Summary
Vi har utviklet en ny metode for co uttrykke flere chimeric fluorescerende fusion proteiner i planter å overvinne vanskelighetene med konvensjonelle metoder. Det tar fordelen av benytter en enkelt utrykk plasmider som inneholder flere funksjonelt uavhengig protein uttrykke kassetter for å oppnå protein co uttrykk.
Abstract
Informasjon om den spatiotemporal subcellular localization(s) av et protein er avgjørende å forstå sine fysiologiske funksjoner i cellene. Fluorescerende proteiner og generasjon fluorescerende fusion proteiner har blitt vilt brukt som et effektivt verktøy å direkte visualisere protein lokalisering og dynamikk i celler. Det er spesielt nyttig å sammenligne dem med kjente organelle markører etter co uttrykk med protein av interesse. Likevel klassisk tilnærminger for protein co uttrykk i planter innebære vanligvis flere uavhengige uttrykk plasmider, og derfor har ulemper med lav co uttrykk effektivitet, uttrykk-nivå variasjon og høy utgifter til genetisk krysset og screening. I denne studien beskriver vi en robust og romanen metode for co uttrykk for flere chimeric fluorescerende proteiner i planter. Løser begrensningene av konvensjonelle metoder ved hjelp av en enkelt utrykk vektor som består av flere semi-uavhengige uttrykke kassetter. Hver protein uttrykk kassett inneholder sin egen funksjonelle protein uttrykkselementer, og derfor det kan fleksibelt justeres for å imøtekomme ulike uttrykk etterspørsel. Også det er enkelt og praktisk å utføre forsamlingen og manipulering av DNA fragmenter i uttrykket plasmider ved hjelp av en optimalisert ettrinns reaksjon uten ekstra fordøyelsen og ligatur skritt. Videre er det kompatible med dagens fluorescerende protein utvunnet bio-imaging teknologi og programmer, som bånd og BiFC. Som en validering av metoden ansatt vi dette nye systemet co express fluorescently smeltet mer sortering reseptor og sekretoriske carrier membran proteiner. Resultatene viser at deres perspektiv subcellular steder er de samme som tidligere studier både forbigående uttrykk og genetisk transformasjon i planter.
Introduction
Chimeric fluorescerende fusion proteiner har vært betraktet som nyttige verktøy for å studere intracellulær dynamikk og subcellular lokalisering og videre forstå deres fysiologiske funksjoner og arbeider mekanismer1,2, 3 , 4. det er spesielt gunstig for co express kjente organelle reporter proteiner med protein aktuelle bedre illustrere dens spatiotemporal begrunnelse, distribusjon og funksjoner i endomembrane systemet i celler4 , 5 , 6 , 7 , 8.
Et chimeric fluorescerende fusion protein kan uttrykkes i planter via forbigående uttrykk og stabil genetisk transformasjon, som har sine respektive fordeler og begrensninger9,10,11. Forbigående uttrykk for et protein er en praktisk tilnærming som inkluderer biolistic bombardement-, polyetylenglykol (PEG)-, eller electroporation-mediert DNA forbigående uttrykk i protoplasts og Agrobacterium-mediert blad infiltrasjon i intakt anlegget celler, som vist i figur 1A, B12,13,14,15,16. Co uttrykk for flere chimeric fluorescerende fusion proteiner i en plante celle krever imidlertid en blanding av flere uavhengige uttrykk plasmider. Dermed ulempene ved å bruke flere plasmider protein co uttrykk i planter er lavere co uttrykk nivåer på grunn av dramatisk redusert sjanse for flere plasmider samtidig inn de samme cellene i forhold til en enkelt plasmider, og varianter av protein uttrykk nivåene skyldes ukontrollert tilfeldig beløpet av hver plasmider overføres til cellen17,18. I tillegg er det teknisk utfordrende å innføre flere uavhengige uttrykk plasmider i en enkelt Agrobacterium for protein co uttrykk9,10,11. Derfor Agrobacterium-mediert protein forbigående uttrykk av infiltrasjon av tobakk blader er bare i stand til å uttrykke en plasmider om gangen, som vist i figur 1B. Derimot er generasjon av transgene uttrykke fluorescerende fusion proteiner vanligvis oppnås ved Agrobacterium som bærer en binær transformasjon vektor. Binær vektoren som formidler genoverføring og innsetting anlegget genomer er imidlertid bare i stand til å uttrykke en enkelt fluorescerende fusion protein (figur 1B)9,10,12. Generere en transgene plante som uttrykker flere chimeric fluorescerende proteiner samtidig krever flere runder med genetisk krysset og screening, som kan ta fra måneder til år avhengig av antall gener skal co uttrykt.
