Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

सिलवाया विविधता के साथ सिंथेटिक फेज प्रदर्शित फैब पुस्तकालय का निर्माण

Published: May 1, 2018 doi: 10.3791/57357
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 1,2,3, 1, 1
1Laboratory of Antibody Engineering, Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University, 2Banting and Best Department of Medical Research, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 3Department of Molecular Genetics, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक विस्तृत प्रक्रिया के निर्माण के लिए एक फेज-प्रदर्शित सिंथेटिक एंटीबॉडी पुस्तकालय सिलवाया विविधता के साथ । सिंथेटिक एंटीबॉडी बुनियादी अनुसंधान से रोग निदान और चिकित्सकीय के लिए व्यापक अनुप्रयोगों है ।

Abstract

बुनियादी अनुसंधान और चिकित्सा में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) की मांग वार्षिक वृद्धि हो रही है । Hybridoma प्रौद्योगिकी १९७५ में अपनी पहली रिपोर्ट के बाद से मॉब विकास के लिए प्रमुख विधि रही है । एक वैकल्पिक प्रौद्योगिकी के रूप में, मॉब विकास के लिए फेज प्रदर्शन तरीकों हुम्रा के बाद से तेजी से आकर्षक हैं, पहली फेज-व्युत्पंन एंटीबॉडी और सबसे बेच mAbs में से एक, २००२ में रुमेटी गठिया के नैदानिक उपचार के लिए अनुमोदित किया गया था । एक गैर पशु आधारित मॉब विकास प्रौद्योगिकी के रूप में, फेज प्रदर्शन प्रतिजन immunogenicity, humanization, और पशुओं के रखरखाव कि पारंपरिक hybridoma प्रौद्योगिकी आधारित एंटीबॉडी विकास से आवश्यक है बाईपास । इस प्रोटोकॉल में, हम 109-1010 एक एकल electroporation के साथ प्राप्य के विचलन के साथ सिंथेटिक फेज-प्रदर्शित फैब पुस्तकालयों के निर्माण के लिए एक विधि का वर्णन । इस प्रोटोकॉल के होते हैं: 1) उच्च दक्षता इलेक्ट्रो-सक्षम सेल तैयारी; 2) uracil की निकासी-युक्त एकल-असहाय डीएनए (dU-ssDNA); 3) Kunkel की विधि आधारित oligonucleotide-निदेशित mutagenesis; 4) electroporation और पुस्तकालय के आकार की गणना; 5) प्रोटीन A/एल आधारित एंजाइम-तह और कार्यात्मक विविधता मूल्यांकन के लिए immunosorbent परख (एलिसा) से जुड़े; और 6) विविधता के डीएनए अनुक्रम विश्लेषण ।

Introduction

mAbs बुनियादी अनुसंधान से रोग निदान और चिकित्सकीय को लेकर व्यापक आवेदन किया है । २०१६ के रूप में, ६० से अधिक mAbs संयुक्त राज्य अमेरिका खाद्य एवं औषधि प्रशासन (USFDA) द्वारा स्व-प्रतिरक्षित रोग, कैंसर, और संक्रामक रोगों के नैदानिक उपचार के लिए1,2अनुमोदित किया गया है ।

१९७५ में, कोल और Milstein एक सेलुलर स्रोत से एक एकल क्लोनिंग के एंटीबॉडी की सतत पीढ़ी के लिए एक तकनीक की सूचना के रूप में संदर्भित करने के लिए ' hybridomas ' और इस तकनीक बाद में दवा और उद्योग 3 में एक आधारशिला बन गया है ,4. इस विधि द्वारा mAbs के उत्पादन प्रतिजन उत्पादन, माउस प्रतिरक्षण, बी लिम्फोसाइटों के निष्कर्षण, मायलोमा कोशिकाओं के साथ बी कोशिकाओं के फ्यूजन अमर hybridoma कोशिकाओं, क्लोन चयन, और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए फार्म के लिए सहित विभिन्न चरणों की आवश्यकता है, humanization मानव विरोधी माउस एंटीबॉडी (हमा)4,5से बचने के लिए आवश्यक है । हालांकि, इस तकनीक के लिए, विषाक्त पदार्थों, रोगजनकों सहित एंटीजन, और अत्यधिक संरक्षित प्रोटीन मॉब उत्पादन5के लिए vivo प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक ट्रिगर में अपेक्षाकृत अप्रभावी हैं ।

१९७८ में, हचिसन एट अल. एक oligonucleotide के उपयोग के लिए एक एकल असहाय भोजी वायरस6में एक अवशेषों के प्रत्यक्ष mutagenesis की सूचना दी । १९८५ में, स्मिथ ने बताया कि विदेशी जीन टुकड़े फ्रेम में जीन एंकोडिंग फेज कोट प्रोटीन III के साथ इनकार किया जा सकता है और इस तरह अपनी infectivity7समझौता किए बिना फेज सतह पर प्रदर्शित किया जा सकता है । इन अग्रणी काम करता है फेज के बाद के निर्माण के लिए एक नींव रखी-प्रतिरक्षा, भोली, और सिंथेटिक रूपों में एकल श्रृंखला चर टुकड़ा (scFv) और प्रतिजन के स्वरूपों के साथ प्रदर्शित एंटीबॉडी पुस्तकालयों-चिकित्सीय के लिए टुकड़ा बाइंडिंग (फैब) मॉब विकास८,९. देखने के तकनीकी बिंदु से, फेज प्रदर्शन आधारित एंटीबॉडी विकास hybridoma-आधारित मॉब विकास के लिए एक पूरक दृष्टिकोण है कि सीमाओं को दरकिनार करने में मदद कर सकते है प्रदान करता है कुछ प्रतिजनों मुद्रा और humanization प्रक्रिया कर सकते है कि hybridoma-व्युत्पंन एंटीबॉडी अक्सर5की आवश्यकता होती है । २०१६ के रूप में, 6 फेज प्रदर्शन-व्युत्पंन mAbs हुम्रा, सबसे सफल रुमेटी गठिया के उपचार के लिए इस्तेमाल mAbs में से एक सहित बाजार में अनुमोदित किया गया है, और कई फेज प्रदर्शन-व्युत्पंन एंटीबॉडी उंमीदवारों के नैदानिक के विभिंन चरणों में वर्तमान में कर रहे है जांच10.

प्रतिरक्षा और भोली फेज एंटीबॉडी पुस्तकालयों के लिए, complementarity की विविधता-प्रकाश और भारी श्रृंखला में क्षेत्रों का निर्धारण (CDRs) प्राकृतिक प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की (यानीसे व्युत्पंन है, बी कोशिकाओं से) । इसके विपरीत, सिंथेटिक फेज एंटीबॉडी पुस्तकालयों में CDRs की विविधता पूरी तरह से कृत्रिम है । पुस्तकालय निर्माण के लिए सिंथेटिक दृष्टिकोण एंटीबॉडी संरचना और समारोह11,12के यंत्रवत अध्ययन के लिए अनुक्रम विविधता और पेशकश के अवसरों के डिजाइन पर सटीक नियंत्रण प्रदान करते हैं । इसके अलावा, सिंथेटिक पुस्तकालयों के लिए ढांचे के बहाव, बड़े पैमाने पर औद्योगिक विकास11,12की सुविधा के लिए पुस्तकालय निर्माण से पहले अनुकूलित किया जा सकता है ।

१९८५ में, Kunkel एक-असहाय डीएनए (ssDNA) टेंपलेट-mutagenesis दृष्टिकोण आधारित साइट परिचय-M13 भोजी कुशलता से13में उत्परिवर्तनों का निर्देशन की सूचना दी । इस दृष्टिकोण फेज-प्रदर्शित पुस्तकालयों के निर्माण के लिए बाद में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया था । फैब CDRs में विविधता लागू करने के लिए डिज़ाइन किए गए रासायनिक संश्लेषित डीएनए oligonucleotides को एक एंटीबॉडी रीढ़ टेम्पलेट के साथ एक phagemid में शामिल किया गया है । इस प्रक्रिया में, phagemid एक uracil-युक्त ssDNA (ड्यू-ssDNA) के रूप में व्यक्त किया जाता है और oligonucleotides annealed डीएनए CDRs और टी-4 डीएनए dsDNA की उपस्थिति में डबल-कतरा डीएनए (T7) को संश्लेषित करने के लिए विस्तारित पर पोलीमरेज़ हैं । अंत में, उत्पंन डी एस-डीएनए electroporation द्वारा ई कोलाई में पेश किया जा सकता है ।

उच्च विविधता, फेज-प्रदर्शित पुस्तकालय निर्माण, इलेक्ट्रो-सक्षम कोशिकाओं के एक दो घटक मिश्रण के उच्च वोल्टेज electroporation और covalently बंद परिपत्र dsDNA (सीसीसी-dsDNA) सावधानी से तैयार किया जाना चाहिए । सिद्धू एट अल. पारंपरिक तरीकों से इलेक्ट्रो सक्षम कोशिकाओं और डीएनए की तैयारी को संशोधित किया है और बहुत सुधार पुस्तकालय विविधता14.

