Summary
Hemos desarrollado un novedoso método para expresar conjuntamente múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas a superar las dificultades de los métodos convencionales. Toma ventaja del uso de un plásmido de expresión única que contiene múltiples proteínas funcionalmente independiente expresando cassettes para lograr la expresión de la proteína.
Abstract
Información sobre la localization(s) espacio-temporal subcelular de una proteína es fundamental para comprender sus funciones fisiológicas en las células. Proteínas fluorescentes y la generación de proteínas fluorescentes de fusión se han utilizado violentamente como una herramienta eficaz para visualizar directamente la localización de proteínas y la dinámica en las células. Es especialmente útil para compararlos con los marcadores de organelo conocido después de coexpresión con la proteína de interés. Sin embargo, métodos clásicos para la expresión de la proteína en las plantas implican generalmente múltiples plásmidos de expresión independiente y por lo tanto tienen inconvenientes que incluyen eficacia baja expresión Co, variación del nivel de expresión y alto tiempo de gasto en cruce genético y cribado. En este estudio, describimos un método robusto y novedoso para la expresión de múltiples proteínas quiméricas fluorescentes en las plantas. Supera las limitaciones de los métodos convencionales mediante el uso de un vector de expresión individual que se compone de múltiples cintas expresando semi-independiente. Cada cassette de expresión de la proteína contiene sus propios elementos de expresión de la proteína funcional, y por lo tanto se puede ajustar fexiblemente para satisfacer la demanda de expresión diversa. Además, es fácil y conveniente para llevar a cabo la Asamblea y fragmentos de manipulación del ADN en el plásmido de expresión mediante el uso de una reacción de un paso optimizado sin digestión adicional y pasos de ligadura. Además, es totalmente compatible con proteína fluorescente derivada bio-proyección de imagen de las tecnologías actuales y las aplicaciones, como el traste y centro. Como una validación del método, se empleó este nuevo sistema vacuolar receptor clasificación express Co fluorescente fundido y proteínas en la membrana secretora portador. Los resultados muestran que sus localizaciones subcelulares de la perspectiva al igual que en anteriores estudios de expresión transitoria y transformación genética en plantas.
Introduction
Proteínas de fusión fluorescente quimérico se han mirado como herramientas útiles para estudiar la dinámica intracelular y localización subcelular y entiendo sus funciones fisiológicas y trabajo mecanismos1,2, 3 , 4. es especialmente beneficioso para express Co organelo conocido reportero las proteínas con la proteína en cuestión para mejor ilustrar su razonamiento espacio-temporal, distribución y funciones dentro del Sistema endomembranoso de células4 , 5 , 6 , 7 , 8.
Una proteína quimérica fusión fluorescente se puede expresar en las plantas a través de la expresión transitoria y transformación genética estable, que tienen sus respectivas ventajas y limitaciones9,10,11. La expresión transitoria de una proteína es un método conveniente que incluye biolística bombardeo-, glicol de polietileno (clavija)-, o la expresión transitoria de ADN mediada por electroporación de protoplastos y Agrobacterium-mediada por infiltración de la hoja en células vegetales intactas, tal como se muestra en la figura 1A, B12,13,14,15,16. Sin embargo, coexpresión múltiples quiméricos fluorescentes de proteínas de fusión en una célula de la planta solo requiere una mezcla de varios plásmidos de expresión independiente. Así, las desventajas de emplear múltiples plásmidos para la expresión de la proteína en las plantas son niveles más bajos de la expresión debido a la posibilidad dramáticamente reducido de varios plásmidos entrar simultáneamente en las mismas células en comparación con un solo plásmido y la variaciones de niveles de expresión de la proteína causadas por la cantidad incontrolable al azar de cada tipo de plásmido se transfiere a la célula17,18. Además, es un desafío técnico para introducir varios plásmidos de expresión independiente de una sola Agrobacterium para proteína coexpresión9,10,11. Por lo tanto, Agrobacterium-mediada proteína expresión transitoria por la infiltración de tabaco deja sólo es capaz de expresar un plásmido a la vez, como se muestra en la figura 1B. En cambio, generación de plantas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes de fusión se logra por Agrobacterium que lleva un vector de transformación binaria. Sin embargo, el vector binario que media la transferencia de genes y la inserción en el genoma de la planta sólo es capaz de expresar una sola fusión fluorescente proteína (figura 1B)9,10,12. Generación de una planta transgénica que expresa simultáneamente varias proteínas fluorescentes quiméricas requiere múltiples rondas de cruce genético y proyección, que puede tomar de meses a años dependiendo de los números de los genes que expresa conjuntamente.
