Summary
Birden çok chimeric floresan füzyon protein geleneksel yöntemlerle zorlukları aşmak tesislerinde ortak ifade etmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Kaset protein ortak ifade ulaşmak için ifade birden çok fonksiyonel olarak bağımsız protein içeren bir tek ifade plazmid kullanarak yararlanır.
Abstract
Zamanmekansal hücre altı localization(s) bir protein hakkında bilgi fizyolojik fonksiyonları hücrelerdeki anlamak için önemlidir. Çılgınca floresan proteinler ve floresan füzyon proteinlerin üretimi doğrudan protein yerelleştirme ve dinamikleri hücrelerdeki görselleştirmek için etkili bir araç kullanılmıştır. Bunları ortak ilgi sözcüğünden sonra ifade protein ile tanınmış organel işaretleri ile karşılaştırmak özellikle yararlıdır. Yine de, bitkilerde protein ortak ifade için Klasik yaklaşımlar genellikle birden çok bağımsız ifade plazmid içerir ve bu nedenle düşük ortak ifade verimliliği, ifade düzey varyasyon ve yüksek saat içerir dezavantajları var genetik geçiş ve eleme harcama. Bu çalışmada, bitkiler birden çok chimeric floresan proteinlerin ortak ifade için sağlam ve Roman yöntemi açıklanmaktadır. Bu birden fazla yarı bağımsız ifade kaset oluşan bir tek ifade vektör kullanarak geleneksel yöntemlerle sınırlamalar üstesinden gelir. Her protein ifade kaset kendi fonksiyonel proteini ifade öğeleri içerir ve bu nedenle bu esnek farklı ifade talebi karşılamak için ayarlanabilir. Ayrıca, kolay ve derleme gerçekleştirmek uygun ve en iyi duruma getirilmiş tek adımlı reaksiyon ek sindirim ve ligasyonu adımları olmadan kullanarak ifade plazmid DNA manipülasyonu parçaları. Ayrıca, dolu birarada olabilir ile mevcut floresan protein elde edilen biyo-görüntüleme teknolojileri ve uygulamaları, perde ve BiFC gibi. Bir doğrulama yöntemi, bu yeni sistemin fluorescently erimiş Co express katmaninin sıralama reseptör ve salgı taşıyıcı membran proteinlerinin çalıştırmaya başladık. Sonuçlar, onların bakış açısı hücre altı yerelleştirmeler geçici ifade ve bitkilerde genetik dönüşüm tarafından önceki çalışmalarda olduğu gibi aynı olduğunu göstermektedir.
Introduction
Chimeric floresan füzyon proteinler hücre içi dinamikleri ve hücre altı yerelleştirme çalışma ve daha fizyolojik fonksiyonları ve çalışma mekanizmaları1,2, anlamak için yararlı araçlar kabul edilmiştir 3 , 4. eş express tanınmış organel muhabir proteinlere, kronolojik zamanmekansal mantığı, dağıtım ve function(s) hücreleri4 endomembrane sistemi içinde daha iyi göstermek için söz konusu protein ile özellikle faydalıdır , 5 , 6 , 7 , 8.
Chimeric floresan füzyon protein onların anılan sıraya göre avantajları ve sınırlamalar9,10,11olan bitkiler ile geçici ifade ve istikrarlı genetik dönüştürme, ifade edilebilir. Geçici bir protein ifadesidir biolistic bombardıman-, Polietilen glikol (PEG) içeren uygun bir yaklaşım-, veya DNA geçici ifade Elektroporasyon aracılı önceki ve Agrobacterium-yaprak infiltrasyon aracılı olduğu gibi bitki hücreleri, Şekil 1A, B12,13,14,15,16' da gösterildiği gibi. Ancak, ortak ifade tek bitki hücrede birden çok chimeric floresan füzyon proteinlerin çeşitli bağımsız ifade plazmid karışımı gerektirir. Böylece, birkaç plazmid aynı anda tek bir plazmid için karşılaştırıldığında aynı hücrelere girerek önemli ölçüde azaltılmış olasılığı nedeniyle ortak ifade düzeyi düşük tesislerinde protein ortak ifade birden çok plazmid istihdam sakıncaları vardır ve Plazmid hücre17,18aktarılan her türde kontrolsüzce rasgele miktarı nedeniyle protein ifade düzeyleri varyasyonları. Buna ek olarak, protein ortak ifade9,10,11tek Agrobacterium içine birkaç bağımsız ifade plazmid tanıtmak için teknik olarak zordur. Bu nedenle, Agrobacterium- Şekil 1Badımında gösterildiği gibi aracılı protein geçici ifade tütün infiltrasyonu tarafından bırakır sadece bir kerede bir plazmid ifade yeteneğine sahip. Buna ek olarak, floresan füzyon protein ifade Transgenik bitkilerin üretimi genellikle ikili dönüşüm vektör taşıyan Agrobacterium tarafından sağlanır. Ancak, gen transferi ve bitki genleri içine ekleme aracılık eder ikili vektör yalnızca bir tek floresan füzyon proteini (Şekil 1B)9,10,12ifade yeteneğine sahiptir. Aynı anda birkaç chimeric floresan proteinler ifade eder bir transgenik bitki üreten birden fazla mermi genetik geçiş ve ay sonra yıl genlerin sayıda bağlı olarak ortak ifade için gerçekleştirebileceğiniz tarama gerektirir.