इस प्रोटोकॉल में, हम 109-1010 एक एकल electroporation के साथ प्राप्य के विचलन के साथ सिंथेटिक फेज-प्रदर्शित फैब पुस्तकालयों के निर्माण के लिए एक विधि का वर्णन । चित्रा 1 सहित पुस्तकालय निर्माण का अवलोकन से पता चलता है: 1) उच्च दक्षता इलेक्ट्रो-सक्षम सेल तैयारी; 2) ड्यूल-ssDNA का निष्कर्षण; 3) Kunkel की विधि आधारित oligonucleotide-निदेशित mutagenesis; 4) electroporation और पुस्तकालय के आकार की गणना; 5) प्रोटीन A/L-तह और कार्यात्मक विविधता मूल्यांकन के लिए एलिसा आधारित; और 6) विविधता के डीएनए अनुक्रम विश्लेषण । सभी एजेंट, उपभेदों और उपकरण सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं । तालिका 1 एजेंट सेटअप दिखाता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: फिल्टर बाँझ सुझाव भर में इस्तेमाल किया जाना चाहिए जब फेज से निपटने के लिए पिपेट बंदूक और आसपास के क्षेत्र के लिए संदूषण से बचने के लिए. अपूतित क्षेत्र या डाकू बैक्टीरिया और फेज प्रयोगों के साथ हैंडलिंग जब इस्तेमाल किया जाना चाहिए. फेज प्रयोग क्षेत्र को साफ किया जाना चाहिए 2% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के बाद ७०% इथेनॉल फेज संदूषण से बचने के लिए का उपयोग कर । इस प्रोटोकॉल में धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाने के लिए, प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए नए सुझावों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

1. ई. कोलाई SS320 इलेक्ट्रो-सक्षम सेल तैयारी

  1. पूर्व गर्म पौंड/tet आगर प्लेट 1 ज के लिए ३७ ° c मशीन पर (तैयार और 4 डिग्री सेल्सियस से कम 1 सप्ताह पुराने के लिए संग्रहीत) । एक zig-मेढ़ी डायरेक में पूर्व गरम पौंड पर SS320 कोशिकाओं के एक ग्लिसरॉल स्टॉक बाहर लकीर करने के लिए एक बाँझ टीका लूप या बाँझ टिप का प्रयोग करें-टेढ़ा प्लेट की सतह के साथ धीरे से tion । लगभग 12-15 घंटे के लिए रातोंरात ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन पर थाली मशीन
  2. अगले दिन, एक बाँझ टीका पाश या बाँझ टिप का उपयोग करने के लिए zig-मेढ़ी लाइन के साथ एक अच्छी तरह से अलग एकल कॉलोनी लेने के लिए और inoculate में 2YT/tet माध्यम के 10 मिलीलीटर में एक ५०-एमएल दौर नीचे ट्यूब माध्यम में लूप की सूई और संक्षेप में सरगर्मी से ।
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर चारों ओर 3-4 एच के लिए २०० rpm पर मिलाते के साथ मशीन जब तक आयुध डिपो६०० 0.4 के आसपास पर पहुंच गया है-0.8 (प्रवेश चरण वृद्धि) । मॉनिटर आयुध डिपो६०० पर 2 एच । इस अवधि के दौरान, पूर्व गर्म 5 पौंड/tet आगर प्लेट्स (तैयार और 4 डिग्री सेल्सियस से कम 1-सप्ताह पुरानी) के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस में कम से 1 ज के लिए संग्रह ।
  4. titer के साथ लैब स्टॉक से 20 μL M13KO7 हेल्पर फेज जोड़ें 1 एक्स 1013 कॉलोनी बनाने इकाई (cfu)/mL में μL १.५-एमएल ट्यूब में बाँझ 1x पंजाबियों के १८० autoclaved में १० १० गुना सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी करने के लिए ।
  5. Aliquot 4 मिलीलीटर autoclaved और तरल 2YT शीर्ष आगर 5 X 14 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूबों में, एक कमजोर पड़ने के साथ प्रत्येक ट्यूब लेबल पांचवें से दस गुना कमजोर पड़ने के नौवें करने के लिए, क्रमशः, और एक ६५ ° c मशीन में मशीन तरल राज्य में 2YT शीर्ष आगर बनाए रखने के लिए ।
  6. मिश्रण ५०० M13KO7 कमजोर पड़ने ट्यूब में लॉग चरण ई. कोलाई SS320 कोशिकाओं के μL (पांचवीं दस गुना कमजोर पड़ने को नौवीं दस गुना कमजोर पड़ने का चयन) और 5-10 मिनट के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में मशीन ।
  7. १.६ कदम की मशीन के दौरान, स्थानांतरण 2YT शीर्ष आगर चरण १.५ से कमरे के तापमान (आरटी) के लिए नीचे के बारे में 5 मिनट के लिए ठंडा करने के लिए ४२ ° c । 2YT शीर्ष आगर के तापमान का परीक्षण करने के लिए भीतरी कलाई का प्रयोग करें; इसे लिक्विड के रूप में ही रहना चाहिए । प्रत्येक इसी 2YT शीर्ष आगर ट्यूब के लिए कदम १.५ से प्रत्येक कमजोर पड़ने मिश्रण हस्तांतरण । बुलबुला पीढ़ी से बचने के लिए कई बार धीरे और संक्षेप में उल्टा मोड़ से प्रत्येक ट्यूब और मिश्रण के ढक्कन कस ।
  8. ध्यान से एक पूर्व के किनारे के साथ एक मिश्रण डालना-गर्म पौंड/tet आगर प्लेट (१.३ कदम से) और प्लेट थोड़ा तिरछा करने के लिए पूरी तरह से और समान रूप से मिश्रण के साथ थाली भरने जबकि बुलबुले की शुरूआत से परहेज । चारों ओर 5-10 मिनट के लिए आरटी पर प्लेटें रखने के लिए प्रत्येक थाली के भीतर शीर्ष आगर जमना और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2YT शीर्ष आगार प्लेटें लगभग 15-18 घंटे के लिए रात भर ।
  9. लगभग 100-200 के साथ १.८ कदम से रातोंरात विकास के बाद कमजोरियां थाली चुनें-आकार, एकल, पट्टिका टीका के लिए अच्छी तरह से अलग पट्टिका । एक हाथ का उपयोग करने के लिए एक प्रकाश स्रोत के खिलाफ आगर प्लेट पकड़, और दूसरे हाथ एक पिपेट बंदूक शीर्ष आगार में खड़ी छुरा के लिए एक लंबे बाँझ पिपेट टिप के साथ भरी हुई पकड़, और एक एकल और अच्छी तरह से अलग पट्टिका इकट्ठा ।
    1. पट्टिका के साथ अलग शीर्ष आगार के लिए थोड़ा पिपेट टिप तिरछा । पिपेट ऊपर और नीचे कई बार एक 14 मिलीलीटर दौर नीचे संस्कृति ट्यूब में पट्टिका के साथ आगर विस्थापित करने के लिए पूर्व 2YT के 1 मिलीलीटर के साथ भरी हुई////
    2. कुल में 3-5 सजीले टुकड़े लेने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ । कई सजीले टुकड़े चुनने का उद्देश्य सफल टीका सुनिश्चित करने के लिए है, एक पट्टिका के रूप में बेहोश हो सकता है और अपेक्षाकृत छोटे जब एक जीवाणु कॉलोनी के साथ तुलना में । ३७ डिग्री सेल्सियस पर २०० rpm पर मिलाते के साथ 8 घंटे के लिए सजीले टुकड़े हो जाना ।
  10. एक २५०-एमएल चकित कुप्पी में 2YT/कान/tet माध्यम की ५० मिलीलीटर में बढ़ती संस्कृति की एक ट्यूब स्थानांतरण । 12 घंटे के आसपास के लिए रातोंरात २०० rpm पर मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर हो जाना
  11. Inoculate तीन 2-L चकित कुप्पी superbroth/tet/कान मध्यम के ९०० मिलीलीटर से युक्त प्रत्येक रातोंरात संस्कृति के 5 मिलीलीटर के साथ । ३७ ° c पर मिलाते हुए के साथ मशीन २०० आरपीएम पर 6-7 के लिए एच. सी.-0.8 के आसपास६०० ।
  12. ठंडा हाथ से लगातार घूमता कोमल के साथ 5 मिनट के लिए एक बर्फ स्नान में बैक्टीरियल संस्कृति की तीन बोतल । ठंड के समाधान और उपकरणों के साथ, बर्फ पर, ठंडे कमरे में निम्नलिखित उपाय किए जाने चाहिए ।
  13. प्रत्येक कुप्पी के बाहरी गिलास को सुखाने के लिए अवशोषक ऊतक तौलिया का उपयोग करें; एक हाथ का प्रयोग करें तिरछा करने के लिए 1-एल autoclaved केंद्रापसारक पीठ पर बोतल और दूसरे हाथ से प्रत्येक के लिए एक बोतल में प्रत्येक कुप्पी से धीरे माध्यम डालना ।
  14. 10 मिनट के लिए ५,००० × g और 4 ° c पर स्पिन जीवाणु गोली करने के लिए।
  15. निंनलिखित केंद्रापसारक, धीरे supernatant एक 5-L autoclaved अपशिष्ट चोंच में खिचड़ी भाषा ।
  16. बाँझ की १०० मिलीलीटर-फ़िल्टर १.० mM HEPES, पीएच ७.४ के साथ प्रत्येक बोतल भरें, और एक autoclaved चुंबकीय हलचल बार एक बोतल को जोड़ने के लिए २०० rpm पर गोली निलंबन में सहायता । भंवर और बोतल की दीवार से पूरे गोली हर कई मिनट चुंबकीय सरगर्मी के दौरान उखाड़ फेंकना । एक बार गोली भंग है, बाँझ के एक अतिरिक्त ४०० मिलीलीटर-फ़िल्टर १.० mM HEPES, पीएच ७.४ के साथ प्रत्येक बोतल भरें ।
  17. ५,००० × g और 4 ° c 10 min. supernatant के लिए खिचड़ी भाषा, बोतल में हलचल बार बनाए रखने पर केंद्रापसारक ।
  18. दोहराएं चरण १.१६ के लिए १.१७ एक बार ।
  19. बाँझ की ५०० मिलीलीटर में प्रत्येक गोली reसस्पेंड-फ़िल्टर्ड, 10% ultrapure ग्लिसरॉल हलचल सलाखों की सहायता के साथ । भंवर और बोतल की दीवार से पूरे गोली हर कई मिनट चुंबकीय सरगर्मी के दौरान उखाड़ फेंकना ।
  20. केंद्रापसारक और १.१७ कदम में के रूप में खिचड़ी भाषा । दोहराएं चरण १.१९ एक बार । हलचल बार हटाने के लिए लंबी बांह autoclaved संदंश का प्रयोग करें ।
  21. ५,००० × g और 4 ° c 15 min. supernatant के लिए और एक पिपेट के साथ प्रत्येक केंद्रापसारक बोतल से supernatant के किसी भी शेष निशान को दूर करने के लिए पर केंद्रापसारक ।
  22. एक बोतल के लिए 10% ultrapure ग्लिसरॉल के ३.० मिलीलीटर जोड़ें और धीरे pipetting द्वारा गोली reसस्पेंड । अगले बोतल को निलंबन हस्तांतरण और दोहराने के सभी जब तक छर्रों reसस्पैंड और एक बोतल में संयुक्त कर रहे हैं । लगभग 6 उच्च केंद्रित कोशिकाओं के एमएल के आसपास 3 x 1011 cfu/एमएल के एक titer के साथ प्राप्त कर रहे हैं ।
  23. पूर्व चिल १.५-एमएल autoclaved microcentrifuge ट्यूबों और १ ९६-डिवाइडर के बिना अच्छी तरह से ट्यूब भंडारण बॉक्स-८० डिग्री सेल्सियस पर इस कदम से पहले कम से 1 ज के लिए । सेल गोली निलंबन के pipetting aliquots से पहले बर्फ पर ठंड कमरे में पूर्व ठंडा microcentrifuge ट्यूबों स्थानांतरण । एक पिपेट का प्रयोग करें aliquot ३५० सेल निलंबन के μL प्रत्येक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में ।
  24. एक फोम बॉक्स फ्लैश ठंड (3-5 मिनट) के लिए तरल नाइट्रोजन से भरा कंटेनर में aliquots स्थानांतरण ।
    1. एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के लिए तरल नाइट्रोजन के साथ फोम बॉक्स परिवहन (१.२३ कदम देखें) ।
    2. निकालें १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब भंडारण बॉक्स से-८० ° c फ्रीजर (चरण १.२३ देखें) और बर्फ पर डाल दिया ।
    3. जल्दी से एक धातु जाल का उपयोग करने के लिए तरल नाइट्रोजन से aliquots छलनी और उंहें ट्यूब भंडारण बॉक्स में जगह है । पर स्टोर-८० ° c ।
      चेतावनी: तरल नाइट्रोजन जलता है और देखभाल के लिए सुरक्षा संरक्षण के लिए लिया जाना चाहिए पैदा कर सकता है । तैयार इलेक्ट्रो सक्षम कोशिकाओं की दक्षता की जांच करने के लिए एक फैब रीढ़ phagemid का प्रयोग करें (फैब रीढ़ phagemid शेयर ultrapure (MilliQ) पानी में ४०० एनजी/µ एल) में होना चाहिए । गल 1 μg की फैब रीढ़ phagemid में 10 µ l ultrapure पानी और बर्फ पर इलेक्ट्रो-सक्षम μL के ३५० aliquot SS320, और बर्फ पर एक ०.२ सेमी गैप electroporation cuvette ।
  25. ३५० μL इलेक्ट्रो सक्षम SS320 कोशिकाओं को पिघलने के बाद 10 µ एल डीएनए में जोड़ें और मिश्रण बर्फ पर रखते हुए कई बार pipetting द्वारा मिश्रण. बुलबुले शुरू करने से बचें ।
  26. पहले electroporation में एक ५०-एमएल ट्यूब में एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में समाज के मध्यम से 15 मिलीलीटर से कम 30 मिनट के लिए गर्म । cuvette के लिए ३६० μL मिश्रण स्थानांतरण और निर्माता के निर्देशों का पालन electroporation प्रदर्शन ।
  27. तुरंत (१.२७ कदम से) पूर्व गर्म समाज मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़कर electroporation के बाद कोशिकाओं को बचाने के लिए और pipetting । मध्यम को cuvette से १२५-एमएल कुप्पी पूर्व-उष्ण समाज के 5 मिलीलीटर के साथ लोड करने के लिए स्थानांतरण ।
  28. cuvette दो बार कुल्ला, पूर्व गर्म समाज मध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ हर बार, और १२५-एमएल कुप्पी के माध्यम हस्तांतरण (१.२७ कदम देखें) । १२५ एमएल कुप्पी के लिए 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए पूर्व गर्म समाज मध्यम जोड़ें ।
  29. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए २०० rpm पर मिलाते के साथ 10 मिलीलीटर सेल संस्कृति मशीन ।
  30. अभिकर्मक दक्षता और M13KO7 पूर्व संक्रमण दर निर्धारित करने के लिए धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाओ ।
    1. एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए 2YT मीडिया के १८० μL जोड़ने के लिए एक ९६-microwell प्लेट के एकल कॉलम के प्रत्येक कुआं ।
    2. 8 दस गुना सीरियल कमजोरियां बनाओ: १.२९ कदम से संस्कृति के 20 μL स्थानांतरण प्लेट की पहली अच्छी तरह से, pipetting द्वारा मिश्रण है, और अगले अच्छी तरह से मिश्रण के 20 μL हस्तांतरण । इस कदम को धारावाहिक कमजोर पड़ने के अंत तक दोहराएं ।
    3. प्लेट 10 पौंड/carb, £/कान पर एक धारावाहिक कमजोर पड़ने के μL, और डुप्लिकेट में पौंड/tet प्लेटें ।
    4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    5. दक्षता परिकलन सूत्र: मान लें कि M औसत कॉलोनी संख्या पतला गुना 10n (n से 1-8 है) से गिना जाता है । ई. कोलाई SS320 इलेक्ट्रो-सक्षम सेल अभिकर्मक से फैब रीढ़ phagemid की क्षमता पौंड/carb थाली के बराबर है M X 10N + 3 cfu/µ जी । M13KO7 पूर्व संक्रमण दर पौंड/कान और पौंड/tet में कालोनियों के अनुपात से अनुमान लगाया गया है । फैब रीढ़ phagemid के साथ transfected SS320 सक्षम कोशिकाओं का प्रतिशत पौंड/carb और पौंड में कालोनियों के अनुपात से अनुमानित है///

