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Immunology and Infection

합성 살 균 소의 건설 맞춤형 다양성 팹 라이브러리 표시

Published: May 1, 2018 doi: 10.3791/57357
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 1,2,3, 1, 1
1Laboratory of Antibody Engineering, Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University, 2Banting and Best Department of Medical Research, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 3Department of Molecular Genetics, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

이 프로토콜에서는 맞춤형 다양성 합성 항 체 살 균 소 전시 도서관의 건설에 대 한 자세한 절차를 설명합니다. 합성 항 체는 질병 진단 및 치료제를 기초 연구에서 광범위 한 응용 프로그램 있다.

Abstract

단일 클론 항 체 (mAbs) 기초 연구와 의학에 대 한 수요는 매년 증가 하 고 있다. Hybridoma 기술 mAb 개발 이후 1975 년에 그것의 첫 번째 보고서에 대 한 지배적인 방법 되었습니다. 대체 기술, mAb 개발에 대 한 파지 디스플레이 방법으로 점점 더 매력적인 Humira, 첫 번째 페이지에서 파생 된 항 체와 베스트 셀러 mAbs 중은 2002 년에 류 마티스 관절염의 임상 치료에 대 한 승인 이후입니다. 비 동물 mAb 개발 기술을 기반으로, 살 균 소 전시 항 원 immunogenicity, 인간 화, 그리고 전통적인 hybridoma 기술 기반 항 체 개발에서 필요한 동물 유지 보수를 무시 합니다. 이 프로토콜에서 우리는 합성 살 균 소 표시 팹 라이브러리의 109-1010 단일 electroporation에 얻을 수의 다양성을 건설 하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 구성: 1) 고효율 전기 유능한 세포 준비; 2) 추출 uracil 포함 하는 단일 가닥 DNA (뒤-ssDNA); 3) Kunkel 메서드 기반 oligonucleotide 감독 mutagenesis; 4) electroporation 그리고 계산 라이브러리 크기; 5) 단백질 A/L 기반 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 폴딩에 대 한 기능적 다양성 평가; 그리고 6) 다양성의 DNA 순서 분석.

Introduction

mAbs 기초 연구에서 질병 진단 및 치료에 이르기까지 광범위 한 응용 프로그램 있다. 2016, 현재 60 mAbs 자가 면역 질환, 암, 그리고 전염병1,2의 임상 치료에 대 한 미국 식품의 약 청 (USFDA)에 의해 승인 되었습니다.

1975 년 Kohler와 Milstein 보고 'hybridomas' 그리고이 기법은 라고도 셀룰러 소스에서 단일 클론 특이성의 항 체의 지속적인 세대를 위한 기술 의학 및 산업3 초석 이후 되고있다. ,4. 이 메서드에서 mAbs의 세대 항 원 생산, 마우스 면역, B 림프 톨의 추출, 치료 응용 프로그램에 대 한 불멸의 hybridoma 세포, 클론 선택, 형성 하기 위하여 myeloma 세포와 B 세포의 융해를 포함 하 여 다양 한 단계 필요 인간 화 인간 안티 마우스 항 체 (하 마)4,5을 피하기 위해 필요 합니다. 그러나,이이 기술에 대 한 항 독 소, 균, 그리고 높은 보존된 단백질을 포함 하 여 상대적으로 mAb 생산5에 대 한 vivo에서 면역 반응을 트리거링에 유효 하지 않습니다.

1978 년, 허 치 슨 외. 단일 가닥 살 균 소 바이러스6잔류물의 직접 mutagenesis는 oligonucleotide 사용 하 여 보고. 1985 년에, 스미스 보고 외국 유전자 파편 유전자 살 균 소의 외 투 단백질 III 인코딩 프레임에 융합 될 수 있다 하 고 따라서 그것의 infectivity7을 타협 하지 않고 살 균 소 표면에 표시 될 수 있습니다. 이 선구적인 작품에 면역, 순진한, 살 균 소 전시 항 체 라이브러리의 후속 건설에 대 한 토대를 마련 하 고 합성을 위한 단일 체인 변수 조각 (scFv)의 항 원 묶는 조각 (팹) 형식으로 형성 치료 mAb 개발8,9. 기술적인 관점에서 파지 디스플레이 기반 항 체 개발 hybridoma 기반 mAb 개발 일부 항 포즈 수 있는 한계를 우회 하는 데 도움이 수 있는 상호 보완적인 접근 방식을 제공 하 고는 인간 화 하는 과정 hybridoma 파생 된 항 체는 종종5가필요합니다. 2016, 현재 6 살 균 소 전시 파생 mAbs Humira, 류 마티스 관절염의 치료에 사용 되는 가장 성공적인 mAbs 중 하나를 포함 하 여 시장 승인 및 많은 파지 디스플레이 파생 된 항 체는 현재 임상의 다양 한 단계에서 조사10.

면역과 순 살 균 소 항 체 라이브러리, complementarity 결정의 다양성에 대 한 지역 (Cdr) 빛과 무거운 체인에 자연 면역 레 퍼 토리 (즉, B 세포에서)에서 파생 됩니다. 반면, 합성 살 균 소 항 체 라이브러리에서 Cdr의 다양성 완전히 인공입니다. 합성 접근 도서관 건축을 정밀 하 게 제어 순서 다양성의 디자인을 제공 항 체 구조의 기계 론 적인 연구에 대 한 기회를 제공 하 고 기능11,12. 또한, 합성 라이브러리 프레임 워크 라이브러리 건설 촉진 하류, 대규모 산업 개발11,12전에 최적화할 수 있습니다.

1985 년, Kunkel M13 살 균 소에 사이트 이동 돌연변이 효율적으로 소개 하는 단일 가닥 DNA (ssDNA) 템플릿 기반 mutagenesis 접근 보고13. 이 방법은 이후 살 균 소 전시 도서관의 건축을 위해 널리 사용 되었다. 화학적 합성된 DNA oligonucleotides 팹 Cdr에 다양성을 소개 하는 항 체 백본 템플릿을 phagemid에 통합 됩니다. 이 프로세스는 phagemid uracil 포함 된 ssDNA (뒤-ssDNA)로 표현 된다 고는 oligonucleotides는 Cdr에 단련는 이중 가닥 DNA (dsDNA) T7 DNA 중 합 효소 및 T4 DNA 리가 존재 합성 확장. 마지막으로, 생성 된 ds DNA electroporation에 의해 대장균 에 도입 될 수 있습니다.

높은 다양성, 살 균 소 전시 도서관 건설, 2 분 대 혼합 전기 유능한 세포와 covalently의 높은 전압 electroporation 닫힌된 원형 dsDNA (CCC-dsDNA) 신중 하 게 준비 한다. Sidhu 외. 전통적인 방법에서 크게 향상 된 라이브러리 다양성14전기-유능한 세포와 DNA의 준비를 수정.

이 프로토콜에서 우리는 합성 살 균 소 표시 팹 라이브러리의 109-1010 단일 electroporation에 얻을 수의 다양성을 건설 하는 방법을 설명합니다. 그림 1 에서는 도서관 건설 등의 개요: 1) 고효율 전기 유능한 세포 준비; 2) 뒤 ssDNA;의 추출 3) Kunkel 메서드 기반 oligonucleotide 감독 mutagenesis; 4) electroporation 그리고 계산 라이브러리 크기; 5) A/L 기반 ELISA 위한 단백질 폴딩 및 기능적 다양성 평가; 그리고 6) 다양성의 DNA 순서 분석. 모든 시 약, 긴장 및 장비 물자의 테이블에 나열 됩니다. 표 1 시 약 설치를 보여 줍니다.

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Protocol

참고: 필터 멸 균 팁 사용 해야 전체 페이지를 다룰 때 피 펫 총 및 주변 지역에 오염을 피하기 위하여. 박테리아와 살 균 소 처리 실험 때 무 균 영역이 나 후드를 사용 해야 합니다. 살 균 소 실험 영역 2% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 뒤에 70% 에탄올을 사용 하 여 살 균 소 오염 방지 청소 되어야 한다. 이 프로토콜에서 직렬 희석을 만들기 위한 각 희석에 대 한 새로운 팁을 사용 해야 합니다.