Bir tek ifade vektör bitki birden çok proteinlerin ortak ifade için önceki birkaç tarafından bildirilmiştir istihdam19,20,21çalışmaları. Ancak, birden fazla mermi enzimatik sindirim ve DNA molekülleri ve omurga vektörel çizimler ligasyonu DNA protein Co ifadesi veya aşırı ifadesi için son plazmid nesil için genellikle gereklidir. Burada, birden çok chimeric floresan proteinler tesislerinde ortak ifade etmek için yeni ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Bitkiler hem geçici ifade için birden fazla protein ortak ifade ve bir onur moda istikrarlı dönüştürme sağlar son derece verimli ve kullanışlı bir yöntemdir. Birden çok fonksiyonel olarak bağımsız protein ifade kaset protein ortak ifade içeren ve böylece geleneksel yöntemlerle sakıncaları üstesinden gelir bir tek vektör kullanır. Ayrıca, hangi DNA'manipülasyonlar ve derleme bir en iyi duruma getirilmiş basit tek adımlı DNA sindirim ve ligasyonu ile tepki ek adımlar olmadan elde edilir son derece çok yönlü sistemidir. Çalışma prensibi Şekil 2' de gösterilmiştir. Ayrıca, tamamen chimeric floresan füzyon protein üzerinde temel alan geçerli, moleküler, hücresel ve biyokimyasal yaklaşımlar ile uyumlu olduğunu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. primer tasarım stratejisi ve DNA amplifikasyon
- Moleküler klonlama, DNA parçaları için astar tasarım. Astar 20 bp gen özel bağlayıcı sıraları ve (örneğin bkz. Tablo 1 ) tamamlayıcı örtüşen sıra bitişik DNA moleküllerinin olan 20-25 bp 5' uç çıkıntı dizileri, oluştururlar.
Not: Sonraki derleme her DNA parçaları, farklı protein ifade kaset, bağlantı ve tüm son ifade vektör ile entegrasyon bağlıdır üzerinde bitişik örtüşen sıralarının tanıma. - DNA parçalarının yarı bağımsız protein ifade kaset standart PCR reaksiyonları ile ilgili onların astar tarafından inşası için gerekli ve yüksek olan organizatörü, floresan muhabir, hedef gen ve Sonlandırıcı, dahil olmak üzere, yükseltmek sadakat polimeraz.
Not: Bu çalışmada DNA amplifikasyon için kullanılan şablonları önceki çalışmalar15,22,23türetilmiştir. Tavlama sıcaklığı ve PCR reaksiyonları süreyi uzatma astar ve gen bağımlı vardır.
2. DNA parçası montaj ve inşaat Protein ifade kaset
- DNA Elektroforez tarafından ilk turda PCR ürünlerinin kalitesini incelemek ve spektrofotometre tarafından ölçmek. % 1'özel jel elektroforez tarafından DNA bozulma ve diğer yabancı maddelerden oluşmuş olup olmadığını kontrol edin. OD260/OD280 PCR ürünlerinin 1.6 ve 1.8 arasında olmalıdır.
- Farklı DNA parçalarının mix (0.05 - 0.1 pmol her parça için) bir yeni son hacmi 5 µL PCR tüp içine.
Not: Mix DNA molekülleri birlikte bir PCR tüpte aynı protein ifade kaset için tasarlanmış. DNA derleme bağlanması için gereken DNA molekülleri artan sayıda nedeniyle verimliliği azaltır bu yana DNA'lar farklı ifade kaset üzerinden birlikte, karıştırma önlemek.
Not: Protokol burada duraklatılmış. - 5 x ISO hisse senedi arabellek hazırlamak: 500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2; 1 mM deoxynucleotide (dNTP); 50 mM dithiothreitol; % 25 Polietilen glikol (PEG) 8000; ve 5 mM Nikotinamid adenin dinükleotit (NAD).
- ISO stok tampon, T5 eksonükleaz aktivitesi, yüksek-sadakat DNA polimeraz 62.5 birimleri, Taq polimeraz 5.000 adet 7,5 adet x 1 mL 2 x 400 µL 5 ana karışım yapmak (bkz. Tablo reçetesi) ve sterilize edilmiş çift distile H2O.