El empleo de que un vector de expresión solo para co expresión de varias proteínas en planta ha sido reportado por varios anteriores estudios19,20,21. Sin embargo, múltiples rondas de digestión enzimática y la ligadura de la DNA de las moléculas de ADN y vectores de la columna vertebral deben generalmente para generación del plásmido final de coexpresión de la proteína o expresión. Aquí, hemos desarrollado un método nuevo y robusto para co expresando múltiples proteínas quiméricas fluorescentes en plantas. Es un método altamente eficaz y práctico que alcanza múltiples coexpresión de la proteína en las plantas para la expresión transitoria tanto y la transformación estable de manera tradicional. Emplea un único vector que contiene varios cassettes de expresión proteína funcionalmente independiente para la expresión de la proteína y así supera los inconvenientes de los métodos convencionales. Por otra parte, es un sistema muy versátil en que ADN manipulación y montaje se logran mediante una reacción en un paso simple optimizado sin pasos adicionales de digestión de DNA y la ligadura. El principio de funcionamiento se ilustra en la figura 2. Además, es totalmente compatible con el actuales enfoques celulares, moleculares y bioquímicos que están basados en proteínas de fusión quimérica de fluorescente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. primer diseño estrategia y amplificación del ADN
- Diseño de los cebadores para la clonación molecular de fragmentos de ADN. Los iniciadores comprenden secuencias de unión específica gen bp 20 y 20 a 25 bp 5'-el extremo voladizo las secuencias, que son la secuencia complementaria superpuesta de las moléculas de ADN adyacentes (ver tabla 1 por ejemplo).
Nota: El montaje posterior de cada ADN fragmentos, acoplamiento de cassettes de expresión de proteínas diferentes, y dependen de integración con el vector de expresión final todos en el reconocimiento de las secuencias superpuestas adyacentes. - Amplificar fragmentos de ADN, como promotor, reportero fluorescente, gene de la blanco y terminator, que son necesarios para la construcción de los cassettes de expresión de proteína semi-independiente por reacciones de polimerización en cadena estándar con sus correspondientes cebadores y alta polimerasa de fidelidad.
Nota: Las plantillas utilizadas en este estudio para la amplificación de ADN se derivan de los anteriores estudios15,22,23. La temperatura de recocido y el tiempo de extensión de las reacciones de PCR son la cartilla y dependiente del gen.
2. ADN fragmento montaje y construcción de Cassettes de expresión de la proteína
- Examinar la calidad de los productos PCR de primera ronda por electroforesis de ADN y cuantificar por el espectrofotómetro. Compruebe si han producido contaminación y degradación del ADN por electroforesis en gel de agarosa 1%. El OD260/OD280 de los productos PCR debe ser entre 1.6 y 1.8.
- Mezclar diferentes fragmentos de ADN (0.05 - 0.1 pmol de cada fragmento) en un nuevo tubo PCR en un volumen final de 5 μl.
Nota: Las moléculas de ADN de mezcla diseñado para el mismo cartucho de expresión de proteína juntos en un tubo de PCR. Evitar mezcla de DNAs de cassettes de expresión diferente, ya que reducirá la eficacia de la Asamblea de ADN debido al creciente número de moléculas de ADN que necesitan vincularse.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. - Preparar 5 x ISO buffer stock: 500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2; 1 mM Deoxinucleótidos (dNTP); 50 mM Ditiotreitol; 25% de polietilenglicol (PEG) 8000; y 5 mM nicotinamida adenina dinucleótido (NAD).
- Completar 1 mL 2 x mezcla maestra de 400 μL 5 x buffer stock ISO, 7,5 unidades de T5 exonucleasa, 62,5 unidades de ADN polimerasa de alta fidelidad, 5.000 unidades de Taq polimerasa (véase Tabla de materiales), y doble esterilizada destilada H2O.
Nota: Esto es adaptado de anteriores estudios24,25,26; Estos volúmenes deben ser optimizados. - Alícuota de 100 μl de 2 x master mezcla por el tubo y conservar a-20 ° C.
PRECAUCIÓN: Frecuentes de congelación y descongelación de la mezcla principal de 2 x pueden causar baja eficiencia de ensamblaje de ADN. - Añadir 15 μl de la mezcla principal de 2 x a la mezcla de ADN 5 μl e incubar a 50 ° C durante 60 minutos.