1. 대장균 SS320 전기 유능한 세포 준비

  1. 1 h. 위해 37 ° C 배양 기에서 미리 따뜻한 파운드/tet 천 배지 (준비 및 저장에서 4 ° C 미만 1 주 된)에서는 살 균 접종 루프 또는 멸 균 팁 미리 따뜻하게 LB/tet 천 배지에 대장균 SS320 셀의 글리세롤 주식 밖으로 행진을 지그재그 direc 접시의 표면 따라 부드럽게 기입니다. 밤새 약 12-15 h에 대 한 37 ° C 배양 기에서 접시를 품 어.
  2. 다음 날, 지그재그 선 따라 잘 분리 된 단일 콜로 니를 선택 하 고 매체에 루프를 찍기 하 고 짧게 감동 하 여 50 mL 둥근 바닥 튜브에 2YT/tet 매체의 10 mL에 접종을 멸 균 접종 루프 또는 멸 균 팁을 사용 합니다.
  3. OD600 0.4-0.8 (로그 단계 성장) 주변에 도달할 때까지 약 3-4 h 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 품 어. 모니터 세600 에서 2 h입니다. 이 기간 동안 사전에 적어도 1 시간에 대 한 37 ° C 배양 기에서 5 파운드/tet 한 천 배지 (준비 및 저장에서 4 ° C 미만 1 주 된) 따뜻한.
  4. 실험실 재고 titer 1 x 10에서 20 μ M13KO7 도우미 페이지 추가13 콜로 니 형성 단위 (cfu) /mL 살 균 1의 180 μ 10 준비 압력가 1.5 mL 튜브에 X PBS ten-fold 직렬 희석.
  5. Aliquot 4 mL 압력가 마로 소독 하 고 액체 2YT 최고 천 5 X 14 mL로 하단 튜브 라운드, 각각, ten-fold 희석의 9에 5에서 한 희석 각 튜브 라벨 및 액체 상태에서 2YT 최고 agar를 유지 하기 위해 65 ° C 배양 기에서 품 어.
  6. 로그 단계 E. 콜라이 SS320의 혼합 500 μ M13KO7 희석 튜브에 세포 (선택 5 9 ten-fold 희석 ten-fold 희석)와 5-10 분 동안 37 ° C 배양 기에서 품 어.
  7. 1.6 단계의 인큐베이션 기간 동안 2YT 최고 천에서에서 전송 단계 1.5 실내 온도를 약 42 ° c.를 약 5 분 (RT) 2YT 최고 천;의 온도 테스트를 안 팔목을 사용 하 여 그것은 유지 한다 액체로. 1.5 단계에서 각 해당 2YT 최고 천 관 각 희석 혼합물을 전송. 각 튜브의 뚜껑을 강화 하 고 믹스 하 여 거꾸로 여러 번 부드럽게 짧게 거품 생성을 피하기 위해.
  8. 조심 스럽게 (1.3 단계)에서 미리 따뜻한 파운드/tet agar 플레이트의 가장자리를 따라 각 혼합물을 부 어 하 고 완전 하 고 균일 하 게 혼합 거품의 소개를 피하고 있는 동안 접시 채우기 위해 약간 접시를 가로질러. 각 배지 내의 최고 agar를 공고히 하 고 15-18 h 약 37 ° C 하룻밤에 2YT 최고 한 천 배지를 품 어 약 5-10 분에 대 한 RT에서 번호판을 유지.
  9. 주위와 단계 1.8에서에서 하룻밤 성장 후 희석 접시를 선택 플 라크 접종에 대 한 100-200 평균 크기의 단일, 잘 분리 된 플 라크. 한 손으로 광원, 그리고 피 펫 총 수직 상단 agar에 찌를 오래 살 균 피 펫 팁와 함께 로드를 반면에 대 한 천 배지를 사용 하 여 고과 잘 분리 된 플 라크를 수집 합니다.
    1. 피 펫 팁 패 최고 천 구분을 약간 경사 2YT/칸/tet 매체의 1 mL와 함께 로드 14 mL 둥근 바닥 문화 관으로 천 플 라크를 꺼내 려 여러 번 왔다 갔다 피 펫 ( 표 1참조).
    2. 총에서 3-5 패를 선택 하려면이 절차를 반복 합니다. 여러 패를 따기의 목적은 성공적인 접종 되도록 패 희미 한 박테리아 식민지와 비교할 때 상대적으로 작은 수로. 성장 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 8 h에 대 한 플 라크.
  10. 문화를 성장 하 고 당황 하 게 250 mL 플라스 크에 2YT/칸/tet 매체의 50 mL에의 한 튜브를 전송 합니다. 37 ° C에 하룻밤 약 12 h에 대 한 200 rpm에서 떨고 함께 성장 한다.
  11. 3 2-L 당황 하 고 플라스 크 하룻밤 문화의 5 mL와 함께 superbroth/tet/칸 매체의 900 mL를 포함 하 접종 OD600 0.6-0.8 주위에 6-7 h 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 품 어.
  12. 3 부드러운 상수 소용돌이 손으로와 5 분 동안 얼음 목욕에서 세균성 문화 flasks을 진정. 다음 단계는 prechilled 솔루션 및 장비와 얼음, 차가운 룸에서 이루어져야 한다.
  13. 흡 광도 조직 수건을 사용 하 여 각 플라스 크;의 외부 유리를 건조 한 손으로 사용 하 여 경사 벤치에 다른 손을 부드럽게 각 플라스 크에서에서 매체 각 원심 분리기 병에 부 어 1 L 압력가 원심 병.
  14. 스핀 5000 × g에서 10 분 작은 박테리아. 4 ° C
  15. 원심 분리, 다음 부드럽게 가만히 5 L 압력가 폐기물 비 커에는 상쾌한을 따르다.
  16. 100 mL의 멸 균 필터링 1.0 mM HEPES, pH 7.4, 각 병 채우기 고 200 rpm에서 물의 resuspension 펠 릿에에서 도움이 각 병 압력가 자석 볶음 바 추가. 소용돌이 자석 교 반 중 몇 분 마다 병 벽에서 전체 펠 릿을 꺼내. 일단 펠 릿을 녹 각 병을 살 균 필터링 1.0 mM HEPES, pH 7.4의 추가 400 mL을 채우십시오.
  17. 원심 분리기 5000 × g에서와 4 ° C 10 분 Decant 상쾌한, 병에 저 어 바 유지에 대 한.
  18. 한 번 1.16 1.17 단계를 반복 합니다.
  19. 저 어 바의 도움으로 살 균 필터링 10% 초순 글리세롤의 500 mL에 각 펠 릿을 resuspend. 소용돌이 자석 교 반 중 몇 분 마다 병 벽에서 전체 펠 릿을 꺼내.
  20. 원심 및 단계 1.17에서 가만히 따르다. 1.19 단계를 한 번 반복 합니다. 긴 팔 압력가 마로 소독 집게를 사용 하 여 저 어 바 제거.
  21. 5000 × g와 15 분 Decant는 상쾌한 4 ° C에서 원심 고 각 원심 분리기는 피 펫 병에서 상쾌한의 남아 있는 흔적을 제거 합니다.
  22. 한 병에 10% 초순 글리세롤의 3.0 mL를 추가 하 고 부드럽게 pipetting으로 펠 릿을 resuspend. 다음 병에 정지를 전송 하 고 알 약의 모든 resuspended 고 한 병에 결합 될 때까지 반복 합니다. 고 농도 세포의 약 6 mL11 cfu/mL 주위 3 x 10의 titer로 가져옵니다.
  23. 전 진정 압력가 microcentrifuge 1.5 mL 튜브 및이 단계 전에 적어도 1 시간을 위한-80 ° C에서 분배자 없이 한 96-잘 튜브 저장 상자. 셀 펠 렛 서 스 펜 션의 aliquots를 pipetting 전에 얼음 차가운 방에 미리 냉장된 microcentrifuge 튜브 전송. 각 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 세포 현 탁 액의 aliquot 350 μ를 피 펫을 사용 합니다.
  24. 거품 상자 컨테이너 가득 플래시 동결에 액체 질소로 (3-5 분)에 aliquots를 전송 합니다.
    1. 거품 상자-80 ° C 냉장고를 액체 질소로 전송 (1.23 단계 참조).
    2. -80 ° C 냉장고에서 1.5 mL microcentrifuge 튜브 저장 상자를 제거 (1.23 단계 참조) 얼음에 넣어.
    3. 신속 하 게 체 액체 질소에서 aliquots 튜브 저장소 상자에 그들을 배치 하는 금속 메시를 사용 합니다. -80 ° c.에 게
      주의: 액체 질소 화상을 일으킬 수 있다 고 주의 안전 보호를 위해 해야 한다. 팹 백본 phagemid를 사용 하 여 (팹 백본 phagemid 주식 400 ng / µ L에서 초순 (MilliQ)에 있어야 합니다) 준비 된 전기 유능한 세포의 효율성을 확인 하기. 10 µ L의 초순에 팹 백본 phagemid의 1 μ g, 얼음, 전기 유능한 SS320의 약 350 μ 수 thaw 그리고 얼음에 0.2 cm 간격 electroporation 멧 prechill.
  25. 녹고 후 10 µ L DNA에 350 μ 전기 유능한 SS320 셀을 추가 하 고 얼음 혼합물을 유지 하면서 여러 번 pipetting으로 혼합. 거품을 소개 하지 마십시오.
  26. 미리 15 mL 50 mL 튜브 electroporation 전에 적어도 30 분 동안 37 ° C 물 목욕에 SOC 매체의 따뜻한. 에 베트를 360 μ 혼합물을 전송 하 고 electroporation 제조업체의 지침에 따라 수행 합니다.
  27. 즉시 (단계 1.27)에서 미리 데워 SOC 매체의 1 mL을 추가 하 고 pipetting 여 electroporation 후 셀 구조. 미리 미리 따뜻하게 soc 5 mL 로드 125 mL 플라스 크에는 베트에서 매체를 전송
  28. 린스는 멧 두 번, 각각 미리 따뜻하게 SOC 매체의 1 mL와 함께 시간과 125 mL 플라스 크에 매체를 전송 (단계 1.27 참조). 미리 데워 진된 SOC 매체 125 mL 플라스 크에 10 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다.
  29. 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 30 분 동안 10 mL 세포 배양 품 어.
  30. Transfection 효율 및 M13KO7 감염 이전의 속도 확인 하려면 직렬 희석을 확인 합니다.
    1. 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 각 잘 96-microwell 접시의 단일 열에 2YT 미디어의 180 μ를 추가.
    2. 8 열 배 직렬 게 희석: pipetting, 혼합 판의 첫 번째 우물을 단계 1.29에서에서 문화의 20 μ를 전송 하 고 잘 다음 혼합물의 20 μ를 전송. 직렬 희석의 끝에이 단계를 반복 합니다.
    3. 플레이트 중복에서 파운드/수화물, 파운드/칸, 그리고 파운드/tet 접시에 각 직렬 희석의 10 μ.
    4. 37 ° c.에서 밤새 품 어
    5. 효율 계산 공식: M 희석된 배 10N 에서 계산 평균 지 수는 가정 (N은 1-8에서). 팹 백본 phagemid LB/수화물 접시에서의 대장균 SS320 전기 유능한 세포 transfection 효율은N + 3 M X 10 cfu / µ g. M13KO7 사전 감염 속도 LB/칸에 LB/tet 식민지의 비율에서 추정 된다. 대장균 SS320 유능한 세포 팹 백본 phagemid와 페의 비율 LB/수화물 및 LB/칸에서 식민지의 비율에서 추정 된다.