Not: Bu önceki çalışmalar24,25,26uyarlanmıştır; Bu birimler optimize edilmelidir. - 2 ana karışım tüp ve mağaza-20 ° C'de başına x aliquot 100 µL
Dikkat: Sık dondurma ve çözme 2 x ana karışımı düşük DNA montaj verimliliği neden olabilir. - 2 x ana karışımı 15 µL 5 µL DNA karışıma ekleyin ve 50 ° c 60 dk için kuluçkaya.
3. bitkilerde birden çok Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade vektör inşaatı
- Tüm yarı bağımsız protein ifade kaset tarafından ikinci tur PCR ürünü kullanarak yükseltmek (0.5 - 1.0 µL) ilk turda izotermal derleme tepki olarak şablon ve en dıştaki astar (Örneğin, 1 FP35S ve 1-RNOS ifade için gelen Kaset 1).
- Yüksek sadakat polimeraz 50 µL tepki birimindeki birimini kullan 1 30 döngüsü tarafından takip (94 ° C 30 s, 30 55 ° C s ve 68 ° C için 2 dk), ardından 68 ° c 5 min için son bir uzantısı.
- Protein geçici ifade ve genetik dönüşüm için sırasıyla, 4 adet Sma ekleyerek tasarlanmıştır son protein ifade omurga vektörel çizimler pUC18 ve pCAMBIA1300, linearize ben bir son 10 µL tepki hacim içine kuluçka 1 için- 25 ° C'de 2 hr Restriksiyon enzimi 20 dk 65 ° C'de kuluçka tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.
- Protein ifade kaset ve Doğrusallaştırılmış son vektör ekimolar DNA moleküllerinin 5 µL son tepki hacim içine karıştırın. Sonra ikinci tur DNA rekombinasyon 15 µL 2 x ana arabellek ve 50 ° c 60 dk için kuluçka ile karıştırılarak gerçekleştirin.
- Yetkili E. coli dönüştürmek için ikinci tur izotermal Rekombinasyon tepkimesi son ürünleri kullanmak standart prosedürler27göre hücreleri (Örneğin, DH5α). Olumlu kolonilerin koloni PCR ile DNA sıralama tarafından iki kez kontrol edin. Bir mini plazmid ekstraksiyon kiti kullanarak E. coli olumlu plazmid ayıklamak ve-80 ° C'de depolayın
Uyarı: Uzun süreli depolama için plazmid TE arabellekte çözünmüş veya çift distile H2O onları E. coli suşları içinde tutmaktan daha istikrarlı.
4. Biolistic-bombardıman geçici eş ifade birden çok Chimeric floresan füzyon protein tesislerinde aracılı
- Tütün BY-2 süspansiyon hücreleri ve Arabidopsis Juvenil bitkiler bombardıman için hazır olun.
- Kültür BY-2 hücreleri tarafından iki kez her hafta bir shaker 25 ° C'de subculturing Murashige ve Skoog (MS) ortamda 130 rpm'de ayarlayın. Ödemeli 30 mL 3 d kültürlü BY-2 hücreleri üzerine 70 mm autoclaved filtre kağıdı ile vakum pompası bir parçası için 40 mbar vakum basıncı ayarlayarak filtre uygulamak.
- Hücreleri aşağıdaki adımları boyunca kurumasını önlemek için birkaç damla BY-2 hücre sıvı kültürel orta bir kabında filtre kağıdı yerleştirmeden önce ekleyin (bir sonraki adım).
- BY-2 hücreleri ile filtre kağıdı üzerine yeni bir Petri kabına (85 mm x 15 mm) aktarın.
- Yüzey sterilize Arabidopsis thaliana (Col-0) tohumları vortexing bir karışım % 0.05 içeren % 70 (v/v) etanol ile ara 20 10 dk için.
- Spin aşağı bir tezgah üst santrifüj 2 için maksimum hızda kullanarak tohum s, süpernatant kaldırmak ve % 100 etanol ile tohum bir kez 30 s. pipet steril başlıklı yeni bir steril filtre kağıdı üzerine tohumlar dışarı için yıkayın. Sonra tohum kurumasına ve onları ½ MS agar levha yayıldı.
- Aşağıdaki ayarlarla bir bitki büyüme odasına aktarmadan önce 48 saat için 4 ° C'de plakaları saklamak: 16 h 120-150 µm m-2 s-1 yoğunluğu ile 22 ° C. 8 h karanlık ışık
- 7 - gün eski örnek bitkiler bombardımanı verimliliğini artırmak için yeni ½ MS orta plaka merkezinde 30 mm çapında çember içine aktarın.
Dikkat: ne zaman transfer ve yeni ½ MS tabağa yerleştirerek bitkiler örtüşen önlemek. - Bitki veya nem korumak ve bitkileri dışarı sırasında aşağıdaki adımları kurutma önlemek için doku yüzeyi ½ MS sıvı orta birkaç damla ekleyin.
- Plazmid DNA ile ceket altın parçacıkları.
- Girdap altın microcarrier çözüm iyice, 3 dk. için hazırlamak yeni 1,5 mL tüp.