2. Phagemid टेम्पलेट से Uracil-युक्त ssDNA (dU-ssDNA) तैयार करना

नोट: एक पहले रिपोर्ट फैब रीढ़ phagemid dU-ssDNA तैयारी के लिए टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था15. फैब रीढ़ phagemid का आर्किटेक्चर चित्रा 2में दिखाया गया है । एक प्लाज्मिड स्पिन किट (QIAprep स्पिन M13) ड्यू के निष्कर्षण के लिए प्रयोग किया जाता है-ssDNA मामूली संशोधनों के साथ ।

  1. पूर्व गर्म एक पौंड/सीएमपी प्लेट (तैयार और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित से कम 1-सप्ताह पुराने के लिए) एक ३७ डिग्री सेल्सियस में 1 एच के लिए मशीन । ई. कोलाई CJ236 कोशिकाओं के एक ग्लिसरॉल शेयर बाहर लकीर (या एक और ड्यूट −/ung − तनाव) बाँझ छोरों या सुझावों के साथ पूर्व गर्म पौंड/सीएमपी प्लेट पर । लगभग 12-15 घंटे के लिए रातोंरात ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन ।
  2. एक 14 मिलीलीटर के गोल-नीचे ट्यूब में 2YT/सीएमपी माध्यम के 2 मिलीलीटर में एक बाँझ टिप और inoculate के साथ एक भी कॉलोनी उठाओ ।
  3. 3-4 एच के लिए २०० rpm पर मिलाते के साथ ३७ ° c पर मध्यम मशीन जब तक आयुध डिपो६०० 0.4 के आसपास पर पहुंच गया है-0.8 (प्रवेश चरण वृद्धि) ।
  4. जोड़ें 5-10 μL फैब रीढ़ के फेज संस्कृति में टेंपलेट, और फेज संक्रमण की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए २०० rpm पर मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
  5. मशीन के बाद, एक पूर्व पर संस्कृति के 10 μL बाहर लकीर करने के लिए एक बाँझ टिप का उपयोग करें-३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म पौंड/carb थाली । लगभग 12-15 घंटे के लिए ३७ ° c रात भर में मशीन ।
  6. एक 14 मिलीलीटर के गोल नीचे ट्यूब में 3 मिलीलीटर 2YT/carb/सीएमपी के एक स्टार्टर संस्कृति inoculate करने के लिए फैब रीढ़ phagemid युक्त ई. कोलाई CJ236 की एक कॉलोनी उठाओ, और लगभग 12 घंटे के लिए रातोंरात २०० rpm पर मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता है ।
  7. Inoculate ०.३ मिलीलीटर स्टार्टर संस्कृति में 30 मिलीलीटर 2YT/carb/सीएमपी में एक २५०-एमएल चकित बोतल ।
  8. 3-4 के लिए २०० rpm पर मिलाते हुए के साथ ३७ ° c पर सेल संस्कृति मशीन, जब तक आयुध डिपो६०० 0.4 के आसपास पर पहुंच गया है-0.8 (प्रवेश चरण वृद्धि) ।
  9. M13KO7 (लैब स्टॉक, titer के लगभग 1 x 1013 cfu/एमएल) से संस्कृति को जोड़ने के संक्रमण (MOI) के लगभग 10 और titer के अंतिम M13KO7 के साथ कदम २.८ लगभग 1 x 1010 cfu/
  10. 1 एच के लिए २०० rpm और ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  11. एक ५०-एमएल दौर में ५,००० × g और 25 डिग्री सेल्सियस से कम ट्यूब 20 मिनट के लिए में केंद्रापसारक द्वारा संस्कृति गोली ।
  12. supernatant के लिए खिचड़ी भाषा और ताजा 2YT के 30 मिलीलीटर के साथ गोली reसस्पेंड/ एक नया २५०-मिलीलीटर चकित बोतल में पुनर्निलंबन स्थानांतरण ।
  13. 22-24 एच के लिए २०० rpm और 25 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  14. एक ५०-एमएल दौर नीचे ट्यूब में २.१३ कदम से संस्कृति स्थानांतरण और 20 मिनट के लिए १२,००० × जी में संस्कृति केंद्रापसारक को बैक्टीरियल सेल गोली से फेज supernatant अलग । फेज supernatant को एक नए ५०-एमएल राउंड-बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें और फेज को तेज़ करने के लिए NaCl समाधान के अंतिम खंड को 1/5 जोड़ें । फेज कणों को तेज करने के लिए 30 मिनट के लिए अच्छी तरह से मिलाएं और बर्फ की मशीन करें ।
  15. १२,००० × जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए supernatant और ४,००० × g और 4 ° c पर केंद्रापसारक के लिए 2 min. महाप्राण शेष supernatant ।
  16. १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूबों के लिए बाँझ-फ़िल्टर 1x पंजाबियों और हस्तांतरण के 2 मिलीलीटर में फेज गोली reसस्पेंड । एक benchtop microcentrifuge में 5 मिनट के लिए १२,००० × जी पर केंद्रापसारक किसी भी शेष बैक्टीरिया का मलबा हटाने के लिए और फेज supernatant नए १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूबों और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान हस्तांतरण ।
  17. ई. कोलाई SS320 के साथ पक्ष की तुलना द्वारा पक्ष के माध्यम से ई. कोलाई CJ236 में uracil निगमन दक्षता की जांच करें ।
    1. जोड़ें १८० 2YT मीडिया के एक अच्छी तरह से थाली की एक पंक्ति के प्रत्येक चहेतों के लिए μL ।
    2. बनाएं १० १०-गुना सीरियल कमजोर पड़ने: फेज supernatant के 20 μL स्थानांतरण प्लेट की पहली अच्छी तरह से, pipetting द्वारा मिश्रण है, और अगले अच्छी तरह से मिश्रण के 20 μL हस्तांतरण । इस कदम को धारावाहिक कमजोर पड़ने के अंत तक दोहराएं ।
    3. पिछले आठ धारावाहिक कमजोर पड़ने से फेज के 10 μL जोड़ें ई. कोलाई CJ236 और ई. कोलाई SS320 के लॉग चरण (आयुध डिपो६०० = 0.4-0.8) में संक्रमित ९० μL । कोमल मिलाते के साथ 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    4. प्लेट 10 ई. कोलाई CJ236 और 2YT पर ई. कोलाई SS320 में प्रत्येक संक्रमण के धारावाहिक कमजोर पड़ने से μL/
    5. ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    6. Titer परिकलन सूत्र: मान लें कि M औसत कॉलोनी संख्या पतला गुना 10n (n से 1-10 है) से गिना जाता है । ई. कोलाई CJ236 या ई. कोलाई SS320 से titer M X 10N + 2 cfu/एमएल के बराबर है । ई. कोलाई CJ236 और ई. कोलाई SS320 के titer अनुपात से uracil निगमन की दक्षता का अनुमान है ।
  18. जोड़ें 1/100 १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूबों में फेज supernatant में फेज वर्षा बफर सांसद की मात्रा, और उल्टा बारी धीरे से कई बार के लिए मिश्रण । आरटी पर कम 2 min. फेज कणों के लिए मशीन संस्कृति माध्यम से उपजी हैं, और इस प्रकार, एक बादल समाधान इस बिंदु पर दिखाई जानी चाहिए ।
  19. नमूना २.१८ से एक प्लाज्मिड स्पिन स्तंभ के लिए (उदा, QIAprep) एक १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब में लागू होते हैं । ssDNA के लिए एक स्पिन कॉलम की बाध्यकारी क्षमता ६,००० × g और 25 डिग्री सेल्सियस पर एक benchtop microcentrifuge में 30 एस के लिए कम से 10 µ g. केंद्रापसारक पर पहुंच सकते हैं । प्रवाह-के माध्यम से जो १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब में है त्यागें । फेज कणों इस स्तर पर कॉलम मैट्रिक्स के लिए बाध्य रहते हैं ।
  20. केंद्र शासित प्रदेशों के ०.७ मिलीलीटर-MLB फेज lysis और बाध्यकारी बफर जोड़ें ( चर्चादेखें) कॉलम और आर टी पर कम 1 मिनट के लिए मशीन ।  30 एस के लिए ६,००० x g और 25 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक और प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
  21. केंद्र शासित प्रदेशों के एक और ०.७ मिलीलीटर-MLB बफर और आरटी पर कम से कम 1 मिनट के लिए मशीन जोड़ें ।
  22. 30 एस के लिए ६,००० × जी पर केंद्रापसारक प्रवाह के माध्यम से त्यागें । इस स्तर पर, फेज कोट प्रोटीन ड्यू-ssDNA, जो कॉलम मैट्रिक्स से बंधे रहता है से अलग है ।
  23. निर्माता के निर्देशों का पालन इथेनॉल युक्त धोने बफर पीई की ०.७ मिलीलीटर जोड़ें । 30 एस के लिए ६,००० × जी पर केंद्रापसारक और प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
  24. दोहराएं २.२३ कदम है, तो एक बार और ६,००० × जी के लिए 30 s के लिए अवशिष्ट बफर पीई हटाने के लिए ।
  25. स्तंभ को नई १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब पर स्थानांतरित करें और जोड़ें १०० μL का रेफरेंस बफर EB (10 एमएम Tris · सीएल, पीएच ८.५) स्तंभ झिल्ली के केंद्र के लिए ।
  26. 10 मिनट के लिए आर टी पर मशीन और 1 मिनट के लिए ६,००० × जी में elute dU-ssDNA । लगभग, 1.5-2.5 μg dU-ssDNA/एमएल कल्चर प्राप्त किया जा सकता है ।
  27. 1% agarose ताे जेल पर electrophoresing 1 μL द्वारा eluted डीएनए का विश्लेषण करें । डीएनए कोई धब्बा के साथ एक मुख्य रूप से एकल बैंड के रूप में प्रकट होना चाहिए ।
  28. २६० एनएम पर एक nanodrop spectrophotometer पर अवशोषण को मापने के द्वारा डीएनए एकाग्रता का निर्धारण (a२६० = १.० के लिए ३३ एनजी/μL के ssDNA) । ठेठ dU-ssDNA सांद्रता 200-500 एनजी/μL के भीतर हैं ।