Sysselsetting en enkelt utrykk vektor co uttrykk for flere proteiner i anlegg har blitt rapportert av flere tidligere studier19,20,21. Men er flere runder av enzymatisk fordøyelsen og DNA ligation av DNA molekyler og ryggraden vektorer vanligvis nødvendig for generering av den endelige plasmider protein co uttrykk eller over-uttrykk. Her har vi utviklet en ny og robust metode for å uttrykke co flere chimeric fluorescerende proteiner i planter. Det er en svært effektiv og praktisk metode som oppnår flere protein co uttrykk i planter for både forbigående uttrykk og stabil transformasjon i en hevdvunne måte. Den sysselsetter en enkelt vektor som inneholder flere funksjonelt uavhengig protein uttrykk kassetter for protein co uttrykk og dermed overvinner ulempene av konvensjonelle metoder. Videre er det en svært allsidig system i som DNA manipulasjoner og montering oppnås ved en enkel ett-trinns optimalisert reaksjon uten ekstra trinn DNA fordøyelsen og ligatur. The Arbeidsprinsipp er illustrert i figur 2. Videre er det fullt kompatibel med gjeldende mobilnettet, molekylær og biokjemiske tilnærminger som er basert på chimeric fluorescerende fusion proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. primer designstrategi og DNA amplifikasjon
- Utforme primerne for molekylær kloning av DNA. Primerne består av 20 bp genet bestemt bindende sekvenser og 20 til 25 bp 5'-end overheng sekvenser, som er komplementære overlappende sekvensen av tilstøtende DNA molekyler (se tabell 1 for eksempel).
Merk: Påfølgende montering av hver DNA fragmenter, kobling mellom annet protein uttrykk kassetter, og integrasjon med den endelige vektoren alle avhenger anerkjennelse av tilstøtende overlappende sekvenser. - Forsterke DNA fragmenter, inkludert arrangøren, fluorescerende reporter, målet genet og terminator, som er nødvendig for bygging av delvis uavhengige protein uttrykk kassettene av standard PCR reaksjoner med deres tilsvarende primere og høy gjengivelse utvalg.
Merk: Maler som brukes i denne studien til DNA amplifikasjon er avledet fra tidligere studier15,22,23. Den annealing temperatur og utvidelse tid av PCR reaksjoner er primer og gene avhengige.
2. DNA Fragment montering og bygging av Protein uttrykk kassetter
- Undersøke kvaliteten på første-runde PCR produktene av DNA geleelektroforese og kvantifisere av spektrofotometeret. Sjekk om DNA fornedrelse og forurensning har oppstått av 1% agarose gel geleelektroforese. OD260/OD280 av PCR-produkter bør være mellom 1,6 og 1,8.
- Bland ulike DNA fragmenter (0,05 - 0,1 pmol for hver fragment) i en ny PCR tube til et endelig antall 5 µL.
Merk: Blanding DNA molekyler designet for samme protein uttrykk kassetten sammen i en PCR tube. Unngå blanding DNAs fra ulike uttrykk kassett sammen, siden det vil redusere effektiviteten av DNA montering på grunn av det økende antallet DNA molekyler som må kobles.
Merk: Protokollen kan pauses her. - Forberede 5 x ISO lager buffer: 500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2; 1 mM deoxynucleotide (dNTP); 50 mM dithiothreitol; 25% polyetylenglykol (PEG) 8000; og 5 mM nikotinamid adenine dinucleotide (NAD).
- Gjøre 1 mL 2 x master blanding fra 400 µL 5 x ISO lager buffer, 7,5 enheter av T5 exonuclease, 62.5 enheter av Hi-Fi-DNA polymerase, 5000 enheter av Taq utvalg (se Tabell for materiale), og sterilisert dobbel destillert H2O.
Merk: Dette er tilpasset fra tidligere studier24,25,26; disse volumene skal optimaliseres. - Aliquot 100 µL av 2 x master blanding per rør og butikk på 20 ° C.
