Summary
Temos desenvolvido um novo método para expressar co várias proteínas da fusão fluorescente quimérico em plantas para superar as dificuldades dos métodos convencionais. Ele tira vantagem do uso de um plasmídeo de expressão única que contém várias proteínas funcionalmente independentes expressando cassettes para alcançar expressão co de proteína.
Abstract
Informações sobre a spatiotemporal localization(s) subcelular de uma proteína são fundamentais para entender suas funções fisiológicas nas células. Proteínas fluorescentes e geração de proteínas fluorescentes fusão tem sido usados descontroladamente como ferramenta eficaz Visualizar diretamente a localização da proteína e a dinâmica nas células. É especialmente útil para compará-los com marcadores de organela conhecido depois da expressão co com a proteína de interesse. No entanto, abordagens clássicas co na expressão de proteínas em plantas geralmente envolvem múltiplos plasmídeos de expressão independente e portanto tem inconvenientes que incluem eficiência baixa expressão co e variação do nível de expressão do que na hora despesas em cruzamento genético e triagem. Neste estudo, descrevemos um método robusto e inovador para expressão co de múltiplas proteínas fluorescentes quiméricoes em plantas. Ele supera as limitações dos métodos convencionais usando um vetor de expressão única que é composto de várias fitas expressando semi-independentes. Cada gaveta de expressão da proteína contém seus próprios elementos de expressão de proteínas funcionais, e, portanto, pode ser ajustado com flexibilidade para atender à demanda diversificada de expressão. Além disso, é fácil e conveniente para realizar a montagem e manipulação de DNA fragmentos no plasmídeo de expressão por meio de uma reação de uma etapa otimizado sem digestão adicional e passos de ligadura. Além disso, é totalmente compatível com tecnologias atuais de bio-imagem fluorescente proteínas derivadas e aplicações, tais como o traste e BiFC. Como uma validação do método, utilizamos este novo sistema receptor de classificação vacuolar express co fluorescente fundido e proteínas de membrana transportadora secretoras. Os resultados mostram que suas localizações subcellular perspectiva são os mesmos como em estudos anteriores pela expressão transiente e transformação genética em plantas.
Introduction
Proteínas quiméricas fluorescente fusão tem sido consideradas como ferramentas úteis para estudar a dinâmica intracelular e Localização subcellular e entender melhor suas funções fisiológicas e trabalho mecanismos1,2, 3 , 4. é especialmente benéfico para as proteínas de repórter de organela conhecido co express com a proteína em questão para ilustrar melhor sua lógica spatiotemporal, distribuição e funções dentro do sistema endomembranoso em células4 , 5 , 6 , 7 , 8.
Uma proteína de fusão fluorescente quimérico pode ser expressa em plantas através de expressão transiente e transformação genética estável, que têm suas respectivas vantagens e limitações9,10,11. Expressão transitória de uma proteína é uma abordagem conveniente que inclui biobalística bombardeamento-, polietileno glicol (PEG)-, ou mediada por eletroporação DNA expressão transiente em protoplastas e Agrobacterium-mediada por infiltração de folha em células de vegetais intactos, como mostrado na figura 1A, B12,13,14,15,16. No entanto, a expressão co de múltiplas proteínas quiméricas fusão fluorescente em uma célula única planta requer uma mistura de vários plasmídeos de expressão independente. Assim, as desvantagens da contratação de múltiplos plasmídeos co na expressão de proteínas em plantas são baixos níveis de expressão co devido a drasticamente reduzida chance de vários plasmídeos entrar simultaneamente as mesmas células quando comparado a um único plasmídeo e o variações dos níveis de expressão de proteínas causadas pela quantidade incontrolavelmente aleatória de cada tipos de plasmídeo sendo transferido para a célula17,18. Além disso, é tecnicamente desafiador para introduzir vários plasmídeos de expressão independente em um único Agrobacterium para proteína expressão co9,10,11. Portanto, Agrobacterium-mediada por proteínas expressão transiente por infiltração de tabaco em folhas só é capaz de expressar um plasmídeo ao mesmo tempo, como mostrado na figura 1B. Em contraste, geração de plantas transgênicas expressando proteínas da fusão fluorescente geralmente é conseguida por Agrobacterium que carrega um vetor de transformação binário. No entanto, o vetor binário que medeia a transferência de genes e inserção em genomas a planta só é capaz de expressar uma fusão única de fluorescente proteína (figura 1B)9,10,12. Gerando uma planta transgênica que expressa várias proteínas fluorescentes quiméricoes simultaneamente requer várias rodadas de cruzamento genético e triagem, que pode levar de meses a anos, dependendo do número de genes para ser co expressa.