3. Kunkel की विधि आधारित Oligonucleotide-निर्देशित Mutagenesis

नोट: यह mutagenic oligonucleotide और प्रतिक्रिया घटकों की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए पूर्ण पैमाने पर प्रतिक्रियाओं से पहले छोटे पैमाने पर प्रतिक्रियाओं का संचालन करने के लिए सलाह दी जाती है । Kunkel की विधि आधारित oligonucleotide का एक कार्टून-निर्देशित mutagenesis चित्रा 3में दिखाया गया है । विभिंन एमिनो एसिड विचलन CDRH1, CDRH2, CDRH3, और CDRL3 क्षेत्रों में IMGT क्रमांकन16 (तालिका 2) नामकरण के साथ शुरू कर रहे हैं । प्रत्येक सीडीआर, कुल सैद्धांतिक अमीनो अम्ल विविधता की सैद्धांतिक अमीनो अम्ल विविधता, और oligonucleotide अनुक्रम तालिका 2में सूचीबद्ध हैं ।

  1. टी-4 polynucleotide कळेनासे के साथ Oligonucleotide फास्फारिलीकरण
    1. mutagenic oligonucleotides, 2 μL 10x टीएम बफर, 2 μL 10 मिमी एटीपी, और 1 μL १०० मिमी डीटीटी के साथ एक एकल सीडीआर, रूपांतरित करने के लिए डिज़ाइन की ०.६ μg का मिश्रण । १.५-एमएल ट्यूब में 18 μL की कुल मात्रा के लिए ultrapure एच2O जोड़ें । पुस्तकालय निर्माण के लिए, 4 अलग और समानांतर फास्फारिलीकरण प्रतिक्रियाओं CDRH1, CDRH2, CDRH3, और CDRL3, क्रमशः के लिए इसी सेट कर रहे हैं ।
    2. प्रत्येक ट्यूब के लिए टी-4 polynucleotide कळेनासे के 20 यू (2 uL) जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन ( 3 तालिकामें प्रतिक्रिया 1) । एनीलिंग के लिए तुरंत प्रयोग करें ।
  2. एनीलिंग को oligonucleotides के खाके को
    1. ड्यू-ssDNA टेम्पलेट के 20 μg के लिए, 10x TM बफर के 25 μL जोड़ें, प्रत्येक phosphorylated oligonucleotide समाधान के 20 μL, और ultrapure एच2ओ ०.५-एमएल ट्यूब में २५० μL के एक अंतिम मात्रा के लिए. अच्छी तरह से मिलाएं और ०.२० मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों (५० μL प्रत्येक) में 2 तालिका 3में प्रतिक्रिया के रूप में स्थानांतरण । ये डीएनए मात्रा oligonucleotide और टेंपलेट के बीच 3:1 के एक दाढ़ अनुपात, यह मानते हुए कि oligonucleotide और टेंपलेट की लंबाई अनुपात 1:100 है प्रदान करते हैं ।
    2. 3 मिनट के लिए ९० ° c, 3 मिनट के लिए ५० ° c, और 5 मिनट के लिए 20 ° c के लिए एक पीसीआर मशीन में प्रतिक्रिया की शुरुआत करें ।
  3. सीसीसी-dsDNA के एंजाइमी संश्लेषण
    1. २५० μL annealed oligonucleotide/टेंपलेट मिश्रण, 10 मिमी एटीपी, 10 μL के 25 मिमी dNTP मिश्रण, 15 μL की १०० मिमी डीटीटी, 30 Weiss इकाइयों टी-4 डीएनए ligase, और 30 U T7 डीएनए पोलीमरेज़ के रूप में प्रतिक्रिया 3 में से 10 μL जोड़ें तालिका 3।
    2. 20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में १.५-एमएल ट्यूब में प्रतिक्रिया की मशीन ।
    3. धो और आरटी में एक 30 केडीए ताकना आकार झिल्ली के साथ एक ०.५-एमएल केंद्रापसारक फिल्टर डिवाइस में संश्लेषित सीसीसी-dsDNA ध्यान केंद्रित ।
      1. फ़िल्टर डिवाइस के लिए रातोंरात प्रतिक्रिया मिश्रण हस्तांतरण और ४०० µ एल अंतिम मात्रा ultrapure एच2O जोड़ें । 10 मिनट के लिए १४,००० × जी पर स्पिन; वॉल्यूम ५० μL से कम है ।
      2. के माध्यम से प्रवाह त्यागें, फ़िल्टर में ultrapure H2के ४०० µ एल जोड़ें, और 10 मिनट के लिए १४,००० × जी पर स्पिन ।
      3. दोहराएं चरण 3.3.3.2 एक बार और ।
      4. सीसीसी-dsDNA को ठीक करने के लिए फ़िल्टर को एक क्लीन microcentrifuge ट्यूब में उल्टा रखें । 2 मिनट के लिए १,००० × जी पर स्पिन; बरामद मात्रा आम तौर पर लगभग 20-40 μL है । बरामद सीसीसी-dsDNA तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है के electroporation के लिए ई. कोलाई या जमे हुए पर-20 बाद में उपयोग के लिए ° c । सामान्य तौर पर 20-40 μg सीसीसी-डीएनए प्राप्त किया जा सकता है ।
    4. Electrophorese १.० µ एल के साथ eluted प्रतिक्रिया उत्पाद के ड्यू-ssDNA टेम्पलेट प्रतिक्रिया के परिणाम की कल्पना करने के लिए.