2. Phagemid 템플릿에서 Uracil 포함 된 ssDNA (뒤-ssDNA) 준비

참고: A는 이전 팹 백본 phagemid 뒤 ssDNA 준비15에 대 한 템플릿으로 사용 되었다 보고. 팹 백본 phagemid의 아키텍처는 그림 2에 표시 됩니다. 플라스 미드 스핀 키트 (QIAprep 스핀 M13) 약간의 수정을 뒤 ssDNA의 추출에 사용 됩니다.

  1. 미리 살 균 루프 또는 미리 따뜻하게 LB/cmp 접시에 팁 1 h. 행진 대장균 CJ236 셀 (또는 다른 dut−/ung− 스트레인)의 글리세롤 주식 밖으로 대 한 37 ° C 배양 기에서 LB/cmp 플레이트 (준비 및 저장에서 4 ° C 미만 1 주 된) 따뜻한. 약 12-15 h 37 ° C 하룻밤 사이에서 격판덮개를 품 어.
  2. 멸 균 팁 하나의 식민지를 선택 하 고 폴 리 프로필 렌 14 mL 라운드 하단 튜브에 2YT/cmp 매체의 2 mL에 접종.
  3. OD600 0.4-0.8 (로그 단계 성장) 주변에 도달할 때까지 3-4 h 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 매체를 품 어.
  4. 문화, 팹 백본 서식 파일의 5-10 μ 페이지를 추가 하 고 살 균 소 감염 수 있도록 30 분 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 품 어.
  5. 부 화, 후 37 ° c.에 미리 따뜻하게 LB/수화물 접시에 문화의 10 μ 밖으로 행진 하 멸 균 팁 사용 약 12-15 h 37 ° C 하룻밤 사이에서 품 어.
  6. 접종 3 mL 2YT/수화물/cmp 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 튜브,의 시작 문화 성장과 37 ° C에서 약 12 h에 대 한 하룻밤 200 rpm에서 떨고와 대장균 CJ236 포함 팹 백본 phagemid의 단일 식민지를 선택 합니다.
  7. 당황 하 게 250 mL 병에서 30 mL 2YT/수화물/cmp로 0.3 mL 스타터 문화를 예방.
  8. OD600 0.4-0.8 (로그 단계 성장) 주변에 도달할 때까지 3-4 h 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 세포 배양 품 어.
  9. 추가 M13KO7 (약 1 x 1013 cfu/mL의 실험실 재고, titer)에서 문화에 약 10의 감염 (MOI)의 다양성을 가진 2.8 단계 M13KO7의 마지막 titer 이며 약 1 x 1010 cfu/mL.
  10. 200 rpm에서 1 h 동안 37 ° C를 품 어.
  11. 50 mL 라운드-하단 튜브 5000 × g 및 20 분 동안 25 ° C에서 원심 분리 하 여 문화를 작은.
  12. 가만히 따르다는 상쾌한 고 신선한 2YT/수화물/칸/uridine의 30 mL와 펠 릿을 resuspend. 새로운 250 mL 절망 속된 병에 있는 물의 resuspension 전송.
  13. 200 rpm 및 22-24 h에 대 한 25 ° C에서 품 어.
  14. 50 mL 라운드-하단 튜브에 단계 2.13에서에서 문화를 전달 하 고 세균성 세포 펠 릿에서 표면에 뜨는 페이지를 분리 하는 문화 20 분 12000 × g에서 원심. 새로운 50 mL 라운드-하단 튜브로 표면에 뜨는 페이지를 전송 하 고 추가 1/5 페이지 침전을 못/NaCl 솔루션의 최종 볼륨. 잘 혼합 하 고 30 분 살 균 소 입자를 침전 얼음에 품 어.
  15. 12000 × g에서와 4 ° C 원심 30 분 Decant는 상쾌한에 대 한 고 2 분에 대 한 4000 × g와 4 ° C에서 원심 분리기 남아 상쾌한 발음.
  16. 2 ml PBS와 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 1 살 균 필터링의 살 균 소 펠 릿을 resuspend. 모든 나머지 세균 파편을 제거 하 고 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브 표면에 뜨는 페이지 전송 4 ° c.에 저장 벤치탑 microcentrifuge에서 5 분 12000 × g에서 원심
  17. E. 콜라이 SS320와 나란히 비교 통해 대장균 CJ236의 uracil 법인 효율성을 확인 하십시오.
    1. 2YT 미디어의 180 μ 96 잘 접시의 한 행의 각 음을 추가 합니다.
    2. 10 10 배 직렬 게 희석: 판의 첫 번째 잘 20 μ 표면에 뜨는 페이지의 전송, pipetting, 혼합 및 다음 잘 혼합의 20 μ를 전송. 직렬 희석의 끝에이 단계를 반복 합니다.
    3. 마지막 8 개의 직렬 희석 CJ236 대장균 및 대장균 SS320 90 μ 로그 단계에서 감염에서 살 균 소의 10 μ를 추가 (OD600 = 0.4-0.8). 부드러운 진동으로 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    4. 플레이트 각 감염 대장균 CJ236에 중복에서 2YT/수화물 접시에 대장균 SS320의 직렬 희석에서 10 μ.
    5. 37 ° c.에서 밤새 품 어
    6. Titer 계산 공식: M 희석된 배 10N 에서 계산 평균 지 수는 가정 (N은 1-10에서). 대장균 CJ236 또는 대장균 SS320 titer가N + 2 M X 10 cfu/mL와 같습니다. CJ236 대장균 및 대장균 SS320 titer 비율에서 uracil 관 효율을 견적 한다.
  18. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 표면에 뜨는 페이지에 페이지 강수량 버퍼 MP의 1/100 볼륨을 추가 하 고 여러 번 섞어 부드럽게 거꾸로 차례. 적어도 2 분 살 균 소 입자는 문화 매체에서 시 켰 던에 대 한 RT에서 품 어 하 고 따라서, 흐린 솔루션 표시 되어야이 시점에서.
  19. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 단계 2.18 플라스 미드 스핀 열 (예를 들어, QIAprep)에 샘플을 적용 됩니다. SsDNA 한 스핀 열 바인딩 용량에 도달할 수 10 µ g. 원심 분리기 6000 × g 30 25 ° C에서 벤치탑 microcentrifuge에 s. 흐름-microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 통해 삭제 합니다. 살 균 소 입자는이 단계에서 열 매트릭스에 바인딩된 남아 있습니다.
  20. 열에 UT MLB 살 균 소 세포 및 바인딩 버퍼 ( 토론참조)의 0.7 mL을 추가 하 고 적어도 1 분 동안 RT에서 품 어.  6000 x g와 25 ° C 30 s와 흐름을 통해 삭제에 대 한 원심.
  21. UT-MLB 버퍼의 또 다른 0.7 mL을 추가 하 고 적어도 1 분 동안 RT에서 품 어.
  22. 플로우 스루 30 s. 폐기를 위해 6000 × g에서 원심. 이 단계에서 살 균 소의 외 투 단백질 열 매트릭스에 바인딩된 남아 뒤 ssDNA에서 분리 된다.
  23. 워시 버퍼 PE 포함 에탄올 제조업체의 지침에 따라 0.7 mL를 추가 합니다. 30 s를 통해 흐름 삭제 6000 × g에서 원심.
  24. 반복 단계 2.23, 다음 한 번 더 30 6000 × g에서 원심 잔여 버퍼 PE를 제거 하는 s.
  25. 새로운 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 열을 전송 하 고 추가 차입 버퍼 EB (10 m m Tris·의 100 μ CL, pH 8.5) 열 막의 센터에.
  26. 10 분, 1 분 뒤 ssDNA elute 6000 × g에서 원심 분리기에 대 한 RT에서 품 어. 약, 1.5-2.5 μ g 뒤-ssDNA/mL 문화 얻어질 수 있다.
  27. 태 젤 1 %agarose electrophoresing 1 μ에 의해 eluted DNA를 분석. DNA는 아무 번짐으로 주로 단일 밴드로 표시 되어야 합니다.
  28. 260에 nanodrop 분 광 광도 계에 흡 광도 측정 하 여 DNA 농도 결정 nm (260 = 1.0 ssDNA의 33 ng/μ에 대 한). 전형적인 뒤 ssDNA 농도 200-500 ng/μ 내에 있습니다.