- Sırayla aşağıdaki çözümleri tüp ve girdap ekleyin: 25 µL (1.5 mg) altın parçacıkları, girdap 10 s; 25.46 mg/L spermidine, girdap 10 s 10 µL; 5 1µg/µL plazmid DNA µL, girdap 3 dk; 25 277.5 mg/L CaCl2 çözüm µL, girdap 1dk.
Dikkat: Bu adımı sırasında vortexing devam et. - Spin aşağı bir tezgah üst santrifüj maksimum hızda 5 s ve dikkatle dışarı süpernatant pipet Pelet bozmadan kullanarak altın microcarriers. Mutlak etanol 200 µL ile yıkama ve Pelet girdap tarafından 5-10 s. Spin için aşağı 5 s ve Kaldır etanol için maksimum hızda yeniden askıya alma.
- Altın parçacıkları 18 µL mutlak etanol ve aliquot 6 µL parçacıklar süspansiyon üzerine üç macrocarriers ortasına yeniden askıya. Kuru hava alsınlar.
- DNA partikül bombardımanı ile bitkiler aktarın.
- Partikül dağıtım sistemi aşağıdaki gibi ayarlayın: 1100 PSI, 28 mm Hg vakum, 1 cm boşluk mesafe ve 9-cm parçacık uçuş mesafesi.
- Hücre/bitkiler agar orta plaka üzerinde için üç kez üç farklı konumlarda ile bombardıman ve hücre/bitkiler karanlıkta bombardımanı hemen sonra bırakın.
Dikkat: işletim parçacık teslim sistemi yüksek basınçlı gaz ve yüksek hızlı parçacıklar sistemi ile ilişkisi nedeniyle koruyucu gözlük giymek.
- 6 ila 72 saat önce floresan sinyallerini gözlenmesi için bitki büyüme odası karanlıkta alı hücreler/bitkiler bulundurun. Bitki büyüme odası 24 h karanlık ve 22 ° c için ayarla
Dikkat: Organizatörü, gen ve bitki/doku-bağımlı ifade verimliliği ve floresan sinyal şiddeti vardır.
5. birden fazla Chimeric floresan proteinler Agrobacteriumtarafından ortak ifade istikrarlı transgenik Arabidopsis nesil-dönüşüm aracılı.
- Agrobacterium yetkili hücre (PMP90) buz çözme ve için 30 dakika bekleyin, sonra (yukarıda hazırlanan yetkili hücrelere) 2 µL ikili vektör (100-200 ng) ekleyin. Karışımı 10 dakika buz üzerinde durur.
- Karışım önceden soğutulmuş 0.1 cm Elektroporasyon küvet aktarın. Küvet Elektroporasyon sistemi yerleştirin ve aşağıdaki ayarlarla Elektroporasyon gerçekleştirmek: 1.6 kV, 600 ohm, 25 µF.
- SOC sıvı orta 1 mL küvet Elektroporasyon hemen sonra ekleyin, hücreleri yeni bir 1,5 mL tüp içine pipette ve 28 ° c 200 devirde bir yatay orbital Shaker 120 min için kuluçkaya.
- Hücreleri 2,348 x g 5 min için oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi, süpernatant çoğunluğu atmak, yavaşça bir pipet ucu pelleted hücrelerle yeniden askıya alma, 50 mg/L Hygromycin B içeren LB tabağa bacaklarını ve 28 ° C'de 2-3 gün kuluçkaya.
- Çiçek DIP28 yöntemi için daha önce açıklandığı gibi birden fazla protein ifade kasetleri ile entegre ikili vektör pCAMBIA1300 içeren Agrobacterium, Arabidopsis thaliana Col-0 bitkilerle dönüşümü istikrarlı transgenik bitkiler üretmek.
- Transgenik Arabidopsis tohum yüzeyinin % 0.05 içeren % 70 (v/v) etanol ile karıştırılarak sterilize ara 20. 10 dk. Spin bir tezgah üst santrifüj 2 için maksimum hızda kullanarak tohum aşağı için girdap s, süpernatant kaldırmak ve bir kez için %30 100 etanol ile tohum yıkama s.
- Pipet steril başlıklı steril bir filtre kağıdı üzerine tohumlar dışarı. Bundan sonra kurutma ve Hygromycin B pozitif ettiklerinizden eleme için içeren ½ MS ağar kaplamalar üzerine aç bacaklarını.
- Plakayı 4 ° C'de 2 gün kuluçkaya. Ardından, onları içine belgili tanımlık bitki büyüme odası ve kültür için 7 gün aktarın.
- 7 - gün eski hayatta kalma Juvenil bitkiler floresan mikroskop altında floresan sinyallerini denetleyerek seçin, sonra bitkiler için daha fazla tarama homozigoz bitkilerin toprak içine transfer.
6. ilaç tedavileri
- İlaç tedavisi, her ilaç uygun çalışma konsantrasyonları kuluçka hücreleri veya bitkiler önce sıvı MS ortamda sulandırmak.