4. Electroporation और पुस्तकालय के आकार की गणना

  1. ठंड शुद्ध सीसीसी-dsDNA (५० μL की एक अधिकतम मात्रा में 20 μg) एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और बर्फ पर ०.२ सेमी अंतर electroporation cuvette में ।
  2. पूर्व में एक ५०-मिलीलीटर में समाज के मीडिया के 20 मिलीलीटर गर्म-शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में ३७ ° c पानी के लिए स्नान के लिए ंयूनतम 30 मिनट ।
  3. गल एक ३५० μL aliquot इलेक्ट्रो-सक्षम ई. कोलाई SS320 बर्फ पर । डीएनए में कोशिकाओं को जोड़ने और कई बार pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । बुलबुले शुरू करने से बचें ।
  4. मिश्रण cuvette करने के लिए स्थानांतरण और निर्माता के निर्देशों का पालन electroporation प्रदर्शन । उदाहरण के लिए, जब BTX ECM-६३० electroporation प्रणाली का प्रयोग किया जाता है, प्रासंगिक सेटिंग्स २.५ केवी क्षेत्र शक्ति, १२५ Ω प्रतिरोध, और ५० µF समाई हैं ।
  5. तुरंत पूर्व गर्म समाज मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़कर electroporated कोशिकाओं को बचाने और एक १२५ मिलीलीटर कुप्पी में समाज माध्यम के 17 मिलीलीटर में स्थानांतरित । cuvette को दो बार समाज माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ कुल्ला करें और उसी कुप्पी (अंतिम खंड 20 मिलीलीटर) में स्थानांतरित करें ।
  6. २०० rpm पर मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
  7. electroporation दक्षता का निर्धारण ।
    1. 2YT मीडिया के १८० μL एक ९६-microwell प्लेट के एक एकल स्तंभ के प्रत्येक कुआं जोड़ें ।
    2. बनाओ ८ १०-गुना सीरियल कमजोर पड़ने: 20-एमएल संस्कृति के 20 μL थाली की पहली अच्छी तरह से स्थानांतरण, pipetting के साथ मिश्रण है, और अगले अच्छी तरह से मिश्रण के 20 μL हस्तांतरण । इस कदम को धारावाहिक कमजोर पड़ने के अंत तक दोहराएं ।
    3. प्लेट 10 μL में एक £/carb थाली पर धारावाहिक कमजोर पड़ने से प्रत्येक के एक । प्लेट १०० µ एल अलग पौंड पर धारावाहिक कमजोर पड़ने से प्रत्येक से शेष/carb प्लेटों के पार की जांच की गिनती के लिए । इन प्लेट्स भी एलिसा और अनुक्रम विश्लेषण के लिए एक क्लोन प्रदान करेगा (अनुभाग 5 देखें) ।
    4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    5. पौंड/carb थाली पर 10 μL डुप्लिकेट से कालोनियों गिनती । मान लें कि M औसत कॉलोनी संख्या 10n गुना पौंड/carb प्लेट (n 1-8 से है) पर गिना जाता है । कुल लाइब्रेरी का आकार 2 एम 1 X 10N + 3 कॉलोनियों के बराबर है ।
  8. Aliquot ४.६ में समान रूप से कदम से संस्कृति दो 2-L चकित कुप्पी, 2YT/carb/कान मध्यम के फेज पुस्तकालय पीढ़ी के लिए एक से युक्त ५०० मिलीलीटर ।
  9. लगभग 16 घंटे के लिए २०० rpm पर मिलाते हुए के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
  10. दो 1-L autoclaved केंद्रापसारक बोतलों के लिए संस्कृति स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर १२,००० × जी में 30 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  11. दो नए 1-L autoclaved केंद्रापसारक बोतलों के लिए supernatant स्थानांतरण और 1/5 खूंटी के अंतिम खंड/NaCl समाधान फेज हाला । 30 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
  12. १२,००० × जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए केंद्रापसारक । ध्यान से supernatant और फेज गोली के परेशान से बचने के लिए नहीं कर सकते । ४,००० x g पर 1 मिनट के लिए स्पिन करें और शेष supernatant को एक पिपेट के साथ निकालें ।
  13. बाँझ-फ़िल्टर 1x पंजाबियों बफर और एक नया ५०-एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण के 20 मिलीलीटर के साथ फेज गोली reसस्पेंड ।
  14. १२,००० × g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा अघुलनशील बात गोली । supernatant एक नया ५०-एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
  15. spectrophotometer द्वारा फेज एकाग्रता उपाय (आयुध डिपो२६८ = १.० 5 X 1012 फेज/एमएल) के समाधान के लिए ।
  16. 10% ultrapure ग्लिसरॉल के साथ 1x पंजाब में 5 X 1012 फेज/एमएल के लिए फेज एकाग्रता समायोजित करें ।
  17. Aliquot 1 मिलीलीटर की फेज समाधान प्रति १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब । -८० डिग्री सेल्सियस पर panning या दुकान के लिए तुरंत पुस्तकालयों का उपयोग करें ।

5. प्रोटीन ए/एल द्वारा गुणवत्ता मूल्यांकन प्रत्यक्ष बाइंडिंग एलिसा परख और अनुक्रमण

  1. बेतरतीब ढंग से एक ९६-दीप अच्छी तरह से संस्कृति 2YT के ८०० μL युक्त थाली में पौंड/carb थाली पर ९६ एकल कालोनियों उठाओ/ ३७ ° c पर 3-4 के लिए मशीन के साथ मिलाते हुए १,००० rpm को आयुध डिपो के लिए६०० = 0.4-0.8 ।
  2. जोड़ें १०० μL के M13KO7 (1 X 1011 cfu/एमएल) के लिए एक ९६-दीप अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ संस्कृति की थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से । 1 एच के लिए १,००० rpm पर मिलाते के साथ ३७ ° c पर मशीन ।
  3. एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ एक अच्छी तरह से कनमीसिन (५०० μg/एमएल) के 10x एकाग्रता युक्त 2YT के १०० μL जोड़ें । १,००० rpm पर मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  4. 1x पंजाब में 1 µ g/mL को प्रोटीन एल भंग । कोट 3/4 एक ३८४ में कुएं की अच्छी तरह से उच्च प्रोटीन polystyrene प्लेट 30 µ एल के साथ/प्रोटीन एल समाधान की अच्छी तरह से । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  5. छोड़ें रातोंरात प्रोटीन एल कोटिंग समाधान से कदम ५.४ । एम के ५० µ एल जोड़ें-PBST (अवरुद्ध समाधान) ३८४ में कुओं के सभी अच्छी तरह से उच्च प्रोटीन एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ polystyrene प्लेट बाध्यकारी । आरटी पर 1 एच के लिए एक microplate शेखर पर प्लेटें मशीन ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३,००० x जी में एक गहरी ९६-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में ५.३ कदम से रातोंरात संस्कृति नीचे स्पिन । फेज supernatant में है ।
  7. चरण ५.५ से ब्लॉकिंग समाधान छोड़ें । एम के 15 μL जोड़ें-PBST और प्रत्येक फेज supernatant के 15 μL (चरण ५.६) के लिए प्रोटीन एल लेपित कुओं के 3 तपसिल के रूप में, और 1 गैर लेपित एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर के रूप में अच्छी तरह से नकारात्मक नियंत्रण । २०० rpm पर झटकों के साथ 1 एच के लिए आरटी में मशीन ।
  8. फेज समाधान छोड़ें । प्लेट धो एक स्वचालित प्लेट वॉशर द्वारा PBST के ८० μL के साथ 6 बार ।
  9. एम के 15 μL जोड़ें-PBST और प्रोटीन के 15 μL a-एचआरपी (1:1500 1x पंजाब में पतला) एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ एक अच्छी तरह से करने के लिए, और 1 के लिए आर टी में लगभग २०० rpm पर मिलाते के साथ गर्मी ।
  10. प्रोटीन A-एचआरपी/M-PBST समाधान छोड़ें । प्लेट को धोकर 6 बार PBST के ८० μL के साथ लें ।
  11. TMB सब्सट्रेट जोड़ें (30 μL/well) एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ और 2-3 मिनट के लिए गर्मी जब तक रंग विकसित करता है । १.० एम एच3पीओ4 (30 μL/अच्छी तरह से) के साथ प्रतिक्रिया बंद करो ।
  12. ४५० एनएम पर spectrophotometrically प्लेट्स पढ़ें । सकारात्मक क्लोन उन है कि प्रदर्शन के रूप में परिभाषित कर रहे है आयुध डिपो के४५० अवशोषण प्रोटीन एल कुओं की एक औसत अनुपात एम-PBST अच्छी तरह से अधिक से अधिक ३.० ।
  13. एक ९६ में अच्छी तरह से, 2YT/tet में SS320 के ५० μL को संक्रमित करने के साथ लॉग चरण में एक ही फेज की एलिसा के लिए प्रयोग किया जाता है के 5 μL (चरण ५.६) आरटी पर 30 मिनट के लिए ।
  14. जोड़ें ९५० μL के 2YT/carb में ९६-गहरी अच्छी तरह से कदम ५.१३ से और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर के साथ मिलाते हुए १,००० rpm पर ।
  15. मिनी तैयारी डीएनए निष्कर्षण किट द्वारा phagemid डीएनए निकालें । वीएल के ऊपर प्राइमरों का प्रयोग करें (5 '-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3 ') और VH (5 '-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3 ') अनुक्रम विश्लेषण के लिए पुस्तकालय अनुक्रम विविधता का अनुमान है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

फैब पुस्तकालय निर्माण के प्रवाह चार्ट के बाद ( चित्रा 1देखें), हम M13KO7 सहायक फेज पूर्व संक्रमित ई. कोलाई SS320 इलेक्ट्रो सक्षम कोशिकाओं को तैयार किया । इन इलेक्ट्रो सक्षम कोशिकाओं की दक्षता 2 X 109 cfu/µ g के रूप में अनुमानित है जब पुस्तकालय निर्माण के लिए फैब phagemid रीढ़ (चित्रा 4) का इस्तेमाल किया गया था ।

uracil दोनों ई. कोलाई CJ236 और ई. कोलाई SS320 कोशिकाओं में titer की तुलना द्वारा दक्षता शामिल की जांच की गई । ई. कोलाई CJ236 और ई. कोलाई SS320 कोशिकाओं फेज हार्बर ड्यू-ssDNA द्वारा संक्रमित थे । ई. कोलाई SS320 एंजाइमों (dUTPase और uracil glycosylase) है कि uracil युक्त डीएनए नीचा कर सकते हैं, जबकि ई. कोलाई CJ236 इन एंजाइमों का अभाव है और uracil युक्त डीएनए नीचा नहीं कर सकता । एक स्वीकार्य uracil निगमन दक्षता प्राप्त करने के लिए, ई. कोलाई CJ236 से titers कम से4 गुना अधिक ई. कोलाई SS320 से उन लोगों की जरूरत है । अन्यथा वन्य-प्रकार की आबादी को अकुशल uracil निगमित करने के कारण होटवार एंटीबॉडी पुस्तकालय में वृद्धि होगी. चित्रा 5 से पता चला कि ई. कोलाई CJ236 से titer लगभग है 3 X 105 बार से अधिक है कि ई. कोलाई SS320, फेज ssDNA में एक कुशल uracil निगमन का संकेत है ।