O emprego de que um vetor de expressão única expressão co de múltiplas proteínas na planta tem sido relatado por vários anteriores estudos19,20,21. No entanto, várias rodadas de digestão enzimática e ligadura do DNA de moléculas de DNA e vetores de espinha dorsal são geralmente necessárias para geração do plasmídeo final para expressão de proteínas co ou sobre-expressão. Aqui, nós desenvolvemos um método novo e robusto para expressar co várias proteínas fluorescentes quiméricoes em plantas. É um método altamente eficiente e conveniente que atinge vários expressão co de proteínas em plantas para tanto expressão transiente e transformação estável de forma honrada. Ele emprega um vetor único que contém várias fitas de expressão de proteínas funcionalmente independente co na expressão de proteínas e, assim, supera os inconvenientes dos métodos convencionais. Além disso, é um sistema altamente versátil, no qual DNA manipulações e montagem são atingidos por uma reação de uma etapa simples otimizada sem etapas extras de digestão do DNA e da ligadura. O princípio de funcionamento está ilustrado na Figura 2. Além disso, é totalmente compatível com abordagens atuais de celulares, moleculares e bioquímicas que são baseadas em proteínas da fusão fluorescente quimérico.
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Protocol
1. primer Design estratégia e amplificação de DNA
- Desenha os primers para clonagem molecular de fragmentos de DNA. Os primers compõem 20 sequências de ligação específica do gene de bp e 20 a 25 bp-extremidade 5' saliência sequências, que são a sequência complementar sobreposição de moléculas de DNA adjacentes (ver tabela 1 , por exemplo).
Nota: A montagem posterior de cada DNA fragmentos, enlace de cassettes de expressão de diferentes proteínas, e integração com o vetor de expressão final todos dependem de reconhecimento das sequências adjacentes sobrepostos. - Amplificar fragmentos de DNA, incluindo o promotor, repórter fluorescente, gene alvo e Exterminador do futuro, que são necessárias para a construção das fitas de expressão de proteína semi-independente por padrão reações de PCR com primers seus correspondentes e alta polimerase de fidelidade.
Nota: Os modelos utilizados neste estudo para amplificação de DNA são derivados de estudos anteriores15,22,23. A temperatura do recozimento e tempo de extensão das reações de PCR são primer e dependente do gene.
2. DNA fragmento de montagem e construção de Cassettes de expressão de proteínas
- Examinar a qualidade dos produtos PCR do primeiro round por eletroforese de DNA e quantificar por Espectrofotômetro. Verifique se a contaminação e degradação de DNA ocorreram por eletroforese em gel de agarose 1%. O OD260/OD280 dos produtos do PCR deve ser entre 1.6 e 1.8.
- Misturar diferentes fragmentos de DNA (0,05 - 0,1 pmol de cada fragmento) para um novo tubo de PCR para um volume final de 5 µ l.
Nota: As moléculas de DNA Mix projetado para a mesma fita de expressão de proteínas juntos em um tubo PCR. Evite mistura de DNAs cassete de expressão diferente, uma vez que reduzirá a eficiência da montagem de DNA devido ao crescente número de moléculas de DNA que precisam estar vinculado.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. - Prepare 5 x ISO buffer de estoque: 500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2; deoxynucleotide de 1 mM (dNTP); Ditiotreitol 50mm; 25% polietileno glicol (PEG) 8000; e 5mm nicotinamida adenina dinucleótido (NAD).
- Fazer 1 mL 2 x mestre mistura de 400 µ l 5 x ISO estoque buffer, 7,5 unidades do exonuclease T5, 62,5 unidades de alta-fidelidade DNA polimerase, 5.000 unidades de Taq polimerase (ver Tabela de materiais), e esterilizado bidestilada H2O.
Nota: Isto é adaptado de anteriores estudos24,25,26; estes volumes devem ser otimizados. - Alíquota 100 µ l de 2 x mestre mistura por tubo e loja a-20 ° C.
Cuidado: Frequente de congelamento e descongelamento de mistura de mestre 2 x podem causar baixa eficiência de montagem de DNA. - Adicionar 15 µ l de mistura de mestre 2 x à mistura de DNA de 5 µ l e incubar a 50 ° C por 60 min.