- Wortmannin tedavi: 1 mM wortmannin hisse senedi çözümler DMSO wortmannin toz çözülerek hazırlamak ve hisse senetleri-20 ° C'de depolayın Bitki hücreleri ya da çocuk bitki 16,5 µM wortmammin içeren sıvı MS orta aktarmak ve 30-45 dk önce görüntüleme için kuluçkaya.
- Brefeldin A (BFA) tedavi: 1 mM DMSO BFA toz çözülerek BFA hisse senedi çözümler hazırlamak ve hisse senetleri-20 ° C'de depolayın Bitki hücreleri veya Juvenil bitkiler 10 µg/mL BFA 30-45 dk önce görüntüleme için içeren sıvı MS orta içine aktarın.
7. confocal mikroskop düşsel ve Protein hücre altı ortak yerelleştirme Analizi
- Juvenil bitki veya süspansiyon hücre geleneksel cam slayt üzerine aktarın ve kapak slayt görüntüleme için üstte mikroskobu tarama standart confocal lazerle kırmadan. Kullanma ertesi gün koyma: 63 X su amaç (N.A 1.4), 0 arka plan, 700 kazanç, 0.168 mm piksel boyutunu ve photomultiplier tüp dedektörü. GFP öğesini proteinler 485, heyecanlandırmak nm ve floresan, 525 nm. 514 RFP öğesini proteinler için heyecanlandırmak nm ve 575 algılamak nm.
- Pearson-Spearman korelasyon (PSC) Co yerelleştirme yukarıda açıklanan8olarak eklentisi ile floresan sinyallerini kullanarak görüntü J yazılım (https://imagej.nih.gov/ij/) Co yerelleştirme oranını hesaplamak. Pearson korelasyon katsayıları veya Spearman'ın sıralama korelasyon katsayıları (Şekil 4) sonuçlarında gösterilir. Üretilen r değerleri -1 ile 1'e olur. + 1 ve -1 tam pozitif ve negatif korelasyon, sırasıyla, iki sinyalleri gösterir, ancak 0 iki sinyallerin tespit yok korelasyon gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Birden çok chimeric floresan füzyon protein tesislerinde ortak bir ifade için sağlam ve yüksek verimli bir yöntem geliştirdik. Bu geleneksel, engellerin üzerinden tatili yaklaşımlar kullanmak birden çok ayrılmış plazmid protein ortak ifade için Şekil 1A, B, yolu ile gösterildiği gibi geçici ifade veya istikrarlı genetik dönüşümü. Bu yeni yöntem, protein ortak ifade aynı anda (Şekil 1 cD) elde etmek için birden fazla protein ifade kaset oluşan bir tek ifade vektör oluşturmak. Protein ifade kaset işlevlerini yarı protein ifade için gerekli kendi DNA elemanları ile independently. Bu nedenle, her protein ifade kaset bağımsız olarak protein ifade farklı gereksinimlerine göre özelleştirilmiş. Değiştirilebilir, temel "Lego" öğeleri yeniden inşa olarak son protein ortak ifade vektör gelince protein ifade kaset içindeki işlev. ve uygun yeniden yerleştirilmiş. Ayrıca, son durak vektör chimeric floresan füzyon proteinlerin ortak ifade ile DNA molekülü derleme, bağlantısını birkaç protein ifade kaset ve DNA parçalarının entegrasyonu için alternatif bir strateji sadece elde edilir via DNA sindirim ve interlinkage daha fazla ek adımlar olmadan bir en iyi duruma getirilmiş izotermal vitro Rekombinasyon tepkimesi. İzotermal vitro Rekombinasyon tepkimesi çalışma prensibi Şekil 2' de gösterilmiştir. Birden fazla DNA molekülleri (Örneğin, üç temsilcisi DNA parçaları 1-3 gösterildiği Şekil 2) ve entegrasyonu son ifade vektör ile bağlantı sadece ve verimli bir şekilde elde tek adımlı reaksiyon (bkz: Şekil 2 tarafından ). Önceki çalışmalarda bu örtüşen rekombinasyon DNA moleküllerinin DNA parçalarının füzyonu ve inşaat plazmid25,26elde etmek için üst üste gelen kısa sıralarıyla aracılı tarafından uyarlanmıştır.