3. construcción del Vector para la co-expresión de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas
- Amplificar el casete de expresión de toda proteína semi-independiente mediante una PCR de segunda ronda con el producto (0,5 - 1,0 μL) de la reacción de la primera ronda Asamblea isotermo como la plantilla y los iniciadores exteriores (por ejemplo, 1 FP35S y 1-RNOS para la expresión cassette 1).
- Unidad de uso 1 de polimerasa de alta fidelidad en un volumen de reacción de 50 μl seguido de 30 ciclos (94 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s y 68 ° C por 2 min), seguido de una extensión final a 68 ° C durante 5 minutos.
- Alinear la proteína final expresión columna vertebral vectores pUC18 y pCAMBIA1300, que están diseñados para la expresión transitoria de proteínas y transformación genética, respectivamente, mediante la adición de 4 unidades Sma I en un volumen final de reacción de 10 μl y de incubación de 1 - 2 horas a 25 ° C. Inactivar la enzima de restricción por incubación a 65 ° C por 20 min.
- Mezcla equimolares moléculas de ADN de cassettes de expresión de la proteína y vector final lineal en un volumen final de reacción de 5 μl. Luego, realizar la recombinación de ADN de la segunda ronda por mezcla con 15 μl 2 x buffer principal y a 50 ° C durante 60 min de incubación.
- Utilizar los productos finales de la reacción de recombinación isotermo segunda ronda para transformar competentes de e. coli las células (por ejemplo, DH5α) según procedimientos estándar27. Revise dos veces las colonias positivas ordenando Colonia PCR y ADN. Extraer la plásmidos positiva de la e. coli utilizando un kit de extracción del plásmido mini y almacenar a-80 ° C.
PRECAUCIÓN: Para almacenamiento a largo plazo, plásmidos disuelven en tampón TE o doble destilada H2O son más estables que mantenerlos en cepas de e. coli .
4. biolística-bombardeo mediado coexpresión transitoria de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas
- Preparación de plantas juveniles de Arabidopsis y tabaco BY-2 células de suspensión para el bombardeo.
- Cultura por-2 células en medio Murashige y Skoog (MS) por subcultivo dos veces por semana a 25 ° C en un agitador a 130 rpm. Filtro recoge 30 mL 3 d cultivada por 2 células en un pedazo de papel de filtro esterilizado de 70 mm por medio de una bomba de vacío mediante el establecimiento de la presión del vacío a 40 mbar.
- Para impedir que las células se sequen durante los pasos siguientes, añadiendo unas gotas de medio cultural líquido de la célula por 2 en una placa Petri antes de colocar el papel de filtro (paso siguiente).
- Transferir el papel filtro con las células de a-2 en él a un nuevo plato de Petri (85 x 15 mm).
- Superficie de esterilizar semillas de Arabidopsis thaliana (Col-0) con un vórtex una mezcla con etanol al 70% (v/v) que contenga 0.05% Tween 20 durante 10 minutos.
- Desactivación de las semillas utilizando una centrífuga Banco a máxima velocidad por 2 s, eliminar el sobrenadante y lavar las semillas con etanol al 100% una vez para pipeta s. 30 semillas en un nuevo papel de filtro estéril en una campana estéril. Luego, seque las semillas y extender sobre placas de agar de MS ½.
- Almacenar las placas a 4 ° C durante 48 horas antes de la transferencia en una cámara de crecimiento de la planta con los siguientes valores: 16 h de luz oscura 8 h con 120-150 μm m-2 s-1 de intensidad, 22 ° C.
- Transferencia de 7 día - viejas plantas de la muestra en un círculo de diámetro de 30 mm en el centro de una placa de medio MS ½ nuevo para aumentar la eficiencia del bombardeo.
PRECAUCIÓN: Evitar la duplicación de las plantas de transferencia y colocarlos sobre la placa nueva de MS ½. - Añadir varias gotas de medio líquido MS ½ en la superficie de las plantas o los tejidos para conservar humedad y evitar que se sequen las plantas durante los pasos siguientes.
- Capa de partículas de oro con ADN plásmido.
- Vórtice oro potencia solución completamente, durante 3 minutos Prepare un nuevo tubo de 1,5 mL.
- Añadir secuencialmente las siguientes soluciones en el tubo y vortex: 25 μl (1,5 mg) oro partículas, vortex 10 s; 10 μl de espermidina 25,46 mg/L, vortex 10 s; 5 μl de ADN de plásmido de 1μg/μl, vortex 3 min; 25 μl de 277,5 mg/L solución de CaCl2 , vortex 1 minuto.
PRECAUCIÓN: Mantenga un vórtex durante este paso. - Desactivación de la microcarriers oro utilizando una centrífuga Banco a máxima velocidad para 5 s y cuidadosamente la pipeta hacia fuera el sobrenadante sin perturbar el pellet. Lavado con 200 μL de etanol absoluto y volver a suspender el sedimento en el vórtex de vuelta s. 5-10 abajo a máxima velocidad para 5 s y eliminar el etanol.
- Vuelva a suspender las partículas de oro en 18 μL de etanol absoluto y alícuotas 6 μl partículas suspensión en el centro de tres macrocarriers. Dejarlos secar al aire.
- Transferencia de ADN en plantas mediante bombardeo de partículas.
- Establecer el sistema de partículas como siguiendo: 1100 psi, vacío de 28 mm Hg, distancia de 1 cm de separación y distancia de vuelo de partículas 9 cm.
- Bombardear las células/plantas en la placa de agar medio tres veces en tres posiciones diferentes y luego mantener las plantas de las células en oscuridad inmediatamente después del bombardeo.
PRECAUCIÓN: Use gafas de seguridad cuando opere el sistema de partículas debido a la Asociación de gas de alta presión y alta velocidad partículas con el sistema.
- Mantener plantas de células bombardeadas en la oscuridad en la cámara de crecimiento de la planta de 6 a 72 horas antes de la observación de señales fluorescentes. Configurar la cámara de crecimiento de la planta a oscura 24 h y 22 ° C.
PRECAUCIÓN: La eficacia de la expresión y la intensidad de la señal fluorescente están promotor, gen y planta/tejidos-dependiente.
5. generación de Arabidopsis transgénica estable Co expresando múltiples proteínas quiméricas fluorescentes por Agrobacterium-mediado transformación.
- Descongelar las células competentes de Agrobacterium (PMP90) en el hielo y esperar 30 minutos, luego añadir 2 μl binario vector (100-200 ng) (preparada anteriormente) en las células competentes. Sienta la mezcla en hielo durante 10 minutos.
- Transferir la mezcla en una cubeta de electroporación previamente enfriada 0,1 cm. Insertar la cubeta en el sistema de electroporación y realizar electroporación con los siguientes ajustes: 1,6 kV, 600 ohmios, 25 μF.
- Añadir 1 mL de medio líquido SOC en la cubeta inmediatamente después de la electroporación, pipetear las células en un tubo nuevo de 1,5 mL e incubar a 28 ° C en un agitador orbital horizontal a 200 rpm por 120 min.
- Centrifugar las células a 2.348 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos, desechar la mayor parte del sobrenadante, suavemente Resuspenda las células concentradas con una punta de pipeta, extender en una placa LB que contiene 50 mg/L de higromicina B e incubar a 28 ° C durante 2-3 días.
- Transformar plantas de Arabidopsis thaliana Col-0 con el Agrobacterium, que contiene el vector binario pCAMBIA1300 integrado con varios cassettes de expresión de proteína, por el método de inmersión floral28 según se describió anteriormente para generar plantas transgénicas estables.
- Esterilizar la superficie de las semillas transgénicas de Arabidopsis por mezcla con etanol al 70% (v/v) que contenga 0.05% Tween 20. Vortex durante 10 minutos de la vuelta abajo las semillas utilizando una centrífuga Banco a máxima velocidad por 2 s, eliminar el sobrenadante y lavar las semillas con etanol al 100% una vez por 30 s.
- Pipetear las semillas en un papel de filtro estéril en una campana estéril. Después, secar al aire y repartirlos en MS ½ placas de agar que contiene Hygromycin B para screening positivo progenie.
- Incubar las placas a 4 ° C durante 2 días. Luego, transferirlos a la cámara de crecimiento de plantas y la cultura durante 7 días.
- Seleccione 7 - viejo plantas juveniles de supervivencia buscando señales fluorescentes bajo el microscopio de fluorescencia y las plantas de transferencia en suelos de mayor proyección de plantas homocigóticas.
6. tratamientos farmacéuticos
- Para tratamientos farmacéuticos, diluir cada fármaco en medio líquido MS a sus concentraciones adecuadas de trabajo antes de la incubación con células o plantas.