अगले, हम तैयार और निकाले dU-ssDNA । ड्यूल-ssDNA शुद्धता को agarose जेल ट्रो (figure 6) द्वारा चेक किया गया है । इसके बाद oligonucleotide-निर्देशित mutagenesis का आयोजन किया गया और सीसीसी-डीएनए में ड्यूल-ssDNA रूपांतरण की दक्षता का मूल्यांकन किया गया (चित्रा 6). ड्यू-ssDNA की तुलना में कम गतिशीलता वाले तीन उत्पाद जेल में सबसे तेजी से चलने वाले बैंड (सीसीसी-dsDNA), मध्य कमजोर बैंड (निक बैंड), और धीमी गति से चलने वाले बैंड (किनारा-विस्थापित डीएनए) सहित विज़ुअलाइज़ किए जा सकते हैं ।

ई. कोलाई SS320 में electroporation के बाद, पुस्तकालय आकार रातोंरात मशीन प्लेट से अनुमानित (कदम 4.7.5 देख रहा था) । औसत पुस्तकालय का आकार 5 X 109 था पर डुप्लिकेट सीरियल कमजोर पड़ने से LB/carb प्लेट्स (चित्रा 7) । हालांकि, इस चरण पर अनुमानित आकार फेज frameshift या stop codon की उपस्थिति के कारण Fabs प्रदर्शित नहीं करते हैं, या प्रदर्शन Fabs प्रकट हो सकता है । अनुक्रमण और एलिसा के लिए निर्माण पुस्तकालय के कार्यात्मक विविधता का अनुमान किया गया । ९६ बेतरतीब ढंग से उठाया एकल क्लोन अनुक्रमण विश्लेषण के लिए भेजा गया था । तालिका 4 से पता चलता है कि ९० से बाहर ९६ बेतरतीब ढंग से उठाया एकल क्लोन सफलतापूर्वक अनुक्रम, जो एक समयपूर्व बंद codon के बिना ७० क्लोनों (५३ क्लोनों के साथ कम से एक सीडीआर उत्परिवर्ती और 17 क्लोनों जंगली प्रकार अनुक्रम के साथ) और एक के साथ 20 क्लोनों शामिल थे समय से पहले विभिंन क्षेत्रों में codon बंद करो । ७० क्लोनों के भीतर, CDRH1, CDRH2, CDRH3, और CDRL3 के उत्परिवर्ती दरों ५०%, ५७%, ५३%, और ५६%, क्रमशः कर रहे हैं, जबकि उत्परिवर्ती दर से कम एक सीडीआर के साथ ७६% है । एक समयपूर्व बंद codon (९०%), समयपूर्व रोक codon के साथ 20 क्लोनों में मुख्य रूप से oligonucleotide mutagenesis प्राइमरों के frameshift से व्युत्पंन किया गया था, जिसमें ४५% (CDRH1), 10% (CDRH2), 15% (CDRH3), और 20% (CDRL3) ।

ठीक से जोड़ Fabs के प्रदर्शन का पता लगाने के लिए, एक प्रोटीन a/l आधारित एलिसा कार्यरत थी क्योंकि यह ज्ञात है कि प्रोटीन ए और प्रोटीन एल VH फ्रेमवर्क और वीएल फ्रेमवर्क, क्रमशः17,18की उचित तह पहचान सकते हैं । अनुक्रमण विश्लेषण के साथ समझौते में, तपसिल में एलिसा परख (चित्र 8) से पता चला है कि एक समय से पहले बंद codon के साथ 20 क्लोन सभी नकारात्मक थे, जबकि एक जंगली प्रकार के अनुक्रम के साथ 17 क्लोन थे सभी सकारात्मक जब सकारात्मक अनुपात था empirically ३.० पर सेट । के लिए ५३ क्लोनों के साथ कम से एक सीडीआर उत्परिवर्ती, ४३ क्लोन एलिसा में सकारात्मक थे, जबकि 10 क्लोन नकारात्मक थे; यह इंगित करता है कि क्लोन के सबसे अच्छी तरह से जोड़ रहे थे, जबकि 10 क्लोन से CDRs फैब तह पर हानिकारक प्रभाव हो सकता है । कुल में, ९० क्लोनों से बाहर ४३ क्लोन (४८%) अच्छी तरह से जोड़ रहे थे और कम से एक सीडीआर उत्परिवर्ती निहित । इस प्रकार, निर्माण पुस्तकालय के कार्यात्मक एमिनो एसिड विविधता प्रोटीन के आधार पर एक/L एलिसा और अनुक्रम विश्लेषण २.४ x 109 (यानी, ४८% 5 x 109) होने का अनुमान था ।