Bir test yöntemi seçtik katmaninin sıralama reseptör (VSR) ve salgı taşıyıcı membran proteini (haylaz), protein salgı ve endositoz yolları, sırasıyla6,22 katılan iki gazeteci proteinler ,23,29,30. VSRs türü vardır-ben salgı yolu çarpıtma ve özellikle trafikte biyosentetik protein aracılık integral membran proteinlerinin yerelleştirir bitkiler6,22,23prevacuolar bölmeleri (PVC) içinde. Buna ek olarak, salgı taşıyıcı zar proteinleri (SCAMPs) bitki endositik yolu katılmak tip IV zar proteinleri vardır. Plazma zarı (am) ve transyerelleştirir-Golgi ağları (TGNs), erken endosomes22,29,30hizmet vermektedir. Biz Arabidopsis VSR2 chimeric füzyon barındıran iki protein ifade kaset inşa (AtVSR2) RFP ve Arabidopsis SCAMP4 (AtSCAMP4) Şekil 3' te gösterilen GFP ile. RFP AtVSR2 acil servise tercüme edilebilir emin olmak için bir sinyal peptid (SP) RFP önce olarak daha önce bildirilen6,31eklenir. İki bireysel protein ifade kaset daha da bağlantılıdır ve son protein ifade vektör pUC18 veya pCAMBIA1300 protein ortak ifade ile ikisinden biri yolu ile protein geçici ligate ya da gösterildiği gibi istikrarlı dönüştürme, bitki Şekil 3. AtVSR2 ve AtSCAMP4 başarılı bir şekilde ortak tütün BY-2 hücreleri ile partikül bombardımanı ifade vardı ve doğru yerelleştirmeler (Şekil 4A) gösterdi. Teklif toplama-AtVSR2 AtSCAMP4-GFP plazma zarı yerelleştirme sitozolik bazı punctate noktalı ayrı bir punctate desen gösterdi. Ayrıca, Arabidopsis AtSCAMP4-GFP ve RFP-AtVSR2 ortak ifade transgenik bitkiler olduğunu Agrobacteriumoluşturulan-dönüşüm aracılı. RFP-AtVSR2 ve AtSCAMP4-GFP kök ve kök saç hücrelerdeki ortak ifade hücre altı yerelleştirmeler Şekil 4B ve 4Egösterilmiştir. BY-2 hücreleri olanlardan anlaşarak ortak ifade sonuçları RFP-AtVSR2 ve AtSCAMP4-GFP transgenik Arabidopsis elde edildi. Buna ek olarak, transgenik Arabidopsis wortmannin ile tedavi ve BFA 30 dk. RFP-AtVSR2 neden Wortmmanin için küçük bir yüzük benzeri yapıda oluşturan PVC etiketli ve Şekil 4 c gösterildiği gibi AtSCAMP-GFP TGN toplama, etiketli BFA indüklenen , D, F, G. Ayrıca, küçük autofluorescent sinyal tütün BY-2 hücreleri ve Arabidopsis kök ve kök saç hücreleri resim koleksiyonu Şekil 4 (ek Şekil 1) gelince aynı ayarları uygulayarak tespit edilebilir.
Şekil 1: bitkilerde birden çok chimeric floresan füzyon proteinlerin ortak ifade için sağlam bir sistem. (A) tesislerinde birden çok floresan muhabir proteinlerin geçici eş ifade geleneksel yaklaşımlar elde aracılığıyla çoğalmasıyla, partikül bombardımanı ve PEG aracılı dönüşüm birkaç bağımsız ifade karıştırılarak vektörel çizimler. (B) bir tek floresan füzyon protein ifade vektör ile bitki genetik dönüşüm Agrobacterium tarafından geleneksel yöntem. Birden çok chimeric floresan füzyon protein transgenik bir bitki ortak ifade etmek için daha fazla genetik geçiş ve tarama birden fazla mermi homozigoz ettiklerinizden elde etmek için gereklidir. (C) ve (D) alternatif yeni protein ortak ifade yöntemi. Birden fazla protein ifade kaset oluşur ve birkaç chimeric floresan muhabir proteinler arasında bitkiler ile birlikte ifade edebilecek bir tek ifade vektör, her iki geçici yararlanır ifade ve genetik dönüşümü. Bu rakam ayrıntılarını ilk Zhong vd. basıldı 201736 (; izni ile yayımlanmaktadır telif hakkı sınırları bitki bilimi). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: tek adımlı DNA derleme yöntemi izotermal Rekombinasyon tepkimesi ile çalışma prensibi gösteri. DNA parçalarının ve dizileri (OSs) çakışan Doğrusallaştırılmış plazmid 5'-bölgeler örtüşen, DNA polimeraz tarafından uzanan ve ligaz tarafından bağlama çıkıntı arasındaki temel soyma tarafından eklenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: birden çok chimeric floresan füzyon protein ortak ifade etmek için tek bir plazmid oluşturma stratejisi. Diyagramda birden çok chimeric floresan füzyon proteinler için geçici ifade veya ahır dönüşüm tesislerinde ortak bir ifade için bir tek ifade plazmid oluşturmak için strateji gösterir. İfade vektör her biri kendi protein ifade ve kendi bireysel chimeric floresan füzyon protein yarı independently ifade işlevleri için gerekli unsurlar içeren iki protein ifade kaset oluşur. Derleme ve DNA moleküllerinin Interlinkage uygun bir en iyi duruma getirilmiş izotermal vitro rekombinasyon yöntemi ile örtüşen DNA parçalarının aracılı tarafından sağlanmaktadır. Bu rakam ayrıntılarını ilk Zhong vd. basıldı 201736 (; izni ile yayımlanmaktadır telif hakkı sınırları bitki bilimi). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Chimeric floresan füzyon VSR ve haylaz bitki hücrelerinde ortak ifade temsilcisi görüntüler.
(A) ortak ifade RFP-AtVSR2 ve AtSCAMP4-GFP partikül bombardımanı tütün BY-2 süspansiyon hücrelerdeki üzerinden. ((B)) RFP-AtVSR2 ve AtSCAMP4-GFP ortak ifade transgenik Arabidopsis kök hücre temsil edici bir görüntü. (C) ve (D) transgenik Arabidopsis kökleri RFP-AtVSR2 ve AtSCAMP4-GFP ortak ifade wortmannin ve BFA ile 30 dk için sırasıyla tedavi edildi. (E) bir transgenik Arabidopsis kök saç RFP-AtVSR2 ve AtSCAMP4-GFP ortak ifade temsilcisi bir görüntü. (F) ve (G) transgenik Arabidopsis kök ortak ifade RFP-AtVSR2 ve AtSCAMP4-GFP wortmannin ve BFA ile 30 dk. oklar (D) ve (G) için tedavi edildi kıllar BFA kaynaklı protein belirtmek toplama. rp = Pearson korelasyon katsayısı; rs Spearman'ın sıralama korelasyon =. Ölçek çubuğu (A)-(D) olduğunu 50 µm, (E)-(G) olduğunu 30 µm. Ayrıntılar bu figürü ilk Zhong vd. yayınlandı 201736 (; izni ile yayımlanmaktadır telif hakkı sınırları bitki bilimi). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| İfade Kaset 1 | ||
| 1-FP35S | GAATTCGAGCTCGGTACCC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 1-RP35S | AGGACGCGGGCGTGGGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 1-FRFP | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCCCACGCCCGCGTCCT | |
| 1-RRFP | ATTATCCATATCACTCCCCA GGCGCCGGTGGAGTGGCGGC | |
| 1-FAtVSR2 | GCCGCCACTCCACCGGCGCC TGGGGAGTGATATGGATAAT | |
| 1-RAtVSR2 | AAATGTTTGAACGATCGGGA TTACAACTCTAGTTGAGAAG | |
| 1-FNOS | CTTCTCAACTAGAGTTGTAA TCCCGATCGTTCAAACATTT | |
| 1-RNOS | GAGAATGGATGCGAGTAATG TCTAGTAACATAGATGACAC | |
| İfade Kaset 2 | ||
| 2-FP35S | CATTACTCGCATCCATTCTC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 2-RP35S | TTAGGATCGTGTCGTGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 2-FAtSCAMP4 | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCACGACACGATCCTAA | |
| 2-RAtSCAMP4 | TCCTCGCCCTTGCTCACCAT TAGTGCACGCATCAAGGTCG | |
| 2-FGFP | CGACCTTGATGCGTGCACTA ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA | |
| 2-RGFP | TAAAACCAAAATCCAGTGAC TTACTTGTACAGCTCGTCCA | |
| 2-FT35S | TGGACGAGCTGTACAAGTAA GTCACTGGATTTTGGTTTTA | |
| 2-RT35S | GTCGACTCTAGAGGATCCCC GTCCGCAAAAATCACCAGTC | |
Tablo 1: astar tasarım stratejisi ve bu çalışmada kullanılan dizileri. Sol panelde her astar adı verilir. Astar tamamlayıcı örtüşen dizisi altı çizilir. Bu tablo ayrıntılarını ilk Zhong vd. basıldı 201736 (; izni ile yayımlanmaktadır telif hakkı sınırları bitki bilimi).
