Summary
在这里, 我们提出了一个实验性的评估血浆凝固在体内的肝脏组织的协议。在猪模型中, 通过激光多普勒检查微循环, 用红外测温仪和红外相机对凝血深度进行组织学测量, 凝血部位温度, 并通过爆裂压力记录管道密封效果。实验。
Abstract
血浆凝固作为一种烙的形式, 用于肝脏手术数十年, 以封闭大肝切除术后, 主要切除后, 以防止出血的后期阶段。血浆凝固对肝脏组织的确切的作用只被检查的很少。在我们的猪模型中, 凝血作用可以接近临床应用。联合激光多普勒流量计和分光光度计文件在8毫米组织深度无创性凝血过程中微循环的变化, 提供了超出主观临床印象的可量化的止血信息。在凝固过程中, 用红外线温度计对凝血部位的温度进行评估, 在凝固期间用红外相机测量气体束温度, 因为器件的上阈值是不可能的。用目标测微仪标定后的苏木精/红/红染色切片, 对凝固深度进行了显微测量, 并给出了功率设定-凝固深度关系的准确信息。在胆管上检查密封效果, 因为血浆凝固无法封堵较大的血管。对说明器官进行了爆裂压力实验, 排除了血压的相关影响。
Introduction
氩离子凝固 (APC) 是腹部手术中广泛使用的仪器, 三年来1、2。通过封堵肝切口表面, 防止术后出血3, 是大鼠肝切除术后继发止血的标准技术。等离子凝固是射频烙的一种特殊形式, 通过电离气体电弧传递电能。提供单电热止血, 这种非接触技术具有防止电极黏附在组织4的优势。电离气体光束被自动定向到最低电阻的区域, 当电阻上升时, 由于干燥到其他尚未干燥的区域, 就会被转走。这产生一个统一的有限深度的凝固5,6。影响凝血效果的因素有活化时间、凝固装置的功率设置以及探针与组织的距离。氦是另一种载体气体, 可用于等离子凝固7。最近的临床研究集中在临床结果, 而不是组织学和功能发现3,8,9, 而实验研究集中在体外调查10或实验在分离的被灌注的器官11。
基础协议允许研究在接近于临床应用的大型动物模型中的血浆凝固作用在猪附近使用标准人的设备: 微循环由激光多普勒流量计无创性评估和分光光度计, 这是一个标准的临床工具为这个征兆12,13。凝固过程中的温度变化用红外线温度计和红外相机进行监测。在采集组织样品后, 测定组织学上的苏木素/伊红染色切片的凝固深度。为与其他二次止血方法进行比较, 进行了爆破压力实验。与以前描述的技术14相比, 这些都是在说明器官上进行的, 以排除血压相关的影响。除了所述的对血浆凝固局部效应的研究外, 还可以在猪模型中进行标准血液检测。
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Protocol
遵循德国法律的动物研究法规以及实验动物保育原则 (国立卫生研究院出版版 8, 2011)。官方许可来自政府动物护理办公室 (Landesamt Natur, Umwelt 和 Verbraucherschutz Nordrhein, Westfalen, 德国)。
1. 动物
- 使用雌性德国长白猪 (重25-30 公斤) 存放在开放的笼子里。
- 每组使用5只动物 (氩和氦)。
- 允许动物在实验前至少一周适应环境。快速动物为 24 h 在手术之前以自由地获得水。
2. 麻醉
- Premedicate 的动物肌肉注射氯胺酮 (15 毫克/千克体重 [体重]), 甲苯噻嗪 (10 毫克/千克体重), 和阿托品 (0.1 毫克/千克体重) 10 分钟前诱导麻醉。
- 通过将22口径套管放置到耳静脉中, 可建立外周静脉通路。
- 静脉注射丙泊酚2毫克/千克体重诱发全麻。
- 将动物置于仰卧位, 在颈静脉沟内进行纵向皮肤切口, 长度为2厘米. 通过钝性的皮下组织的制备找到静脉。插入套管, 然后 Seldinger 导线。
- 缩回套管并插入14法郎导管在导丝上。退刀导丝。将导管连接到延伸处, 用皮带或缝合固定导管。
- 拔掉舌头, 插入直喉镜。使用喉镜的尖端拉下会厌。用声带插入管子。把袖口放在声门下, 充气。
- 通风与40% 氧气在20-26 呼吸/分钟和潮汐容量10毫升/公斤保持末端潮汐部分二氧化碳紧张在36和42毫米汞之间。
- 用异氟醚保持麻醉, 浓度为 1-1. 5%, 芬太尼浓度为3-4 µg/千克/小时。
- 以4毫升/千克/小时的初始速率供应响铃的乳酸溶液, 在剖腹手术后增加8毫升/公斤/小时的恒定输液率。
3. 手术和血浆凝固
- 将动物置于仰卧位, 放置在标准手术台上。
- 使用标准的外科消毒剂 (2 丙醇45克/100 克, 1 丙醇10克/100g, Biphenyl-2-ol 0.2 克/100 克) 消毒皮肤, 用手术拭子治疗3次。
- 用手术刀进行宽中线剖腹手术, 从剑突过程到耻骨, 并安装手术拉钩。
- 开关在等离子凝固装置, 打开氩或氦气瓶, 取决于使用的载体气体。将气体流量调整到3升/分. 选择混凝设备输出功率根据需要。
注: 惰性气体、氩气或氦均可用于等离子凝固。凝固作用是可比较的。有关详细信息, 请参阅参考资料7 。 - 在左肝叶上进行血浆凝固, 如前所述7。使用钛模 (方形孔径 1 x 1 厘米2) 来规范凝固区。凝聚为 5 s 与探针距离 1 cm。不同电源设置的 coagulations 可以并排执行, coagulations 之间的距离为5毫米 (图 1)。
- 为了收割肝脏, 将所有韧带的连接与肝脏分开。分离和分割上十二指肠弯曲以上的肝蒂, 留下门静脉和胆总管的长部分。将静脉的静脉分在肝脏的上方和下方, 然后取出器官。
- 在收获肝脏之后, 猪通过静脉注射管理被安乐死0.16 克/千克戊巴比妥。
- 对于爆裂压力实验, 切除一半左内侧肝叶与锋利的剪刀。等离子凝固的切割表面 (100W 输出功率) 或密封的切割表面与纤维蛋白密封剂 (图 2)。
4. 微循环测量
注: 激光多普勒光谱可以通过测量红细胞运动引起的多普勒移位来确定组织中的血流。激光信号与运动红细胞数目有关。激光多普勒技术是临床应用 (如移植医学), 并已验证了多次15。
- 开关激光多普勒流量计和分光光度计。使用平面探头。
- 对流速和流速进行基线测量。保存或记下值。
- 按照3.5 的描述进行凝固。
- 将平探头放在凝固部位, 测量流速和流速。再次保存或记下值。
- 对凝固设备的所有电源设置重复。
5. 测温
- 切换系统 (红外相机、笔记本和红外线温度计), 并让它在执行测量之前至少运行1小时。
- 调整焦点和视图框架在红外相机上凝固地点。红外序列可以检测到的空间分辨率为 1024年 x 768 像素, 温度分辨率大于 20 mK。考虑到, 凝血区和周围组织--受传热影响--位于视图中间。
注意: 它应该包含尽可能多的帧像素, 以实现最佳的空间分辨率。 - 用红外相机在2分钟的时间内用等离子凝固在肝脏表面记录凝固过程。
- 用热像分析软件分析图像序列: 定义感兴趣的区域。
注: 软件计算随时间推移的相应平均温度的过程。
6. 混凝深度测量
- 用锋利的剪刀收割左内侧肝叶。
- 用1厘米厚的凝固部位进行消费。切成3毫米厚的纵段进行进一步加工。
- 用中性10% 缓冲福尔马林固定4摄氏度的组织样本。热石蜡2°c 在熔点和嵌入切片。进程过夜。
- 执行苏木精/伊红染色。
- Deparaffinize 和水合组织随后浸泡在2x 二甲苯, 100% 乙醇 (乙醇), 95% 乙醇, 70% 乙醇, 去离子 H2O 为2分钟每。
- 用迈耶的苏木精溶液染色组织样品3分钟。
- 现在用自来水冲洗5分钟。
- 用3分钟的伊红溶液染色组织。
- 冲洗2x 乙醇 95%, 然后二甲苯3分钟。安装标准安装介质。
- 切换系统 (显微镜连接的摄像头, 成像软件)。查看所有具有40X 放大倍数的部分。
- 在放大40X 的情况下, 取一个物体千分尺的图像。在 "目标" 窗口中按 "重新校准" 按钮。选择手动校准。在100µm 的千分尺图像上画一条线. 在对话框中输入01毫米, 然后按 "确定"。
- 在 "视图" > "分析控件" > "注释和测量" 窗口中选择 "长度"。测量从肝脏表面到凝固边缘与老鼠。导出或记下结果。对同一张幻灯片上的另一个位置重复测量。
注: 凝血深度可以很容易地与正常肝组织的区别, 由正常肝脏线和坏死区之间的明显缩小细胞质, 固缩核, 出血区。 - 计算两个测量值的平均值。
7. 爆破压力测量
- 切换系统 (自动泵, 压力表)。根据步骤3.7 准备肝脏标本。
注: 使用两个并联泵通过3路旋塞阀连接。单泵不能获得1500毫米汞的最大压力。 - 用剪刀将门静脉、普通肝动脉和胆管隔离在触觉蒂内。钳门静脉与 overholt 钳和结扎 monofil 缝合4-0。钳共肝动脉 overholt 钳和结扎 monofil 缝合4-0。
- 将 Ch-16 导管插入胆总管, 结扎2-0 丝缝合。将导管连接到自动泵, 安装3路旋塞阀与压力表 (图 3)。
- 用生理盐水填满灌注注射器。
- 启动自动泵, 交货率为99毫升/小时。
- 监测肝切口表面和压力表的渗漏和记录爆裂压力。
注: 为便于识别泄漏, 专利蓝可以添加到生理盐水 (2 毫升专利蓝 + 18 毫升生理盐水)。通过注意压力表压力损失时间, 可以更容易地观察爆破压力。
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Representative Results
微循环:通过对血浆凝固后止血的诊断装置, 可以通过微循环的改变来证明。毛细管血流 (显示为任意单位 (AU)) 从基线值减少 142.7, 76.08 au 到 57.78, 49.57 au 在 25 w 设备输出功率, 48.5 @ 7.26 au 在 50 w 和 5.04 @ 1.31 au 在 100 w (图 4)。
温度:用红外相机测量凝固部位的温度 (图 5)。唯一无意义的温度变化是用红外线温度计记录下来的。它显示的基线温度为 32.42, 2.27 ° C。25 W 凝固后, 温度为 33.33 1.81 摄氏度。凝固与 50 W 激光产生的温度为 31.17, 2.13 ° C。凝固后, 最大功率设置为 100 W, 温度主要不变, 30.17 3.19 ° C (图 6)。
凝固深度:血浆凝固形成一个浅区的坏死, 可以很容易地区别于正常肝实质 (图 7)。坏死深度可以测量在多个部分和显示不完全线性增加与上升的力量水平的血浆凝固。氦等离子凝固后, 凝固深度为 230.2 57.83µm, 在 25W, 314.6 87.39 µm 50 W, 292.2 @ 45.65 µm 75W 和 412.9 @ 160.9 µm 在 100 W 设备输出功率 (图 8)。该装置的输出功率可以自由选择, 并与凝固深度7呈正相关。
爆裂压力:在说明左内侧肝叶切口表面进行的爆裂压力测量显示氦 (1254±578.7 mmHg) 或氩 (1003 554.4 mmHg) 血浆凝固后无差异 (图 9)。与纤维蛋白密封剂相比, 爆裂压力低7 , 但似乎适合临床使用。
图 1: 氩离子凝固后左内侧肝叶.八个凝血点在左内侧肝叶 (从左上至下右:10 w, 15 w, 20 W, 25 w, 30 w, 50 w, 75 w, 100 w)。凝固程度与模具标准化。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 制备用于爆裂压力测量的肝移植物.一半肝叶切除, 肝切除表面用纤维蛋白密封剂密封。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 用于爆破压力测量的设备.全自动泵 (注射器灌满生理盐水) 和压力表通过3路旋塞阀连接。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 微循环变化.在 25 w、50 w 和 100 w 设备输出功率 (n=3-6) 的氩等离子凝固前后, 血流量 (显示为任意单位) 的变化。* = P< 0.05, 1 路方差分析。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 用红外相机测量凝固部位的温度.在氦等离子凝固与40W 设备输出功率的红外相机的模范图片。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 用红外线温度计测量凝固部位的温度.凝固部位的温度用红外线温度计测量氩离子凝固前后 (n=3-6)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: 氦等离子凝固后浅表坏死区.苏木精/伊红染色肝切片40X 倍。坏死区表现为肝细胞脊髓结构的丧失、细胞质萎缩和出血区的细胞。箭头指示两个不同位置的凝固深度。请单击此处查看此图的较大版本.
图 8: 氦等离子凝固后的凝固深度.凝固深度在不同的功率水平 (25W, 50W, 75W 和 100W, n=6)。* = p< 0.05, ** = p< 0.001, 1 路方差分析。请单击此处查看此图的较大版本.
图 9: 爆裂压力.在氩或氦等离子凝固后, 肝脏切口表面的爆裂压力测量。请单击此处查看此图的较大版本.
图 10: 血液测试结果.临床生物化学和血气结果的选定参数在氩离子凝固前和之后显示。没有发生明显的变化, 表明血浆凝固的影响被限制在凝固部位的局部变化。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
肝脏手术的啮齿动物模型建立了很长时间16。然而, 大型动物模型提供了一定的优势: 不需要显微外科设备作为人体标准手术设备, 手术技术可与临床使用相媲美, 标准的临床评价方法可以转移到实验。例如, 标准的临床血液测试可以进行, 而不需要特殊的实验室测试方法 (图 10)。
猪是适当的实验动物为心肺研究作为他们的生理相似人17。猪是实验性肝外科的标准实验动物之一, 由于其大小、节段结构和组织学的相似性,18。在猪模型中, 由于对人体生理的相似性和标准临床设备的评价, 对血浆凝固进行了评估7。与外科技术相比, anesthesiologic 管理不能轻易地推断出来。特别是气道管理可能是困难的17。从门牙到声门的距离是很长的, 解剖是不同的人使气管插管困难的没有经验的研究员。此外, 在猪体内, 面罩通气几乎是不可能的, 因此应存在抢救策略 (如气管切开)。
为了达到血浆凝固的可比结果, 研究者应严格注意规范探针距离和凝固时间。虽然保持探头距离相对容易, 但是秒表可以用来计算5的凝固时间。本文以肝表面等离子凝固技术为基础, 对血浆凝固在体内7的作用进行了基本的研究。以上描述的猪麻醉、手术和血浆凝固技术也可用于检查肝切除术, 并比较不同的切口表面封堵技术。
激光多普勒流量计和微循环测量分光光度计是一种标准的临床工具19 , 对直接对器官实质循环的评价具有十分重要的意义。用非 invasivity 的优势计算血流量和血流速度值。微循环参数只是凝血效应的间接测量指标, 因此多普勒测量应与一个客观的凝血参数相关。在实验中, 我们用组织学凝固深度进行相关性。
温度测量的缺点是由于等离子光束的温度高于两个器件的上阈值, 所以在凝固过程中无法测量等离子光束的温度。红外线温度计是很容易应用, 而红外相机设置更复杂, 但提供更精确的数据。凝固前的基线温度低于预期 (猪体温 ~ 38.5 摄氏度 C17), 表明剖腹手术对体温的破坏性影响。凝固过程中和后的温度不会增加, 表明肝脏的良好灌注。这种热窃取的效果的肝脏是已知的射频消融20。在胆管系统上, 而不是在肝血管上进行了爆裂压力管理, 原因很简单: 血浆 coagulators (如纤维蛋白密封剂) 无法密封较大的血管。两种二次止血方法均封堵切除器官的切口表面, 而较大的血管在切除过程中结扎。与所报告的技术14相比, 我们的爆裂压力实验略有改进。为了组织的原因, 我们测量了说明器官的爆裂压力。这些规定了血压相关的影响, 比使用灌注或体内器官更容易应用。因此, 压力实验的价值可能与灌注/体内测量不同, 因为肝结构改变 (通常说明器官的压力较高)。以上描述的爆裂压力技术也可以在体内进行。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者没有确认。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine 20 mg/mL | Vetoquinol GmbH | Xylapan | |
| Ketamine 100 mg/mL | Ceva GmbH | Ceva Ketamine Injection | |
| Atropine 100 mg / 10 mL | Dr. Franz Köhler Chemie GmbH | Atropinsulfat Köhler 100mg Amp. | |