Advarsel: Hyppige frysing og tining av 2 x master blanding kan føre lav DNA montering effektivitet. - Legg til 15 µL av 2 x master blanding til 5 µL DNA blanding og ruge ved 50 ° C for 60 min.
3. bygging av vektoren for co uttrykk for flere Chimeric fluorescerende Fusion proteiner i planter
- Forsterke hele semi-uavhengige protein uttrykk kassetten av en andre-runde PCR av produktet (0,5 - 1.0 µL) fra første runde isotermiske montering reaksjonen som malen og ytterste primerne (f.eks 1-FP35S og 1-RNOS for uttrykk kassett 1).
- Bruk 1 enhet Hi-Fi utvalg i et 50 µL reaksjon volum etterfulgt av 30 sykluser (94 ° C for 30 s, 55 ° C for 30 s og 68 ° C i 2 min), etterfulgt av en siste utvidelse på 68 ° C i 5 min.
- Linearize siste protein uttrykk ryggraden vektorer pUC18 og pCAMBIA1300, som er utviklet for protein forbigående uttrykk og genetisk transformasjon, henholdsvis ved å legge til 4 enheter Sma til et siste 10 µL reaksjon volum og rugende for 1 - 2 hr på 25 ° C. Deaktiver begrensingen enzymet av rugende ved 65 ° C i 20 min.
- Bland ekvimolare DNA molekyler av protein uttrykk kassetter og lineær final vektor i et siste reaksjon volum av 5 µL. Deretter Utfør andre-runde DNA rekombinasjon ved å blande med 15 µL 2 x master buffer og rugende ved 50 ° C for 60 min.
- Bruk siste produkter av andre-runde isotermiske rekombinasjon reaksjonen for å transformere kompetent E. coli celler (f.eks DH5α) i henhold til standard prosedyrer27. Dobbeltsjekk positiv kolonier av kolonien PCR og DNA sekvensering. Ekstra positiv plasmider fra E. coli ved hjelp av en mini plasmider utvinning kit og lagre på-80 ° C.
Advarsel: For langtidslagring, plasmider oppløst i TE buffer eller double destillert H2O er mer stabile enn å holde dem i E. coli stammer.
4. Biolistic-bombardement mediert forbigående co uttrykk for flere Chimeric fluorescerende Fusion proteiner i planter
- Forberede tobakk ved-2 suspensjon celler og Arabidopsis unge planter bombardement.
- Kultur ved-2 cellene i Murashige og Skoog (MS) medium av subculturing to ganger per uke ved 25 ° C i en shaker satt til 130 rpm. Filtrere samle 30 mL 3 d kultivert ved-2 celler på et stykke av 70 mm autoklaveres filter papir via en vakuumpumpe ved å sette det tomrommet trykket til 40 mbar.
- For å hindre cellene tørker ut under følgende, legge flere dråper ved-2 celle flytende kulturelle medium i en Petriskål før du plasserer filter papir (neste trinn).
- Overføre filter papir med BY-2 celler på den til en ny Petriskål (85 mm x 15 mm).
- Overflaten sterilisere Arabidopsis thaliana (Col-0) frø av vortexing en blanding med 70% (v/v) etanol 0,05 prosent mellom 20 for 10 min.
- Nedspinning frøene med en benk toppen sentrifuge på maks fart for 2 s, fjerne nedbryting og vask frøene med 100% etanol gang for 30 s. Pipette ut frøene til en ny sterilt filter papir i sterilt hette. Deretter air-dry frø og spre dem på ½ MS agar plater.
- Oppbevare platene på 4 ° C for 48 timer før overfører dem til en plante vekst kammer med følgende innstillinger: 16 h lys 8t mørk med 120-150 µm m-2 s-1 intensitet, 22 ° C.
- Overføre 7 - dagers gammel eksempel planter i en 30 mm diameter sirkel i midten av en ny ½ MS middels plate for å effektivisere bombardement.
Forsiktig: Unngå overlappende plantene når overføring og plassere dem på den nye ½ MS-platen. - Legge til flere dråper ½ MS flytende medium på overflaten av planter eller vev å bevare fuktighet og hindre uttørking planter ut under følgende.
- Coat gull partikler med plasmider DNA.
- Vortex gull microcarrier løsning grundig, for 3 min. forberede en ny 1,5 mL tube.