- Wortmannin tratamiento: preparar 1 mM soluciones stock de wortmannin disolviendo polvo de wortmannin en DMSO y almacenar las existencias a-20 ° C. Transferencia de células de la planta o plantas menores en el medio MS líquido contiene 16.5 μm wortmammin e incube durante 30-45 min antes de la proyección de imagen.
- Tratamiento Brefeldin A (BFA): preparar 1 mM soluciones stock de BFA disolviendo polvo BFA en DMSO y almacenar las existencias a-20 ° C. Transferencia de células de la planta o plantas menores en el medio MS líquido que contiene 10 μg/mL BFA por 30-45 min antes de la proyección de imagen.
7. Análisis de localización subcelular de la proyección de imagen de microscopio confocal y la proteína
- Transferencia de las plantas juveniles o las células de suspensión en un portaobjetos de vidrio convencional y suavemente poner una diapositiva de cubierta en la parte superior de la proyección de imagen por láser confocal estándar de microscopía. Utilice la siguiente configuración: 63 X agua objetivo (1.4 N.A) 0 fondo, ganancia 700, tamaño de píxel de 0,168 mm y detector de tubo fotomultiplicador. Excite proteínas GFP-etiquetado a 485 nm y detectar la fluorescencia en 525 nm. Las proteínas con etiqueta RFP, excitar a 514 nm y detectar a 575 nm.
- Calcular el cociente de la co-localización de señales fluorescentes utilizando el software de Image J (https://imagej.nih.gov/ij/) con el Pearson Spearman correlación (PSC) co-localización plug-in como se describió previamente8. Coeficientes de correlación de Pearson o coeficientes de correlación de Spearman se muestran en los resultados (figura 4). Los valores de r producido será de -1 a 1. 0 no muestra ninguna correlación detectable de dos señales, mientras que + 1 y -1 muestran correlación total positivo y negativo, respectivamente, de dos señales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hemos desarrollado un método robusto y altamente eficiente para la co-expresión de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas. Se rompe a través de las barreras de lo convencional enfoques utilizan múltiples plásmidos separados para la coexpresión de la proteína, como se muestra en la figura 1A, B, a través de la expresión transitoria o transformación genética estable. En este nuevo método, se genera un vector de expresión individual que se compone de varios cassettes de expresión de proteínas para lograr la expresión de la proteína a la vez (figura 1D). Las proteína expresión cassette funciones semi-independently con sus propios elementos de ADN necesarias para la expresión de la proteína. Por lo tanto, cada cassette de expresión de la proteína podría ser modificado para requisitos particulares independientemente según diversos requisitos para la expresión de la proteína. En cuanto a la proteína final coexpresión de vectores, los cassettes de expresión de la proteína en él funcionan como elementos básicos "Lego" que pueden ser modificados, volver a construir. y volver a colocar convenientemente. Además, una estrategia alternativa para el montaje de la molécula de ADN, acoplamiento de varios cassettes de expresión de la proteína y la integración de fragmentos de ADN con el vector de destino final de coexpresión de proteínas de fusión quimérica de fluorescentes se logra simplemente mediante una optimizado isotermo en vitro recombinación reacción sin más pasos adicionales de digestión de DNA y relación. El principio de funcionamiento de la reacción de recombinación isotermo en vitro se ilustra en la figura 2. La vinculación de múltiples moléculas de ADN (por ejemplo, los tres representante ADN fragmentos 1-3 se muestra en la figura 2) y su integración con el vector de expresión final se logran simplemente y eficientemente por la reacción de un solo paso (ver figura 2 de ). Es adaptación de estudios previos de recombinación superpuesta de las moléculas de ADN mediado con secuencias cortas superpuestas para lograr la fusión de fragmentos de ADN y la construcción de plásmidos25,26.
Como una prueba del método, elegimos el receptor clasificación vacuolar (VSR) y la proteína de la membrana secretora portador (SCAMP), que son dos proteínas de reportero en proteínas secretoras y caminos de endocytosis, respectivamente6,22 ,23,29,30. VSRs son tipo-localiza proteínas de membrana integral que median tráfico de biosíntesis de la proteína en la vía secretora a la vacuola y principalmente en compartimentos prevacuolar (PVCs) en las plantas6,,,2223. En contraste, las proteínas de la membrana secretora portador (sinvergüenzas) son proteínas de membrana de tipo IV que participan en la vías endocíticas planta. Localiza a la membrana plasmática (PM) y trans-redes de Golgi (TGNs), que sirven como principios endosomas22,29,30. Construimos dos cassettes de expresión de proteínas que las fusiones quiméricas de Arabidopsis VSR2 (AtVSR2) con RFP y SCAMP4 de Arabidopsis (AtSCAMP4) con GFP, como se muestra en la figura 3. Para asegurar la que RFP-AtVSR2 se puede traducir en la sala de emergencia, un péptido de señal (SP) se agrega antes de RFP, como previamente reportado6,31. Los dos casetes de expresión de proteínas individuales están más interrelacionados y ligan con la proteína final expresión vector pUC18 o pCAMBIA1300 para la expresión de la proteína o proteínas vía transitoria o planta de transformación estable, como se muestra en Figura 3. AtVSR2 y AtSCAMP4 fueron exitosamente Co expresado en tabaco BY-2 células por medio de partículas bombardeo y mostraron correcto localizaciones (Figura 4A). RFP-AtVSR2 mostró un patrón punteado, que era distinto de la localización de la membrana del plasma de AtSCAMP4-GFP con algunos puntos punteadas citosólicas. Por otra parte, Arabidopsis plantas transgénicas que expresan Co AtSCAMP4-GFP y RFP AtVSR2 fueron generados vía Agrobacterium-mediado transformación. Las localizaciones subcelulares de expresar Co RFP-AtVSR2 y AtSCAMP4-GFP en células de la raíz y el pelo de la raíz se muestran en la Figura 4B y 4E. Los resultados de la co-expresión de RFP-AtVSR2 y AtSCAMP4-GFP de transgénicas de Arabidopsis estaban de acuerdo con los de las células por-2. Además, los transgénicos Arabidopsis fueron tratados con wortmannin BFA 30 min Wortmmanin causado RFP-AtVSR2 etiquetado como PVCs formando una pequeño anillo-como la estructura y BFA inducida por AtSCAMP-GFP marcado agregación de TGN, como se muestra en la figura 4 de , D, F, G. Además, poco señal autofluorescent puede detectarse en células de tabaco BY-2 y Arabidopsis las células de la raíz y el pelo de raíz mediante la aplicación de la misma configuración de la colección de imágenes en cuanto a la figura 4 (figura 1 complementaria).
Figura 1: un sistema robusto para la co-expresión de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas. (A) los enfoques convencionales de coexpresión transitoria de múltiples proteínas de reportero fluorescente en plantas logrado mediante electroporación, bombardeo de partículas y la transformación mediada por PEG mezclando varios expresión independiente vectores. (B) el método convencional para la transformación genética de plantas por Agrobacterium con un vector de expresión de proteínas de fusión fluorescente solo. Para expresar conjuntamente múltiples proteínas quiméricas fluorescentes fusión en una planta transgénica, cruce genético y múltiples rondas de cribado se requieren más para la obtención de progenies homocigóticas. (C) y (D) nueva proteína coexpresión método alternativo. Se aprovecha de un vector de expresión única, que se compone de varios cassettes de expresión de proteínas y es capaz de expresar conjuntamente varias proteínas quiméricas reportero fluorescente en las plantas a través de dos transitorios expresión y transformación genética. Detalles de esta figura fueron publicados primero en Zhong et al. 201736 (reimpreso con permiso; copyright fronteras de la ciencia de planta). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: demostración del principio de funcionamiento del método de Asamblea de ADN de un paso por la reacción de recombinación isotermo. Los fragmentos de la DNA y el plásmido linearizado con superposición de secuencias (OSs) se unen por la base pelado entre la 5'-proyección de la superposición de regiones, que se extiende por la polimerasa de ADN y vincular por ligasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: la estrategia de construir un solo plásmido para co expresando múltiples proteínas quiméricas fluorescentes fusión. El diagrama muestra la estrategia para la construcción de un plásmido de expresión única para la expresión conjunta de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescente para la expresión transitoria o estable transformación en plantas. El vector de expresión se compone de dos cassettes de expresión de la proteína, que contiene sus propios elementos necesarios para la expresión de la proteína y funciones en la expresión de su proteína de fusión fluorescente quimérica individuales semi-independently. Asamblea y relación de todas las moléculas de ADN se obtienen convenientemente por un método de recombinación optimizado isotermo en vitro mediado con los fragmentos de DNA traslapados. Detalles de esta figura fueron publicados primero en Zhong et al. 201736 (reimpreso con permiso; copyright fronteras de la ciencia de planta). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes representativas de la co-expresión de quimérica fusión fluorescente de VSR y SCAMP en las células vegetales.
(A) coexpresión de RFP-AtVSR2 y AtSCAMP4-GFP mediante bombardeo de partículas en las células de suspensión tabaco BY-2. (B) una imagen representativa de una raíz de Arabidopsis transgénica celular Co expresando su RFP-AtVSR2 y AtSCAMP4-GFP. (C) y (D) raíces transgénicas de Arabidopsis expresando Co RFP-AtVSR2 y AtSCAMP4-GFP fueron tratadas con wortmannin y BFA por 30 min respectivamente. (E) una imagen representativa de un pelo de raíz de Arabidopsis transgénica Co expresando RFP-AtVSR2 y AtSCAMP4-GFP. (F) y (G) transgénicas de Arabidopsis pelos de la raíz Co expresando su RFP-AtVSR2 y AtSCAMP4-GFP fueron tratados con wortmannin y BFA min 30 flechas en (D) y (G) indican proteína inducida por BFA agregación. rp = coeficiente de correlación de Pearson; rs = correlación de rango de Spearman. Barra de escala en (A)-(D) es de 50 μm, (E)-(G) es de 30 μm. detalles de esta figura fueron publicados primero en Zhong et al. 201736 (reimpreso con permiso; copyright fronteras de la ciencia de planta). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Cassette de expresión 1 | ||
| 1-FP35S | GAATTCGAGCTCGGTACCC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 1-RP35S | AGGACGCGGGCGTGGGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 1-FRFP | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCCCACGCCCGCGTCCT | |
| 1-RRFP | ATTATCCATATCACTCCCCA GGCGCCGGTGGAGTGGCGGC | |
| 1-FAtVSR2 | GCCGCCACTCCACCGGCGCC TGGGGAGTGATATGGATAAT | |
| 1-RAtVSR2 | AAATGTTTGAACGATCGGGA TTACAACTCTAGTTGAGAAG | |
| 1-FNOS | CTTCTCAACTAGAGTTGTAA TCCCGATCGTTCAAACATTT | |
| 1-RNOS | GAGAATGGATGCGAGTAATG TCTAGTAACATAGATGACAC | |
| Cassette de expresión 2 | ||
| 2-FP35S | CATTACTCGCATCCATTCTC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 2-RP35S | TTAGGATCGTGTCGTGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 2-FAtSCAMP4 | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCACGACACGATCCTAA | |
| 2-RAtSCAMP4 | TCCTCGCCCTTGCTCACCAT TAGTGCACGCATCAAGGTCG | |
| 2-FGFP | CGACCTTGATGCGTGCACTA ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA | |
| 2-R.G.F.P. | TAAAACCAAAATCCAGTGAC TTACTTGTACAGCTCGTCCA | |
| 2-FT35S | TGGACGAGCTGTACAAGTAA GTCACTGGATTTTGGTTTTA | |
| 2-RT35S | GTCGACTCTAGAGGATCCCC GTCCGCAAAAATCACCAGTC | |
Tabla 1: estrategia de diseño de la cartilla y secuencias utilizadas en este estudio. Nombre de cada cartilla está dado en el panel izquierdo. Las secuencias complementarias de superposición de los iniciadores están subrayadas. Los datos de esta tabla fueron publicados primero en Zhong et al. 201736 (reimpreso con permiso; copyright fronteras de la ciencia de planta).
Suplementario Figura 1: imágenes representativas de Autofluorescencia en células por-2 y las raíces de Arabidopsis y pelos de la raíz. (A) la autofluorescencia de las células de tipo salvaje BY-2 fue detectada en las mismas condiciones de proyección de imagen con las células transformadas. (B) y (C) de Arabidopsis pelos y células de la raíz fueron detectadas en las mismas condiciones de proyección de imagen con las células transformadas de Arabidopsis. Barra de escala en (A)-(C) es de 20 μm. DIC, contraste de interferencia diferencial. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aquí hemos demostrado un nuevo método para robusta Co expresar proteínas quiméricas fluorescentes fusión en plantas. Puede utilizar para la expresión transitoria y transformación genética y es compatible con actuales fluorescentes basados en proteína bio-proyección de imagen molecular y bioquímica aplicaciones y tecnologías9,10,13 . Además, supera las dificultades de los métodos convencionales que utilizan varios plásmidos de expresión individual de la expresión de la proteína. En cambio, emplea un vector de expresión única que contiene varios cassettes de expresión de proteína con sus propios promotores individuales, etiquetas fluorescentes, terminadores y proteínas objetivo. Por otra parte, el casete de expresión de la proteína se puede manejar independientemente para satisfacer necesidades de expresión diversos, como el uso de un promotor específico y la fusión quimérica de N o C terminal de una proteína fluorescente con la proteína diana. Por lo tanto, las funciones de cassettes de expresión de proteínas como un elemento básico del "Lego" que funciona de forma semi independiente en el plásmido. Además, también es un sistema muy versátil en que gene edición, reemplazo, y conjunto de todos puede lograrse fácilmente por una reacción de recombinación isotérmica de un solo paso sin procesos adicionales de digestión de la enzima y la ligadura. Hemos optimizado la eficiencia de la reacción de recombinación isotérmico de estudios anteriores, como se describe en el paso 2.4, probando diferentes concentraciones de T5 exonucleasa, la polimerasa de DNA de Phusion y Taq polimerasa. Además, la concentración de cada ADN fragmentos para la reacción de recombinación isotérmica de un solo paso se sugiere para estar entre 0.05 y 0.1 pmol obtener la eficiencia máxima de la ligadura.
Sobre expresión de un transgén por reemplazar su promotor endógena con un fuerte y continuo promotor, como promotor ubiquitina-10 (UBQ10) y la introducción de copias adicionales del gene es un enfoque utilizado violentamente para estudiar sus funciones celulares y mecanismo subyacente en las células15,32. Sin embargo, inesperada abajo-regulación y fuerte inhibición de la expresión de genes a veces se encontró así33,34. El porcentaje de oscila entre 2 y 100% bajo estas situaciones33,35el silenciamiento del gen impredecible. Por otra parte, silenciamiento génico tiene una mayor probabilidad de ocurrir en la expresión de varios genes al mismo tiempo, transformación de alta copias de ADN y un aumento significativo de gene nivel transcripcional9,33,24 ,35. Con el fin de minimizar la ocurrencia de silenciamiento en el robusto sistema de coexpresión de proteína de fusión múltiple del gen, elegimos promotores activos diferentes a los cassettes de expresión de diferentes proteínas cuando Co expresando múltiples proteínas de fusión. Por otra parte, hemos evitado usar continuamente el mismo promotor para cassettes de expresión diferente. Además, otra limitación potencial del presente Protocolo es la reducida eficiencia de recombinación isotérmica de un solo paso ADN causado por el creciente número de cassettes de expresión de proteína para la expresión. Además, el número de los cassettes de expresión que se puede alojar en el plásmido de expresión final principalmente se basa en el replicón de la columna vertebral plásmido24,25,35.
Tomados en conjunto, hemos desarrollado un potente sistema para expresar conjuntamente múltiples proteínas quiméricas fluorescentes fusión convenientemente en plantas36. Supera las limitaciones de los métodos clásicos y utiliza una reacción de Asamblea de ADN de un paso optimizado para la construcción de interrelación y plásmido de DNA de manera ancestral. Este avance técnico ha sido validado por AtVSR2 y AtSCAMP4 Co-expresión en la planta las células a través de la expresión transitoria y transformación genética. Por lo tanto, muestra un método convincente y novedoso de los distintos aspectos de los descubrimientos científicos de coexpresión quiméricos fluorescentes de proteínas de fusión en las plantas. Además, el concepto y principio de coexpresión múltiples quiméricos fluorescentes de proteínas de fusión a través de un vector de expresión individual son totalmente compatibles con tecnologías de expresión CRISPR Cas9, ARNi y proteínas para el estudio de las funciones y interacciones de múltiples genes en plantas37,38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Wang de las discusiones útiles y comentarios. Este trabajo es apoyado por la nacional Ciencias naturales Fundación de China (NSFC, grant no. 31570001) y la Fundación de Ciencias naturales de la provincia de Guangdong y la ciudad de Guangzhou (concesión 201707010024 y Nº 2016A030313401) a H.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
References
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
- Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
- Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
- Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
- Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
- Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
- Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).
- Li, S., et al. Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean. Front Plant Sci. 8, 246 (2017).
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
- Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
- Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
- Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).
- Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
- Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
- Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
- Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
- Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
- Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
- Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
- Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
- Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
- Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
- Bruening, G. Plant gene silencing regularized. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).
- Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
- Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
- Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).
- Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
- Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
- Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).