| Propofol | Fresenius Kabi GmbH | Propofol 1% MCT Fresenius | |
| Fentanyl | KG Rotexmedica GmbH | Fentanyl 0,5mg Rotexmedica | |
| Isoflurane | Abbot GmbH | Forene 100% (V/V) 250 mL | |
| Ringer's lactate solution | Baxter Deutschland GmbH | sodium 131mmol/l, potassium 5 mmol/l, calcium 2 mmol/l, cloride 111 mmol/l, lactate 29 mmol/l | |
| Surgical disinfactant | Schülke & Mayr GmbH | Kodan Tinktur forte gefärbt 1l 104804 | |
| Motorized microscope | Nikon Instruments Europe | Eclipse TE2000-E | |
| Microscope camera | Nikon Instruments Europe | Digitalsight DS-Qi1Mc | |
| Imaging software | Nikon Instruments Europe | NIS elements Vers. 4.40 | |
| Plasma coagulator | Söring GmbH | CPC-1000 | |
| Argon gas | Linde AG | Argon 4.8 | |
| Helium gas | Linde AG | Helium 4.8 | |
| O2C | LEA Medizintechnik GmbH | O2C Version 1212 | with LF-2 or LF-3 probe |
| Infrared thermometer | Voltcraft | VOLTCRAFT IR 260-8S | |
| Thermographic camera | InfraTec GmbH | VarioCAM HD head 820 | |
| Thermographic analysis software | InfraTec GmbH | IRBIS 3 | |
| Mayer's Hematoxylin solution | Merck 1.09249 | ||
| Eosin solution | VWR International GmbH | Merck 1.09844 | |
| Rollerpump Masterflex L/S easy Load | Cole-Parmer Instrument Company | model 7518-10 | |
| Perfusorpump | B. Braun Melsungen AG | Perfusor secura FT | |
| Digital pressure meter | Greisinger electronic | GMH 3161 | |
| Perfusorsyringe, 50 mL | B. Braun Melsungen AG | REF 8728810 F | |
| Perfusor line, Type IV Standard, PVC Luer lock | B. Braun Melsungen AG | REF 8722960 | |
| 3-Way stopcock, Dicofix C35C | B. Braun Melsungen AG | REF 16494 C | |
| Silk 2-0. 3 metric | Resorba | REF H5F | |
| Vicryl 4-0 Sutupak | Ethicon | V1224H | |
| NaCl 0.9 % | B. Braun Melsungen AG |
References
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