- Fortløpende legge følgende løsninger i rør og vortex: 25 µL (1.5 mg) gull partikler, vortex 10 s; 10 µL av 25.46 mg/L spermidine, vortex 10 s; 5 µL av 1µg/µL plasmider DNA, vortex 3 min; 25 µL av 277.5 mg/L CaCl2 løsning, vortex 1 min.
Advarsel: Holde vortexing under dette trinnet. - Nedspinning gull microcarriers med en benk toppen sentrifuge på maks fart for 5 s og nøye pipette ut nedbryting uten å forstyrre pellet. Vask med 200 µL av absolutt etanol og å suspendere pellet av vortex for 5-10 s. spinn ned på maks fart for 5 s og fjern etanol.
- Nytt avbryte gull partikler 18 µL absolutt etanol og aliquot 6 µL partikler suspensjon på midten av tre macrocarriers. La dem lufttørke.
- Overføre DNA i planter via partikkel bombardement.
- Angi partikkel leveringssystemet som følgende: 1100 psi, 28 mm Hg vakuum, 1 cm gapet avstand og 9 cm partikkel flight avstand.
- Bombardere celler/planter på agar middels plate for tre ganger på tre forskjellige posisjoner og deretter holde celler og planter i mørket umiddelbart etter bombingen.
Forsiktig: Bruk vernebriller når partikkel leveringssystemet på grunn av tilknytningen av høytrykks gass og høyhastighets partikler systemet.
- Holde bombet celler og planter i mørket i anlegget vekst kammer for 6 til 72 timer før observasjon av fluorescerende signaler. Angi anlegget vekst kammer til 24 h mørke og 22 ° C.
Advarsel: Uttrykk effektivitet og fluorescerende signal intensitet er arrangøren, gene og anlegg/vev-avhengige.
5. generasjon stabil transgene Arabidopsis co uttrykke flere Chimeric fluorescerende proteiner av Agrobacterium-mediert transformasjon.
- Tine Agrobacterium kompetent cellene (PMP90) på is venter 30 min, og legger 2 µL binære vektor (100-200 ng) (forberedt ovenfor) inn i kompetent cellene. Sitte blandingen på is 10 min.
- Overføre blandingen til pre kjølt 0,1 cm electroporation søppel. Cuvette inn electroporation systemet og utføre electroporation med følgende innstillinger: 1.6 kV, 600 ohm, 25 µF.
- Legg 1 mL av SOC flytende medium til cuvette umiddelbart etter electroporation Pipetter cellene i en ny 1,5 mL tube og ruge på 28 ° C i en horisontal orbital shaker på 200 rpm for 120 min.
- Sentrifuge cellene på 2,348 x g ved romtemperatur for 5 min, forkaste fleste nedbryting av, forsiktig å suspendere pelleted cellene med Pipetter tips, spre dem på en LB plate inneholder 50 mg/L Hygromycin B og ruge på 28 ° C i 2-3 dager.
- Transformere Arabidopsis thaliana Col-0 planter med den Agrobacterium, som inneholder binære vektor pCAMBIA1300 integrert med flere protein uttrykk kassetter, av floral dukkert28 metoden som beskrevet tidligere å generere stabil transgene planter.
- Sterilisere overflaten av transgene Arabidopsis frø ved å blande dem med 70% (v/v) etanol 0,05 prosent mellom 20. Vortex for 10 min. spinn ned frøene med en benk toppen sentrifuge på maks fart for 2 s, fjerne nedbryting, og vask frøene med 100% etanol gang for 30 s.
- Pipetter ut frøene til et sterilt filter papir i sterilt hette. Deretter lufttørke og spre dem på ½ MS agar plater som inneholder Hygromycin B for screening positiv progenies.
- Inkuber platene på 4 ° C i 2 dager. Deretter overføre dem inn i anlegget vekst kammer og kultur i 7 dager.
- Velg 7 - dagers gammel overlevelse juvenile planter ved å søke etter fluorescerende signaler under fluorescerende mikroskopet og overføre planter til jord for ytterligere screening av homozygous planter.
6. farmasøytiske behandlinger
- For farmasøytiske behandlinger, fortynne rusmiddel i flytende MS medium til de aktuelle arbeider konsentrasjonene før inkubasjon med celler eller planter.