Figure 1
चित्रा 1: फेज-प्रदर्शित फैब पुस्तकालय निर्माण का अवलोकन. फेज-प्रदर्शित फैब पुस्तकालय निर्माण कदम की एक बुनियादी श्रृंखला के बाद । यह उच्च दक्षता विद्युत सक्षम बैक्टीरियल कोशिकाओं, dU के निष्कर्षण-ssDNA, Kunkel विधि आधारित oligonucleotide-निर्देशित mutagenesis, electroporation और फेज फैब पुस्तकालय आकार, कार्यात्मक मूल्यांकन की गणना की तैयारी शामिल प्रोटीन A/L एलिसा, और डीएनए अनुक्रम विश्लेषण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: फैब पुस्तकालय निर्माण के लिए Phagemid वास्तुकला. phagemid रीढ़ की बुनियादी सुविधाओं एकल-असहाय (f1 ओरि) और डबल असहाय (dsDNA ओरि) डीएनए प्रतिकृति के मूल से मिलकर बनता है, और एक एम्पीसिलीन/carbenicillin प्रतिरोध जीन (AmpR) । फैब प्रदर्शन के लिए, alkaline फॉस्फेट प्रमोटर (PhoA) के नियंत्रण में, phagemid एक bicistronic कैसेट की अभिव्यक्ति और के स्राव ड्राइव शामिल हैं: लाइट चेन (नियंत्रण रेखा) एक स्राव संकेत से मिलकर, वीएल (प्रकाश श्रृंखला के चर क्षेत्र), सीएल (लगातार प्रकाश श्रृंखला के क्षेत्र), और सी-टर्मिनल झंडा टैग; और भारी श्रृंखला (कोर्ट) एक गुप्त संकेत से मिलकर, VH (भारी श्रृंखला के चर क्षेत्र), और CH1 (लगातार भारी श्रृंखला के क्षेत्र 1) एक पी 3 फेज छोटे कोट प्रोटीन के साथ जुड़े । लाइट चेन और ई. कोलाई periplasm के भीतर फैब में भारी श्रृंखला के विधानसभा फेज सतह पर फैब के प्रदर्शन का निर्देशन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: Kunkel की विधि के आधार पर योजनाबद्ध oligonucleotide-निर्देशित mutagenesis । इस प्रोटोकॉल में, हम ड्यू-ssDNA टेम्पलेट तैयार करने के लिए Kunkel की विधि का इस्तेमाल किया । CDRH1 के लिए Oligonucleotides, CDRH2, CDRH3, और CDRL3 डिजाइन विविधता के साथ phosphorylated, annealed के लिए कर रहे हैं, और एसएस-डीएनए सीसीसी-dsDNA में परिवर्तित करने के लिए इस्तेमाल किया । ई. कोलाई SS320 इलेक्ट्रो सक्षम कोशिकाओं में electroporation के बाद, heteroduplex डीएनए या तो जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती फार्म के लिए मरंमत की है; जंगली प्रकार किनारा में uracil की उपस्थिति के कारण, मरंमत प्रक्रिया उत्परिवर्ती फार्म एहसान, और इस तरह, उत्परिवर्ती फार्म पुस्तकालय हावी है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: M13KO7 पूर्व संक्रमित ई. कोलाई SS320 इलेक्ट्रो-सक्षम सेल दक्षता का आकलन. एक phagemid रीढ़ वेक्टर सक्षम कोशिकाओं के electroporation दक्षता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । सूत्र क्षमता की गणना करने के लिए इस प्रकार है: मान लें कि एम औसत कॉलोनी सबसे पतला गुना 10n (n 1-8 से डुप्लिकेट में है) से गिना संख्या है । £/carb थाली से ई. कोलाई SS320 दक्षता M X 10N + 3 cfu/µ जी के बराबर है । इलेक्ट्रो सक्षम कोशिकाओं की दक्षता के आसपास है 2 X 109 cfu/µ जी कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: ई. कोलाई CJ236 और ई. कोलाई SS320 कोशिकाओं के फेज संक्रमण द्वारा ssDNA में uracil निगमन का आकलन । है Kunkel विधि के आधार पर, uracil निगमन दक्षता दोनों ई. कोलाई CJ236 और ई. कोलाई SS320 कोशिकाओं में फेज संक्रमण titer की तुलना द्वारा जांच की है । titer परिकलन सूत्र निम्नानुसार है: लगता है कि एम औसत कॉलोनी सबसे पतला से गिना संख्या है 10n (n 1-10 से है), और कि titer से ई. कोलाई CJ236 या ई. कोलाई SS320 के बराबर है एम एक्स 10एन + 2 cfu/एमएल । uracil निगमन की दक्षता ई. कोलाई CJ236 और ई. कोलाई SS320 के titer अनुपात से अनुमान लगाया जा सकता है । ई. कोलाई CJ236 में titer 9 x 1012 cfu/जबकि titer ई. कोलाई SS320 में 3 x 107 cfu/एमएल था । ई. कोलाई CJ236 और ई. कोलाई SS320 के titer अनुपात 3 X 105था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: oligonucleotide द्वारा सीसीसी-डीएनए के लिए dU-ssDNA का रूपांतरण-निर्देशित mutagenesis । निम्नलिखित oligonucleotide-निर्देशित mutagenesis, सीसीसी-डीएनए को ड्यू-ssDNA रूपांतरण की दक्षता का मूल्यांकन किया गया था । दू-ssDNA पूरी तरह से dsDNA में परिवर्तित हो गया था. प्रमुख बैंड सीसीसी-dsDNA है, जबकि वहां निक dsDNA और कतरा-विस्थापित डीएनए का एक छोटा सा हिस्सा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7: लाइब्रेरी आकार की गणना के लिए फेज अनुमापन. ई. कोलाई SS320 में electroporation के बाद, पुस्तकालय आकार पौंड/carb प्लेटों पर धारावाहिक कमजोर पड़ने से अनुमान लगाया गया था । आकार परिकलन सूत्र निम्नानुसार है: मान M औसत कॉलोनी सबसे पतला से गिना संख्या है 10n से 2YT/Carb प्लेट (n 1-8 से है), आकार 2 एम X 10N + 3के बराबर है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र ८: प्रोटीन A/L प्रत्यक्ष बंधनकारक फेज एलिसा. प्रोटीन एल अच्छी तरह से जोड़ कापा प्रकाश श्रृंखला वीएल और प्रोटीन एक अच्छी तरह से जोड़ भारी श्रृंखला VH के ढांचे को पहचान सकते है के ढांचे को पहचान सकते हैं । प्रोटीन एल के साथ फैब के बंधन और एक दोनों भारी श्रृंखला और प्रकाश श्रृंखला की उचित तह इंगित करता है । संक्षेप में, तपसिल में प्रोटीन एल और नकारात्मक नियंत्रण एम-PBST प्लेट के लिए लेपित थे, अलग क्लोन से फैब फेज supernatants प्रोटीन एल और एम-PBST, तो धोने के बाद, प्रोटीन A-एचआरपी के लिए बाध्य फैब फेज पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । फेज एलिसा रीडिंग दिखाया ९० बेतरतीब ढंग से सफल अनुक्रमण readout के साथ क्लोन उठाया । एक थ्रेशोल्ड धनात्मक के रूप में क्लोन का प्रतिनिधित्व करने वाली पंक्ति empirically परिभाषित किया गया था जहां प्रोटीन एल से आयुध डिपो४५० अवशोषक मूल्य का अनुपात (त्रुटि पट्टी के साथ तपसिल के औसत) बनाम नकारात्मक नियंत्रण से अधिक ३.० था । अनुक्रमण विश्लेषण के आधार पर तीन समूहों, लाल (५३ क्लोन) में बंद codon बिना एक उत्परिवर्ती के लिए इसी, नीले (17 क्लोन) में जंगली प्रकार (WT) दिखाया गया, और ग्रीन में बंद codon के साथ उत्परिवर्ती (20 क्लोन) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एजेंट सेटअप घटक राशि टिप्पणियां/
2YT माध्यम खमीर निकालें 10 ग्राम १.० एल के लिए मात्रा बनाने के लिए ultrapure पानी जोड़ें, ७.०, आटोक्लेव के लिए पीएच समायोजित करें ।
Tryptone 16 ग्राम
Nacl 5 ग्राम
2YT परिसरातील आगार खमीर निकालें 10 ग्राम ultrapure पानी जोड़ें करने के लिए मात्रा बनाने के लिए १.० L और ७.० को पीएच समायोजित, गर्मी भंग करने के लिए, आटोक्लेव.
Tryptone 16 ग्राम
Nacl 5 ग्राम
दानेदार आगर ७.५ छ
2YT/carb/सीएमपी माध्यम Carbenicillin १०० μg/एमएल
क्लॉरॅंफेनिकोल 10 μg/एमएल
2YT/carb/कान/uridine माध्यम Carbenicillin १०० μg/एमएल
कनमीसिन ५० μg/एमएल
Uridine ०.२५ μg/एमएल
2YT/carb/tet मध्यम Carbenicillin १०० μg/एमएल
टेट्रासाइक्लिन 10 μg/एमएल
2YT/carb माध्यम Carbenicilin १०० μg/एमएल
2YT/कान मध्यम कनमीसिन ५० μg/एमएल
2YT/कान/tet मध्यम कनमीसिन ५० μg/एमएल
टेट्रासाइक्लिन 10 μg/एमएल
2YT/tet मीडियम टेट्रासाइक्लिन 10 μg/एमएल
2YT/सीएमपी माध्यम क्लॉरॅंफेनिकोल 10 μg/एमएल
पौंड मध्यम आगर खमीर निकालें 5 ग्राम १.० एल के लिए मात्रा बनाने के लिए ultrapure पानी जोड़ें, ७.०, आटोक्लेव के लिए पीएच समायोजित करें । पौंड के लिए, दानेदार आगर, आटोक्लेव के 20 ग्राम जोड़ें ।
Tryptone 10 ग्राम
Nacl 10 ग्राम
LB/carb प्लेट्स पौंड आगर 1L
Carbenicillin १०० μg/एमएल
LB/tet प्लेट्स पौंड आगर 1 L
टेट्रासाइक्लिन 10 μg/एमएल
LB/सीएमपी प्लेट्स क्लॉरॅंफेनिकोल 10 μg/एमएल
LB/ कनमीसिन ५० μg/एमएल
समाज माध्यम खमीर निकालें 5 ग्राम १.० एल के लिए मात्रा बनाने के लिए ultrapure पानी जोड़ें और ७.०, आटोक्लेव पीएच को समायोजित करें ।
Tryptone 20 ग्राम
Nacl ०.५ छ
KCl ०.२ छ
२.० एम MgCl2 ५.० एमएल
१.० एम ग्लूकोज 20 मिलीलीटर
Superbroth माध्यम Tryptone 12 ग्राम जोड़ें ultrapure पानी के लिए ९०० मिलीलीटर, आटोक्लेव, जोड़ें १०० मिलीलीटर की autoclaved ०.१७ m KH2पीओ4, ०.७२ m K2HPO4.
खमीर निकालें 24 ग्राम
ग्लिसरॉल 5 मिलीलीटर
Superbroth/tet मध्यम कनमीसिन ५० μg/एमएल
टेट्रासाइक्लिन 10 μg/एमएल
1x पंजाब Nacl १३७ एमएम ७.२, आटोक्लेव के लिए पीएच समायोजित करें ।
KCl 3 मिमी
ना२HPO४ 8 मिमी
KH2पो4 १.५ एमएम
ताे/agarose जेल ताे बफर
Agarose 1% (w/
GelRed 1:10000 (वि. वि./
TMB सब्सट्रेट TMB ५०% (वि. वि./
एच2ओ2 peroxidase सब्सट्रेट ५०% (वि. वि./
M-PBST बफर 1x पंजाब १०० एमएल
के बीच-20 ०.०५% (वि. वि./
गैर वसा पाउडर दूध ५% (वि. वि./
5x पेग NaCl/ खूंटी-८००० 20% (w/ 1L करने के लिए मात्रा बनाने के लिए ultrapure पानी जोड़ें, और आटोक्लेव.
Nacl २.५ मीटर
PBST बफर 1x पंजाब 1 L ०.२२ माइक्रोन फ़िल्टर-निष्फल ।
के बीच-20 ०.०५% (वि. वि./
10x टीएम बफर MgCl2 ०.१ मीटर ७.५ के लिए पीएच समायोजित करें ।
Tris ०.५ मीटर
१.० मिमी HEPES, पीएच ७.४ १.० एम HEPES ४.० एमएल ०.२२ माइक्रोन फ़िल्टर-निष्फल ।
Ultrapure पाणी ४.० एल
10% (v/v) ultrapure ग्लिसरॉल Ultrapure ग्लिसरॉल १०० एमएल ०.२२ माइक्रोन फ़िल्टर-निष्फल ।
Ultrapure पाणी ९०० एमएल
Ultrapure पाणी ज20 Dnase-मुक्त, Rnase-मुक्त, पायरोजेन-मुक्त ।

तालिका 1: एजेंट सेटअप ।

Table 2
तालिका 2: सीडीआर गोताखोरों और mutagenesis प्राइमरों । सीडीआर क्षेत्रों के डीएनए दृश्यों को लाल रंग में दिखाया गया है; अनुक्रम आईयूपीएसी न्यूक्लियोटाइड कोड का उपयोग कर स्वरूपित हैं । "एक्स" अलग एमिनो एसिड सेट शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया गया एक मिश्रण से त्रिकोणीय न्यूक्लियोटाइड इंगित करता है; "n" एक्स की एक अलग संख्या के साथ एक्स पांच प्राइमरों के विभिंन संख्या को इंगित करता है CDRL3 या CDRH3 विविधता, क्रमशः, CDRL3 और CDRH3 के चर लंबाई उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । अवशेष संख्या IMGT नामकरण के द्वारा परिभाषित कर रहे हैं । इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Kunkel की विधि आधारित mutagenesis
प्रतिक्रिया १. टी-4 polynucleotide कळेनासे के साथ Oligonucleotide फास्फारिलीकरण
घटक राशि अंतिम
mutagenic oligonucleotides ०.६ μg
10x टीएम बफर 2 μL 1X
10 एमएम एटीपी 2 μL 1 मिमी
१०० मिमी डीटीटी 1 μL 5 मिमी
टी-4 polynucleotide कळेनासे (10 U/μL) 2 μL 20 यू
Ultrapure एच20 20 μL तक
प्रतिक्रिया सेटिंग
चरण 1 । ३७ ° c 1 ज के लिए
प्रतिक्रिया २. एनीलिंग को oligonucleotides के खाके को
घटक राशि अंतिम
ड्यूल-ssDNA टेम्पलेट 20 μg 20 μg
10x टीएम बफर 25 μL 1X
phosphorylated CDRH1 oligonucleotides 20 μL ०.६ μg
phosphorylated CDRH2 oligonucleotides 20 μL ०.६ μg
phosphorylated CDRH3 oligonucleotides 20 μL ०.६ μg
phosphorylated CDRL3 oligonucleotides 20 μL ०.६ μg
Ultrapure एच20 २५० μL तक
प्रतिक्रिया सेटिंग
चरण 1 । 3 मिनट के लिए ९० ° c
चरण 2. 5 मिनट के लिए ५० ° c
चरण 3. 5 मिनट के लिए 20 ° c
प्रतिक्रिया ३. सीसीसी-dsDNA के एंजाइमी संश्लेषण
घटक राशि अंतिम
annealed oligonucleotides/टेंपलेट मिश्रण २५० μL
10 एमएम एटीपी 10 μL ३४६ µ मी प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड
dNTP मिश्रण (प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड के 25 मिमी) 10 μL ८६५ µ मी प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड
१०० मिमी डीटीटी 15 μL 5 मिमी
टी-4 डीएनए ligase 1 μL 30 Weiss इकाइयां
T7 डीएनए पोलीमरेज़ 3 μL 30 यू
प्रतिक्रिया सेटिंग
चरण 1 । 20 ° c रात भर के लिए

तालिका 3: प्रक्रियाओं और Kunkel की विधि आधारित प्रतिक्रिया के घटक ।

समूह क्लोन संख्या क्षेत्र प्रतिशत
कोई समयपूर्व रोक codon ७० CDRH1 उत्परिवर्तन ५०% (35/70)
CDRH2 उत्परिवर्तन ५७% (40/70)
CDRH3 उत्परिवर्तन ५३% (37/70)
CDRL3 उत्परिवर्तन ५६% (39/70)
एक सीडीआर उत्परिवर्तन ७६% (53/70)
असमय रोक codon 20 CDRH1 दोष ४५% (9/20)
CDRH2 दोष 10% (2/20)
CDRH3 दोष 15% (3/20)
CDRL3 दोष 20% (4/20)
अन्य दोष 10% (2/20)