Tamamlayıcı Şekil 1: autofluorescence BY-2 hücreleri ve Arabidopsis kökler ve kök tüyleri temsilcisi görüntüler. (A) autofluorescence vahşi tip BY-2 hücreleri dönüştürülmüş hücreleri ile aynı görüntüleme koşulları altında tespit edildi. (B) ve (C) Arabidopsis kök saç ve kök hücreleri dönüştürülmüş Arabidopsis hücreleri ile aynı görüntüleme koşulları altında tespit edildi. Ölçek çubuğu (A)-(C) 20 µm. DIC, fark girişim kontrast olduğunu. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sağlam chimeric floresan füzyon protein tesislerinde ortak ifade etmek için yeni bir yöntem göstermiştir. Geçici ifade ve genetik dönüşümü için kullanılabilir ve geçerli floresan protein bazlı biyo-görüntüleme, moleküler ve biyokimyasal uygulamaları ve teknolojileri9,10ile,13 uyumludur . Buna ek olarak, protein ortak ifade için birkaç bireysel ifade plazmid kullanan geleneksel yöntemleri zorluklar üstesinden gelir. Buna ek olarak, kendi bireysel rehberleri, floresan Etiketler, hedef proteinler ve sonlandırıcılar ile birden fazla protein ifade kasetleri içeren bir tek ifade vektör kullanır. Ayrıca, protein ifade kaset kullanımını belirli bir organizatörü ve N - veya C-terminal chimeric füzyon hedef protein ile floresan bir protein gibi farklı ifade gereksinimlerini karşılamak için bağımsız olarak yönetilebilir. Bu nedenle, yarı bağımsız plazmid çalışır bir temel "Lego" öğesi gibi protein ifade kaset çalışır. Ayrıca, aynı zamanda hangi gen düzenleme, değiştirme, çok yönlü bir sistemdir ve derleme tüm kolayca bir tek adımlı izotermal Rekombinasyon tepkimesi enzim sindirim ve ligasyonu tarafından ekstra işlemler olmadan elde edilebilir. Önceki çalışmalar, T5 eksonükleaz aktivitesi, Phusion DNA polimeraz ve Taq polimeraz farklı konsantrasyonları test ederek adım 2.4, açıklandığı gibi izotermal Rekombinasyon tepkimesi verimliliğini optimize. Tek adımlı izotermal Rekombinasyon tepkimesi ligasyonu maksimum verimlilik elde etmek için 0,05 ile 0.1 pmol arasında olması önerilir için Ayrıca, konsantrasyon her DNA parçaları.
Eski yerine koymak onun güçlü bir ile endojen organizatörü ve ubiquitin-10 organizatörü (UBQ10), gibi sürekli organizatörü ve gen ek kopyalarını tanıtan bir transgene aşırı ifade hücresel fonksiyonları çalışmaya çılgınca kullanılan bir yaklaşımdır ve temel çalışma yönteminde hücreleri15,32. Ancak, gen ekspresyonu bazen beklenmedik down-regülasyonu ve güçlü inhibisyonu de33,34bulundu. Öngörülemeyen Gen 2 aralıkları %100 bu durumlar33,35altında susturmak yüzdesi. Ayrıca, aynı anda birkaç genlerin ifadesinde olmasını daha yüksek bir şansı var gen susturmak gen transkripsiyon düzey9,33,24 önemli ölçüde artırdığını ve DNA yüksek kopyalarını dönüşümü ,35. Sağlam içinde birden çok füzyon protein ortak ifade sistem susturmak gen oluşumunu en aza indirmek için biz ne zaman birden fazla füzyon protein ortak ifade farklı protein ifade kaset sürmeyi farklı etkin Rehberleri seçti. Ayrıca, sürekli olarak aynı organizatörü farklı ifade kaset için kullanarak kaçınılmalıdır. Ayrıca, başka bir potansiyel bu iletişim kuralı tek adımlı DNA izotermal rekombinasyon protein ifade kaset ortak ifade için artan sayıda nedeniyle indirimli verimliliğini kısıtlamasıdır. Ayrıca, son ifade plazmid esas olarak barındırılabilir ifade kaset sayısı omurga plazmid24,25,35replicon üzerinde dayanır.
Birlikte ele alındığında, birden çok chimeric floresan füzyon proteinler bitkiler36arasında elverişli bir konuma sahip ortak ifade etmek için güçlü bir sistem geliştirdik. Bu klasik yöntemlerle sınırlamalar üstesinden gelir ve bir en iyi duruma getirilmiş tek adımlı DNA derleme reaksiyon DNA interlinkage ve plazmid inşaat bir onur moda için kullanır. Bu teknik önceden AtVSR2 tarafından doğrulandı ve AtSCAMP4 ortak ifade bitki hücreleri ile geçici ifade ve genetik dönüşümü. Bu nedenle, bitkilerde chimeric floresan füzyon proteinlerin Co ifadeye göre farklı yönleriyle bilimsel keşifler için ikna edici ve Roman yöntemi gösterir. Ayrıca, kavram ve ortak ifade tek ifade vektör üzerinden birden çok chimeric floresan füzyon proteinlerin prensibi işlevleri çalışmaya CRISPR-Cas9, RNAi ve protein aşırı ifade teknolojileri ile tamamen uyumludur ve bitkiler37,38,39' birden çok gen etkileşimleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz yararlı tartışmalar ve yorumlar için Wang laboratuvar üyeleri teşekkür ederim. Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (NSFC, grant no. 31570001) ve doğal Bilim Vakfı Guangdong Eyaleti ve Guangzhou City (no. 2016A030313401 ve 201707010024 vermek) H.W. için desteklenir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
References
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
- Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
- Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
- Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
- Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
- Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
- Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).
- Li, S., et al. Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean. Front Plant Sci. 8, 246 (2017).
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
- Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
- Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
- Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).
- Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
- Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
- Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
- Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
- Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
- Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
- Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
- Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
- Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
- Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
- Bruening, G. Plant gene silencing regularized. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).
- Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
- Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
- Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).
- Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
- Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
- Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).
