंत्र प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट शामिल है और इस तरह पारंपरिक तरीकों की कमियां काबू में रोजगार । इसके अलावा, यह एक उच्च बहुमुखी प्रणाली है जिसमें डीएनए जोड़तोड़ और विधानसभा डीएनए पाचन और बंधाव के अतिरिक्त कदम के बिना एक सरल एक कदम अनुकूलित प्रतिक्रिया द्वारा प्राप्त कर रहे हैं । कार्य सिद्धांत चित्रा 2में सचित्र है । इसके अलावा, यह वर्तमान सेलुलर, आणविक, और जैव रासायनिक दृष्टिकोण है कि chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन पर आधारित है के साथ पूरी तरह से संगत है ।

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Protocol

1. प्राइमर डिजाइन रणनीति और डीएनए प्रवर्धन

  1. डीएनए टुकड़े की आणविक क्लोनिंग के लिए प्राइमरों डिजाइन । प्राइमरों में 20 बीपी जीन विशिष्ट बाइंडिंग अनुक्रम और 20 से 25 बीपी 5 '-अंत बदस्तूर दृश्यों, जो आसंन डीएनए अणुओं के पूरक अतिव्यापी अनुक्रम है शामिल है (उदाहरण के लिए तालिका 1 देखें) ।
    नोट: प्रत्येक डीएनए टुकड़े के बाद के विधानसभा, विभिंन प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट के संबंध, और अंतिम अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ एकीकरण सभी आसंन अतिव्यापी दृश्यों की मांयता पर निर्भर करते हैं ।
  2. बढ़ाना डीएनए टुकड़े, प्रमोटर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर, लक्ष्य जीन, और टर्मिनेटर, कि अर्द्ध स्वतंत्र प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट के निर्माण के लिए आवश्यक है मानक पीसीआर प्रतिक्रियाओं से उनके इसी प्राइमरों और उच्च के साथ निष्ठा पोलीमरेज़ ।
    नोट: डीएनए प्रवर्धन के लिए इस अध्ययन में इस्तेमाल किया टेंपलेट्स पिछले अध्ययन से प्राप्त कर रहे है15,22,23। एनीलिंग तापमान और पीसीआर प्रतिक्रियाओं का विस्तार समय प्राइमर और जीन निर्भर हैं ।

2. डीएनए टुकड़ा विधानसभा और प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट का निर्माण

  1. डीएनए ट्रो द्वारा पहले दौर पीसीआर उत्पादों की गुणवत्ता की जांच और spectrophotometer द्वारा मात्रा । जांच करें कि क्या डीएनए क्षरण और संदूषण 1% agarose जेल ट्रो द्वारा हुई है । पीसीआर प्रॉडक्ट्स की OD260/OD280 १.६ और १.८ के बीच होनी चाहिए ।
  2. मिश्रण अलग डीएनए टुकड़े (०.०५-प्रत्येक टुकड़ा के लिए ०.१ pmol) एक नई पीसीआर ट्यूब में 5 µ की एक अंतिम मात्रा के लिए एल
    नोट: मिश्रण डीएनए एक ही प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट के लिए एक साथ एक पीसीआर ट्यूब में डिजाइन अणुओं । अलग अभिव्यक्ति कैसेट से एक साथ DNAs मिश्रण से बचें, क्योंकि यह डीएनए की बढ़ती संख्या के कारण विधानसभा की दक्षता कम हो जाएगा डीएनए अणुओं की जरूरत है कि जोड़ा जा करने के लिए ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।
  3. 5x आईएसओ स्टॉक बफर तैयार: ५०० mM Tris-HCl, pH ७.५; ५० मिमी MgCl2; 1 मिमी deoxynucleotide (dNTP); ५० मिमी dithiothreitol; 25% पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) ८०००; और 5 एमएम nicotinamide adenine dinucleotide (णड) ।
  4. 1 मिलीलीटर 2x मास्टर मिश्रण से ४०० µ एल 5x आईएसओ स्टॉक बफर, ७.५ इकाइयों के T5 exonuclease, ६२.५ उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ की इकाइयों, Taq पोलीमरेज़ की ५,००० इकाइयों ( सामग्री की तालिकादेखें), और डबल आसुत एच2ओ निष्फल ।
    नोट: यह पिछले अध्ययन से अनुकूलित है24,25,26; इन वॉल्यूंस ऑप्टिमाइज़ किया जाना चाहिए ।
  5. Aliquot १०० µ एल ट्यूब प्रति 2x मास्टर मिश्रण का और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    चेतावनी: लगातार ठंड और 2x मास्टर मिश्रण के गल कम डीएनए विधानसभा दक्षता पैदा कर सकता है ।
  6. 5 µ एल डीएनए मिश्रण करने के लिए 2x मास्टर मिश्रण के 15 µ एल जोड़ें और ६० मिनट के लिए ५० ° c पर मशीन ।

3. सह के लिए वेक्टर के निर्माण-पौधों में एकाधिक Chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति

  1. एक दूसरे दौर पीसीआर द्वारा पूरे अर्द्ध स्वतंत्र प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट बढ़ाना टेंपलेट और सबसे बाहरी प्राइमरों के रूप में पहले दौर इज़ोटेर्माल विधानसभा प्रतिक्रिया से उत्पाद (०.५-१.० µ एल) का उपयोग (जैसे, 1-FP35S और अभिव्यक्ति के लिए 1-RNOS कैसेट 1) ।
    1. एक ५० µ एल प्रतिक्रिया मात्रा में 30 एस, 30 एस के लिए ५५ ° c, और 2 मिनट के लिए ६८ ° c के लिए (९४ ° c), 5 मिनट के लिए ६८ ° c पर एक अंतिम विस्तार के बाद के द्वारा पीछा 1 यूनिट के उच्च निष्ठा पोलीमरेज़ का प्रयोग करें ।
  2. Linearize अंतिम प्रोटीन अभिव्यक्ति रीढ़ वैक्टर pUC18 और pCAMBIA1300 है, जो प्रोटीन क्षणिक अभिव्यक्ति और आनुवंशिक परिवर्तन के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं, क्रमशः, 4 इकाइयों को जोड़ने के द्वारा एक अंतिम 10 µ l प्रतिक्रिया मात्रा में Sma और 1 के लिए मशीनिंग- 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 hr. 20 मिनट के लिए ६५ ° c पर मशीन द्वारा प्रतिबंध एंजाइम को निष्क्रिय ।
  3. मिश्रण प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट के equimolar डीएनए अणुओं और रैखिक अंतिम 5 µ के एक प्रतिक्रिया मात्रा में सदिश के एल । फिर, 15 µ एल 2x मास्टर बफर के साथ मिश्रण और ६० मिनट के लिए ५० ° c पर मशीनिंग द्वारा दूसरे दौर डीएनए पुनर्संयोजन प्रदर्शन करते हैं ।
  4. मानक प्रक्रियाओं27के अनुसार सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं (जैसे, DH5α) को बदलने के लिए दूसरे दौर इज़ोटेर्माल पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया के अंतिम उत्पादों का प्रयोग करें । डबल कॉलोनी पीसीआर और डीएनए अनुक्रमण द्वारा सकारात्मक कालोनियों की जांच करें । एक मिनी प्लाज्मिड निष्कर्षण किट का उपयोग करके ई. कोलाई से सकारात्मक plasmids निकालें और-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    चेतावनी: लंबी अवधि के भंडारण के लिए, plasmids ते बफर या डबल आसुत एच2ओ में भंग कर रहे है उंहें ई. कोलाई उपभेदों में रखने से अधिक स्थिर हैं ।

4. सूची-बमबारी मध्यस्थता में कई Chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन के पौधों में मध्यस्थीय सह अभिव्यक्ति

  1. -2 निलंबन कोशिकाओं और बमबारी के लिए Arabidopsis किशोर पौधों द्वारा तंबाकू तैयार करते हैं ।
    1. द्वारा संस्कृति-Murashige में 2 कोशिकाओं और Skoog (एमएस) द्वारा मध्यम subculturing में दो बार प्रति सप्ताह 25 डिग्री सेल्सियस पर एक शेखर १३० rpm पर सेट । फ़िल्टर 30-एमएल 3 डी द्वारा कल्चरित-2 कोशिकाओं के एक टुकड़े पर ७०-mm autoclaved फ़िल्टर कागज एक वैक्यूम पंप के माध्यम से ४० mbar करने के लिए वैक्यूम दबाव की स्थापना के द्वारा ।
    2. आदेश में निंनलिखित चरणों के दौरान बाहर सुखाने से कोशिकाओं को रोकने के लिए, फ़िल्टर कागज (अगले कदम) रखने से पहले एक पेट्री डिश में द्वारा-2 सेल तरल सांस्कृतिक माध्यम की कई बूंदें जोड़ें ।
    3. यह एक नई पेट्री डिश (८५ मिमी x 15 मिमी) के लिए पर द्वारा-2 कोशिकाओं के साथ फिल्टर पेपर स्थानांतरण ।
    4. सतह बंध्याकरण Arabidopsis थालियाना (कर्नल-0) बीज ७०% के साथ एक मिश्रण भंवर से (v/v) इथेनॉल युक्त ०.०५% के बीच 20 10 मिनट के लिए ।
    5. नीचे स्पिन 2 एस के लिए अधिकतम गति से एक बेंच शीर्ष केंद्रापसारक का उपयोग कर, supernatant हटाने और १००% इथेनॉल के साथ बीज एक बार एक बाँझ डाकू में एक नया बाँझ फिल्टर कागज पर बीज बाहर 30 एस पिपेट के लिए धो लो । फिर, हवा-बीज सूखी और उंहें ½ एमएस पर फैल प्लेटें ।
    6. ४८ घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों की दुकान निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एक संयंत्र विकास कक्ष में उन्हें स्थानांतरित करने से पहले: 16 ज प्रकाश/१२०-१५० µm एम-2 एस-1 तीव्रता, 22 डिग्री सेल्सियस के साथ 8 एच डार्क।
    7. एक नया ½ एमएस मीडियम प्लेट के केंद्र में एक 30 मिमी व्यास सर्कल में 7 दिन पुराने नमूना पौधों स्थानांतरण बमबारी की दक्षता बढ़ाने के लिए ।
      चेतावनी: पौधों अतिव्यापी जब स्थानांतरित करने और उंहें नए ½ एमएस प्लेट पर रखने से बचें ।
    8. पौधों या ऊतकों की सतह पर ½ एमएस तरल माध्यम के कई बूंदें जोड़ने के लिए नमी की रक्षा और बाहर पौधों सुखाने निंनलिखित चरणों के दौरान बाहर रोकने के ।
  2. प्लाज्मिड डीएनए के साथ कोट सोने के कणों ।
    1. भंवर सोने microcarrier समाधान अच्छी तरह से, के लिए 3 मिनट के लिए एक नया १.५ एमएल ट्यूब तैयार ।
    2. क्रमिक रूप से ट्यूब और भंवर में निंनलिखित समाधान जोड़ें: 25 µ l (१.५ मिलीग्राम) सोने के कण, भंवर 10 s; 10 µ l of २५.४६ mg/l spermidine, भंवर 10 s; 5 µ l का 1 µ g/µ l प्लाज्मिड DNA, भंवरा 3 min; 25 µ एल के २७७.५ मिलीग्राम/एल CaCl2 समाधान, भंवर 1 मिनट ।
      चेतावनी: इस कदम के दौरान भंवर रखो ।
    3. गोल्ड microcarriers नीचे स्पिन 5 एस के लिए अधिकतम गति पर एक बेंच शीर्ष केंद्रापसारक का उपयोग और ध्यान से गोली परेशान बिना supernatant बाहर पिपेट । पूर्ण इथेनॉल और फिर से २०० µ एल के साथ धो-5-10 के लिए भंवर ने गोली निलंबित एस । अधिकतम स्पीड पर 5 एस के लिए नीचे स्पिन और इथेनॉल को दूर ।
    4. पुनः निलंबित 18 µ एल में सोने के कणों निरपेक्ष इथेनॉल और aliquot के 6 µ l कणों निलंबन तीन macrocarriers के बीच पर. उन्हें शुष्क हवा दें ।
  3. कण बमबारी के माध्यम से पौधों में डीएनए स्थानांतरण ।
    1. निंनलिखित के रूप में कण वितरण प्रणाली सेट करें: ११०० साई, 28 मिमी पारा वैक्यूम, 1 सेमी गैप दूरी, और 9 सेमी कण उड़ान दूरी ।
    2. तीन विभिन्न पदों पर तीन बार आगर मीडियम प्लेट पर पौधों की बौछार करें और फिर बमबारी के तुरंत बाद कोशिकाओं को अँधेरे में रखें/
      चेतावनी: सुरक्षा चश्मा पहनते हैं, क्योंकि उच्च दबाव गैस और उच्च प्रणाली के साथ गति कणों के संघ के कण वितरण प्रणाली के संचालन ।
  4. 6 से ७२ घंटे के लिए फ्लोरोसेंट संकेतों के अवलोकन से पहले संयंत्र विकास चैंबर में अंधेरे में बमबारी कोशिकाओं/ संयंत्र विकास चैंबर 24 ज अंधेरे और 22 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट करें ।
    चेतावनी: अभिव्यक्ति दक्षता और फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता प्रमोटर हैं, जीन, और संयंत्र/ऊतक-निर्भर ।