- Wortmannin behandling: forberede 1 mM lager løsninger av wortmannin ved å løse opp wortmannin pulver i DMSO og lagre bestandene på 20 ° C. Overføre anlegget celler eller unge planter til flytende MS medium som inneholder 16,5 µM wortmammin og ruge i 30-45 minutter før bildebehandling.
- Brefeldin A (Uteksaminert) behandling: forberede 1 mM lager løsninger av Uteksaminert ved oppløsning Uteksaminert pulver i DMSO og lagre bestandene på 20 ° C. Overføre anlegget celler eller unge planter til flytende MS medium som inneholder 10 µg/mL Uteksaminert i 30-45 minutter før bildebehandling.
7. AC confocal mikroskop bildebehandling og Protein Subcellular co lokalisering analyse
- Overføre juvenile planter eller suspensjon cellene til en konvensjonell objektglass og forsiktig plassere et dekke lysbilde på toppen for bildebehandling ved bruk av standard AC confocal laser mikroskopi. Bruk følgende innstillinger: 63 X vann mål (N.A 1.4), 0 bakgrunn, 700 gevinst, 0.168 mm pikselstørrelsen og photomultiplier rør detektor. Opphisse GFP-merket proteiner på 485 nm og oppdage fluorescens på 525 nm. For RFP-merket proteiner, opphisse på 514 nm og oppdage på 575 nm.
- Beregne co lokalisering forholdet mellom fluorescerende signaler ved hjelp av Image J programvare (https://imagej.nih.gov/ij/) med den Pearson-Spearman sammenheng (PSC) co lokaliseringen plug-in som beskrevet tidligere8. Pearson korrelasjonskoeffisienter eller Spearmans rang korrelasjonskoeffisienter vises i resultatene (Figur 4). Produsert r-verdiene vil være fra -1 til 1. 0 viser ingen synlig sammenheng av to signaler, mens 1 og -1 viser full positiv og negativ sammenheng, henholdsvis av to signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har utviklet en robust og svært effektiv metode for co uttrykk for flere chimeric fluorescerende fusion proteiner i planter. Det bryter gjennom barrierene av den konvensjonelle tilnærminger bruke flere atskilt plasmider for protein co uttrykk, som vist i figur 1A, B, via forbigående uttrykk eller stabil genetisk transformasjon. I denne nye metoden generere vi en enkelt utrykk vektor som består av flere protein uttrykk kassetter å oppnå protein co uttrykk samtidig (figur 1 cD). De protein uttrykk kassett funksjonene semi independently med egne nødvendige DNA elementer protein uttrykk. Derfor kan hver protein uttrykk kassett tilpasses uavhengig etter ulike krav til protein uttrykk. Som for den endelige protein co uttrykk vektoren fungere protein uttrykk kassettene i den som grunnleggende "Lego" elementer som kan endres, re-bygget. og igjen plassert beleilig. Videre oppnås bare en alternativ strategi for DNA molekylet montering, kobling mellom flere protein uttrykk kassetter og integrasjon av DNA med endelige destinasjon vektoren for co uttrykk for chimeric fluorescerende fusion proteiner via en optimalisert isotermiske i vitro rekombinasjon reaksjon uten ytterligere ekstra trinn DNA fordøyelsen og interlinkage. The Arbeidsprinsipp for isotermiske i vitro rekombinasjon reaksjonen er illustrert i figur 2. Koblingen av flere DNA molekyler (f.eks tre representant DNA fragmenter 1-3 vist i figur 2) og deres integrering med den endelige vektoren er enkelt og effektivt oppnådd ettrinns reaksjon (se figur 2 ). Det er tilpasset fra tidligere studier av overlappende rekombinasjon DNA molekyler mediert med overlappende korte sekvenser fusjon av DNA og bygging av plasmider25,26.