3. Kunkel 메서드 기반 Mutagenesis Oligonucleotide 감독

노트: 그것은 돌연변이 oligonucleotide 및 반응 부품의 품질을 보장 하기 위해 전체 규모 반응 전에 소규모 반응을 수행 하는 것이 좋습니다. Kunkel의 방식 만화 oligonucleotide 감독 mutagenesis는 그림 3에 표시 됩니다. 다양 한 아미노산 다양성 IMGT 명명법16 (표 2) 번호와 CDRH1, CDRH2, CDRH3, 및 CDRL3 지역으로 소개 된다. 각 CDR의 이론적인 아미노산 다양성, 총 이론적인 아미노산 성과 oligonucleotide 시퀀스는 표 2에 나열 됩니다.

  1. T4 polynucleotide 키와 oligonucleotide 인 산화
    1. 2 μ 10 X TM 버퍼, 2 μ 10mm ATP, 1 μ 100mm DTT와 단일 CDR을 변형 하도록 설계 된 돌연변이 oligonucleotides의 0.6 μ g를 결합 한다. 1.5 mL 튜브에 18 μ의 전체 볼륨에 초순 h 조2O를 추가 합니다. 라이브러리 건설에 대 한 4 별도 및 병렬 인 산화 반응에 해당 하는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, 그리고 CDRL3, 각각 설정 됩니다.
    2. 20 U를 추가 (2 uL) T4 polynucleotide 키 각각의 튜브와 37 ° C (반응 1 표 3)에서 1 시간에 품 어. 사용 하 여 즉시 어 닐 링입니다.
  2. 서식 파일에 oligonucleotides의 어 닐 링
    1. 뒤 ssDNA 템플릿의 20 μ g, 0.5 mL 튜브에 250 μ의 최종 볼륨을 10 X TM 버퍼의 25 μ, 각 phosphorylated oligonucleotide 솔루션 및 초순 H2O의 20 μ 추가. 잘 혼합 하 고 표 3에 반응 2로 0.20 mL PCR 튜브 (각 50 μ)로 전송. 이러한 DNA 수량 oligonucleotide 및 서식 파일의 길이 비율 1: 100 이라고 가정 하면 oligonucleotide 템플릿, 사이 3: 1의 몰 비율을 제공 합니다.
    2. 품 어는 PCR 기계 90 ° C에서 3 분, 3 분, 50 ° C에서에서 반응 하 고 5 분 동안 20 ° C.
  3. CCC dsDNA의 효소 합성
    1. 250 μ 단련 oligonucleotide/템플릿 혼합물에 10mm ATP의 10 μ, 25mm dNTP 믹스의 10 μ, 100 mM DTT의 15 μ, 30와 이즈 단위 T4 DNA 리가, 그리고 30 U T7 DNA 중 합 효소 반응 3 표 3에 추가 합니다.
    2. 하룻밤 20 ° C에서 1.5 mL 튜브에 반응을 품 어.
    3. 세척 하 고 합성된 CCC dsDNA 실시간에 30 kDa 기 공 크기 막으로 0.5 mL 원심 필터 장치에 집중
      1. 필터 장치에 하룻밤 반응 혼합물을 전송 하 고 400 µ L 최종 볼륨을 초순 h 조2O를 추가 합니다. 10 분;에 대 한 14000 × g에서 회전 볼륨은 50 미만 μ.
      2. 삭제를 통해 흐름 필터, 초순 H2O의 400 µ L을 추가 하 고 10 분 14000 × g에서 회전.
      3. 3.3.3.2 단계를 한 번 더 반복 합니다.
      4. CCC dsDNA를 복구 하려면 깨끗 한 microcentrifuge 튜브에 필터를 거꾸로 놓습니다. 2 분;에 대 한 1000 × g에서 회전 복구 볼륨은 일반적으로 약 20-40 μ. 복구 된 CCC dsDNA electroporation 대장균 의 즉시 사용 하거나 나중에 사용-20 ° C에서 냉동 수 있습니다. 일반적으로 20-40 μ g CCC DNA는 얻을 수 있습니다.
    4. 반응의 결과 시각화 뒤 ssDNA 템플릿 함께 eluted 반응 제품의 1.0 µ L electrophorese

4. Electroporation 및 라이브러리 크기의 계산

  1. 순화 CCC dsDNA 진정 (50 μ의 최대 볼륨에 20 μ g)는 1.5 mL microcentrifuge와 얼음에 0.2 cm 간격 electroporation 베트.
  2. 미리 20 mL 50 mL 폴 리 프로필 렌 원뿔 원심 분리기 튜브 적어도 30 분 동안 37 ° C 물 목욕에 SOC 미디어의 따뜻한.
  3. 전기 유능한 대장균 의 350 μ 약 수를 녹여 얼음에 SS320. DNA를 혼합 셀 추가 철저 하 게 여러 번 pipetting으로 합니다. 거품을 소개 하지 마십시오.
  4. 베트에 혼합물을 전송 하 고 electroporation 제조업체의 지침에 따라 수행 합니다. 예를 들어 BTX ECM-630 electroporation 시스템을 사용 하는 경우 관련 설정은 2.5 kV 강도, 125 Ω 저항, 및 50 µ F 커패시턴스 있습니다.
  5. 즉시 미리 따뜻하게 SOC 매체의 1 mL을 추가 하 고 17 mL 125 mL 플라스 크에 SOC 매체의 전송 여 electroporated 세포 구조. 동일한 플라스 크에 SOC 매체 및 전송의 1 mL로 두 번 베트 린스 (최종 볼륨은 20 mL).
  6. 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 30 분 동안 품 어.
  7. Electroporation 효율을 결정 합니다.
    1. 각 잘 96-microwell 접시의 단일 열에 2YT 미디어의 180 μ를 추가 합니다.
    2. 8 10 배 직렬 게 희석: 20 mL 문화 20 μ 판의 첫 번째 잘 전송, pipetting, 혼합 및 다음 잘 혼합의 20 μ를 전송. 직렬 희석의 끝에이 단계를 반복 합니다.
    3. 플레이트 각 중복에서 한 파운드/수화물 접시에 직렬 희석 10 μ. 각 식민지 수 크로스-검사에 대 한 별도 LB/수화물 접시에 직렬 희석의 남은 100 µ L 플레이트. 이 접시도 ELISA와 시퀀스 분석 (섹션 5 참조)에 대 한 단일 클론을 제공 합니다.
    4. 37 ° c.에서 밤새 품 어
    5. LB/수화물 접시에 10 μ 중복에서 식민지를 계산 합니다. M을N 숫자 계산된에 10 파운드/수화물 플레이트 (N은 1-8에서) 배 평균 식민지 가정 합니다. 총 도서관 크기는 2 M 10N + 3 식민지 배와 같습니다.
  8. 약 수 페이지 라이브러리 생성을 위한 2YT/수화물/칸 매체의 두 2-L 당황 하 고 플라스 크, 각 포함 500 mL에 똑같이 4.6 단계에서 문화.
  9. 하룻밤 사이 약 16 h에 대 한 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 품 어.
  10. 2 1-L 압력가 원심 병 및 4 ° c.에 12000 × g에서 30 분 동안 원심 분리기를 문화를 전송
  11. 두 개의 새로운 압력가 분리기 1 L 병은 상쾌한 전송 및 1/5을 추가 페이지를 침전을 못/NaCl 솔루션의 최종 볼륨. 30 분 동안 얼음에 품 어.
  12. 12000 × g에서 30 분 및 4 ° c.에 대 한 원심 분리기 신중 하 게는 상쾌한 가만히 따르다 하 고 살 균 소 펠 릿의 방해 하지 않도록. 4000 x g에서 1 분 동안 회전 시키십시오 그리고 제거는 피 펫과 나머지 상쾌한.
  13. 1 X PBS 버퍼 살 균 필터링 및 새로운 50 mL 튜브에 20 mL와 함께 살 균 소 펠 릿 resuspend
  14. 12000 × g에서 5 분 및 4 ° c.에 대 한 centrifuging 여 불용 성 물질을 작은 새로운 50 mL 튜브에는 상쾌한을 전송.
  15. 분 광 광도 계에 의해 살 균 소 농도 측정 (OD268 = 5 × 1012 살 균 소/mL의 솔루션에 대 한 1.0).
  16. 5 X 1012 살 균 소/ml 10% 초순 글리세롤과 1 X PBS에 살 균 소 농도 조정 합니다.
  17. Aliquot 1 mL 당 1.5 mL microcentrifuge 튜브 살 균 소 솔루션의. 이동에 대 한 라이브러리를 즉시 사용 하는 방법 또는-80 ° c.에 저장

5. 품질 평가 단백질 A / L 직접 바인딩 ELISA 분석 결과 및 시퀀싱

  1. 무작위로 각 잘에서 2YT/수화물의 800 μ를 포함 하는 깊은 96 잘 문화 접시에 단계 4.7.3에서에서 LB/수화물 접시에 96 단일 식민지를 선택 하십시오. OD600 1000 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 3-4 h에 대 한 품 어 0.4-0.8 =.
  2. M13KO7의 100 μ를 추가 (1 X 1011 cfu/mL) 각 96-깊은 우물을 잘 플레이트 멀티 채널 피 펫 문화. 1 시간에 1000 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 품 어.
  3. 멀티 채널 피 펫 각 잘 하 대 (500 μ g/mL)의 10 배 농도 포함 하는 2YT의 100 μ를 추가 합니다. 1000 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 밤새 품 어.
  4. 1 X PBS에서 1 µ g/mL를 L 단백질 분해. 코트 3/4는 웰 스의 384-잘 높은 단백질 바인딩 폴리스 티 렌 접시 30 µ L/L 단백질 해결책의 잘. 4 ° c.에서 밤새 품 어
  5. 5.4 단계에서 하룻밤 단백질 L 코팅 솔루션을 삭제 합니다. 50 µ L M PBST의 추가 (차단 솔루션) 모든 멀티 채널 피 펫과 384-잘 높은 단백질 바인딩 폴리스 티 렌 격판덮개 우물. 실시간에서 1 시간에 대 한 미 판 통에 번호판을 품 어
  6. 4 ° c.에서 10 분 동안 3000 x g에서 깊은 96 잘 문화 접시에 단계 5.3에서에서 하룻밤 문화 아래로 회전 페이지는 상쾌한입니다.
  7. 단계 5.5에서에서 차단 솔루션을 삭제 합니다. 3 3 중, 고 1 비 코팅 잘 부정적인 제어 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 단백질 코팅 L 우물의 15 μ M PBST의 및 각 페이지 표면에 뜨는 (5.6 단계)의 15 μ를 추가 합니다. 200 rpm 동요와 1 시간에 대 한 RT에서 품 어.
  8. 살 균 소 솔루션을 삭제 합니다. 6 번 자동된 접시 세탁기에 의해 PBST의 80 μ와 접시 세척.
  9. 각 잘 멀티 채널 피 펫을 15 μ M PBST의와 15 μ 단백질 A-HRP (1:1, 500 1 X PBS에 희석)를 추가 하 고 1 시간에 대 한 약 200 rpm에서 떨고와 RT에서 품 어.
  10. 단백질 A-HRP/M-PBST 솔루션을 삭제 합니다. 6 번 PBST의 80 μ와 접시 세척.
  11. 멀티 채널 피 펫을 TMB 기판 (30 μ/잘)을 추가 하 고 색상 개발 될 때까지 2-3 분 동안 품 어. 1.0 M H3포4 (30 μ/잘) 반응을 중지 합니다.
  12. Spectrophotometrically 450에서 번호판을 읽기 nm. 긍정적인 클론 M-PBST 잘 3.0 보다 큰에 단백질 L 우물의 OD450 흡 광도의 평균 비율을 전시 하는 그 정의 됩니다.
  13. 96-깊은에서 잘, 실시간에서 30 분 동안 엘리 사 (5.6 단계) 사용 같은 살 균 소의 5 μ와 로그 단계에서 2YT/tet에 SS320의 50 μ를 감염
  14. 단계 5.13에서에서 96-깊이에 2YT/수화물의 950 μ를 추가 하 고 1000 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 밤새 품 어.
  15. 소형 예비 DNA 추출 키트에 의해 phagemid DNA를 추출 합니다. VL의 업스트림 뇌관을 사용 하 여 (5'-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3') 및 VH (5'-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3') 시퀀스 분석 라이브러리 시퀀스 다양성 예측을 위해.

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Representative Results

팹 도서관 건축의 흐름 차트를 다음 ( 그림 1참조) 우리는 M13KO7 도우미 페이지 미리 감염 대장균 SS320 전기 유능한 세포 준비. 도서관 건축을 위한 팹 phagemid 백본 사용 되었다 때 이러한 전기 유능한 세포의 효율성 2 X 109 cfu / µ g로 추정 된다 (그림 4).

Uracil 관 효율 비교 하 여 CJ236 대장균 과 대장균 SS320 세포에서 titer의 되었다 검사. CJ236 대장균 및 대장균 SS320 셀 뒤 ssDNA를 은닉 하는 살 균 소 감염 했다. E. 콜라이 SS320는 효소 (dUTPase 및 uracil glycosylase) uracil-포함 된 DNA를 대장균 CJ236이이 효소 부족 uracil 포함 된 DNA를 저하 수 없습니다 하는 동안 저하 될 수 있습니다. 허용 uracil 법인 효율성을 달성 하기 위해, 대장균 CJ236에서 titers 대장균 SS320에서 그 보다 높은 104 회 해야 합니다. 그렇지 않으면 야생 타입 인구 비효율적인 uracil 설립으로 인해 생성 된 항 체 라이브러리에서 증가할 것 이다. 그림 5 페이지 ssDNA에 효율적인 uracil 법인을 나타내는 대장균 CJ236에서 titer 약 3 × 105 배 이상의 대장균 SS320에서 그는 보여주었다.

다음으로, 우리는 준비 하 고 뒤 ssDNA를 추출. 뒤 ssDNA 순도 agarose 젤 전기 이동 법 (그림 6)에 의해 검사 됩니다. Oligonucleotide 감독 mutagenesis 실시 그리고 CCC DNA에 뒤 ssDNA 변환의 효율성 평가 되었다 (그림 6). 뒤 ssDNA 보다 낮은 운동 성 3 제품 젤 빠른 실행 밴드 (CCC-dsDNA), 중간 약한 밴드 (긁어 밴드), 그리고 느린 실행 밴드 (DNA 가닥 전치)를 포함 하 여에 구상 될 수 있다.

E. 콜라이 SS320으로 electroporation, 후 라이브러리 크기 하룻밤 배양 접시에서 견적 되었다 (단계 4.7.5 참조). 평균 라이브러리 크기는 5 X 109 파운드/수화물 접시 (그림 7)에 중복 직렬 희석에서 했다. 그러나,이 단계에서 예상된 크기 하거나 하지 않는 한 frameshift의 존재로 인해 팹을 표시 또는 정지 codon, misfolded 팹 표시 페이지를 포함할 수 있습니다. 시퀀싱 및 ELISA 생성 된 라이브러리의 기능적 다양성을 추정 하 사용 되었다. 96 무작위로 고른된 단일 클론 시퀀싱 분석을 위해 보내졌다. 표 4 는 90에서 96 무작위로 고른된 단일 클론 했다 성공적으로 시퀀싱, 야생-타입 시퀀스 (53 클론 하나 이상 CDR 돌연변이) 및 17 조 숙한 정지 codon 없이 70 클론 및 20를 포함 하는 다른 지역에서 조 숙한 정지 codon입니다. 70 클론 내 돌연변이 CDRH1, CDRH2, CDRH3, 및 CDRL3의 요금은 50%, 57%, 53% 및 56%, 각각, 동안 적어도 하나의 CDR로 돌연변이 율은 76% 합니다. 조 숙한 정지 codon (90%)와 20 클론에 조 숙한 정지 codon oligonucleotide mutagenesis 뇌관, 45% (CDRH1), 10% (CDRH2), 15% (CDRH3), 20% (CDRL3) 등의 frameshift에서 주로 파생 되었다.

제대로 접힌된 팹, 단백질 A의 디스플레이 감지 하려면 / L 엘리 사를 기반으로 단백질 및 단백질 L 프레임 워크 VH와 VL 프레임 워크, 각각17,18의 적절 한 접는 인식할 수 알려진 대로 고용 되었다. 시퀀싱 분석, 계약 3 (그림 8) 중에 ELISA 분석 결과가 보였다 동안 야생-타입 시퀀스 17 클론 모두 긍정적인 긍정적인 비율 때 조 숙한 정지 codon 20 클론 모두 부정 했다 3.0에서 경험적으로 설정 합니다. 적어도 하나의 CDR 돌연변이와 53 클론에 대 한 43 클론 긍정 했다 ELISA에 10 클론은 부정적인; 이 클론의 대부분 10 클론에서 Cdr 팹 접는에 해로운 효과 가질 수 있는 동안에 잘 접혀 했다 나타냅니다. 총에서 90 클론 (48%)에서 43 클론 잘 접혀 있었다 고 하나 이상 CDR 돌연변이 포함. 따라서, 생성 된 라이브러리의 기능 아미노산 다양성 단백질 A에 따라 L ELISA와 시퀀스 분석 2.4 X 10으로 추정 했다 /9 (즉, 5 X 109의 48%).

Figure 1
그림 1: 페이지 표시 팹 도서관 건축의 개요. 페이지 표시 팹 도서관 건설 기본 일련의 단계를 따릅니다. 그것은 높은 효율 전기 유능한 세균성 세포의 준비, 추출 뒤 ssDNA Kunkel의 방식 oligonucleotide 감독 mutagenesis, electroporation, 살 균 소 팹 라이브러리 크기, 기능 평가의 계산의 포함 단백질 A / L 엘리 사, 그리고 DNA 순서 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: Phagemid 팹 도서관 건축을 위한 건축. 단일 가닥 (f1 오 라) 및 더블-좌초 (dsDNA 오 라) DNA의 기원 이루어져 phagemid 등뼈의 기본 기능, 및 암 피 실린/carbenicillin 저항 유전자 (AmpR). 팹 디스플레이 (PhoA), 알칼리 성 인산 가수분해 효소 발기인의 통제는 phagemid 포함 bicistronic 카세트 드라이브 식 및의 분 비: 체인 (LC)로 구성 된 분 비 신호, VL (경 쇄의 변하기 쉬운 지구), CL (상수 빛 빛 체인의 지역), 그리고 C 터미널 플래그 태그; 그리고 무거운 체인 (HC) 분 비 신호, VH (무거운 체인의 가변 영역), 그리고 c h 1의 구성 된 p3 살 균 소 작은 외 투 단백질으로 융합 하는 (일정 지역 무거운 체인의 1). 대장균 periplasm 내 팹으로 경 쇄와 무거운 체인의 어셈블리 페이지 표면에 팹의 디스플레이 지시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: Kunkel의 방법의 회로도 기반 oligonucleotide 감독 mutagenesis. 이 프로토콜에서 우리 뒤 ssDNA 서식 파일 준비 Kunkel의 방법 사용. CDRH1, CDRH2, CDRH3, 및 CDRL3에 대 한 설계 다양성 oligonucleotides phosphorylated, 서식 파일, 단련 있으며 CCC dsDNA ss DNA 변환 하는 데 사용. 대장균 SS320 전기 유능한 세포에 electroporation, 다음 heteroduplex DNA 복구 야생 타입 또는 돌연변이 형태; 야생 타입 스트랜드에서 uracil의 존재로 인해 복구 프로세스 호의 돌연변이 형태 그리고 돌연변이 양식 라이브러리를 지배 하는 따라서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4:는 M13KO7의 추정 중 감염 대장균 SS320 전기 유능한 셀 효율. 유능한 세포의 electroporation 효율성 확인 phagemid 백본 벡터 사용 되었다. 효율성을 계산 하는 수식을 다음과 같이 이다: M 가장 희석된 배 10N 에서 계산 평균 지 수는 가정 (N은 1-8에서) 중복에서. 대장균 LB/수화물 접시에서 SS320 효율성은 M X 10N + 3 cfu / µ g. 전기 유능한 세포의 효율은 약 2 × 109 cfu / µ g. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: CJ236 대장균 및 대장균 SS320 세포의 살 균 소 감염에 의해 ssDNA로 uracil 설립의 평가. Kunkel의 방법에 따라, uracil 관 효율 CJ236 대장균 과 대장균 SS320 세포에서 살 균 소 감염 titer의 비교에 의해 검사 된다. titer 계산 공식은 다음과 같습니다: M 가장 희석된 배 10N 에서 계산 평균 지 수는 가정 (N은 1-10에서), 그리고 그 대장균 CJ236 또는 대장균 SS320 titer가N + 2 M X 10 cfu/mL. Uracil 관 효율 CJ236 대장균 및 대장균 SS320 titer 비율에서 추정 될 수 있습니다. 3 X 107 cfu/mL에 대장균 SS320 titer 동안 대장균 CJ236에서 titer 9 X 1012 cfu/mL 이었다. CJ236 대장균 및 대장균 SS320 titer 비율 3 X 105이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: CCC-dna oligonucleotide 감독 mutagenesis에 의해 뒤 ssDNA의 변환. Mutagenesis oligonucleotide 지시에 따라 CCC dna 뒤 ssDNA 변환의 효율성 평가 되었습니다. 뒤 ssDNA dsDNA 완전히 변환 되었다. 지배적인 밴드는 CCC dsDNA 긁어 dsDNA와 DNA 가닥 난민의 작은 부분입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: 라이브러리 크기의 계산에 대 한 살 균 소 적정. E. 콜라이 SS320으로 electroporation, 후 라이브러리 크기 LB/수화물 접시에 직렬 희석에서 추정 되었다. 크기 계산 공식은 다음과 같습니다: M (N은 1-8에서) 2YT/수화물 플레이트에서 가장 희석된 배 10N 에서 계산 하는 평균 식민지 수, 크기는 10N + 3X 2 M 가정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8: 단백질 A / L 직접 바인딩 살 균 소 ELISA. 단백질 L 잘 접힌된 카파 경 쇄 VL의 프레임 워크와 단백질 수 인식 잘 접힌된 무거운 체인 VH의 프레임 워크를 인식할 수 있습니다. 단백질 L과 A와 팹의 바인딩 무거운 체인 및 빛 체인의 적절 한 접는 나타냅니다. 간단히, 3 중에 부정적인 제어 M PBST 단백질 L 플레이트 코팅 했다, 다른 클론에서 팹 살 균 소 supernatants 단백질 L와 M-PBST, 워시, 그 후 incubated 했다 단백질 A HRP는 바인딩된 팹 살 균 소를 캡처하는 데 사용 되었다. 살 균 소 ELISA 수치가 90 무작위로 고른된 클론 성공적인 시퀀싱 판독 했다. 긍정적으로 클론을 나타내는 임계값 라인은 경험적으로 정의의 비율은 단백질 L에서에서 OD450 흡 광도 값 (오차 막대와 3 중의 평균) 부정적인 제어 대가 3.0 이상. 시퀀싱 분석에 따라 3 개의 그룹에 해당 하는 빨간색 (53 클론), 야생 타입 (WT) 정지 codon 없이 돌연변이 (17 클론), 파랑과 녹색 (20 클론) 정지 codon으로 돌연변이에 표시 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