5. एग्रोबेक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन द्वारा स्थिर ट्रांसजेनिक Arabidopsis सह एकाधिक Chimeric फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त की पीढ़ी ।

  1. गल बर्फ पर एग्रोबेक्टीरियम सक्षम कोशिकाओं (PMP90) और 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें, तो जोड़ें 2 µ एल द्विआधारी वेक्टर (१००-२०० एनजी) (ऊपर तैयार) सक्षम कोशिकाओं में । 10 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण बैठो ।
  2. एक पूर्व ठंडा ०.१ सेमी electroporation cuvette में मिश्रण स्थानांतरण । electroporation सिस्टम में cuvette संमिलित करें और निंनलिखित सेटिंग्स के साथ electroporation प्रदर्शन: १.६ केवी, ६०० ohms, 25 µF ।
  3. cuvette में समाज के तरल माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें तुरंत electroporation के बाद, पिपेट एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं, और 28 ° c में एक क्षैतिज कक्षीय शेखर में मशीन १२० मिनट के लिए २०० rpm पर ।
  4. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर २,३४८ x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक, supernatant के बहुमत को त्यागें, धीरे फिर से एक पिपेट टिप के साथ छर्रों कोशिकाओं को निलंबित, उंहें एक पौंड प्लेट ५० mg/L Hygromycin B युक्त पर फैला है, और 2-3 दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  5. रूपांतरण Arabidopsis थालियाना कर्नल-0 एग्रोबेक्टीरियमहै, जो कई प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट के साथ एकीकृत pCAMBIA1300, के रूप में पहले से वर्णित पुष्प डुबकी28 विधि से शामिल है के साथ पौधों स्थिर ट्रांसजेनिक संयंत्रों उत्पन्न करते हैं ।
  6. ७०% (v/v) इथेनॉल युक्त ०.०५% 20 के बीच के साथ मिश्रण से ट्रांसजेनिक Arabidopsis बीज की सतह को निष्फल । 10 मिनट के लिए भंवर नीचे स्पिन 2 एस के लिए अधिकतम गति से एक बेंच शीर्ष केंद्रापसारक का उपयोग कर बीज, supernatant को हटाने, और १००% इथेनॉल के साथ बीज 30 एस के लिए एक बार धो लो ।
  7. एक बाँझ डाकू में एक बाँझ फिल्टर कागज पर बीज बाहर पिपेट. इसके बाद, हवा सूखी और उंहें ½ एमएस Hygromycin बी युक्त प्लेटों पर सकारात्मक जिन्न स्क्रीनिंग के लिए फैल गया ।
  8. 2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें मशीन । फिर, उंहें संयंत्र विकास चैंबर और संस्कृति में 7 दिनों के लिए स्थानांतरण ।
  9. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत फ्लोरोसेंट संकेतों के लिए जाँच द्वारा 7 दिन पुराने जीवन रक्षा किशोर पौधों का चयन करें, तो homozygous संयंत्रों के आगे स्क्रीनिंग के लिए मिट्टी में पौधों का हस्तांतरण.

6. दवा उपचार

  1. दवा उपचार के लिए, तरल एमएस मध्यम में प्रत्येक दवा कोशिकाओं या पौधों के साथ मशीन से पहले इसकी उचित काम सांद्रता के लिए पतला ।
    1. Wortmannin उपचार: DMSO में Wortmannin पाउडर को भंग करके Wortmannin के 1 mM स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें और स्टॉक्स को 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर कर लें । स्थानांतरण संयंत्र कोशिकाओं या तरल एमएस माध्यम में किशोर पौधों १६.५ µ m wortmammin युक्त और इमेजिंग से पहले 30-45 मिनट के लिए मशीन ।
    2. Brefeldin ए (BFA) उपचार: DMSO में BFA पाउडर को भंग करके BFA के 1 mM स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें और स्टॉक्स को 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर कर लें । इमेजिंग से पहले 30-45 मिनट के लिए 10 µ g/mL BFA युक्त तरल MS माध्यम में पादप कोशिकाओं या किशोर पौधों का स्थानांतरण ।

7. फोकल माइक्रोस्कोप इमेजिंग और प्रोटीन उपसेलुलर सह स्थानीयकरण विश्लेषण

  1. एक पारंपरिक गिलास स्लाइड पर किशोर पौधों या निलंबन कोशिकाओं स्थानांतरण और धीरे मानक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के लिए शीर्ष पर एक कवर स्लाइड डाल दिया । निंन सेटिंग्स का उपयोग करें: 63X पानी उद्देश्य (एन. ए १.४), 0 पृष्ठभूमि, ७०० लाभ, ०.१६८ मिमी पिक्सेल आकार, और photomultiplier ट्यूब डिटेक्टर । उत्तेजित GFP-४८५ एनएम में प्रोटीन टैग और ५२५ एनएम पर प्रतिदीप्ति का पता लगाने । आरएफपी के लिए-टैग प्रोटीन, ५१४ एनएम पर उत्तेजित और ५७५ एनएम में पता लगाने ।
  2. पियरसन-स्पीमरन सहसंबंध (पीएससी) के साथ छवि जे सॉफ्टवेयर (https://imagej.nih.gov/ij/) का उपयोग कर फ्लोरोसेंट संकेतों के सह स्थानीयकरण अनुपात की गणना करें-स्थानीयकरण प्लग-इन के रूप में पहले वर्णित8। पियरसन सहसंबंध गुणांक या स्पीमरन के रैंक सहसंबंध गुणांक परिणाम (आरेख 4) में दिखाए जाते हैं । उत्पादित r मान-1 से 1 करने के लिए किया जाएगा । 0 दो संकेतों का कोई पता लगाने वाला सहसंबंध दर्शाता है, जबकि + 1 और-1 शो पूर्ण सकारात्मक और नकारात्मक सहसंबंध, क्रमशः, दो संकेतों की ।

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Representative Results

हम सह के लिए एक मजबूत और अत्यधिक कुशल विधि विकसित की है पौधों में कई chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति । यह पारंपरिक दृष्टिकोण के अवरोधों के माध्यम से टूटता है प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के लिए एकाधिक अलग plasmids का उपयोग करें, जैसा चित्र 1a, बी में दिखाया गया है, या तो क्षणिक अभिव्यक्ति या स्थिर आनुवंशिक परिवर्तन के माध्यम से । इस नई विधि में, हम एक एकल अभिव्यक्ति वेक्टर है कि कई प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट से एक समय में प्रोटीन सह अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए बना है उत्पंन (चित्रा 1C, डी) । प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट कार्य अर्द्ध स्वतंत्र रूप से प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए अपने स्वयं के आवश्यक डीएनए तत्वों के साथ । इसलिए, प्रत्येक प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट स्वतंत्र रूप से प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए विविध आवश्यकताओं के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है । अंतिम प्रोटीन सह अभिव्यक्ति वेक्टर के लिए के रूप में, यह बुनियादी "लेगो" तत्वों जो संशोधित किया जा सकता है, फिर से निर्माण के रूप में यह समारोह में प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट । और फिर से आसानी से रखा । इसके अलावा, डीएनए अणु विधानसभा के लिए एक वैकल्पिक रणनीति, कई प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट के संबंध, और अंतिम गंतव्य के लिए सदिश के साथ डीएनए अंशों के एकीकरण सह के लिए-अभिव्यक्ति chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की बस हासिल की है इन विट्रो में एक अनुकूलित इज़ोटेर्माल के माध्यम से डीएनए पाचन और अपलिंकिंग के आगे अतिरिक्त कदम के बिना reयुग्म प्रतिक्रिया । इन विट्रो पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया में इज़ोटेर्माल के कार्य सिद्धांत चित्रा 2में सचित्र है । एकाधिक डीएनए अणुओं के संबंध (उदाहरण के लिए, तीन प्रतिनिधि डीएनए 1-3 चित्रा 2में दिखाया गया है) और अंतिम अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ उनके एकीकरण बस रहे है और कुशलता से एक कदम प्रतिक्रिया द्वारा प्राप्त ( चित्रा 2 देखें ). यह डीएनए अणुओं के अतिव्यापी संयोजन अतिव्यापी छोटे दृश्यों के साथ मध्यस्थता के डीएनए टुकड़े और plasmids25,26के निर्माण के फ्यूजन को प्राप्त करने के द्वारा पिछले अध्ययनों से अनुकूलित है ।

विधि का एक परीक्षण के रूप में, हम vacuolar छंटाई रिसेप्टर (VSR) और स्रावी वाहक झिल्ली प्रोटीन (SCAMP) है, जो दो रिपोर्टर प्रोटीन स्रावी और endocytosis रास्ते, क्रमशः6,22 में भाग ले रहे हैं प्रोटीन चुना ,२३,२९,३०. VSRs प्रकार-मैं अभिंन झिल्ली प्रोटीन है कि स्रावी मार्ग में vacuole के लिए और मुख्य रूप से6,22,23पौधों में prevacuolar डिब्बों (PVCs) में स्थानीयकरण की मध्यस्थता । इसके विपरीत, स्रावी वाहक झिल्ली प्रोटीन (SCAMPs) प्रकार-IV झिल्ली प्रोटीन है कि संयंत्र endocytic मार्ग में भाग ले रहे हैं । यह प्लाज्मा झिल्ली (प्रधानमंत्री) और ट्रांसGolgi नेटवर्क (TGNs) है, जो जल्दी endosomes22,29,30के रूप में सेवा करने के लिए स्थानीयकृत । हम दो प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट का निर्माण किया है कि मेजबान के chimeric संलयन Arabidopsis VSR2 (AtVSR2) के साथ आरएफपी और Arabidopsis SCAMP4 (AtSCAMP4) के साथ, के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है । आरएफपी-AtVSR2 एर में अनुवाद किया जा सकता है यह सुनिश्चित करने के लिए, एक संकेत पेप्टाइड (SP) आरएफपी से पहले जोड़ा जाता है, के रूप में पहले6,31रिपोर्ट । दो व्यक्ति प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट आगे लिंक कर रहे है और प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के लिए अंतिम प्रोटीन अभिव्यक्ति वेक्टर pUC18 या pCAMBIA1300 के साथ ligate या तो प्रोटीन क्षणिक या संयंत्र स्थिर परिवर्तन के माध्यम से, में दिखाया के रूप में चित्र 3. AtVSR2 और AtSCAMP4 सफलतापूर्वक सह-द्वारा तंबाकू में व्यक्त किया गया-कण बमबारी के माध्यम से 2 कोशिकाओं और सही स्थानीयकरण (चित्रा 4a) दिखाया । आरएफपी-AtVSR2 कुछ GFP cytosolic डॉट्स के साथ AtSCAMP4-कबरा के प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण से अलग था, जो एक कबरा पैटर्न, दिखाया. इसके अलावा, Arabidopsis ट्रांसजेनिक पौधों कि सह व्यक्त AtSCAMP4-GFP और आरएफपी-AtVSR2 एग्रोबेक्टीरियम मध्यस्थता परिवर्तन के माध्यम सेउत्पंन किया गया । सह-व्यक्त आरएफपी के उपसेलुलर स्थानीयकरण-AtVSR2 और AtSCAMP4-GFP रूट और रूट बालों की कोशिकाओं में चित्रा 4B और 4Eमें दिखाया गया । आरएफपी-AtVSR2 और AtSCAMP4-GFP ट्रांसजेनिक Arabidopsis से प्राप्त की सह-अभिव्यक्ति परिणाम द्वारा-2 कोशिकाओं से लोगों के साथ समझौते में थे । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक Arabidopsis 30 मिनट के लिए wortmannin और BFA के साथ इलाज किया गया । Wortmmanin कारण आरएफपी-AtVSR2 त्यसपछि PVCs गठन गर्ने एक छोटो रिंग लाईक संरचना, र BFA प्रेरित AtSCAMP-GFP त्यसपछि TGN समुच्चय, जैसा फिगर 4c में दर्शाए , डी, एफ, जी. इसके अतिरिक्त, छोटे फ्लोरोसेंट संकेत द्वारा तंबाकू में पाया जा सकता है-2 कोशिकाओं और Arabidopsis जड़ और जड़ बाल कोशिकाओं छवि संग्रह की एक ही सेटिंग्स को लागू करने के द्वारा 4 चित्रा (पूरक चित्रा 1) के लिए के रूप में ।

Figure 1
चित्रा 1: सह के लिए एक मजबूत प्रणाली-पौधों में कई chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति । (एक) कई स्वतंत्र अभिव्यक्ति मिश्रण द्वारा electroporation, कण बमबारी, और खूंटी मध्यस्थता परिवर्तन के माध्यम से प्राप्त पौधों में कई फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन की क्षणिक सह अभिव्यक्ति के पारंपरिक दृष्टिकोण वैक्टर. (ख) एक एकल फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ एग्रोबेक्टीरियम द्वारा संयंत्र आनुवंशिक परिवर्तन के लिए पारंपरिक विधि । सह करने के लिए एक ट्रांसजेनिक संयंत्र में कई chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त, आगे आनुवंशिक पार और स्क्रीनिंग के कई दौर homozygous की जांच प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं । (ग) और (घ) वैकल्पिक नई प्रोटीन सह-अभिव्यक्ति पद्धति. यह एक एकल अभिव्यक्ति सदिश का लाभ लेता है, जो कई प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट से बना है और सह दोनों क्षणिक अभिव्यक्ति और आनुवंशिक परिवर्तन के माध्यम से पौधों में कई chimeric फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त करने में सक्षम है । इस आंकड़े का विवरण सबसे पहले Zhong एट अल में प्रकाशित किया गया । २०१७३६ (अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित; कॉपीराइट संयंत्र विज्ञान में फ्रंटियर्स) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: इज़ोटेर्माल पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया द्वारा एक कदम डीएनए विधानसभा विधि के कार्य सिद्धांत का प्रदर्शन. डीएनए टुकड़े और अतिव्यापी दृश्यों (OSs) के साथ रैखिक प्लाज्मिड 5 ' के बीच आधार कतरन से जुड़े रहे है-बदस्तूर अतिव्यापी क्षेत्रों, डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा विस्तार, और ligase द्वारा जोड़ने । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सह के लिए एक एकल प्लाज्मिड के निर्माण की रणनीति कई chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त । आरेख कई chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की सह अभिव्यक्ति के लिए एक एकल अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के निर्माण के लिए रणनीति को दर्शाता है या तो क्षणिक अभिव्यक्ति या पौधों में स्थिर परिवर्तन के लिए । अभिव्यक्ति वेक्टर दो प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट से बना है, जिनमें से प्रत्येक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए अपने स्वयं के आवश्यक तत्व होते हैं, और अपने व्यक्तिगत chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन अर्द्ध स्वतंत्र रूप से व्यक्त करने में कार्य करता है । विधानसभा और सभी डीएनए अणुओं के परस्पर संबंध को सुविधाजनक ढंग से एक अनुकूलित इज़ोटेर्माल द्वारा प्राप्त कर रहे है इन विट्रो पुनर्संयोजन विधि अतिव्यापी डीएनए टुकड़े के साथ मध्यस्थता । इस आंकड़े का विवरण सबसे पहले Zhong एट अल में प्रकाशित किया गया । २०१७३६ (अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित; कॉपीराइट संयंत्र विज्ञान में फ्रंटियर्स) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: सह के प्रतिनिधि छवियों VSR और संयंत्र कोशिकाओं में SCAMP के chimeric फ्लोरोसेंट संलयन की अभिव्यक्ति ।
(क) आरएफपी की सह-अभिव्यक्ति-AtVSR2 और AtSCAMP4-GFP द्वारा तंबाकू में कण बमबारी के माध्यम से-2 निलंबन कोशिकाओं । (ख) एक ट्रांसजेनिक Arabidopsis जड़ कोशिका सह व्यक्त आरएफपी-AtVSR2 और AtSCAMP4-GFP की एक प्रतिनिधि छवि. (ग) और (घ) ट्रांसजेनिक Arabidopsis जड़ें सह-व्यक्त आरएफपी-AtVSR2 और AtSCAMP4-GFP क्रमशः ३० मिनट के लिए wortmannin और BFA के साथ व्यवहार किया गया. (ङ) एक ट्रांसजेनिक Arabidopsis जड़ बाल सह व्यक्त आरएफपी-AtVSR2 और AtSCAMP4-GFP की एक प्रतिनिधि छवि. (च) और (छ) ट्रांसजेनिक Arabidopsis जड़ झांट सह व्यक्त आरएफपी-AtVSR2 और AtSCAMP4-GFP के लिए wortmannin और BFA के साथ 30 मिनट के लिए उपचार किया गया । में तीर (D) और (g) संकेत BFA-प्रेरित प्रोटीन एकत्रीकरण. rp = पियरसन सहसंबंध गुणांक; आरएस = स्पीमरन रैंक सहसंबंध । स्केल बार में (A)-(D) is ५० µm, (E)-(G) 30 µm है । इस आंकड़े का विवरण सबसे पहले Zhong एट अल में प्रकाशित किया गया था । २०१७३६ (अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित; कॉपीराइट संयंत्र विज्ञान में फ्रंटियर्स) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अभिव्यक्ति कैसेट 1
1-FP35S GAATTCGAGCTCGGTACCC ACATGGTGGAGCACGACACA
1-RP35S AGGACGCGGGCGTGGGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC
1-FRFP GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCCCACGCCCGCGTCCT
1-RRFP ATTATCCATATCACTCCCCA GGCGCCGGTGGAGTGGCGGC
1-FAtVSR2 GCCGCCACTCCACCGGCGCC TGGGGAGTGATATGGATAAT
1-RAtVSR2 AAATGTTTGAACGATCGGGA TTACAACTCTAGTTGAGAAG
1-FNOS CTTCTCAACTAGAGTTGTAA TCCCGATCGTTCAAACATTT
1-RNOS GAGAATGGATGCGAGTAATG TCTAGTAACATAGATGACAC
अभिव्यक्ति 2 कैसेट
2-FP35S CATTACTCGCATCCATTCTC ACATGGTGGAGCACGACACA
2-RP35S TTAGGATCGTGTCGTGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC
2-FAtSCAMP4 GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCACGACACGATCCTAA
2-RAtSCAMP4 TCCTCGCCCTTGCTCACCAT TAGTGCACGCATCAAGGTCG
2-FGFP CGACCTTGATGCGTGCACTA ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
2-RGFP TAAAACCAAAATCCAGTGAC TTACTTGTACAGCTCGTCCA
2-FT35S TGGACGAGCTGTACAAGTAA GTCACTGGATTTTGGTTTTA
2-RT35S GTCGACTCTAGAGGATCCCC GTCCGCAAAAATCACCAGTC

तालिका 1: प्राइमर डिजाइन रणनीति और इस अध्ययन में इस्तेमाल किया दृश्यों । प्रत्येक प्राइमरी का नाम बाएं पैनल पर दिया गया है । पूरक प्राइमरों के अतिव्यापी दृश्यों रेखांकित कर रहे हैं । इस तालिका का विवरण सबसे पहले Zhong एट अल में प्रकाशित किया गया । २०१७३६ (अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित; कॉपीराइट संयंत्र विज्ञान में फ्रंटियर्स) ।

पूरक चित्रा 1: द्वारा-2 कोशिकाओं और Arabidopsis जड़ों और जड़ बाल में autofluorescence की प्रतिनिधि छवियां । (क) रूपांतरित कोशिकाओं के साथ ही इमेजिंग शर्तों के तहत वाइल्ड टाइप बाय-२ कोशिकाओं के autofluorescence का पता लगाया गया. (ख) और (ग) रूपांतरित Arabidopsis कोशिकाओं के साथ समान इमेजिंग शर्तों के तहत Arabidopsis रूट हेयर और रूट कोशिकाओं का पता लगाया गया. (A)-(C) में स्केल बार 20 µm., अवकलन हस्तक्षेप कंट्रास्ट है । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

यहां हम मजबूती से सह करने के लिए एक उपंयास विधि का प्रदर्शन किया है, पौधों में chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त करते हैं । यह दोनों क्षणिक अभिव्यक्ति और आनुवंशिक परिवर्तन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और वर्तमान फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ संगत जैव इमेजिंग, आणविक आधारित है, और रासायनिक अनुप्रयोगों और प्रौद्योगिकियों9,10,13 . इसके अतिरिक्त, यह पारंपरिक तरीकों कि प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के लिए कई व्यक्तिगत अभिव्यक्ति plasmids का उपयोग की कठिनाइयों पर काबू । इसके विपरीत, यह एक एकल अभिव्यक्ति वेक्टर है कि अपने स्वयं के व्यक्तिगत प्रवर्तकों, फ्लोरोसेंट टैग, लक्ष्य प्रोटीन, और टर्मिनेटर के साथ कई प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट शामिल कार्यरत हैं । इसके अलावा, प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट स्वतंत्र रूप से प्रबंधित किया जा सकता है विभिंन अभिव्यक्ति आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, इस तरह के एक विशिष्ट प्रमोटर और एन के उपयोग के रूप में या सी-टर्मिनल लक्ष्य प्रोटीन के साथ एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की chimeric संलयन । इसलिए, प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट कार्य एक बुनियादी "लेगो" तत्व है कि अर्द्ध स्वतंत्र रूप से काम करता है प्लाज्मिड में की तरह । इसके अलावा, यह भी एक उच्च बहुमुखी प्रणाली है जिसमें जीन संपादन, प्रतिस्थापन, और विधानसभा सभी आसानी से एंजाइम पाचन और बंधाव की अतिरिक्त प्रक्रियाओं के बिना एक कदम इज़ोटेर्माल पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । हम पिछले अध्ययनों से इज़ोटेर्माल पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया की क्षमता को अनुकूलित किया है, के रूप में २.४ कदम में वर्णित है, T5 exonuclease, Phusion डीएनए पोलीमरेज़, और Taq पोलीमरेज़ के विभिंन सांद्रता परीक्षण द्वारा । इसके अलावा, एक कदम इज़ोटेर्माल पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया के लिए प्रत्येक डीएनए टुकड़े की एकाग्रता के लिए ०.०५ और ०.१ pmol के बीच अधिकतम बंधाव दक्षता प्राप्त करने के लिए सुझाव दिया है ।

इस तरह के ubiquitin के रूप में एक मजबूत और सतत प्रमोटर, के साथ अपने अंतर्जात प्रमोटर की जगह से एक transgene की अभिव्यक्ति-10 प्रमोटर (UBQ10), और जीन की अतिरिक्त प्रतियां शुरू करने के लिए अपनी सेलुलर कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक बेतहाशा इस्तेमाल किया दृष्टिकोण है और कक्षों में अंतर्निहित कार्य तंत्र15,३२. हालांकि, अप्रत्याशित नीचे-विनियमन और जीन अभिव्यक्ति की मजबूत संकोच के रूप में अच्छी तरह से पाया गया३३,३४। अप्रत्याशित जीन मुंह बंद करने पर्वतमाला का प्रतिशत 2 से १००% इन स्थितियों के अंतर्गत३३,३५। इसके अलावा, जीन मुंह बंद करने एक उच्च कई जीन की अभिव्यक्ति में एक साथ होने का मौका है, डीएनए की उच्च प्रतियां के परिवर्तन, और जीन transcriptional स्तर9,३३,24 की महत्वपूर्ण वृद्धि ,३५. आदेश में मजबूत एकाधिक संलयन प्रोटीन सह अभिव्यक्ति प्रणाली में जीन मुंह बंद करने की घटना को कम करने के लिए, हम विभिंन सक्रिय प्रवर्तकों को चुना अलग प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट ड्राइव जब सह कई फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त । इसके अलावा, हम लगातार अलग अभिव्यक्ति कैसेट के लिए एक ही प्रमोटर का उपयोग कर टाल दिया । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल की एक और संभावित सीमा एक कदम डीएनए इज़ोटेर्माल सह के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट की बढ़ती संख्या की वजह से संयोजन की कमी क्षमता है अभिव्यक्ति । इसके अलावा, अभिव्यक्ति कैसेट्स कि अंतिम अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में आयोजित किया जा सकता है की संख्या में मुख्य रूप से रीढ़ की replicon पर निर्भर करता है प्लाज्मिड24,25,३५।

एक साथ ले लिया, हम सह के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली विकसित की है३६पौधों में कई chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन आसानी से व्यक्त । यह शास्त्रीय तरीकों की सीमाओं पर काबू पाता है और एक अनुकूलित एक-एक समय में डीएनए अपलिंकिंग और प्लाज्मिड निर्माण के लिए कदम डीएनए विधानसभा प्रतिक्रिया का संमान फैशन का इस्तेमाल करता है । इस तकनीकी अग्रिम दोनों क्षणिक अभिव्यक्ति और आनुवंशिक परिवर्तन के माध्यम से संयंत्र कोशिकाओं में AtVSR2 और AtSCAMP4 सह अभिव्यक्ति द्वारा मान्य किया गया है. इसलिए, यह पौधों में chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की सह अभिव्यक्ति द्वारा वैज्ञानिक खोजों के विभिंन पहलुओं के लिए एक कायल और उपंयास विधि दर्शाता है । इसके अतिरिक्त, अवधारणा और सह के सिद्धांत एकाधिक chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति एक एकल अभिव्यक्ति वेक्टर के माध्यम से पूरी तरह से CRISPR के साथ संगत कर रहे हैं-Cas9, RNAi, और प्रोटीन पर अभिव्यक्ति प्रौद्योगिकियों के कार्यों का अध्ययन करने के लिए और पौधों में कई जीन की सहभागिता३७,३८,३९.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम सहायक विचार विमर्श और टिप्पणियों के लिए वांग प्रयोगशाला के सदस्यों को धंयवाद । इस काम के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है चीन (NSFC, अनुदान no. ३१५७०००१) और प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन गुआंग्डोंग प्रांत और गुआंगज़ौ शहर (ग्रांट no. 2016A030313401 और २०१७०७०१००२४) को बुश hw

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD-FX Polymerase TOYOBO KFX-101
Sma I NEB R0141L/S/V
Tris-HCl BBI A600194-0500
MgCl2 BBI A601336-0500
dNTP NEB #N0447V
DTT BBI C4H10O2S2
PEG 8000 BBI A100159-0500
NAD BBI A600641-0001
T5 exonuclease Epicentre T5E4111K
Phusion High-Fidelity DNA polymerase NEB M0530S
Taq DNA polymerase NEB B9022S
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) Sigma M5524
Ethanol BBI A500737-0500
Tween 20 BBI A600560-0500
Agar BBI A505255-0250
Spermidine BBI A614270-0001
Gold microcarrier particles Bio-Rad 165-2263 1.0 µm
CaCl2 BBI CD0050-500
Macrocarriers Bio-Rad 165-2335
Rupture disk Bio-Rad 165-2329
Stopping screen Bio-Rad 165-2336
Tryptone OXOID LP0042
Yeast Extract OXOID LP0021
NaCl BBI A610476-0001
KCl BBI A610440-0500
Glucose BBI A600219-0001
Hygromycin B Genview AH169-1G
Wortmannin Sigma F9128
Brefeldin A Sigma SML0975-5MG
Dimethylsulphoxide (DMSO) BBI A600163-0500
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
Growth chamber Panasonic MLR-352H-PC
PSD-1000/He particle delivery system Bio-Rad 165-2257
Gene Pulser Bio-Rad 1652660
Cuvette Bio-Rad 1652083
Benchtop centrifuge Eppendorf 5427000097
Confocal microscope Zeiss LSM 7 DUO (780&7Live)
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000
EPS-300 Power Supply Tanon EPS 300
Fluorescent microscope Mshot MF30
Agrose BBI A600234
Ampicillin BBI A100339
Ethylene Diamine Tetraacetie Acid BBI B300599

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References

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रसायन विज्ञान अंक १३७ प्रोटीन सह अभिव्यक्ति chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन प्रोटीन उपसेलुलर स्थानीयकरण और गतिशीलता प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट एक कदम डीएनए विधानसभा प्रतिक्रिया एकल अभिव्यक्ति वेक्टर क्षणिक अभिव्यक्ति स्थिर आनुवंशिक परिवर्तन
पौधों में एक कुशल तरीके में एकाधिक Chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की सह अभिव्यक्ति
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Peng, X., Zhong, G., Wang, H.… More

Peng, X., Zhong, G., Wang, H. Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants. J. Vis. Exp. (137), e57354, doi:10.3791/57354 (2018).

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