Som en test av metoden valgte vi mer sortering reseptoren (VSR) og sekretoriske carrier membran protein (SCAMP), som er to reporter proteiner deltar i protein sekretoriske og endocytose pathways, henholdsvis6,22 ,23,29,30. VSRs er type-jeg integrert membran proteiner som megle biosyntetiske protein trafikk i sekretoriske veien til vacuole og hovedsakelig regionaliserer i prevacuolar rom (PVCer) i planter6,22,23. Sekretoriske carrier membran proteiner (tøffe) er type-IV membran proteiner som deltar i fabrikken endocytic veien. Det regionaliserer plasma membran (PM) og trans-Golgi nettverk (TGNs), som fungerer som tidlig endosomes22,29,30. Vi bygget to protein uttrykk kassetter som vert de chimeric kombinasjoner av Arabidopsis VSR2 (AtVSR2) med RFP og Arabidopsis SCAMP4 (AtSCAMP4) med GFP, som vist i Figur 3. Slik RFP-AtVSR2 kan oversettes til ER er et signal peptid (SP) lagt før RFP, som tidligere rapportert6,31. To individuelle protein uttrykk kassettene er videre sammenvevd og ligate med siste protein uttrykk vektor pUC18 eller pCAMBIA1300 for protein co uttrykk enten via protein forbigående eller plante stabil transformasjon, som vist i Figur 3. AtVSR2 og AtSCAMP4 var vellykket co uttrykt i tobakk ved-2 celler via partikkel bombardement og viste riktig lokaliseringer (figur 4A). RFP-AtVSR2 viste en vises punctate mønster, som var forskjellig fra den plasma membran lokaliseringen av AtSCAMP4-GFP med noen cytosolic vises punctate prikker. Videre Arabidopsis transgene planter som co uttrykker AtSCAMP4-GFP og RFP-AtVSR2 ble generert via Agrobacterium-mediert transformasjon. Subcellular lokaliseringer av co uttrykke RFP-AtVSR2 og AtSCAMP4-GFP i rot og roten håret celler ble vist i figur 4B og 4E. Co uttrykk resultatene av RFP-AtVSR2 og AtSCAMP4-GFP fra transgene Arabidopsis var med de fra BY-2 celler. I tillegg av transgene Arabidopsis ble behandlet med wortmannin og Uteksaminert i 30 min. Wortmmanin forårsaket RFP-AtVSR2 merket PVCer danner en liten ring-lignende struktur, og Uteksaminert indusert AtSCAMP-GFP merket TGN aggregering, som vist i figur 4C , D, F, G. I tillegg kan liten autofluorescent signal påvises i tobakk ved-2 cellene og Arabidopsis rot og roten håret ved å bruke de samme innstillingene for bildesamlingen for Figur 4 (supplerende figur 1).
Figur 1: et robust system for co uttrykk for flere chimeric fluorescerende fusion proteiner i planter. (A) konvensjonelle tilnærminger av forbigående co uttrykk for flere fluorescerende reporter proteiner i planter oppnådd via electroporation, partikkel bombardement og PEG-mediert transformasjon ved å blande flere uavhengige uttrykk vektorer. (B) det tradisjonelle metoden for plante genetisk transformasjon av Agrobacterium med en enkelt fluorescerende fusion protein uttrykk vektor. For å uttrykke co flere chimeric fluorescerende fusion proteiner i en transgene plante, ytterligere genetisk krysset og flere runder med screening er nødvendig for å få homozygous progenies. (C) og (D) den alternative nye protein co uttrykk metoden. Det drar nytte av en enkelt utrykk vektor, som består av flere protein uttrykk kassetter og kunne uttrykke co flere chimeric fluorescerende reporter proteiner i planter via både forbigående uttrykk og genetisk transformasjon. Detaljer om dette tallet ble første gang publisert i Zhong et al. 201736 (gjengitt med tillatelse; copyright grenser i Plant Science). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: demonstrasjon av the Arbeidsprinsipp for ettrinns DNA montering metoden av isotermiske rekombinasjon reaksjon. DNA fragmenter og lineær plasmider med overlappende sekvenser (OSs) er knyttet av base paring mellom 5'-overheng overlappende områder, utvide ved DNA polymerase og kobling av ligase. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: strategien for å bygge et enkelt plasmider for co uttrykke flere chimeric fluorescerende fusion proteiner. Diagrammet viser strategien for å bygge et enkelt utrykk plasmider for co uttrykk for flere chimeric fluorescerende fusion proteiner for forbigående uttrykk eller stabil transformasjon i planter. Uttrykket vektoren består av to protein uttrykk kassetter, hver inneholder egne nødvendige elementer protein uttrykk og funksjoner i å uttrykke sin personlige chimeric fluorescerende fusion protein semi independently. Montering og Interlinkage av alle DNA molekyler enkelt oppnås ved en optimalisert isotermiske i vitro rekombinasjon metode mediert med overlappende DNA fragmenter. Detaljer om dette tallet ble første gang publisert i Zhong et al. 201736 (gjengitt med tillatelse; copyright grenser i Plant Science). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representant bilder av co uttrykk for chimeric fluorescerende blanding av VSR og SCAMP i anlegget celler.