시 약 설치 구성 요소 금액 의견/설명
2YT 매체 효 모 추출 물 10 g 추가 볼륨을 1.0 l, pH 7.0, 조정에 초순 압력솥.
Tryptone 16 g
NaCl 5 g
2YT 최고 천 효 모 추출 물 10 g 1.0 l는 볼륨을 구성 하 고 pH 7.0, 열 분해, 오토 클레이 브를 조정 초순 물을 추가 합니다.
Tryptone 16 g
NaCl 5 g
입자가 굵은 한 천 7.5 g
2YT/수화물/cmp 매체 Carbenicillin 100 μ g/mL
페니 10 μ g/mL
2YT/수화물/칸/uridine 매체 Carbenicillin 100 μ g/mL
대 50 μ g/mL
Uridine 0.25 μ g/mL
2YT/수화물/tet 매체 Carbenicillin 100 μ g/mL
항생물질 10 μ g/mL
2YT/수화물 매체 Carbenicilin 100 μ g/mL
2YT/칸 매체 대 50 μ g/mL
2YT/칸/tet 매체 대 50 μ g/mL
항생물질 10 μ g/mL
2YT/tet 매체 항생물질 10 μ g/mL
2YT/cmp 매체 페니 10 μ g/mL
LB 매체 한 천 효 모 추출 물 5 g 추가 볼륨을 1.0 l, pH 7.0, 조정에 초순 압력솥. 파운드 천 추가 20 g과 립된 agar의 오토 클레이 브.
Tryptone 10 g
NaCl 10 g
LB/수화물 플레이트 한 천 파운드 1 L
Carbenicillin 100 μ g/mL
LB/tet 플레이트 한 천 파운드 1 L
항생물질 10 μ g/mL
LB/cmp 플레이트 페니 10 μ g/mL
LB/칸 접시 대 50 μ g/mL
SOC 매체 효 모 추출 물 5 g 7.0에 pH를 조정 하 고 1.0 l 볼륨을 초순 추가 압력솥.
Tryptone 20 g
NaCl 0.5 g
KCl 0.2 g
2.0 M MgCl2 5.0 mL
1.0 M 포도 당 20 mL
Superbroth 매체 Tryptone 12 g 900 mL, 초순 추가 압력솥, 압력가 0.17 M KH2포4, 0.72 M K2HPO4의 100 mL를 추가.
효 모 추출 물 24 g
글리세롤 5 mL
Superbroth 칸/tet 매체 대 50 μ g/mL
항생물질 10 μ g/mL
1 X PBS NaCl 137 mM PH 7.2에 조정 압력솥.
KCl 3 m m
나2HPO4 8 m m
KH2포4 1.5 m m
태/agarose 젤 태 버퍼
Agarose 1% (w/v)
GelRed 1:10000 (v/v)
TMB 기판 TMB 50% (v/v)
H2O2 과산화 효소 기질 50% (v/v)
M-PBST 버퍼 1 X PBS 100 ml
트윈-20 0.05% (v/v)
비-지방 우유 가루 5% (v/v)
5 X 못/NaCl 못-8000 20% (w/v) 볼륨 1 L, 그리고 압력솥에 메이크업 초순 물을 추가 합니다.
NaCl 2.5 M
PBST 버퍼 1 X PBS 1 L 0.22 μ m 필터 소독.
트윈-20 0.05% (v/v)
TM 버퍼 X 10 MgCl2 0.1 M 7.5 pH를 조정 합니다.
트리 스 0.5 M
1.0 mM HEPES, pH 7.4 1.0 M HEPES 4.0 mL 0.22 μ m 필터 소독.
초순 수 4.0 L
10% (v/v) 초순 글리세롤 초순 글리세롤 100 ml 0.22 μ m 필터 소독.
초순 수 900 mL
초순 수 H20 Dnase 무료 Rnase, Pyrogen 무료.

표 1: 시 약 설치 합니다.

Table 2
표 2: CDR 다양성 및 mutagenesis 뇌관. CDR 지역 변경 될의 DNA 시퀀스 빨간색; 표시 됩니다. 시퀀스는 IUPAC 뉴클레오티드 코드를 사용 하 여 형식이 지정 됩니다. "X" 나타냅니다 다른 아미노산 집합;을 포함 하도록 설계 되었습니다 혼합에서 트라이-뉴클레오티드 "n" 수가 다른 수 X의 엑스 5 뇌관 다변화 CDRL3 또는 CDRH3, 각각, CDRL3 및 CDRH3의 가변 길이 생성 사용 했다 나타냅니다. 잔류물 번호 IMGT 명명법에 의해 정의 됩니다. 이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

Kunkel의 방식 mutagenesis
반응 1입니다. T4 polynucleotide 키와 oligonucleotide 인 산화
구성 요소 금액 최종
변이 원 성 oligonucleotides 0.6 μ g
TM 버퍼 X 10 2 Μ 1 X
10mm ATP 2 Μ 1mm
100 mM DTT 1 Μ 5 mM
T4 polynucleotide 키 니 아 제 (10 U/μ) 2 Μ 20 U
초순 H20 최대 20 μ
반응 설정
1 단계입니다. 1 시간 동안 37 ° C
반응 2입니다. 서식 파일에 oligonucleotides의 어 닐 링
구성 요소 금액 최종
뒤 ssDNA 템플릿 20 μ g 20 μ g
TM 버퍼 X 10 25 Μ 1 X
phosphorylated CDRH1 oligonucleotides 20 Μ 0.6 μ g
phosphorylated CDRH2 oligonucleotides 20 Μ 0.6 μ g
phosphorylated CDRH3 oligonucleotides 20 Μ 0.6 μ g
phosphorylated CDRL3 oligonucleotides 20 Μ 0.6 μ g
초순 H20 최대 250 μ
반응 설정
1 단계입니다. 3 분 동안 90 ° C
2 단계입니다. 5 분 동안 50 ° C
3 단계입니다. 5 분 동안 20 ° C
반응 3입니다. CCC dsDNA의 효소 합성
구성 요소 금액 최종
단련된 oligonucleotides/템플릿 혼합물 250 Μ
10mm ATP 10 Μ 각 뉴클레오티드의 346 µ M
dNTP 믹스 (각 뉴클레오티드의 25 m m) 10 Μ 각 뉴클레오티드의 865 µ M
100 mM DTT 15 Μ 5 mM
T4 DNA 리가 1 Μ 30와 이즈 단위
T7 DNA 중 합 효소 3 Μ 30 U
반응 설정
1 단계입니다. 하룻밤에 20 ° C

표 3: 절차 및 Kunkel의 방법의 구성 요소 기반 반응.