3. construção do vetor de expressão co de múltiplas proteínas quiméricas fusão fluorescente em plantas
- Amplificar a gaveta de expressão toda proteína semi-independente por uma segunda PCR usando o produto (0,5 - 1,0 µ l) da reação isotérmica montagem primeira rodada como o modelo e os primers mais externo (por exemplo, FP35S-1 e 1-RNOS para expressão gaveta 1).
- Unidade de uso 1 do polymerase de alta fidelidade em um volume de reação de 50 μL de seguido de 30 ciclos (94 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s e 68 ° C por 2 min), seguido por uma extensão final a 68 ° C por 5 min.
- Linearizar a proteína final expressão espinha dorsal vetores pUC18 e pCAMBIA1300, que são projetados para expressão transiente da proteína e transformação genética, respectivamente, adicionando-se 4 unidades Sma eu em um volume final de reação de 10 µ l e incubação de 1 - hr 2 a 25 ° C. Inativar a enzima de restrição incubando a 65 ° C por 20 min.
- Misture equimolar moléculas de DNA de cassettes de expressão de proteínas e vetor tornado linear final em um volume final de reação de 5 µ l. Em seguida, execute a segunda recombinação de DNA misturando com 15 µ l 2 x buffer de mestre e incubando a 50 ° C por 60 min.
- Usar os produtos finais da reação segunda recombinação isotérmico para transformar competentes de Escherichia coli células (por exemplo, DH5α) de acordo com os procedimentos padrão27. Verifique duas vezes colônias positivas por PCR e DNA sequenciamento de colônia. Extrair os plasmideos positivos da e. coli usando um kit de extração de plasmídeo mini e armazenar a-80 ° C.
Atenção: Para o armazenamento a longo prazo, plasmídeos dissolvido em tampão TE ou destilada duplo H2O são mais estáveis do que mantê-los em cepas de Escherichia coli .
4. biobalística-bombardeio mediada expressão co transitória de múltiplas proteínas quiméricas fusão fluorescente em plantas
- Prepare o tabaco BY-2 células de suspensão e plantas juvenis de Arabidopsis para bombardeio.
- Células de cultura BY-2 em meio de Murashige e Skoog (MS), de repicagem, duas vezes por semana a 25 ° C em um shaker fixado em 130 rpm. Filtre por-2 células de cobrar 30 mL 3 d cultivada em um pedaço de papel de filtro autoclavados-70mm através de uma bomba de vácuo, definindo a pressão do vácuo para 40 mbar.
- Para evitar que as células de secar durante as etapas a seguir, juntar algumas gotas de meio cultural líquido BY-2 celular em uma placa de Petri, antes de colocar o papel de filtro (próximo passo).
- Transferi o papel de filtro com os BY-2 células nele para uma nova placa de Petri (85 x 15 mm).
- Superfície esterilizar as sementes de Arabidopsis thaliana (Col-0) vortexing uma mistura com etanol a 70% (v/v) contendo 0,05% Tween 20 por 10 min.
- Gire para baixo as sementes usando uma centrífuga de bancada superior à velocidade máxima de 2 s, remover o sobrenadante e lavar as sementes com etanol 100% uma vez por 30 s. pipeta fora as sementes em um novo papel de filtro estéril numa vizinhança de estéril. Em seguida, secar as sementes e espalhá-los em placas de ágar ½ MS.
- Armazenar as placas a 4 ° C durante 48 horas antes de transferi-los para a câmara de crescimento de planta, com as seguintes configurações: 16 h luz negra 8 h com 120-150 µm m-2 s-1 intensidade 22 ° C.
- Transferência de plantas de amostra 7 - dias velho em um círculo de diâmetro de 30 mm no centro de uma nova placa de médio ½ MS para aumentar a eficiência do bombardeio.
PRECAUÇÃO: Evite a sobreposição das plantas quando transferir e colocá-los na nova chapa de ½ MS. - Adicione algumas gotas de ½ MS meio líquido na superfície dos vegetais ou tecidos para preservar a umidade e evitar a secagem das plantas para fora durante as etapas a seguir.
- Revestimento com partículas de ouro com o plasmídeo.
- Solução de ouro microcarrier de vórtice completamente, por 3 min. preparar um novo tubo de 1,5 mL.
- Sequencialmente, adicione as seguintes soluções para o tubo e o vórtice: 25 µ l (1,5 mg) ouro de partículas, vórtice 10 s; 10 µ l de espermidina 25,46 mg/L, vórtice 10 s; 5 µ l de 1µg / µ l plasmídeo, vortex 3 min; 25 µ l de solução de CaCl2 de 277,5 mg/L, vortex 1 min.
Atenção: Manter num Vortex durante esta etapa. - Spin para baixo o ouro microcarriers usando uma centrífuga de bancada superior em velocidade máxima por 5 s e cuidadosamente pipeta para fora o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Lavar com 200 µ l de etanol absoluto e ressuspender o sedimento pelo vórtice voltinha s. 5-10 para baixo em velocidade máxima por 5 s e remover o etanol.
- Re-suspenda as partículas de ouro em 18 µ l de etanol absoluto e alíquota 6 suspensão de partículas µ l no meio de três macrocarriers. Deixe-os secar ao ar.
- Transferência de DNA em plantas através do bombardeamento de partículas.
- Defina o sistema de entrega de partículas, como as seguintes: 1100 psi, vácuo de 28 mm Hg, 1 cm de distância e distância de voo 9cm partícula.
- Bombardeiam as células/plantas na placa de ágar médio por três vezes em três posições diferentes e em seguida, mantenha as células/plantas escuras imediatamente após o bombardeio.
Cuidado: Use óculos de segurança ao operar o sistema de entrega de partículas por causa da associação do gás de alta pressão e partículas de alta velocidade com o sistema.
- Manter células/plantas bombardeadas no escuro em câmara de crescimento de planta para 6 a 72 horas antes da observação de sinais fluorescentes. Conjunto de câmara de crescimento de planta para escuro 24 h e 22 ° C.
Cuidado: A eficiência da expressão e intensidade de sinal fluorescente são promotor, gene e planta/tecido-dependente.
5. geração de estável Arabidopsis transgênica expressando co várias proteínas fluorescentes quiméricoes por Agrobacterium-mediado transformação.
- Descongelar as células competentes de Agrobacterium (PMP90) no gelo e esperar por 30 min e, em seguida, adicionar 2 µ l binário vetor (100-200 ng) (preparada acima) para as células competentes. Sente-se a mistura no gelo por 10 min.
- Transfira a mistura para uma cubeta de eletroporação pre-refrigerados 0,1 cm. Inserir o sistema electroporation cubeta e executar eletroporação com as seguintes configurações: 1.6 kV, 600 ohms, 25 µF.
- Adicione 1 mL de meio líquido SOC para a cubeta imediatamente após o electroporation, pipetar as células para um novo tubo de 1,5 mL e incubar a 28 ° C em um agitador orbital horizontal a 200 rpm por 120 min.
- Centrifugar as células a 2.348 x g, à temperatura ambiente por 5 min, descartar a maioria do líquido sobrenadante, cuidadosamente re-suspender as células peletizadas com uma ponta da pipeta, espalhá-los em um prato LB contendo 50 mg/L hptII B e incubar a 28 ° C durante 2-3 dias.
- Transformar plantas de Arabidopsis thaliana Col-0 com o Agrobacterium, que contém o vetor binário pCAMBIA1300 integrado com várias fitas de expressão da proteína, pelo método de28 mergulho floral, como descrito anteriormente para gere plantas transgênicas estáveis.
- Esterilizar a superfície das sementes transgénicas Arabidopsis misturando-os com etanol a 70% (v/v) contendo 0,05% Tween 20. Vórtice de 10 min. Spin para baixo as sementes usando uma centrífuga de bancada superior à velocidade máxima de 2 s, remover o sobrenadante e lavar as sementes com etanol 100% uma vez por 30 s.
- Pipetar para fora as sementes em um papel de filtro estéril numa vizinhança de estéril. Depois, secar ao ar e espalhá-los em placas de ágar ½ MS contendo Hygromycin B para a seleção de progênies de positivos.
- Incube as placas a 4 ° C durante 2 dias. Em seguida, transferi-los para a câmara de crescimento de planta e cultura por 7 dias.
- Selecione 7 - dias velho plantas juvenil de sobrevivência verificando sinais fluorescentes sob o microscópio fluorescente e, em seguida, transferir as plantas no solo para rastreio suplementar de plantas homozigotos.
6. farmacêuticos tratamentos
- Para tratamentos farmacêuticos, dilua cada fármaco em meio MS líquido para suas concentrações adequadas de trabalho antes de incubação com células ou plantas.
- Tratamento de Wortmannin: preparar 1 mM soluções estoque de wortmannin dissolvendo o pó wortmannin em DMSO e armazenar os estoques a-20 ° C. Transferir células vegetais ou plantas juvenis para o meio MS líquido contendo 16,5 µM wortmammin e incube por 30-45 min antes de imagem.
- Tratamento de brefeldin A (BFA): preparar 1 mM Soluções conservadas em estoque do BFA pela dissolução do pó do BFA em DMSO e armazenar os estoques a-20 ° C. Transferi células vegetais ou plantas juvenis para o meio MS líquido contendo 10 µ g/mL BFA para 30-45 min antes de imagem.
7. análise de localização Subcellular co confocal microscópio Imaging e proteína
- Transferir as plantas juvenis ou células de suspensão numa lâmina de vidro convencional e gentilmente colocou um slide de tampa na parte superior para a imagem latente por padrão laser confocal, microscopia eletrônica de varredura. Use as seguintes configurações: 63 X água objetivo (N.D. 1.4), 0 fundo, ganho 700, tamanho de pixel de 0,168 mm e detector de tubo fotomultiplicador. Excitar as proteínas GFP-etiquetado em 485 nm e detectar a fluorescência em 525 nm. Para proteínas RFP-etiquetadas, excitar em 514 nm e detectar a 575 nm.
- Calcule a relação de co-localização de sinais fluorescentes usando software Image J (https://imagej.nih.gov/ij/) com a Pearson Spearman correlação (PSC) co localização plug-in como descrito anteriormente8. Coeficientes de correlação de Pearson ou coeficientes de correlação de Spearman rank são mostrados nos resultados (Figura 4). Os valores de r produzido será de -1 a 1. 0 não demonstra nenhuma correlação detectável de dois sinais, Considerando que + 1 e -1 mostram correlação total positiva e negativa, respectivamente, de dois sinais.
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Representative Results
Nós desenvolvemos um método robusto e altamente eficiente para a expressão co de múltiplas proteínas quiméricas fusão fluorescente em plantas. Ele rompe as barreiras do convencional abordagens usam múltiplos plasmídeos separados co na expressão de proteínas, como mostrado na figura 1A, B, através de expressão transiente ou transformação genética estável. Neste novo método, geramos um vetor de expressão única que é composto de várias fitas de expressão de proteínas para atingir a expressão da proteína co simultaneamente (Figura 1D). As proteína expressão gaveta funções semi independently com seus próprios elementos de DNA necessários para expressão de proteínas. Portanto, cada gaveta de expressão da proteína pode ser personalizada independentemente de acordo com exigências diversas para a expressão da proteína. Como para o vetor de expressão co proteína final, as fitas de expressão de proteínas na mesma função como elementos básicos "Lego", que podem ser modificados, re-construído. e re-colocados convenientemente. Além disso, uma estratégia alternativa para a montagem de molécula de DNA, enlace de várias fitas de expressão de proteínas e integração de fragmentos de DNA com o vetor de destino final para co expressão de proteínas quiméricas fusão fluorescente é alcançada simplesmente através de uma otimizado isotérmico em vitro recombinação reação sem etapas mais adicionais da digestão do DNA e articulação. O princípio de funcionamento da reação isotérmica em vitro recombinação é ilustrado na Figura 2. A ligação de várias moléculas de DNA (por exemplo, os três representante DNA fragmentos de 1-3 mostrada na Figura 2) e sua integração com o vetor de expressão final são simplesmente e eficientemente alcançado pela reação de uma etapa (ver Figura 2 de ). Ele é adaptado de estudos anteriores por sobreposição de recombinação de moléculas de DNA mediada com sequências curtas sobrepostas para alcançar a fusão de fragmentos de DNA e a construção de plasmídeos25,26.
Como um teste do método, escolhemos o receptor classificação vacuolar (VSR) e a proteína de membrana transportadora secretoras (Banzé), que são duas proteínas repórter participando de proteínas secretoras e vias de endocitose, respectivamente6,22 ,23,29,30. VSRs são tipo-eu proteínas integrais de membrana que medeiam o tráfego de biossíntese de proteína na via secretora para o vacúolo e principalmente localiza-se em compartimentos prevacuolar (PVCs) em plantas de22,6,23. Em contraste, as proteínas de membrana transportadora secretoras (palhaços) são proteínas de membrana tipo IV que participam na via endocítica da planta. Ele localiza a membrana plasmática (PM) e trans-redes de Golgi (TGNs), que servem como início endossomos22,29,30. Nós construímos duas fitas de expressão da proteína que hospedam as fusões quiméricoes de Arabidopsis VSR2 (AtVSR2) com RFP e SCAMP4 de Arabidopsis (AtSCAMP4) com as boas práticas agrícolas, como mostrado na Figura 3. Para garantir a que RFP-AtVSR2 pode ser traduzido no pronto-socorro, um peptídeo sinal (SP) é adicionado antes de RFP, como anteriormente relatado6,31. As duas fitas de expressão de proteínas individuais estão mais interligadas e ligam com a proteína final expressão vetor pUC18 ou pCAMBIA1300 co na expressão de proteínas ou através da proteína transitória ou plantar transformação estável, conforme mostrado na Figura 3. AtVSR2 e AtSCAMP4 foram com sucesso co expressas em tabaco BY-2 células através de partículas bombardeio e mostraram suas localizações corretas (Figura 4A). RFP-AtVSR2 mostrou um padrão punctate, que era distinto a localização da membrana plasmática de AtSCAMP4-GFP com alguns pontos punctate citosólica. Além disso, Arabidopsis plantas transgénicas que expressam co AtSCAMP4-GFP e RFP-AtVSR2 foram gerados por meio da Agrobacterium-mediado transformação. As localizações subcellular de expressar co RFP-AtVSR2 e AtSCAMP4-GFP em células de raiz e a raiz do cabelo foram mostradas na Figura 4B e 4E. Os resultados de expressão co de RFP-AtVSR2 e AtSCAMP4-GFP obtidos de transgénicos Arabidopsis foram de acordo com os de células por-2. Além disso, os transgênicos Arabidopsis foram tratados com wortmannin BFA de 30 min. Wortmmanin causada RFP-AtVSR2 rotulado PVCs, formando uma estrutura em anel pequena e BFA induzida AtSCAMP-GFP rotulado agregação TGN, conforme mostrado na Figura 4 de , D, F, G. Além disso, pouco sinal de autofluorescent pode ser detectado no tabaco BY-2 células e células de raiz e a raiz do cabelo de Arabidopsis aplicando as mesmas configurações da coleção da imagem quanto a Figura 4 (Supplemental Figura 1).
Figura 1: um sistema robusto para expressão co de múltiplas proteínas quiméricas fusão fluorescente em plantas. (A) abordagens convencionais de expressão co transitória de múltiplas proteínas fluorescentes repórter em plantas alcançado através da eletroporação, bombardeio de partículas e transformação mediada por PEG, misturando várias expressão independente vetores. (B) o método convencional para transformação genética de plantas por Agrobacterium com um vetor de expressão de proteína de fusão única de fluorescente. Para co expressar várias proteínas da fusão fluorescente quimérico em uma planta transgênica, ainda mais cruzamento genético e várias rodadas de triagem são necessárias para a obtenção de progênies homozigotos. (C) e (D) o método de expressão co alternativo nova proteína. Aproveita-se de um vetor de expressão única, que é composto de várias fitas de expressão de proteínas e é capaz de expressar co várias proteínas quiméricas repórter fluorescentes em plantas através de ambos os transientes expressão e transformação genética. Detalhes desta figura foram publicados primeiramente em Zhong et al 201736 (reimpresso com permissão; copyright fronteiras na ciência de planta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: demonstração do princípio de funcionamento do método de montagem de DNA de uma etapa pela reação de recombinação isotérmicas. Os fragmentos de DNA e plasmídeo linear, com sobreposição de sequências (OSs) estão ligados pela base emparelhamento entre o 5'-saliência sobreposição de regiões, estendendo-se pela DNA polimerase e ligando por ligase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A estratégia de construir um único plasmídeo para expressar co várias proteínas da fusão fluorescente quimérico. O diagrama demonstra a estratégia para a construção de um plasmídeo de expressão único para a expressão co de múltiplas proteínas quiméricas fusão fluorescente para expressão transiente ou transformação estável em plantas. O vetor de expressão é composto de duas fitas de expressão de proteínas, cada uma das quais contém seus próprios elementos necessários para a expressão da proteína e funções em expressar sua proteína de fusão fluorescente quimérico individual semi independently. Montagem e articulação de todas as moléculas de DNA são convenientemente alcançado por um método recombinação otimizado isotérmico em vitro mediado com os fragmentos de DNA sobrepostos. Detalhes desta figura foram publicados primeiramente em Zhong et al 201736 (reimpresso com permissão; copyright fronteiras na ciência de planta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens representativas de expressão co de fusão fluorescente quimérico de VSR e SCAMP em células vegetais.
(A) expressão co de RFP-AtVSR2 e AtSCAMP4-GFP através do bombardeio de partícula, em células de suspensão do tabaco por-2. (B) uma imagem representativa de uma célula de raiz de Arabidopsis transgênica expressando co RFP-AtVSR2 e AtSCAMP4-GFP. (C) e (D) raízes transgénicas Arabidopsis co expressando RFP-AtVSR2 e AtSCAMP4-GFP foram tratadas com wortmannin e BFA por 30 min, respectivamente. (E) uma imagem representativa de um cabelo de raiz de Arabidopsis transgênica co expressando RFP-AtVSR2 e AtSCAMP4-GFP. (F) e (G) transgénicos Arabidopsis pelos radiculares co expressando RFP-AtVSR2 e AtSCAMP4-GFP foram tratados com wortmannin e BFA por 30 min. as setas em (D) e (G) indicam a proteína induzida pelo BFA agregação. rp = coeficiente de correlação de Pearson; rs = correlação de Spearman. Barra de escala na (A)-(D) é de 50 µm, (E)-(G) é de 30 µm. detalhes desta figura foram publicados primeiramente em Zhong et al 201736 (reimpresso com permissão; copyright fronteiras na ciência de planta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Gaveta de expressão 1 | ||
| 1-FP35S | GAATTCGAGCTCGGTACCC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 1-RP35S | AGGACGCGGGCGTGGGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 1-FRFP | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCCCACGCCCGCGTCCT | |
| 1-RRFP | ATTATCCATATCACTCCCCA GGCGCCGGTGGAGTGGCGGC | |
| 1-FAtVSR2 | GCCGCCACTCCACCGGCGCC TGGGGAGTGATATGGATAAT | |
| 1-RAtVSR2 | AAATGTTTGAACGATCGGGA TTACAACTCTAGTTGAGAAG | |
| 1-FNOS | CTTCTCAACTAGAGTTGTAA TCCCGATCGTTCAAACATTT | |
| 1-RNOS | GAGAATGGATGCGAGTAATG TCTAGTAACATAGATGACAC | |
| Gaveta de expressão 2 | ||
| 2-FP35S | CATTACTCGCATCCATTCTC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 2-RP35S | TTAGGATCGTGTCGTGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 2-FAtSCAMP4 | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCACGACACGATCCTAA | |
| 2-RAtSCAMP4 | TCCTCGCCCTTGCTCACCAT TAGTGCACGCATCAAGGTCG | |
| 2-FGFP | CGACCTTGATGCGTGCACTA ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA | |
| 2-RGFP | TAAAACCAAAATCCAGTGAC TTACTTGTACAGCTCGTCCA | |
| 2-FT35S | TGGACGAGCTGTACAAGTAA GTCACTGGATTTTGGTTTTA | |
| 2-RT35S | GTCGACTCTAGAGGATCCCC GTCCGCAAAAATCACCAGTC | |
Tabela 1: estratégia de design do Primer e sequências utilizadas neste estudo. Nome de cada primer é dado no painel esquerdo. As sequências complementares sobreposição dos primers são sublinhadas. Detalhes desta tabela foram publicados primeiramente em Zhong et al 201736 (reimpresso com permissão; copyright fronteiras na ciência de planta).
Suplementar Figura 1: imagens representativas de autofluorescência no BY-2 células de Arabidopsis e pelos radiculares. (A) a autofluorescência de células de tipo selvagem BY-2 foi detectada nas mesmas condições de imagem com as células transformadas. (B) e (C) de Arabidopsis raiz do cabelo e as células da raiz foram detectadas nas mesmas condições de imagem com as células transformadas de Arabidopsis. Barra de escala na (A)-(C) é de 20 µm. DIC, contraste de interferência diferencial. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Aqui temos demonstrado um método novo expressar robustamente co proteínas quiméricas fusão fluorescente em plantas. Ele pode ser usado tanto para expressão transiente e transformação genética e é compatível com o atual fluorescentes à base de proteínas de bio-imagem, moleculares e bioquímicos aplicativos e tecnologias9,10,13 . Além disso, ele supera as dificuldades dos métodos convencionais que usam vários plasmídeos de expressão individual, a expressão de proteínas co. Em contraste, ele emprega um vetor de expressão única que contém várias fitas de expressão de proteínas com seus próprios promotores individuais, etiquetas fluorescentes, proteínas alvo e terminadores. Além disso, a fita de expressão de proteínas pode ser gerenciada independentemente para atender a requisitos de expressão diversas, tais como o uso de um promotor específico e a fusão de quimérico de N - ou C-terminal de uma proteína fluorescente com a proteína do alvo. Portanto, as funções de gaveta de expressão de proteínas como um elemento básico de "Lego" que funciona semi independente no plasmídeo. Além disso, também é um sistema altamente versátil no qual gene edição, substituição, e montagem tudo pode ser facilmente alcançada por uma reação de recombinação isotérmica de uma etapa sem processos extras de digestão enzimática e ligadura. Otimizamos a eficiência da reação de recombinação isotérmicas de estudos anteriores, conforme descrito na etapa 2.4, testando diferentes concentrações de Taq polimerase, Phusion DNA polimerase e do exonuclease T5. Além disso, a concentração de cada DNA fragmentos para a reação de recombinação isotérmica de uma etapa é sugerida para ser entre 0,05 e 0,1 pmol de alcançar a eficiência máxima da ligadura.
Excesso de expressão de um transgene substituindo seu promotor endógeno com uma forte e contínua promotor, como promotor da ubiquitina-10 (UBQ10), e introdução de cópias adicionais do gene é uma abordagem usada descontroladamente para estudar suas funções celulares e mecanismo de trabalho subjacente em células15,32. No entanto, inesperado para baixo-regulamento e forte inibição da expressão gene às vezes foi encontrada também33,34. A porcentagem de silenciamento varia de 2 a 100% sob estas situações33,35imprevisível do gene. Além disso, silenciamento de genes tem uma chance maior de acontecer na expressão de vários genes simultaneamente, transformação de altas cópias de DNA e aumentos significativos de gene nível transcricional9,33,24 ,35. A fim de minimizar a ocorrência de silenciamento no robusto sistema de expressão co de proteína de fusão múltiplas do gene, escolhemos diferentes promotores ativos para conduzir as fitas de expressão de proteínas diferentes quando co expressar várias proteínas da fusão. Além disso, evitamos continuamente, usando o mesmo promotor para fitas de expressão diferente. Além disso, outra limitação potencial deste protocolo é a redução da eficiência de recombinação de isotérmicas de DNA uma etapa causada pelos números crescentes de gaveta de expressão da proteína para expressão co. Além disso, o número das fitas de expressão que pode ser hospedado no plasmídeo de expressão final principalmente depende o replicon da espinha dorsal do plasmídeo24,25,35.
Tomados em conjunto, nós desenvolvemos um sistema poderoso para expressar co várias proteínas da fusão fluorescente quimérico convenientemente em plantas36. Ele supera as limitações dos métodos clássicos e utiliza uma reação de montagem de DNA otimizado de uma etapa para a construção de articulação e plasmídeo de DNA de forma honrada. Este avanço técnico foi validado por AtVSR2 e AtSCAMP4 expressão co na planta de células através de ambos expressão transiente e transformação genética. Portanto, ele demonstra um método convincente e romance para diferentes aspectos das descobertas científicas por co expressão de proteínas quiméricas fusão fluorescente em plantas. Além disso, o conceito e princípio da expressão co de múltiplas proteínas quiméricas fusão fluorescente através de um vetor de expressão único são totalmente compatíveis com tecnologias de sobre-expressão CRISPR-Cas9, RNAi e proteína para estudar as funções e interações de múltiplos genes em plantas37,38,39.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos os membros do laboratório de discussões úteis e comentários Wang. Este trabalho é apoiado pela Nacional Natural Science Foundation da China (NSFC, grant, n. º 31570001) e a Fundação ciência Natural da província de Guangdong e cidade de Guangzhou (conceder 201707010024 e n. º 2016A030313401) para H.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
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