(A) co uttrykk av RFP-AtVSR2 og AtSCAMP4-GFP via partikkel bombardement i tobakk ved-2 suspensjon celler. (B) et representativt bilde av en transgene Arabidopsis rot celle co uttrykke RFP-AtVSR2 og AtSCAMP4-GFP. (C) og (D) transgene Arabidopsis røtter co uttrykke RFP-AtVSR2 og AtSCAMP4-GFP ble behandlet med wortmannin og Uteksaminert i 30 min henholdsvis. (E) et representativt bilde av en transgene Arabidopsis rot hår co uttrykke RFP-AtVSR2 og AtSCAMP4-GFP. (F) og (G) transgene Arabidopsis rothår co uttrykke RFP-AtVSR2 og AtSCAMP4-GFP ble behandlet med wortmannin og Uteksaminert i 30 min. pilene i (D) og (G) angi Uteksaminert-indusert protein aggregering. rp = Pearson korrelasjonskoeffisient; rs = Spearmans rang korrelasjon. Skala bar i (A)-(D) er 50 µm, (E)-(G) er 30 µm. detaljer om dette tallet ble første gang publisert i Zhong et al. 201736 (gjengitt med tillatelse; copyright grenser i Plant Science). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Uttrykket kassett 1 | ||
| 1-FP35S | GAATTCGAGCTCGGTACCC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 1-RP35S | AGGACGCGGGCGTGGGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 1-FRFP | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCCCACGCCCGCGTCCT | |
| 1-RRFP | ATTATCCATATCACTCCCCA GGCGCCGGTGGAGTGGCGGC | |
| 1-FAtVSR2 | GCCGCCACTCCACCGGCGCC TGGGGAGTGATATGGATAAT | |
| 1-RAtVSR2 | AAATGTTTGAACGATCGGGA TTACAACTCTAGTTGAGAAG | |
| 1-FNOS | CTTCTCAACTAGAGTTGTAA TCCCGATCGTTCAAACATTT | |
| 1-RNOS | GAGAATGGATGCGAGTAATG TCTAGTAACATAGATGACAC | |
| Uttrykket kassett 2 | ||
| 2-FP35S | CATTACTCGCATCCATTCTC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 2-RP35S | TTAGGATCGTGTCGTGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 2-FAtSCAMP4 | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCACGACACGATCCTAA | |
| 2-RAtSCAMP4 | TCCTCGCCCTTGCTCACCAT TAGTGCACGCATCAAGGTCG | |
| 2-FGFP | CGACCTTGATGCGTGCACTA ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA | |
| 2-RGFP | TAAAACCAAAATCCAGTGAC TTACTTGTACAGCTCGTCCA | |
| 2-FT35S | TGGACGAGCTGTACAAGTAA GTCACTGGATTTTGGTTTTA | |
| 2-RT35S | GTCGACTCTAGAGGATCCCC GTCCGCAAAAATCACCAGTC | |
Tabell 1: strategi for utforming av Primer og sekvenser som er brukt i denne studien. Navnet på hver primer er gitt på venstre panel. Utfyllende overlappende sekvenser av primerne understrekes. Detaljene for denne tabellen ble første gang publisert i Zhong et al. 201736 (gjengitt med tillatelse; copyright grenser i Plant Science).
Ekstra figur 1: representant bilder av autofluorescence i BY-2 celler og Arabidopsis røtter og rot hår. (A) autofluorescence av vill-type ved-2 celler ble oppdaget under samme imaging forhold med transformert celler. (B) og (C) Arabidopsis rot hår og rot celler ble oppdaget under samme imaging forhold med forvandlet Arabidopsis celler. Skala bar i (A)-(C) er 20 µm. DIC, differensial forstyrrelser kontrast. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi vist en ny metode for å robust co express chimeric fluorescerende fusion proteiner i planter. Den kan brukes for både forbigående uttrykk og genetisk transformasjon og er kompatibel med gjeldende fluorescerende protein-basert bio-imaging, molekylær og biokjemiske applikasjoner og teknologier9,10,13 . I tillegg overvinner det vanskelighetene av konvensjonelle metoder som bruker flere individuelle uttrykk plasmider for protein co uttrykket. Derimot benytter den en enkelt utrykk vektor som inneholder flere protein uttrykk kassetter med egne personlige arrangører, fluoriserende merker, målet proteiner og terminatorer. Videre kan protein uttrykk kassetten styres uavhengig å møte ulike uttrykk krav, slik som bruk av en bestemt promoter og N - eller C-terminalen chimeric fusjon av et fluorescerende protein med målet protein. Derfor som protein uttrykk kassett funksjoner grunnleggende "Lego" element som fungerer semi uavhengig i plasmider. Videre er det også et svært allsidig system i hvilket gen redigering, erstatning, og montering alle kan enkelt oppnås ved en ettrinns isotermiske rekombinasjon reaksjon uten ekstra prosesser enzym fordøyelsen og hemorroider. Vi har optimalisert effektiviteten av isotermiske rekombinasjon reaksjonen fra tidligere studier som beskrevet i trinn 2.4, ved å teste ulike konsentrasjoner av T5 exonuclease Phusion DNA utvalg og Taq utvalg. I tillegg fragmenter konsentrasjonen av hver DNA for ettrinns isotermiske rekombinasjon reaksjonen er foreslått for å være mellom 0,05 og 0,1 pmol å oppnå maksimal ligation effektivitet.
Over-uttrykk for en transgene ved å erstatte sine endogene selskapet med en sterk og sammenhengende promoter, som ubiquitin-10 promoter (UBQ10), og presenterer flere kopier av genet er en vill brukes tilnærming til studere cellulære funksjoner og underliggende fungerende mekanisme i celler15,32. Men ble uventet ned-regulering og sterk hemming av genuttrykk noen ganger funnet samt33,34. Prosenten av uforutsigbare genet stanse varierer fra 2 til 100% under disse situasjonene33,35. Videre genet stanse har en større sjanse til å skje i uttrykket av flere gener samtidig, transformasjonen av høy kopier av DNA, og betydelig økning av gene transcriptional nivå9,33,24 ,35. For å redusere forekomsten av genet stanse i robust flere fusion protein co uttrykk systemet, valgte vi ulike aktivt arrangører å kjøre annet protein uttrykk kassettene når co uttrykke flere fusion proteiner. Videre unngikk vi stadig bruker samme arrangøren for ulike uttrykk kassetter. Dessuten, er en annen potensiell begrensning av denne protokollen redusert effektiviteten av ettrinns DNA isotermiske rekombinasjon forårsaket av et økende antall protein uttrykk kassett co uttrykk. Videre er nummeret på uttrykket kassettene som kan ligge i den endelige plasmider hovedsakelig avhengig av replicon av ryggraden plasmider24,25,35.
Sammen har vi utviklet et kraftig system for co uttrykke flere chimeric fluorescerende fusion proteiner beleilig i planter36. Det løser begrensningene for den klassiske metodene og benytter en optimalisert ettrinns DNA montering reaksjon DNA interlinkage og plasmider bygging på hevdvunne måte. Denne tekniske fremskritt har blitt godkjent av AtVSR2 og AtSCAMP4 co uttrykk i anlegget celler via både forbigående uttrykk og genetisk transformasjon. Derfor viser en overbevisende og romanen metode for ulike aspekter av vitenskapelige oppdagelser av co uttrykk chimeric fluorescerende fusion proteiner i planter. I tillegg konseptet og prinsippet om co uttrykk for flere chimeric fluorescerende fusion proteiner via en enkelt utrykk vektor er kompatible med CRISPR-Cas9, RNAi og protein over uttrykk teknologier å studere funksjonene og samhandling av flere gener i planter37,38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker medlemmene av Wang laboratorium for nyttig diskusjoner og kommentarer. Dette arbeidet er støttet av National Natural Science Foundation av Kina (NSFC, grant nr. 31570001) og Natural Science Foundation av Guangdong-provinsen og Skopje (gi nr. 2016A030313401 og 201707010024) til HW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
References
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
- Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
- Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
- Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
- Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
- Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
- Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).
- Li, S., et al. Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean. Front Plant Sci. 8, 246 (2017).
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
- Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
- Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
- Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).
- Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
- Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
- Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
- Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
- Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
- Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
- Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
- Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
- Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
- Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
- Bruening, G. Plant gene silencing regularized. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).
- Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
- Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
- Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).
- Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
- Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
- Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).