그룹 복제 수 지역 백분율
아니 조 숙한 정지 codon 70 CDRH1 돌연변이 50% (35/70)
CDRH2 돌연변이 57% (40/70)
CDRH3 돌연변이 53% (37/70)
CDRL3 돌연변이 56% (39/70)
적어도 하나의 CDR 돌연변이 76% (53/70)
조 숙한 정지 codon 20 CDRH1 결함 45% (9/20)
CDRH2 결함 10% (2/20)
CDRH3 결함 15% (3/20)
CDRL3 결함 20% (4/20)
다른 결함 10% (2/20)

표 4: CDRH1, CDRH2, CDRH3, 및 합성 팹 라이브러리에서 CDRL3의 순서 분석.

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Discussion

높은 다양성, 팹 라이브러리 페이지 표시, 품질 관리 구성 하 체크 포인트 전기 유능한 세포, 뒤 ssDNA 서식 파일의 효율성의 품질 역량을 포함 하 여 건설 과정의 다양 한 단계를 모니터링 하는 데 필요한 CCC dsDNA 합성, electroporation, 팹 접는 성과 아미노산 Cdr의 팹 파지 클론의 시퀀스 분석 후 titer.

고수익 뒤 ssDNA의 순도 높은 mutagenesis 속도 대 한 필수적입니다. 우리의 경험에서는, 25 ° C에서 살 균 소 유도 하룻밤 37 ° C에서 살 균 소 유도 하룻밤에서 그 보다 더 뒤 ssDNA를 얻을 수 있습니다. 이것은 이전 보고서19일치 하 여 이다. SsDNA 추출에 관한 초기 플라스 미드 스핀 키트 (QIAprep)는 살 균 소 세포와 바인딩 MLB를 포함. 나중에, MLB 알 수 없는 이유로 단종 되었고 PB로 대체. 우리는 뒤 ssDNA의 수익률은 MLB 치료에서 PB 치료에 비해 훨씬 낮은 발견. 이 프로토콜 우리 MLB 대체 뒤 ssDNA의 수확량은 초기 회전 키트에서와 비슷한 발견을 UT MLB20 이라는 시 약을 사용 합니다.

아미노산 조합 및 비율, 특정 집합으로 맞춤형된 다양성을 소개 하 고 중복 바이어스 및 정지 codons와 같은 타락 한 codons 도입을 제거 하는 항 원 인식21, 가장 다양 한 지역을 CDRH3와 CDRL3 NNK (N/C/G/T;의 아데닌 K, G/T의 아데닌), 삼합체 codon phosphoramidite 기반 oligonucleotides22 정확히 하나의 삼합체 codon 해당 특정 아미노산은 CDRH3 및 CDRL3을 위해 설계 되었습니다 하나 하와. 또한, CDRH3 및 CDRL3 oligonucleotides의 가변 길이 더욱 다양성을 높이기 위해 사용 되었다.

CCC dsDNA의 효소 합성 후 일반적으로 3 개의 악대는 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 관찰 하 고 밴드 얼룩 없이 명확 해야 합니다. 그 중 가장 빠른 실행 밴드 CCC dsDNA electroporation23후 높은 돌연변이 비율 (약 80%)을 얻을 수입니다. 느린 실행 밴드 고유의 스트랜드-변위 T7 DNA 중 합 효소의 활동에서 발생 하 고 낮은 돌연변이 속도 (약 20%)23가닥 난민 DNA 이다. 중간 약한 밴드 T4 DNA 리가 활동 부족 또는 부족 한 oligonucleotide 인 산화 확장 후 DNA는 긁어입니다.

작은 연속 샘플 수영장 비록 정확 하지24라이브러리 다양성을 추정 하 사용 되었다. 진짜 다양성을 정확 하 게 예측 하려면 차세대 시퀀싱 (NGS) 건설된 도서관25의 다양 성과 깊이 광산에서 좋은 옵션이 있을 수 있습니다. 실제로, NGS의 현재 도전 때문 기술 등 읽기 길이, 정확성, 비용, 및 높은 처리량, 약 950의 길이와이 프로토콜에서 사용 하는 팹 페이지 라이브러리의 시퀀싱 혈압 CDRH1, CDRH2, CDRH3, 및 CDRL3에 걸친 아니다 달성; 그러나, 그것은 추정 된 scFv 수 (약 700 bp) 수백만의 범위 내의 라이브러리 다양성24,25. 생성 된 라이브러리의 다양성을 평가 하기 위해 또 다른 주요 표준 라이브러리를 사용 하 여 다양 한 종류의 항 원에 대 한 이동 및 캡처 라이브러리 다양성 직접 항 원의 성공적인 속도와 상관 관계가 이후 긍정적인 클론을 계산 하는 것입니다. 26이동 높은 처리량 선택 플랫폼은이 목적을 위해 잘 적합 하 고 독자 Miersch 그 외 여러분 보고 상세한 프로토콜을 참조할 수 있습니다. 27

이론적으로, 맞춤형 다양성 페이지 표시 하는 합성 항 체 라이브러리를 대상으로 어떤 항 원 따라서 광범위 한 응용 프로그램 사용할 수 있습니다. 현재, 케임브리지 항 체 기술 (고양이), MedImmune, Genentech, Dyax, Bioinvent, 화 이자, 및 MorphoSys를 포함 하 여 기업 무 겁 게 살 균 소 치료 항 체 개발28디스플레이 플랫폼에 의존 합니다. 또한, 많은 파지 디스플레이 핵심 기술 특허29만료 되었을. 의심할 여 지 없이,이 살 균 소 전시 항 체 기술의 최대 잠재력을 쏴 라 것입니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자에 대 한 중요 한 의견 Kunkel의 방식 합성 팹 페이지 라이브러리 건설 Sidhu 연구소에서 박사 프레드릭 Fellouse 주셔서 감사합니다. 저자 감사 부인 Alevtina Pavlenco 및 높은 효율 전기 유능한 준비의 귀중 한 도움 Sidhu 실험실에서 다른 멤버 대장균 세포 및 고품질 뒤 ssDNA. 이 작품은 중국의 국가 자연과학 기초에 의해 지원 되었다 (허가 번호: 81572698, 31771006) DW 및 ShanghaiTech 대학으로 (부여 번호: F-0301-13-005) 항 체 공학의 실험실에.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1.0 M H3PO4 Fisher AC29570
1.0 M Tris, pH 8.0 Invitrogen 15568-025
10 mM ATP Invitrogen 18330-019
100 mM dithiothreitol Fisher BP172
100 mM dNTP mix GE Healthcare 28-4065-60 solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-76-02
50X TAE Invitrogen 24710030
Agarose Fisher BP160
Carbenicillin, carb Sigma C1389 100 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL.
Chloramphenicol, cmp Sigma C0378 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9620G
Granulated agar VWR J637-500G
H2O2 peroxidase substrate Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-65-02
K2HPO4 Sigma 795488
Kanamycin, kan Fisher AC61129 50 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL.
KH2PO4 Sigma P2222
Na2HPO4 Sigma 94046
NaCl Alfa Aesar U19C015
Nanodrop Fisher ND2000C
NaOH Fisher SS256 ! CAUTION NaOH causes burns.
NON-Fat Powdered Milk Sangon Biotech A600669
PEG-8000 Fisher BP233
Protein A-HRP conjugate Invitrogen 101123
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 22704
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Recombinant Protein L Fisher 77679
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203S
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T7 DNA polymerase New England Biolabs M0274S
Tetracycline, tet Sigma T7660 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
Tryptone Fisher 0123-07-5
Tween-20 Sigma P2287
Ultrapure glycerol Invitrogen 15514-011
Uridine Sigma U3750 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL.
Yeast extract VWR DF0127-08
Name Company Catalog Number Comments
Strains
E.coli CJ236 New England Biolabs E4141 Genotype: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA.
E.coli SS320 Lucigen 60512 Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.
M13KO7 New England Biolabs N0315S
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2-cm gap electroporation cuvette BTX
96-well 2mL Deep-well plates Fisher 278743
96-well Maxisorp immunoplates Nunc 151759
Baffled flasks Corning
Benchtop centrifuge Eppendorf 5811000096
Centrifuge bottles Nalgene
ECM-630 electroporator BTX
Magnetic stir bars Nalgene
Thermo Fisher centrifuge Fisher
High speed shaker TAITEK MBR-034P
Microplate shaker QILINBEIER QB-9002
Liquid handler for 96 and 384 wells RAININ
Mutil-channel pipette RAININ E4XLS
Amicon concentrator Merck UFC803096

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References

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Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).

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