तालिका 4: CDRH1, CDRH2, CDRH3, और CDRL3 के अनुक्रम विश्लेषण सिंथेटिक फैब पुस्तकालय से ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

उच्च विविधता, फेज-प्रदर्शित फैब पुस्तकालयों का निर्माण करने के लिए, गुणवत्ता नियंत्रण जांच बिंदुओं के निर्माण की प्रक्रिया के विभिंन चरणों की निगरानी की जरूरत है, इलेक्ट्रो सक्षम कोशिकाओं की क्षमता सहित, ड्यूल-ssDNA टेम्पलेट की गुणवत्ता, की क्षमता सीसीसी-dsDNA संश्लेषण, titer के बाद electroporation, फैब तह, और CDRs के एमिनो एसिड विविधता फैब-फेज क्लोन के अनुक्रम विश्लेषण द्वारा ।

उच्च उपज और ड्यू-ssDNA की शुद्धता उच्च mutagenesis दर के लिए आवश्यक है । हमारे अनुभव में, फेज प्रेरण 25 डिग्री सेल्सियस रात भर में अधिक dU-ssDNA से कि फेज प्रेरण से ३७ डिग्री सेल्सियस रातोंरात उपज सकते हैं । यह पिछली रिपोर्ट19के साथ अनुबंध में है । ssDNA निष्कर्षण के बारे में, प्रारंभिक प्लाज्मिड स्पिन किट (QIAprep) फेज lysis और बाध्यकारी के लिए MLB समाहित । बाद में, MLB अज्ञात कारण से बंद कर दिया गया था और पंजाब द्वारा प्रतिस्थापित । हमने पाया है कि ssDNA की उपज के रूप में MLB इलाज से तुलना में पंजाब उपचार से बहुत कम है । इस प्रोटोकॉल में, हम एक reएजेंट का इस्तेमाल किया यूटी-mlb20 mlb की जगह और dU की उपज पाया ssDNA कि प्रारंभिक स्पिन किट से इसी तरह की है ।

के रूप में CDRH3 और CDRL3 प्रतिजन मांयता21के लिए सबसे विविध क्षेत्रों रहे हैं, एमिनो एसिड संयोजन और अनुपात के एक विशिष्ट सेट के साथ एक सिलवाया विविधता परिचय, और अतिरेक पूर्वाग्रह और बंद करो-codons के रूप में उत्पंन द्वारा शुरू की codons को दूर NNK (N, equimolar of A/C/G/T; K, equimolar of G/T), ट्रिमर codon phosphoramidite-आधारित oligonucleotides22 के साथ बिल्कुल एक ट्रिम कर दीजिए codon इसी के लिए एक विशिष्ट एमिनो एसिड CDRH3 और CDRL3 के लिए डिजाइन किए गए थे । इसके अलावा, CDRH3 और CDRL3 oligonucleotides के चर लंबाई आगे विचलन बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया ।

सीसीसी-dsDNA के एंजाइमी संश्लेषण के बाद, आम तौर पर तीन बैंड agarose जेल ट्रो द्वारा मनाया जाता है और बैंड धब्बा के बिना स्पष्ट होना चाहिए । उनमें से, सबसे तेजी से चल बैंड सीसीसी-dsDNA है कि एक उच्च उत्परिवर्तन दर उपज सकते है (लगभग ८०%) electroporation के बाद23। धीमी गति से चलने वाले बैंड कतरा-विस्थापित डीएनए है कि अंतर्निहित किनारा-T7 डीएनए पोलीमरेज़ की विस्थापन गतिविधि से उत्पंन होता है और एक कम उत्परिवर्तन दर (20%)23के आसपास है । मध्य कमजोर बैंड अपर्याप्त टी-4 डीएनए ligase गतिविधि या अपर्याप्त oligonucleotide फास्फारिलीकरण के कारण विस्तार के बाद डीएनए निक है ।

एक छोटे sequencing नमूना पूल हालांकि सही नहीं24पुस्तकालय विविधता का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । असली विविधता सही अनुमान लगाने के लिए, अगली पीढ़ी sequencing (NGS) निर्माण पुस्तकालय की विविधता गहराई खनन में एक अच्छा विकल्प हो सकता है25. अभ्यास में, पढ़ने की लंबाई, सटीकता, लागत, और उच्च प्रवाह सहित NGS प्रौद्योगिकी की वर्तमान चुनौतियों के कारण, लगभग ९५० बीपी फैले CDRH1, CDRH2, CDRH3, और CDRL3 की लंबाई के साथ इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल फैब फेज पुस्तकालय के अनुक्रमण नहीं है प्राप्त; हालांकि, यह scFv (लगभग ७०० bp) लाखों24,25की सीमा के भीतर पुस्तकालय विविधता का अनुमान लगाना संभव है । एक अंय प्रमुख मानक के निर्माण पुस्तकालय की विविधता का मूल्यांकन करने के लिए पुस्तकालय का उपयोग करने के लिए कई विभिंन प्रकार के एंटीजन के खिलाफ पैन और सकारात्मक पुस्तकालय विविधता के बाद से कब्जा कर लिया क्लोन की गणना है सीधे प्रतिजन की सफल दर के साथ संबद्ध है 26panning । उच्च प्रवाह चयन मंच अच्छी तरह से इस उद्देश्य के लिए अनुकूल है और पाठकों को एक विस्तृत Miersch एट अल द्वारा रिपोर्ट प्रोटोकॉल का उल्लेख कर सकते हैं । 27

सैद्धांतिक रूप से, सिलवाया विविधता के साथ फेज-प्रदर्शित सिंथेटिक एंटीबॉडी पुस्तकालयों किसी भी प्रतिजन लक्ष्य और इस तरह व्यापक अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । वर्तमान में, कैंब्रिज एंटीबॉडी प्रौद्योगिकी (कैट) सहित कंपनियों, MedImmune, Genentech, Dyax, आविष्कार, फाइजर, और MorphoSys चिकित्सीय फेज विकास के लिए एंटीबॉडी प्रदर्शन प्लेटफार्मों पर भारी भरोसा28। इसके अलावा, कई फेज डिस्प्ले कोर टेक्नोलॉजी पेटेंट्स की समयसीमा29हो चुकी है । निस्संदेह, यह फेज-प्रदर्शित एंटीबॉडी प्रौद्योगिकी की अधिकतम क्षमता दिलाने होगा ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने Kunkel की विधि आधारित सिंथेटिक फैब फेज लाइब्रेरी निर्माण पर महत्वपूर्ण टिप्पणी के लिए सिद्धू लैब से डॉ. Frederic Fellouse की सराहना की । लेखक उच्च दक्षता विद्युत सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं और उच्च गुणवत्ता dU-ssDNA तैयार करने की बहुमूल्य मदद के लिए सिद्धू लैब से श्रीमती Alevtina Pavlenco और अन्य सदस्यों की सराहना करते हैं । इस काम के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था चीन (अनुदान सं.: ८१५७२६९८, ३१७७१००६) DW को और ShanghaiTech विश्वविद्यालय द्वारा (अनुदान सं.: F-0301-13-005) एंटीबॉडी इंजीनियरिंग की प्रयोगशाला के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1.0 M H3PO4 Fisher AC29570
1.0 M Tris, pH 8.0 Invitrogen 15568-025
10 mM ATP Invitrogen 18330-019
100 mM dithiothreitol Fisher BP172
100 mM dNTP mix GE Healthcare 28-4065-60 solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-76-02
50X TAE Invitrogen 24710030
Agarose Fisher BP160
Carbenicillin, carb Sigma C1389 100 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL.
Chloramphenicol, cmp Sigma C0378 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9620G
Granulated agar VWR J637-500G
H2O2 peroxidase substrate Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-65-02
K2HPO4 Sigma 795488
Kanamycin, kan Fisher AC61129 50 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL.
KH2PO4 Sigma P2222
Na2HPO4 Sigma 94046
NaCl Alfa Aesar U19C015
Nanodrop Fisher ND2000C
NaOH Fisher SS256 ! CAUTION NaOH causes burns.
NON-Fat Powdered Milk Sangon Biotech A600669
PEG-8000 Fisher BP233
Protein A-HRP conjugate Invitrogen 101123
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 22704
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Recombinant Protein L Fisher 77679
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203S
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T7 DNA polymerase New England Biolabs M0274S
Tetracycline, tet Sigma T7660 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
Tryptone Fisher 0123-07-5
Tween-20 Sigma P2287
Ultrapure glycerol Invitrogen 15514-011
Uridine Sigma U3750 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL.
Yeast extract VWR DF0127-08
Name Company Catalog Number Comments
Strains
E.coli CJ236 New England Biolabs E4141 Genotype: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA.
E.coli SS320 Lucigen 60512 Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.
M13KO7 New England Biolabs N0315S
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2-cm gap electroporation cuvette BTX
96-well 2mL Deep-well plates Fisher 278743
96-well Maxisorp immunoplates Nunc 151759
Baffled flasks Corning
Benchtop centrifuge Eppendorf 5811000096
Centrifuge bottles Nalgene
ECM-630 electroporator BTX
Magnetic stir bars Nalgene
Thermo Fisher centrifuge Fisher
High speed shaker TAITEK MBR-034P
Microplate shaker QILINBEIER QB-9002
Liquid handler for 96 and 384 wells RAININ
Mutil-channel pipette RAININ E4XLS
Amicon concentrator Merck UFC803096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. , (2017).
  2. Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).
  3. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  4. Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).
  5. Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).
  6. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
  7. Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
  8. Sidhu, S. S. Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. , CRC Press. (2005).
  9. Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).
  10. Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).
  11. Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).
  12. Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
  13. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).
  14. Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
  15. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).
  16. Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).
  17. Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9 (8), 679-687 (2001).
  18. Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).
  19. Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58 (1), 10-17 (2012).
  20. Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
  21. Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).
  22. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).
  23. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).
  24. Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12 (5), e0177574 (2017).
  25. Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring? Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
  26. Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).
  27. Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492 (2015).
  28. Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).
  29. Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics - the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १३५ सिंथेटिक एंटीबॉडी पुस्तकालय फेज प्रदर्शन एंटीबॉडी बंधन टुकड़ा सिलवाया विविधता पुस्तकालय डिजाइन पुस्तकालय निर्माण hybridoma प्रौद्योगिकी
सिलवाया विविधता के साथ सिंथेटिक फेज प्रदर्शित फैब पुस्तकालय का निर्माण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S.,… More

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter