Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

بناء بالعاثية الاصطناعية عرض مكتبة القوات المسلحة البوروندية مع التنوع مصممة

doi: 10.3791/57357 Published: May 1, 2018
* These authors contributed equally

Summary

ويصف هذا البروتوكول إجراء مفصل لبناء مكتبة عرض بالعاثية جسم الاصطناعية مع التنوع مصممة. الأجسام الاصطناعية لها تطبيقات واسعة من البحوث الأساسية لتشخيص الأمراض والمداواة.

Abstract

يتزايد الطلب على الأجسام المضادة (مابس) في البحوث الأساسية والأدوية سنوياً. وكانت التكنولوجيا هيبريدوما الأسلوب السائد لتنمية الإنسان والمحيط الحيوي منذ تقديم تقريرها الأولى في عام 1975. كتكنولوجيا بديلة، بالعاثية عرض أساليب لتنمية الإنسان والمحيط الحيوي جاذبية متزايدة منذ حميرا، جسم بالعاثية المشتقة الأولى وواحد من مابس مبيعاً، وتمت الموافقة للعلاج السريري لالتهاب المفاصل في عام 2002. كما غير الحيوانية على أساس تكنولوجيا التنمية ماب، يتجاوز العرض بالعاثية مستضد الاستمناع وإضفاء الصبغة الإنسانية والحيوانية الصيانة المطلوبة من هيبريدوما التقليدية القائمة على التكنولوجيا جسم تطوير. في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة لبناء مكتبات القوات المسلحة البوروندية الاصطناعية عرضها بالعاثية مع التنوعات9-10 1010 يمكن الحصول عليها مع انهانسر واحد. ويتألف هذا البروتوكول من: 1) إعداد الخلية المختصة الكهربائية ذات الكفاءة العالية؛ 2) استخراج المحتوية على اليوراسيل واحد-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (دو-ssDNA)؛ 3) الأسلوب كونكيل على أساس الطفرات الموجهة اليغنوكليوتيد؛ 4) انهانسر وحساب حجم المكتبة؛ 5) البروتين A/L-تعتمد المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (أليسا) للطي وتقييم التنوع الوظيفي؛ و 6) تحليل تسلسل الحمض النووي للتنوع.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

مابس لها تطبيقات واسعة تتراوح بين البحوث الأساسية لتشخيص الأمراض والمداواة. وحتى عام 2016، عليها مابس أكثر من 60 من "الولايات المتحدة للأغذية" وإدارة المخدرات (معايير) للعلاج السريري لأمراض المناعة الذاتية والسرطان والأمراض المعدية1،2.

وفي عام 1975، ذكرت كولر وميلشتاين تقنية لتوليد الأجسام المضادة التحديد الاستنساخ واحد من مصدر خلوية يشار إلى 'هيبريدوماس' وهذه التقنية مستمرة وأصبح فيما بعد حجر زاوية في الطب والصناعة3 ،4. جيل مابس بهذه الطريقة يتطلب خطوات مختلفة بما في ذلك إنتاج مستضد وتحصين الماوس، استخراج لمفاوية ب والانصهار ب الخلايا مع خلايا المايلوما لتشكيل خلايا هيبريدوما الخالد، اختيار استنساخ، والتطبيقات العلاجية، إضفاء الطابع الإنساني على مطلوب لتجنب البشرية الماوس المضادة الأجسام المضادة (حماة)4،5. لهذه التكنولوجيا، المستضدات بما في ذلك السموم ومسببات الأمراض ويحافظ على درجة عالية من البروتينات غير فعالة نسبيا في أحداث استجابة مناعية في الجسم الحي للإنسان والمحيط الحيوي الإنتاج5.

هوتشيسون et al. في عام 1978، عن استخدام اليغنوكليوتيد للطفرات مباشرة من رواسب في فيروس عاثية واحد-الذين تقطعت بهم السبل6. في عام 1985، أفاد سميث أن شظايا الجينات الأجنبية يمكن أن تنصهر في الإطار مع الجينات ترميز البروتين معطف بالعاثية الثالث، ويمكن عرض ذلك على السطح بالعاثية دون المساس العدوى7. هذه رائدة يعمل أرست أساسا للبناء اللاحقة جسم بالعاثية عرض المكتبات في السذاجة المناعية، وأشكال الاصطناعية مع تنسيقات جزء متغير سلسلة مفردة (سكفف) ويفتت مستضد ملزمة (القوات المسلحة البوروندية) للعلاج ماب التنمية8،9. من وجهة نظر تقنية، يقدم بالعاثية المستندة إلى عرض جسم تطوير نهج التنمية القائم على هيبريدوما ماب يمكن أن تساعد على الالتفاف على القيود التي يمكن أن تشكل بعض المستضدات مكملة وعملية إضفاء الطابع الإنساني على غالباً ما تتطلب الأجسام المضادة المستمدة من هيبريدوما5. اعتبارا من عام 2016، تمت الموافقة على 6 بالعاثية مابس المستمدة من العرض في السوق بما في ذلك حميرا، أحد مابس الأكثر نجاحا التي تستخدم للعلاج من التهاب المفاصل، وكثير من المرشحين المستمدة من عرض جسم بالعاثية حاليا في مراحل مختلفة من السريرية 10من التحقيق.

للمناعة والسذاجة مكتبات جسم بالعاثية، تنوع التكامل-تحديد المناطق (تقارير الإنجاز الموحدة) في سلسلة الخفيفة والثقيلة مشتق من مرجع المناعة الطبيعية (أيمن الخلايا باء). على النقيض من ذلك، تنوع تقارير الإنجاز الموحدة في مكتبات جسم بالعاثية الاصطناعية مصطنعة تماما. النهج الاصطناعية لبناء مكتبة توفر دقة السيطرة على تصميم التسلسل التنوع وتتيح فرصاً للدراسات الميكانيكية لهيكل جسم وتعمل11،12. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون الأمثل إطارا لمكتبات الاصطناعية قبل بناء المكتبة المصب، تيسير التنمية الصناعية على نطاق واسع11،12.

في عام 1985، أفادت كونكيل نهج واحد-الذين تقطعت بهم السبل الطفرات التي تستند إلى قالب الحمض النووي (سدنى) استحداث الطفرات موقع الموجه إلى عاثية M13 كفاءة13. واستخدمت هذا النهج على نطاق واسع في وقت لاحق لتشييد المكتبات عرض بالعاثية. مركباً كيميائيا النوكليوتيد الحمض النووي تهدف إلى إدخال التنوع في "القوات المسلحة البوروندية تقارير الإنجاز الموحدة" تدمج فاجيميد مع قالب جسم العمود الفقري. في هذه العملية، فاجيميد يتم التعبير عنها ك ssDNA المحتوية على اليوراسيل (دو-سدنى) والنوكليوتيد تعتيق على تقارير التنفيذ الموحدة والموسع لتوليف مزدوج تقطعت الحمض النووي (dsDNA) حضور بوليميراز الدنا T7 وليجاسي T4 الحمض النووي. وأخيراً، يمكن تقديم ds الحمض النووي الذي تم إنشاؤه في الإشريكيّة القولونية بواسطة انهانسر.

للتنوع الكبير، وبناء مكتبة عرض بالعاثية، انهانسر الفولت العالي من خليط المكون الثاني من الخلايا الكهربائية المختصة وتساهمي دسدنا دائرية مغلقة (CCC-دسدنا) ينبغي أن تعد بعناية. تعديل سيدهو et al. لإعداد الخلايا الكهربائية المختصة والحمض النووي من الأساليب التقليدية والمكتبة إلى حد كبير تحسين التنوع14.

في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة لبناء مكتبات القوات المسلحة البوروندية الاصطناعية عرضها بالعاثية مع التنوعات9-10 1010 يمكن الحصول عليها مع انهانسر واحد. ويبين الشكل 1 نظرة عامة لبناء مكتبة بما في ذلك: 1) إعداد الخلية المختصة الكهربائية ذات الكفاءة العالية؛ 2) استخراج دو-سدنى؛ 3) الأسلوب كونكيل على أساس الطفرات الموجهة اليغنوكليوتيد؛ 4) انهانسر وحساب حجم المكتبة؛ 5) البروتين A/L المستندة إلى أليسا للطي وتقييم التنوع الوظيفي؛ و 6) تحليل تسلسل الحمض النووي للتنوع. يتم سرد كافة الكواشف وسلالات والمعدات في الجدول للمواد. ويبين الجدول 1 الإعداد كاشف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ملاحظة: نصائح العقيمة تصفية يجب استخدام في جميع أنحاء عند التعامل مع بالعاثية لتفادي التلوث إلى البندقية ماصة والمنطقة المحيطة بها. يجب أن تستخدم منطقة معقمة أو هود عند التعامل مع البكتيريا وبالعاثيه التجارب. منطقة التجربة بالعاثية يجب تنظيف استخدام الصوديوم 2% دوديسيل كبريتات (SDS) تليها الإيثانول 70% لتفادي التلوث بالعاثية. لجعل تخفيف المسلسل في هذا البروتوكول، ينبغي أن تستخدم نصائح جديدة لتمييع كل.

1. إعداد الخلايا الكهربائية المختصة SS320 كولاي

  1. لوحة أجار رطل/tet الحار مسبقاً (معدّة ومخزنة في 4 درجات مئوية لمدة تقل عن 1-الأسبوع القديمة) في 37 درجة مئوية حاضنة حاء – 1 استخدام حلقة التطعيم العقيمة أو تلميح العقيمة إلى الانتصارات من مخزون والغليسيرول من الخلايا SS320 كولاي على لوح أجار رطل/tet المعالجون مسبقاً في المباشرة التعرج نشوئها بلطف على سطح اللوحة. احتضان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لحوالي 12-15 ح بين عشية وضحاها.
  2. في اليوم التالي، استخدم حلقة التطعيم العقيمة أو تلميح العقيمة لاختيار مستعمرة واحدة جيدا منفصلة على طول خط التعرج وتطعيم في 10 مل من 2YT/tet المتوسطة في أنبوب 50 مل قاع جولة التي تستنزف في الحلقة المتوسطة وآثاره بإيجاز.
  3. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة لحوالي 3-4 ح حتى يتم التوصل إلى OD600 في حوالي 0.4-0.8 (سجل مرحلة النمو). رصد OD600 في ح 2. وخلال هذه الفترة، قبل الحارة 5 رطل/tet أجار لوحات (معدّة ومخزنة في 4 درجات مئوية لمدة تقل عن 1-الأسبوع القديمة) في حاضنة 37 درجة مئوية على الأقل 1 ح.
  4. إضافة 20 ميكروليتر M13KO7 مساعد بالعاثية من مخزون المعمل مع عيار حوالي 1 × 1013 مستعمرة تشكيل/mL وحدة (زيمبابوي) إلى 180 ميكروليتر معقمة 1 X برنامج تلفزيوني في أنابيب 1.5 مل يعقم لإعداد 10 تخفيف المسلسل عشرة إضعاف.
  5. مل 4 الكوة 2YT يعقم والسائل أجار أعلى إلى 5 × 14 مل جولة أنابيب أسفل وتسمية كل أنبوبة مع تمييع واحد من الخامس إلى التاسع عشرة إضعاف إضعاف، على التوالي، واحتضانها في حاضنة 65 درجة مئوية الحفاظ على أجار 2YT أعلى في الحالة السائلة.
  6. ميكس 500 ميكروليتر من سجل المرحلة SS320 كولاي الخلايا في أنبوب تمييع M13KO7 (اختر الخامسة عشرة إضعاف إضعاف إلى الدورة التاسعة وعشرة إضعاف إضعاف) واحتضان في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
  7. أثناء احتضان الخطوة 1، 6، نقل 2YT أجار أعلى من الخطوة 1، 5 إلى درجة حرارة الغرفة (RT) ليبرد لمدة حوالي 5 دقائق لحوالي 42 درجة مئوية. استخدام الرسغ الداخلية لاختبار درجة الحرارة من 2YT أجار أعلى؛ أنها يجب أن تبقى كسائل. نقل كل خليط التخفيف من الخطوة 1، 5 لكل أنبوبة أجار أعلى 2YT المقابلة. تشديد غطاء كل أنبوبة ومزيج من تحول رأسا على عقب عدة مرات بلطف وإيجاز لتجنب توليد فقاعة.
  8. بعناية من أجل كل الخليط على طول حافة صفيحة أجار رطل/tet الحار مسبقاً (من الخطوة 1، 3) وانحدار لوحة قليلاً لملء تماما وبشكل متساو اللوحة مع الخليط مع تجنب إدخال فقاعات. تبقى اللوحات على RT لحوالي 5-10 دقيقة ترسيخ أجار أعلى داخل كل لوحة واحتضان لوحات أجار الأعلى 2YT في 37 درجة مئوية لحوالي 15-18 ح بين عشية وضحاها.
  9. اختر لوحة تمييع بعد النمو بين عشية وضحاها من الخطوة 1.8 مع حوالي 100-200 لويحات متوسط الحجم، مفرد، فصل جيدا لتلقيح اللوحة. استخدام يدا واحدة لعقد لوحة أجار ضد مصدر ضوء ومن ناحية أخرى عقد بندقية ماصة محملة بتلميح ماصة عقيمة طالما طعن عمودياً في أجار أعلى، وجمع لوحة واحدة والمنفصلين عن ذويهم جيدا.
    1. انحدار لنصيحة ماصة قليلاً لفصل أجار أعلى مع اللوحة. ماصة صعودا وهبوطاً عدة مرات لإزاحة أجار مع اللوحة في أنبوب ثقافة قاع جولة 14 مل محملة مسبقاً مع 1 مل من 2YT/كان/tet المتوسطة (انظر الجدول 1).
    2. كرر هذا الإجراء لاختيار لويحات 3-5 في المجموع. الغرض من الانتقاء لويحات عدة لضمان نجاح التطعيم، كما يمكن أن تكون لوحة باهتة وصغيرة نسبيا إذا ما قورنت مع مستعمرة لبكتيريا. نمو لويحات ح 8 في 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة.
  10. نقل أنبوب تنامي الثقافة إلى 50 مل من 2YT/كان/tet المتوسطة في قارورة حيرة 250 مل. تنمو في 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة لحوالي 12 ح بين عشية وضحاها.
  11. تلقيح ثلاثة قوارير حيرة 2-L الذي يحتوي على 900 مل سوبيربروث/tet/كان متوسطة مع 5 مل ثقافة بين عشية وضحاها. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة ل 6-7 (ح) OD600 حوالي 0.6-0.8.
  12. تشيل ثلاثة قوارير الثقافة البكتيرية في حمام الثلج لمدة 5 دقائق مع دوامات ثابتة لطيف باليد. وينبغي أن يتم بالخطوات التالية في غرفة باردة، على الجليد، ومع حلول بريتشيليد والمعدات.
  13. استخدام امتصاص الأنسجة منشفة لتجفيف الزجاج الخارجي لكل قارورة؛ استخدم يد واحدة لإمالة الزجاجة 1-L يعقم الطرد المركزي على مقاعد البدلاء واليد الأخرى صب المتوسطة بلطف من كل قارورة في كل زجاجة أجهزة الطرد المركزي.
  14. تدور في 5,000 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة بيليه البكتيريا.
  15. وعقب الطرد المركزي، بلطف صب المادة طافية في كوب نفايات يعقم 5-L.
  16. ملء كل زجاجة مع 100 مل من العقيمة التي تمت تصفيتها 1.0 مم حبيس، درجة الحموضة 7.4، وإضافة شريط يعقم إثارة مغناطيسية لكل زجاجة للمساعدة في استثارة بيليه 200 لفة في الدقيقة. دوامة وإزاحة بيليه كامل من الجدار زجاجة كل عدة دقائق أثناء إثارة المغناطيسية. حالما يتم حل بيليه، ملء كل زجاجة مع 400 مل إضافية العقيمة التي تمت تصفيتها 1.0 مم حبيس، درجة الحموضة 7.4.
  17. الطرد المركزي في 5,000 × ز و 4 درجات مئوية عن 10 دقيقة صب المادة طافية، الاحتفاظ بشريط ضجة في الزجاجة.
  18. كرر الخطوات من 1، 16 إلى 1.17 مرة واحدة.
  19. ريسوسبيند كل بيليه في 500 مل من العقيمة-تصفيتها، 10% والغليسيرول عالي النقاوة مع معونة القضبان ضجة. دوامة وإزاحة بيليه كامل من الجدار زجاجة كل عدة دقائق أثناء إثارة المغناطيسية.
  20. الطرد المركزي وصب كما في الخطوة 1.17. كرر الخطوة 1.19 مرة واحدة. استخدام الملقط يعقم الذراع الطويلة لإزالة الشريط ضجة.
  21. الطرد المركزي في 000 5 ز × و 4 درجات مئوية عن 15 دقيقة صب المادة طافية وإزالة أي بقايا من المادة طافية من كل زجاجة الطرد المركزي مع ماصة.
  22. إضافة 3.0 مل من 10% والغليسيرول عالي النقاوة إلى زجاجة واحدة ولطف ريسوسبيند بيليه بيبيتينج. نقل التعليق على زجاجة المقبل وكرر حتى جميع الكريات حراكه وجنبا إلى جنب في زجاجة واحدة. يتم الحصول على حوالي 6 مل خلايا مركزة للغاية مع عيار حوالي 3 × 1011 زيمبابوي/مل.
  23. قبل chill أنابيب 1.5 مل يعقم ميكروسينتريفوجي وصندوق تخزين أنبوب 96-بئر واحد دون فواصل في-80 درجة مئوية على الأقل 1 ساعة قبل هذه الخطوة. نقل أنابيب مبردة مسبقاً ميكروسينتريفوجي إلى الغرفة الباردة على الجليد قبل بيبيتينج مختبرين لتعليق بيليه الخلية. استخدام ماصة إلى الكوة ميكروليتر 350 من تعليق خلية في كل أنبوبة ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
  24. نقل مختبرين في وعاء مربع رغوة مليئة بالنيتروجين السائل لتجميد الفلاش (3-5 دقائق).
    1. نقل مربع رغوة مع النيتروجين السائل لثلاجة-80 درجة مئوية (راجع الخطوة 1، 23).
    2. إزالة مربع تخزين أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل من الثلاجة-80 درجة مئوية (راجع الخطوة 1.23) ووضع على الجليد.
    3. سرعة استخدام شبكة معدنية منخل مختبرين من النتروجين السائل ووضعها في مربع التخزين الأنبوبة. مخزن في-80 درجة مئوية.
      تنبيه: نيتروجين سائل يمكن أن تسبب الحروق، ويجب توخي الحذر لحماية السلامة. استخدام فاجيميد من القوات المسلحة البوروندية العمود الفقري للتحقق من كفاءة الخلايا الكهربائية المختصة استعداد (يجب أن يكون المخزون فاجيميد العمود الفقري القوات المسلحة البوروندية في الماء (ملك) عالي النقاوة في 400 نانوغرام/ميليلتر). ذوبان الجليد 1 ميكروغرام من فاجيميد العمود الفقري القوات المسلحة البوروندية في 10 ميليلتر ماء عالي النقاوة ومن قاسمة ميكروليتر 350 من SS320 الكهربائية المختصة على الجليد، وبريتشيل ومبومو انهانسر فجوة 0.2 سم على الجليد.
  25. إضافة خلايا SS320 الكهربائية المختصة ميكروليتر 350 للحمض النووي 10 ميليلتر بعد ذوبان الجليد ومزيج من بيبيتينج عدة مرات مع الحفاظ على المخاليط على الجليد. تجنب إدخال الفقاعات.
  26. قبل الحارة 15 مل من شركة نفط الجنوب متوسطة في أنبوب 50 مل في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل انهانسر. نقل الخليط ميكروليتر 360 ومبومو وأداء انهانسر اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  27. فورا لإنقاذ الخلايا بعد انهانسر بإضافة 1 مل من حرارة قبل شركة نفط الجنوب متوسطة (من الخطوة 1.27) وبيبيتينج. نقل المتوسطة من ومبومو إلى قارورة 125 مل محملة مسبقاً مع 5 مل من شركة نفط الجنوب قبل حرارة
  28. شطف ومبومو مرتين وفي كل مرة مع 1 مل من حرارة قبل شركة نفط الجنوب متوسطة ونقل المتوسطة لقارورة 125 مل (راجع الخطوة 1.27). إضافة حرارة قبل شركة نفط الجنوب متوسطة إلى وحدة تخزين نهائي من 10 مل لقارورة 125 مل.
  29. احتضان ثقافة الخلية 10 مل مدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة.
  30. جعل تخفيف المسلسل لتحديد كفاءة تعداء ومعدل الإصابة ما قبل M13KO7.
    1. استخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 180 ميكروليتر من وسائل الإعلام 2YT لكل بئر من عمود واحد من لوحة 96-ميكروويل.
    2. جعل 8 المسلسل عشرة إضعاف تخفيف: نقل 20 ميكروليتر من الثقافة من الخطوة 1.29 للبئر الأولى اللوحة، مزيج من بيبيتينج، ونقل 20 ميكروليتر من المخلوط التالي جيدا. كرر هذه الخطوة حتى النهاية لتمييع المسلسل.
    3. لوحة 10 ميكروليتر من كل تمييع المسلسل على لوحات رطل/الكربوهيدرات ورطل/كان رطل/تيت في مكررة.
    4. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    5. معادلة حساب الكفاءة: تفترض أن M هو عدد مستعمرة متوسط عد من حظيرة المخفف 10N (N من 1-8). كفاءة تعداء الخلايا الكهربائية المختصة SS320 كولاي فاجيميد العمود الفقري القوات المسلحة البوروندية من لوحة رطل/الكربوهيدرات يساوي 10 س من + 3 زيمبابوي/ميكروغرام. ويقدر معدل الإصابة ما قبل M13KO7 من نسبة المستعمرات في أساسه/رطل ورطل/تيت. ويقدر أن النسبة المئوية للخلايا المختصة SS320 كولاي transfected مع فاجيميد العمود الفقري القوات المسلحة البوروندية من نسبة المستعمرات في رطل/الكربوهيدرات ورطل/كان.

2-إعداد ssDNA المحتوية على اليوراسيل (دو-سدنى) من القالب فاجيميد

ملاحظة: A سابقا عن فاجيميد العمود الفقري القوات المسلحة البوروندية وكان استخدامه كالقالب ل إعداد سدنى dU15. ويرد هيكل فاجيميد العمود الفقري القوات المسلحة البوروندية في الشكل 2. يتم استخدام مجموعة تدور بلازميد (M13 تدور قيابريب) لاستخراج سدنى dU مع تعديلات طفيفة.

  1. قبل الحارة صفيحة رطل/cmp (معدّة ومخزنة في 4 درجات مئوية لمدة تقل عن 1-الأسبوع القديمة) في 37 درجة مئوية حاضنة حاء 1 متواصلة من مخزون والغليسيرول من الخلايا CJ236 كولاي (أو آخر من سلالة dut−/ung−) مع الحلقات العقيمة أو نصائح على لوح رطل/cmp المعالجون مسبقاً. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لحوالي 12-15 ح بين عشية وضحاها.
  2. اختيار مستعمرة واحدة مع تلميح عقيمة وتطعيم إلى 2 مل متوسط 2YT/cmp في أنبوب أسفل الجولة 14 مل البوليبروبيلين.
  3. احتضان المتوسطة عند 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة ح 3-4 حتى يتم التوصل إلى OD600 في حوالي 0.4-0.8 (سجل مرحلة النمو).
  4. إضافة 5-10 ميكروليتر بالعاثية قالب العمود الفقري القوات المسلحة البوروندية في الثقافة، واحتضان في 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة مدة 30 دقيقة للسماح للعدوى بالعاثية.
  5. بعد الحضانة، استخدام تلميح عقيمة إلى الانتصارات خارج 10 ميكروليتر للثقافة على صفيحة رطل/الكربوهيدرات المعالجون مسبقاً عند 37 درجة مئوية. احتضان في 37 درجة مئوية لحوالي 12-15 ح بين عشية وضحاها.
  6. اختيار مستعمرة واحدة من فاجيميد العمود الفقري القوات المسلحة البوروندية التي تحتوي على CJ236 كولاي تطعيم ثقافة كاتب 3 مل 2YT/الكربوهيدرات/cmp في أنبوب أسفل الجولة 14 مل البوليبروبيلين، وتنمو في 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة لحوالي 12 ح بين عشية وضحاها.
  7. تلقيح ثقافة كاتب مل 0.3 إلى 30 مل 2YT/الكربوهيدرات/cmp في زجاجة حيرة 250 مل.
  8. احتضان ثقافة الخلية عند 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة ح 3-4 حتى يتم التوصل إلى OD600 في حوالي 0.4-0.8 (سجل مرحلة النمو).
  9. إضافة M13KO7 (عيار مختبر الأسهم، من حوالي 1 × 1013 زيمبابوي/mL) إلى الثقافة من خطوة 2.8 مع تعدد حالات العدوى (وزارة الداخلية) لما يقرب من 10 وعيار النهائي من M13KO7 1 × 10 تقريبا10 زيمبابوي/مل.
  10. احتضان في 200 لفة في الدقيقة و 37 درجة مئوية ح 1.
  11. بيليه الثقافة بالطرد المركزي في أنبوب 50 مل القاع المستديرة في 000 5 ز × و 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  12. صب المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع 30 مل من 2YT/الكربوهيدرات/كان/أردين الطازجة. نقل استثارة في زجاجة حيرة 250 مل جديدة.
  13. احتضان في 200 لفة في الدقيقة و 25 درجة مئوية ح 22-24.
  14. نقل الثقافة من الخطوة 2.13 في أنبوب 50 مل القاع المستديرة والطرد المركزي الثقافة في ز × 12,000 لمدة 20 دقيقة لفصل بالعاثية طافية من الخلايا البكتيرية بيليه. نقل بالعاثية طافية في أنبوب 50 مل القاع جولة جديدة وإضافة 1/5 حجم الحل الوتد/كلوريد الصوديوم التعجيل بالعاثية النهائي. يخلط جيدا واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة يعجل الجسيمات بالعاثية.
  15. أجهزة الطرد المركزي في 12,000 × ز و 4 درجات مئوية عن 30 دقيقة صب المادة طافية وأجهزة الطرد المركزي في 4000 × ز و 4 درجات مئوية للحد الأدنى 2 نضح المادة طافية المتبقية.
  16. ريسوسبيند بيليه بالعاثية في 2 مل العقيمة التي تمت تصفيتها 1 × برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنابيب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي. الطرد المركزي في ز × 12,000 لمدة 5 دقائق في ميكروسينتريفوجي benchtop لإزالة أي بقايا البكتيرية المتبقية ونقل بالعاثية طافية على أنابيب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي جديدة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  17. التحقق من فعالية إدماج اليوراسيل في CJ236 كولاي عن طريق مقارنة جنبا إلى جنب مع SS320 كولاي .
    1. إضافة ميكروليتر 180 من وسائل الإعلام 2YT لكل بئر من صف واحد من لوحة 96-جيدا.
    2. جعل عشرة 10 إضعاف المسلسل تخفيف: نقل 20 ميكروليتر من بالعاثية طافية إلى البئر الأولى اللوحة، مزيج من بيبيتينج، ونقل 20 ميكروليتر من المخلوط التالي جيدا. كرر هذه الخطوة حتى النهاية لتمييع المسلسل.
    3. إضافة 10 ميكروليتر من بالعاثية من تخفيف المسلسل الثماني الأخيرة لتصيب ميكروليتر 90 CJ236 كولاي و SS320 كولاي في المرحلة سجل (OD600 = 0.4-0.8). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الهز لطيف.
    4. لوحة 10 ميكروليتر من المسلسل تمييع كل الإصابة في CJ236 كولاي و SS320 كولاي على لوحات 2YT/الكربوهيدرات في التكرارات.
    5. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    6. معادلة حساب عيار: تفترض أن M هو عدد مستعمرة متوسط عد من حظيرة المخفف 10N (N من 1-10). عيار من CJ236 كولاي أو SS320 كولاي يساوي 10 س من + 2 زيمبابوي/مل. تقدير كفاءة إدماج اليوراسيل من نسبة عيار CJ236 كولاي و SS320 كولاي .
  18. إضافة إلى حجم 1/100 بالعاثية هطول الأمطار المخزن المؤقت للنائب في بالعاثية طافية في أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، وانتقل رأسا على عقب بلطف إلى مزيج لعدة مرات. احتضان على RT لمالا يقل عن 2 دقيقة بالعاثية الجسيمات هي عجلت من المتوسط الثقافة، وهكذا، ينبغي أن يكون حلاً غائم مرئية عند هذه النقطة.
  19. تطبيق العينة من الخطوة 2.18 إلى عمود دوران بلازميد (مثلاً، قيابريب) في أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي. يمكن أن تصل إلى قدرة ربط عمود الدوران واحد ssDNA مالا يقل عن 10 ميكروغرام. أجهزة الطرد المركزي في 000 6 × ز و 25 درجة مئوية لمدة 30 ثانية في ميكروسينتريفوجي benchtop. تجاهل في التدفق من خلال الذي في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. جسيمات بالعاثية تظل ملزمة بمصفوفة العمود في هذه المرحلة.
  20. إضافة مل 0.7 UT MLB بالعاثية تحلل وربط المخزن المؤقت (انظر المناقشة) إلى العمود واحتضان في RT لمدة 1 دقيقة على الأقل.  الطرد المركزي في 6,000 س ز و 25 درجة مئوية 30 ثانية وتجاهل التدفق من خلال.
  21. إضافة آخر مل 0.7 من المخزن المؤقت UT ملب واحتضان في RT لمدة 1 دقيقة على الأقل.
  22. الطرد المركزي في 6,000 × ز لتجاهل س. 30-التدفق عبر. في هذه المرحلة، يتم فصل البروتين معطف بالعاثية من دو سدنى، التي ما زالت ملتزمة بمصفوفة العمود.
  23. إضافة مل 0.7 من غسل العازلة PE الإيثانول التي تحتوي على اتباع إرشادات الشركة المصنعة. الطرد المركزي في 6,000 ز × 30 ثانية وتجاهل التدفق من خلال.
  24. كرر الخطوة 2.23، ثم الطرد المركزي مرة أخرى على 6,000 × ز لمدة 30 ثانية لإزالة بقايا المخزن المؤقت PE.
  25. نقل العمود إلى أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي جديدة وإضافة 100 ميكروليتر من المخزن المؤقت شطف EB (10 مم Tris· CL، الأس الهيدروجيني 8.5) إلى مركز للغشاء العمود.
  26. احتضان في الرايت 10 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي في 6,000 × ز لمدة 1 دقيقة الوتي دو-سدنا. تقريبا، ويمكن الحصول على 1.5-2.5 ميكروغرام مليلتر دو سدنا الثقافة.
  27. تحليل الحمض النووي الوتيد ميكروليتر 1 اليكتروفوريسينج على 1% [اغروس] هلام تاي. يجب أن تظهر عصابة واحدة غالباً مع لا تلطيخ الحمض النووي.
  28. تحديد تركيز الحمض النووي عن طريق قياس امتصاص في نانودروب جهاز المطياف الضوئي في 260 نيوتن متر (260 = 1.0 33 نانوغرام/ميكروليتر من ssDNA). تركيزات ssDNA dU نموذجية على مسافة 200-500 نانوغرام/ميكروليتر.

3-الأسلوب كونكيل على أساس الطفرات الموجهة اليغنوكليوتيد

ملاحظات: يستحسن القيام بردود فعل الصغيرة قبل ردود فعل واسعة النطاق لضمان جودة مكونات اليغنوكليوتيد ورد فعل مطفرة. رسم كاريكاتوري لأسلوب كونكيل لأساس اليغنوكليوتيد الموجه الطفرات هو هو مبين في الشكل 3. يتم عرض مختلف الأحماض الأمينية التنوعات في مناطق CDRH1، CDRH2، CDRH3، و CDRL3 مع إيمجت ترقيم التسميات16 (الجدول 2). وترد في الجدول 2تنوع الأحماض الأمينية النظرية لكل مجلس الإنماء والإعمار والتنوع النظري الكلي من الأحماض الأمينية، وتسلسل اليغنوكليوتيد.

  1. الفسفرة اليغنوكليوتيد مع T4 بولينوكليوتيدي كيناز
    1. الجمع بين 0.6 ميكروغرام من النوكليوتيد مطفرة، مصممة التحور مفردة مجلس الإنماء والإعمار، مع 2 ميكروليتر 10 × المخزن المؤقت و 2 ميكروليتر 10 ملم ATP ميكروليتر 1 100 مم DTT TM. إضافة عالي النقاوة ح2س إلى إجمالي حجم ميكروليتر 18 في أنبوب 1.5 مل. لبناء المكتبة، يتم إعداد 4 ردود الفعل الفسفرة منفصلة ومتوازية في المقابلة CDRH1، CDRH2، CDRH3، و CDRL3، على التوالي.
    2. إضافة 20 ش (2 ماي) T4 بولينوكليوتيدي كيناز إلى كل أنبوب واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية (1 رد الفعل في الجدول 3). استخدام فورا للصلب.
  2. الصلب من النوكليوتيد إلى قالب
    1. إلى 20 ميكروغرام من قالب دو-سدنى، إضافة 25 ميكروليتر من المخزن المؤقت X TM 10، 20 ميكروليتر من كل حل اليغنوكليوتيد فوسفوريلاتيد، وعالي النقاوة ح2س إلى وحدة تخزين نهائي من 250 ميكروليتر في أنبوب 0.5 مل. مزيج جيد ونقل إلى أنابيب PCR مل 0.20 (50 ميكروليتر في كل) كرد فعل 2 في الجدول 3. توفر هذه الكميات الحمض النووي مولى نسبة 3:1 بين اليغنوكليوتيد والقالب، بافتراض أن نسبة طول اليغنوكليوتيد والقالب 1: 100.
    2. تبني رد فعل في جهاز PCR عند 90 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 50 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، و 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. توليف الانزيمية لمجلس التعاون الجمركي-دسدنا
    1. إلى خليط قالب اليغنوكليوتيد/250 ميكروليتر تعتيق، إضافة 10 ميكروليتر من 10 ملم ATP، 10 ميكروليتر من مزيج دنتب 25 مم، 15 ميكروليتر من 100 مم DTT، 30 فايس T4 وحدات الحمض النووي ليجاسى و 30 "يو T7 دنا" بوليميريز كرد فعل 3 في الجدول 3.
    2. تبني رد فعل في أنبوب 1.5 مل عند 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    3. أغسل وتركيز مجلس التعاون الجمركي-دسدنا المركب في جهاز الطرد مركزي تصفية 0.5 مل مع غشاء كاتشين 30 حجم مسام في الرايت
      1. نقل خليط التفاعل بين عشية وضحاها إلى جهاز عامل التصفية وإضافة عالي النقاوة ح2س إلى 400 ميليلتر الحجم النهائي. تدور في 14,000 × ز لمدة 10 دقائق؛ وحدة التخزين أقل من 50 ميكروليتر.
      2. تجاهل التدفق من خلال إضافة 400 ميليلتر من النقاوة ح2س في عامل التصفية وتدور في ز × 14,000 لمدة 10 دقائق.
      3. كرر الخطوة 3.3.3.2 مرة أخرى.
      4. وضع التصفية رأسا على عقب في أنبوب ميكروسينتريفوجي نظيفة لاسترداد CCC-دسدنا. تدور في 1,000 ز × 2 دقيقة؛ المجلد المسترد عموما حوالي 20-40 ميكروليتر. يمكن استخدامها على الفور انهانسر كولاي CCC-دسدنا المستردة أو المجمدة في-20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق. عادة 20-40 ميكروغرام يمكن الحصول على الحمض النووي مجلس التعاون الجمركي.
    4. اليكتروفوريسي 1.0 ميليلتر من نتاج رد فعل التيد جنبا إلى جنب مع قالب سدنى دو لتصور النتيجة لرد فعل.

4-انهانسر وحساب حجم المكتبة

  1. تشيل سي سي سي-دسدنا المنقي (20 ميكروغرام في حجم الحد أقصى من 50 ميكروليتر) في أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي وفجوة 0.2 سم انهانسر ومبومو على الجليد.
  2. قبل الحارة 20 مل من وسائل الإعلام في شركة نفط الجنوب في أنبوب 50 مل البوليبروبيلين مخروطية أجهزة الطرد مركزي في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  3. ذوبان الجليد قاسمة ميكروليتر 350 من الكهربائية المختصة كولاي SS320 على الجليد. إضافة الخلايا بالحمض النووي ومزيج دقيق من بيبيتينج عدة مرات. تجنب إدخال الفقاعات.
  4. نقل الخليط إلى ومبومو وأداء انهانسر اتباع إرشادات الشركة المصنعة. على سبيل المثال، عند استخدام نظام انهانسر BTX ECM-630، هي الإعدادات ذات الصلة 2.5 كيلو فولت ميدان القوة والمقاومة Ω 125 50 µF السعة.
  5. فورا لإنقاذ الخلايا اليكتروبوراتيد بإضافة 1 مل من حرارة قبل شركة نفط الجنوب متوسطة ونقل إلى 17 مل من شركة نفط الجنوب متوسطة في قارورة 125 مل. شطف ومبومو مرتين مع 1 مل من شركة نفط الجنوب متوسطة ونقل إلى قارورة نفسه (الحجم النهائي و 20 مل).
  6. احتضان مدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة.
  7. تحديد كفاءة انهانسر.
    1. إضافة ميكروليتر 180 من وسائل الإعلام 2YT لكل بئر من عمود واحد من لوحة 96-ميكروويل.
    2. جعل 8 المسلسل عشرة إضعاف تخفيف: نقل 20 ميكروليتر من الثقافة 20 مل للبئر الأولى اللوحة وتخلط مع بيبيتينج ونقل 20 ميكروليتر من المخلوط بالتالي جيدا. كرر هذه الخطوة حتى النهاية لتمييع المسلسل.
    3. لوحة 10 ميكروليتر كل من تخفيف المسلسل على لوح واحد رطل/الكربوهيدرات في مكررة. لوحة 100 ميليلتر المتبقية من كل من تخفيف المسلسل على لوحات رطل/الكربوهيدرات منفصلة لمستعمرة العد بتدقيق. كما ستوفر هذه اللوحات استنساخ واحدة لتحليل إليزا وتسلسل (انظر القسم 5).
    4. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    5. عد المستعمرات من التكرارات 10 ميكروليتر على لوحة رطل/الكربوهيدرات. نفترض أن م مستعمرة متوسط عدد الأصوات التي تم فرزها في 10ن أمثال لوحة رطل/الكربوهيدرات (N من 1-8). حجم المكتبة الإجمالي يساوي 2 م × 10ن + 3 مستعمرات.
  8. قاسمة الثقافة من الخطوة 4.6 على قدم المساواة إلى اثنين 2-L حيرة قوارير، كل يحتوي على 500 مل من المتوسط 2YT/الكربوهيدرات/كان بالعاثية مكتبة الجيل.
  9. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة لحوالي 16 ح بين عشية وضحاها.
  10. نقل الثقافة إلى اثنين من زجاجات 1-L يعقم أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 12,000 ز × في 4 درجات مئوية.
  11. نقل المادة طافية على زجاجتين 1-L يعقم أجهزة الطرد المركزي الجديدة وإضافة 1/5 حجم الحل الوتد/كلوريد الصوديوم التعجيل بالعاثية النهائي. تبني على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  12. أجهزة الطرد المركزي عن 30 دقيقة في 12,000 × ز و 4 درجة مئوية. صب المادة طافية وتجنب الإخلال ببيليه بالعاثية بعناية. وتدور لمدة 1 دقيقة في 4,000 س ز إزالة المادة طافية المتبقية مع ماصة.
  13. ريسوسبيند بيليه بالعاثية مع 20 مل العقيمة التي تمت تصفيتها المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني X 1، ونقل إلى أنبوب 50 مل جديدة.
  14. بيليه هذه المسألة غير قابلة للذوبان من سينتريفوجينج لمدة 5 دقائق في 12,000 × ز و 4 درجة مئوية. نقل المادة طافية إلى أنبوب 50 مل جديدة.
  15. قياس تركيز بالعاثية بجهاز المطياف الضوئي (OD268 = 1.0 لحل 5 × 1012 بالعاثية مليلتر).
  16. ضبط تركيز بالعاثية إلى 5 × 1012 بالعاثية مليلتر في برنامج تلفزيوني X 1 مع 10% والغليسيرول عالي النقاوة.
  17. 1 مل الكوة الحل بالعاثية كل أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي. استخدام المكتبات فورا للغسل أو تخزينها في-80 درجة مئوية.

5-نوعية التقييم بالبروتين A/L المباشر ملزم أليسا المقايسة والتسلسل

  1. عشوائياً اختيار 96 المستعمرات واحد على لوحة رطل/الكربوهيدرات من الخطوة 4.7.3 في لوحة ثقافة جيدا 96-العميق الذي يحتوي على 800 ميكروليتر من 2YT/الكربوهيدرات في كل بئر. احتضانها ح 3-4 في 37 درجة مئوية مع الهز 1,000 لفة في الدقيقة للتطوير التنظيمي600 = 0.4-0.8.
  2. إضافة 100 ميكروليتر من M13KO7 (1 × 1011 زيمبابوي/mL) لكل بئر من 96-عميق للثقافة أيضا لوحة مع ماصة متعددة القنوات. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز 1,000 لفة في الدقيقة ح 1.
  3. إضافة 100 ميكروليتر من 2YT التي تحتوي على تركيز X 10 كاناميسين (500 ميكروغرام/مل) لكل بئر مع ماصة متعددة القنوات. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الهز 1,000 لفة في الدقيقة.
  4. حل البروتين لتر إلى 1 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني X 1. معطف 3/4 آبار في صفيحة البوليستيرين ملزمة البروتين عالية 384-جيدا مع حل البروتين ل 30 ميليلتر/جيدا. تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  5. تجاهل الحل طلاء البروتين ل بين عشية وضحاها من الخطوة 5، 4. إضافة 50 ميليلتر من ببست م (حل حظر) لجميع الآبار في لوحة البوليستيرين ملزمة البروتين عالية 384-جيدا مع ماصة متعددة القنوات. احتضان اللوحات على شاكر ميكروسكوبية ح 1 في الرايت
  6. تدور أسفل ثقافة بين عشية وضحاها من الخطوة 5.3 في لوحة ثقافة العميقة 96-جيدا في س 3,000 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. بالعاثية في المادة طافية.
  7. تجاهل حل حظر من الخطوة 5.5. إضافة 15 ميكروليتر من ببست م و 15 ميكروليتر من كل بالعاثية طافية (الخطوة 5، 6) إلى 3 آبار ل مغلفة البروتين كثلاث نسخ، و 1 التحكم أيضا سلبية المغلفة بعدم استخدام ماصة الأقنية. احتضان على RT ح 1 مع الهز 200 لفة في الدقيقة.
  8. تجاهل الحل بالعاثية. أغسل لوحة 6 مرات مع 80 ميكروليتر من ببست بغسالة لوحة الآلي.
  9. إضافة 15 ميكروليتر من ببست م و 15 ميكروليتر من البروتين A-برنامج الصحة الإنجابية (1:1، 500 المخفف في برنامج تلفزيوني X 1) لكل بئر مع ماصة متعددة القنوات، واحتضان في RT ح 1 مع الهز حوالي 200 لفة في الدقيقة.
  10. تجاهل حل البروتين A-برنامج الصحة الإنجابية/M-ببست. أغسل لوحة 6 مرات مع 80 ميكروليتر من ببست.
  11. إضافة الركازة TMB (30 ميكروليتر/جيد) مع ماصة متعددة القنوات واحتضان لمدة 2-3 دقيقة حتى يتطور اللون. وقف رد الفعل مع 1.0 م ح3ص4 (30 ميكروليتر/جيد).
  12. قراءة لوحات سبيكتروفوتوميتريكالي على 450 نانومتر. يتم تعريف الحيوانات المستنسخة إيجابية كتلك التي يحمل متوسط نسبة OD450 امتصاص البروتين ل آبار لأكبر أيضا من 3.0 M-ببست.
  13. في 96-عميق جيدا، تصيب 50 ميكروليتر من SS320 في 2YT/tet مرحلة سجل مع 5 ميكروليتر من بالعاثية نفسها المستخدمة لإليزا (الخطوة 5، 6) لمدة 30 دقيقة في الرايت
  14. إضافة 950 ميكروليتر من 2YT/الكربوهيدرات إلى 96-أعماق جيدا من الخطوة 5.13 واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الهز 1,000 لفة في الدقيقة.
  15. استخراج فاجيميد الحمض النووي بأدوات استخراج الحمض النووي الإعدادية المصغر. استخدام كبسولة تفجير المنبع لداء الليشمانيات الحشوي (5 '-تكجكتتجتتتتاتتتتتاتجتا-3') و VH (-جاكتاكتاتاكاتااجتكتاكجككج 5 '-3') لتحليل تسلسل لتقدير التنوع تسلسل مكتبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

بعد الرسم البياني لبناء مكتبة القوات المسلحة البوروندية (انظر الشكل 1)، نحن على استعداد M13KO7 مساعد SS320 كولاي بالعاثية قبل إصابة الخلايا الكهربائية المختصة. ويقدر كفاءة هذه الخلايا الكهربائية المختصة ك 2 × 109 زيمبابوي/ميكروغرام عندما استخدمت القوات المسلحة البوروندية فاجيميد العمود الفقري لبناء مكتبة (الشكل 4).

فعالية إدماج اليوراسيل بالمقارنة من عيار في الخلايا CJ236 كولاي و SS320 كولاي تم التحقق. الخلايا CJ236 كولاي و SS320 كولاي أصيبوا بالعاثية إيواء دو-سدنا. وقد SS320 كولاي الإنزيمات (جليكوسيلاسي دوتباسي واليوراسيل) التي يمكن أن تتحلل اليوراسيل المحتوية على الحمض النووي، بينما يفتقر إلى هذه الإنزيمات CJ236 كولاي ولا تتحلل المحتوية على اليوراسيل في الحمض النووي. ولتحقيق كفاءة إدماج اليوراسيل مقبولة، يلزم التتر من CJ236 كولاي 10 على الأقل4 مرات أعلى من تلك التي من SS320 كولاي . خلاف ذلك سوف زيادة السكان البرية من نوع في مكتبة جسم المركبة بسبب إدراج اليوراسيل غير فعالة. الشكل 5 أظهرت أن عيار من CJ236 كولاي حوالي 3 × 105 مرات أعلى من SS320 كولاي ، مما يدل إدماج ssDNA بالعاثية اليوراسيل كفاءة.

المقبل، ونحن إعداد واستخراج دو-سدنى. يتم فحص نقاء ssDNA دو قبل [اغروس] هلام استشراد (الشكل 6). ثم أجرى الطفرات الموجهة اليغنوكليوتيد وتم تقييم كفاءة التحويل ssDNA دو سي سي سي-الحمض النووي (الشكل 6). المنتجات الثلاثة مع حركية أقل مما يمكن تصور دو-سدنا على الجل بما في ذلك الفرقة أسرع تشغيل (CCC-دسدنا) والفرقة ضعف المتوسط (رصدت الفرقة)، والفرقة تشغيل أبطأ (المشردين حبلا الحمض النووي).

بعد انهانسر إلى SS320 كولاي ، قدرت حجم المكتبة من لوحة الحضانة بين عشية وضحاها (راجع الخطوة 4.7.5). وكان حجم مكتبة متوسط 5 × 109 من تخفيف المسلسل مكررة على ألواح رطل/الكربوهيدرات (الشكل 7). ومع ذلك، قد تحتوي على الحجم المقدر في هذه الخطوة بالعاثية لا عرض الشؤون بسبب وجود فراميشيفت أو وقف كودون، أو عرض الشؤون تجمعات. التسلسل وإليزا استخدمت لتقدير التنوع الوظيفي شيدت المكتبة. وأرسلت 96 استنساخ واحدة انتقاؤها عشوائياً لتحليل التسلسل. ويبين الجدول 4 أن 90 من أصل 96 المستنسخين واحد انتقاؤها عشوائياً كانت متسلسلة بنجاح، الذي يحتوي على استنساخ 70 دون كودون توقف قبل أوان (استنساخ 53 مع واحد على الأقل مجلس الإنماء والإعمار المسخ) واستنساخ 17 مع تسلسل البرية من نوع واستنساخ 20 مع كودون التوقف قبل الأوان في مختلف المناطق. ضمن المستنسخين 70، متحولة معدلات CDRH1، CDRH2، CDRH3، CDRL3، وهي 50% و 57%، 53%، 56%، على التوالي، في حين أن معدل متحولة مع مجلس الإنماء والإعمار واحد على الأقل هو 76%. في استنساخ 20 مع كودون توقف قبل أوان (90%)، كودون التوقف قبل الأوان أساسا مستمدة من فراميشيفت اليغنوكليوتيد الطفرات كبسولة تفجير، بما في ذلك 45% (CDRH1) 10% (CDRH2)، 15% (CDRH3) ونسبة 20 في المائة (CDRL3).

للكشف عن عرض الشؤون مطوية بشكل صحيح، بروتين A/L أساس أليسا كان يعمل كما هو معروف أن البروتين A والبروتين ل يمكن التعرف السليم طي الإطار VH وداء الليشمانيات الحشوي الإطار، على التوالي17،18. باﻻتفاق مع تحليل التسلسل، أظهر تحليل إليزا في ثلاث نسخ (الشكل 8) أن المستنسخين 20 مع كودون توقف قبل أوان كانت كلها سلبية في حين المستنسخين 17 مع تسلسل البرية من نوع كلها إيجابية عندما كانت نسبة إيجابية تعيين تجريبيا في 3.0. لاستنساخ 53 مع واحد على الأقل مجلس الإنماء والإعمار المسخ، استنساخ 43 كانت إيجابية في أليسا حين استنساخ 10 السلبية؛ يشير هذا إلى أن معظم من استنساخ كانت مطوية جيدا بينما تقارير الإنجاز الموحدة من المستنسخين 10 يمكن له آثار ضارة بالقوات المسلحة البوروندية قابلة للطي. في المجموع، استنساخ 43 من أصل 90 المستنسخين (48 في المائة) كانت مطوية بشكل جيد ويتضمن واحد على الأقل مجلس الإنماء والإعمار المسخ. وهكذا تنوع وظيفي من الأحماض الأمينية شيدت المكتبة استناداً إلى البروتين A/"ل أليسا" وتسلسل التحليل كان يقدر أن 2.4 X 109 (أي48 في المائة من 5 × 109).

Figure 1
رقم 1: نظرة عامة عن تشييد مكتبة القوات المسلحة البوروندية عرض بالعاثية. بناء مكتبة القوات المسلحة البوروندية عرض بالعاثية يتبع سلسلة الخطوات أساسية. أنها تنطوي على إعداد الخلايا البكتيرية المختصة الكهربائية ذات الكفاءة العالية، واستخراج دو سدنى والأسلوب على أساس الطفرات كونكيل الموجهة اليغنوكليوتيد، انهانسر وحساب بالعاثية حجم المكتبة القوات المسلحة البوروندية، التقييم الفنية التي البروتين A/L أليسا، والحمض النووي تسلسل تحليل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الهندسة المعمارية فاجيميد لبناء مكتبة القوات المسلحة البوروندية- الميزات الأساسية للعمود الفقري فاجيميد تتكون من أصول واحدة-الذين تقطعت بهم السبل (أوري f1) والحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (دسدنا أوري) النسخ المتماثل، وجينات مقاومة الأمبيسلّين/كاربينيسيلين (عمبر). لعرض القوات المسلحة البوروندية، تحت سيطرة المروج الفوسفاتيز القلوية (فوا)، يحتوي فاجيميد كاسيت بيسيسترونيك للتعبير بالسيارة وإفراز: الضوء على سلسلة (LC) تتكون من إشارة إفراز، فل (منطقة متغير سلسلة الخفيفة)، CL (ثابت منطقة السلسلة الخفيفة)، والعلامة العلم ج-الطرفية؛ والسلسلة الثقيلة (HC) تتألف من إشارة إفراز، VH (منطقة متغير السلسلة الثقيلة)، و CH1 (المنطقة 1 سلسلة ثقيلة ثابتة) تنصهر مع بروتين طفيفة معطف بالعاثية p3. وتوجه الجمعية سلسلة الخفيفة والثقيلة سلسلة إلى القوات المسلحة البوروندية داخل بيريبلاسم كولاي عرض القوات المسلحة البوروندية على سطح بالعاثية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: أساس تخطيطي الأسلوب كونكيل للطفرات الموجهة اليغنوكليوتيد. في هذا البروتوكول، استخدمنا الأسلوب كونكيل لإعداد قالب دو-سدنا. النوكليوتيد ل CDRH1، CDRH2، CDRH3، و CDRL3 مع التنوع مصممة فوسفوريلاتيد، تعتيق للقالب، وتستخدم لتحويل ss-الحمض النووي لمجلس التعاون الجمركي-دسدنا. بعد انهانسر داخل الخلايا الكهربائية المختصة SS320 كولاي ، يتم إصلاح الحمض النووي هيتيرودوبليكس لنوع البرية أو النموذج المسخ؛ بسبب وجود اليوراسيل في حبلا نوع البرية، تفضل عملية إصلاح النموذج المسخ، وهكذا، شكل المسخ يهيمن على المكتبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تقدير M13KO7 قبل إصابة كفاءة الخلية الكهربائية المختصة SS320 كولاي . واستخدم متجه العمود الفقري فاجيميد للتحقق من كفاءة انهانسر الخلايا المختصة. صيغة لحساب الكفاءة كما يلي: تفترض أن M هو عدد مستعمرة متوسط عد من حظيرة الأكثر المخفف 10N (N من 1-8) في مكررة. كولاي الكفاءة SS320 من لوحة رطل/الكربوهيدرات يساوي 10 س من + 3 زيمبابوي/ميكروغرام. كفاءة الخلايا الكهربائية المختصة حوالي 2 × 109 زيمبابوي/ميكروغرام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5: تقييم إدماج اليوراسيل في سدنى بالعدوى بالعاثية من الخلايا CJ236 كولاي و SS320 كولاي . استناداً إلى الأسلوب الذي كونكيل، يتم التحقق من فعالية إدماج اليوراسيل بمقارنة بالعاثية عيار الإصابة في الخلايا CJ236 كولاي و SS320 كولاي . معادلة حساب عيار كما يلي: تفترض أن M هو عدد مستعمرة متوسط عد من حظيرة الأكثر المخفف 10N (N من 1-10)، وأن عيار من CJ236 كولاي أو SS320 كولاي يساوي 10 س من + 2 زيمبابوي/مل. ويمكن تقدير فعالية إدماج اليوراسيل من عيار نسبة CJ236 كولاي و SS320 كولاي . كان عيار في CJ236 كولاي 9 × 1012 زيمبابوي/مل حين كان عيار في SS320 كولاي 3 × 107 زيمبابوي/مل. وكان نسبة عيار CJ236 كولاي و SS320 كولاي 3 × 105. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: التحويل من دو-سدنا CCC-الحمض النووي من الطفرات الموجهة اليغنوكليوتيد. في أعقاب موجه اليغنوكليوتيد الطفرات، تم تقييم كفاءة التحويل ssDNA دو سي سي سي-الحمض النووي. تم تحويل ssDNA دو تماما إلى دسدنا. الفرقة المهيمن هو مجلس التعاون الجمركي-دسدنا بينما هناك جزء ثانوية دسدنا رصدت والمشردين حبلا الحمض النووي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: معايرة بالعاثية لحساب حجم المكتبة. وقدرت حجم المكتبة بعد انهانسر إلى SS320 كولاي ، من تخفيف المسلسل على لوحات رطل/الكربوهيدرات. معادلة حساب الحجم على النحو التالي: تحمل M هو عدد مستعمرة متوسط عد من حظيرة الأكثر المخفف 10N من لوحة 2YT/الكربوهيدرات (N من 1-8)، وحجم يساوي 2 متر × 10ن + 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8: البروتين A/L المباشر ملزم بالعاثية أليسا. يمكن التعرف على البروتين ل إطار السلسلة الخفيفة كابا مطوية جيدا فل والبروتين يمكن أن يعترف إطار سلسلة ثقيل كذلك مطوية VH. ملزمة للقوات المسلحة البوروندية مع البروتين L و A يشير إلى قابلة للطي مناسبة للسلسلة الثقيلة والخفيفة سلسلة. وباختصار، كانت مغلفة بروتين L في ثلاث نسخ ومراقبة سلبية ببست م اللوحة، supernatants بالعاثية القوات المسلحة البوروندية من استنساخ مختلفة كانت المحتضنة مع البروتين L و M-ببست، ثم بعد يغسل، البروتين A-برنامج الصحة الإنجابية كان يستخدم لالتقاط بالعاثية القوات المسلحة البوروندية منضم. قراءات أليسا بالعاثية أظهرت 90 استنساخ انتقاؤها عشوائياً مع قراءات تسلسل النجاح. خط عتبة يمثل استنساخ إيجابية كان تجريبيا المعرفة حيث كانت نسبة OD450 امتصاص قيمة من البروتين L (متوسط ثلاث نسخ مع شريط خطأ) مقابل المراقبة السلبية أكثر من 3.0. وعرضت ثلاث مجموعات على أساس تحليل التسلسل، تناظر متحولة دون كودون التوقف باللون الأحمر (53 استنساخ)، نوع البرية (WT) في الزرقاء (17 استنساخ)، والمسخ مع كودون التوقف باللون الأخضر (20 استنساخ). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

إعداد كاشف المكون المبلغ تعليقات/الوصف
متوسطة 2YT استخراج الخميرة ز 10 إضافة الماء عالي النقاوة جعل وحدة التخزين إلى 1.0 ل، وضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.0، اﻷوتوكﻻف.
تريبتوني ز 16
كلوريد الصوديوم ز 5
أجار 2YT العلوي استخراج الخميرة ز 10 إضافة الماء عالي النقاوة جعل وحدة التخزين إلى 1.0 ل وضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.0، الحرارة حل، اﻷوتوكﻻف.
تريبتوني ز 16
كلوريد الصوديوم ز 5
حبيبات أجار ز 7.5
2YT/الكربوهيدرات/cmp المتوسطة كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل
الكلورامفينيكول 10 ميكروغرام/مل
متوسطة 2YT/الكربوهيدرات/كان/أوريديني كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل
كاناميسين 50 ميكروغرام/مل
أردين 0.25 ميكروغرام/مل
2YT/الكربوهيدرات/tet المتوسطة كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل
التتراسيكلين 10 ميكروغرام/مل
2YT/الكربوهيدرات متوسطة كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل
2YT/كان متوسطة كاناميسين 50 ميكروغرام/مل
2YT/كان/tet المتوسطة كاناميسين 50 ميكروغرام/مل
التتراسيكلين 10 ميكروغرام/مل
2YT/tet المتوسطة التتراسيكلين 10 ميكروغرام/مل
2YT/cmp المتوسطة الكلورامفينيكول 10 ميكروغرام/مل
رطل متوسطة أجار استخراج الخميرة ز 5 إضافة الماء عالي النقاوة جعل وحدة التخزين إلى 1.0 ل، وضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.0، اﻷوتوكﻻف. لاجار رطل، أضف 20 غ من حبيبات أجار، اﻷوتوكﻻف.
تريبتوني ز 10
كلوريد الصوديوم ز 10
لوحات رطل/الكربوهيدرات أجار رطل 1 لتر
كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل
لوحات رطل/تيت أجار رطل 1 L
التتراسيكلين 10 ميكروغرام/مل
لوحات رطل/cmp الكلورامفينيكول 10 ميكروغرام/مل
لوحات رطل/كان كاناميسين 50 ميكروغرام/مل
شركة نفط الجنوب متوسطة استخراج الخميرة ز 5 إضافة الماء عالي النقاوة لجعل وحدة التخزين إلى 1.0 ل، وضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.0، اﻷوتوكﻻف.
تريبتوني ز 20
كلوريد الصوديوم ز 0.5
بوكل ز 0.2
2.0 مجكل م2 مل 5.0
1.0 الجلوكوز م 20 مل
متوسطة سوبيربروث تريبتوني ز 12 إضافة الماء عالي النقاوة إلى 900 مل، اﻷوتوكﻻف، إضافة 100 مل من يعقم 0.17 م خ2ص4، 0.72 م ك2مكتب البراءات الهنغاري4.
استخراج الخميرة ز 24
الجلسرين 5 مل
سوبيربروث كان/tet المتوسطة كاناميسين 50 ميكروغرام/مل
التتراسيكلين 10 ميكروغرام/مل
1 X برنامج تلفزيوني كلوريد الصوديوم 137 مم ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.2، اﻷوتوكﻻف.
بوكل 3 مم
غ2هبو4 8 مم
خ2ص4 1.5 مم
تاي/[اغروس] هلام المخزن المؤقت تاي
[اغروس] 1% (w/v)
جيلريد 1:10000 (v/v)
الركيزة TMB TMB 50% (v/v)
ح2س2 البيروكسيديز الركيزة 50% (v/v)
M-ببست المخزن المؤقت 1 X برنامج تلفزيوني 100 مل
20-توين 0.05% (v/v)
اللبن المجفف الخالي من الدسم 5% (v/v)
5 X الوتد/كلوريد الصوديوم شماعة-8000 20% (w/v) إضافة الماء عالي النقاوة لجعل وحدة التخزين إلى 1 لتر، والاوتوكلاف.
كلوريد الصوديوم 2.5 متر
المخزن المؤقت ببست 1 X برنامج تلفزيوني 1 L 0.22 ميكرومتر تصفية تعقيم.
20-توين 0.05% (v/v)
10 × TM المخزن المؤقت مجكل2 0.1 M ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.5.
تريس 0.5 M
1.0 مم هيبيس، درجة الحموضة 7.4 1.0 هيبيس م مل 4.0 0.22 ميكرومتر تصفية تعقيم.
الماء عالي النقاوة. 4.0 L
والغليسيرول عالي النقاوة 10% (v/v) والغليسيرول عالي النقاوة. 100 مل 0.22 ميكرومتر تصفية تعقيم.
الماء عالي النقاوة. 900 مل
الماء عالي النقاوة. ح20 خالية من الدناز، رناسي مجانية، وخالية من مولد.

الجدول 1: كاشف الإعداد.

Table 2
الجدول 2: مجلس الإنماء والإعمار التنوعات والطفرات الإشعال. تسلسل الحمض النووي للمناطق مجلس الإنماء والإعمار أن تحور تظهر باللون الأحمر؛ تسلسل يتم تهيئتها باستخدام التعليمات البرمجية النوكليوتيدات البحتة. ويشير "X" إلى ثلاثي-النوكليوتيدات من خليط مصممة لتحتوي على مجموعات مختلفة من الأحماض الأمينية؛ "n" يشير إلى عدد مختلف من كبسولة تفجير "خمس عاشرا" مع عدد مختلف من X واستخدمت لتنويع CDRL3 أو CDRH3، على التوالي، لتوليد متغيرة الطول CDRL3 و CDRH3. أرقام بقايا تتحدد بتسمية إيمجت. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الأسلوب على أساس الطفرات كونكيل
رد فعل 1. الفسفرة اليغنوكليوتيد مع T4 بولينوكليوتيدي كيناز
المكون المبلغ النهائي
النوكليوتيد مطفرة 0.6 ميكروغرام
10 × TM المخزن المؤقت 2 ميكروليتر 1 X
10 ملم ATP 2 ميكروليتر 1 مم
100 مم DTT 1 ميكروليتر 5 مم
T4 بولينوكليوتيدي كيناز (يو 10/ميكروليتر) 2 ميكروليتر 20 ش
عالي النقاوة ح20 ما يصل إلى 20 ميكروليتر
إعداد رد فعل
الخطوة 1. 37 درجة مئوية ح 1
الرد 2. الصلب من النوكليوتيد إلى قالب
المكون المبلغ النهائي
قالب دو ssDNA 20 ميكروغرام 20 ميكروغرام
10 × TM المخزن المؤقت 25 ميكروليتر 1 X
فوسفوريلاتيد CDRH1 النوكليوتيد 20 ميكروليتر 0.6 ميكروغرام
فوسفوريلاتيد CDRH2 النوكليوتيد 20 ميكروليتر 0.6 ميكروغرام
فوسفوريلاتيد CDRH3 النوكليوتيد 20 ميكروليتر 0.6 ميكروغرام
فوسفوريلاتيد CDRL3 النوكليوتيد 20 ميكروليتر 0.6 ميكروغرام
عالي النقاوة ح20 ما يصل إلى 250 ميكروليتر
إعداد رد فعل
الخطوة 1. 90 درجة مئوية لمدة 3 دقائق
الخطوة 2. 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق
الخطوة 3. 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق
رد فعل 3. توليف الانزيمية لمجلس التعاون الجمركي-دسدنا
المكون المبلغ النهائي
خلائط ملدنة النوكليوتيد/قالب 250 ميكروليتر
10 ملم ATP 10 ميكروليتر ميكرومتر 346 من كل النوكليوتيدات
مزيج دنتب (25 مم من كل النوكليوتيدات) 10 ميكروليتر ميكرومتر 865 من كل النوكليوتيدات
100 مم DTT 15 ميكروليتر 5 مم
ليجاسى T4 الحمض النووي 1 ميكروليتر 30 وحدة فايس
بوليميراز الدنا T7 3 ميكروليتر 30 يو
إعداد رد فعل
الخطوة 1. 20 درجة مئوية للمبيت

الجدول 3: الإجراءات والعناصر المكونة للأسلوب كونكيل للقائمة على رد الفعل.

المجموعة عدد النسخ المنطقة النسبة المئوية
لا كودون التوقف قبل الأوان 70 الطفرات CDRH1 50% (35/70)
الطفرات CDRH2 57% (40/70)
الطفرات CDRH3 53% (37/70)
الطفرات CDRL3 56 في المائة (39/70)
واحد على الأقل من الطفرة مجلس الإنماء والإعمار 76% (53/70)
كودون التوقف قبل الأوان 20 عيب CDRH1 45 في المائة (9/20)
عيب CDRH2 10% (2/20)
عيب CDRH3 15% (3/20)
عيب CDRL3 20% (4/20)
عيب الأخرى 10% (2/20)

الجدول 4: تحليل تسلسل من CDRH1، CDRH2، CDRH3، و CDRL3 من مكتبة القوات المسلحة البوروندية الاصطناعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

بناء عالية التنوع، عرض بالعاثية مكتبات القوات المسلحة البوروندية، ومراقبة الجودة يتطلب نقاط التفتيش لرصد المراحل المختلفة لعملية البناء، بما في ذلك كفاءة الخلايا الكهربائية المختصة، ونوعية القالب دو-سدنى، كفاءة مجلس التعاون الجمركي-دسدنا التوليف، عيار بعد انهانسر، والقوات المسلحة البوروندية قابلة للطي، والتنوع من الأحماض الأمينية من تقارير التنفيذ الموحدة بتحليل تسلسل من القوات المسلحة البوروندية بالعاثية الحيوانات المستنسخة.

عالية الغلة ونقاء دو ssDNA ضروري لمعدل الطفرات عالية. في تجربتنا، يمكن أن تسفر عن تحريض بالعاثية عند 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها ssDNA دو أكثر من ذلك من تحريض بالعاثية عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. وهذا يتفق مع تقرير سابق19. فيما يتعلق باستخراج ssDNA، الواردة بلازميد الأولى تدور كيت (قيابريب) ملب لتحلل بالعاثية وملزمة. في وقت لاحق، MLB توقف بسبب معروف والاستعاضة عنه بالجريدة الرسمية. وجدنا أن عائد سدنى دو أقل بكثير من العلاج PB بالمقارنة بمن العلاج MLB. في هذا البروتوكول، استخدمنا كاشف المسمى UT MLB20 إلى استبدال ملب والعثور على عائد سدنى دو مشابه لذلك من "عدة تدور" الأولى.

CDRH3 و CDRL3 هي المناطق الأكثر تنوعاً ل الاعتراف مستضد21، الأخذ بتنوع مصممة مع مجموعة معينة من مجموعات من الأحماض الأمينية والنسب، وإزالة التحيز القائم على التكرار والتوقف-codons عرضته codons منحط مثل نك (N, اكويمولار للتكييف/ز/تي؛ ك، اكويمولار ل G/T)، تريمير كودون النوكليوتيد المستندة إلى فوسفوراميديتي22 مع واحد بالضبط تريمير كودون المقابلة لأحد الأحماض الأمينية محددة صممت ل CDRH3 و CDRL3. وعلاوة على ذلك، استخدمت أطوال متغير من النوكليوتيد CDRH3 و CDRL3 لزيادة التنوع.

بعد توليف الانزيمية دسدنا مجلس التعاون الجمركي، عموما ثلاثة نطاقات يتم مراقبتها من قبل [اغروس] هلام التفريد والعصابات ينبغي أن تكون واضحة دون تشويه. فيما بينها، هي الفرقة أسرع تشغيل مجلس التعاون الجمركي-دسدنا التي يمكن أن تحقق معدل الطفرات عالية (حوالي 80 في المائة) بعد انهانسر23. الفرقة تشغيل أبطأ من المشردين حبلا الحمض النووي ينشأ من التشرد حبلا الملازمة لنشاط بوليميراز الدنا T7 وقد طفرة انخفاض معدل (حوالي 20%)23. هو رصدت الفرقة ضعف المتوسط الحمض النووي بعد التمديد بسبب عدم كفاية النشاط ليجاسى T4 الحمض النووي أو الفسفرة اليغنوكليوتيد غير كافية.

تجمع عينة تسلسل صغيرة استخدمت لتقدير التنوع المكتبة على الرغم من عدم دقة24. قد يكون الجيل التالي التسلسل (خ ع) لتقدير التنوع الحقيقي بدقة، خيار جيد في التعدين عمق التنوع شيدت المكتبة25. في الممارسة العملية، نظراً للتحديات الحالية من خ ع التكنولوجيا بما في ذلك قراءة الطول والدقة، والتكلفة وعالية الإنتاجية، تتابع القوات المسلحة البوروندية بالعاثية المكتبة المستخدمة في هذا البروتوكول بطول حوالي 950 bp التي تغطي CDRH1، CDRH2، CDRH3، CDRL3، ولا قابلة للتحقيق؛ ومع ذلك، من الممكن لتقدير سكفف (حوالي 700 bp) مكتبة التنوع داخل نطاق الملايين24،25. معيار رئيسي آخر لتقييم تنوع المكتبة مكونة لاستخدام المكتبة لعموم ضد العديد من أنواع مختلفة من مولدات المضادات، وحساب المستنسخين إيجابية القبض عليه نظراً لتنوع المكتبة ارتباطاً مباشرا مع معدل نجاح مستضد الغسل26. منصة التحديد إنتاجية عالية ومناسب تماما لهذا الغرض والقراء يمكن الرجوع إلى بروتوكول مفصل عنها ميرسك et al. 27

نظرياً، يمكن استخدام مكتبات بالعاثية عرض جسم الاصطناعية مع التنوع مصممة استهداف أي مستضد وبالتالي لها تطبيقات واسعة النطاق. في الوقت الراهن، تعتمد اعتماداً كبيرا على الشركات بما في ذلك تكنولوجيا الأجسام المضادة كامبريدج (CAT)، ميديموني، Genentech، دي، بيوينفينت، شركة فايزر، ومورفوسيس على منصات العرض بالعاثية لجسم العلاجية التنمية28. وعلاوة على ذلك، العديد من بالعاثية العرض الأساسية تكنولوجيا براءات الاختراع انتهت29. ولا شك أن هذا سوف يطلق العنان لأقصى إمكانات تكنولوجيا عرض بالعاثية جسم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

الكتاب نقدر الدكتور فريدريك فيلوسي من مختبر سيدهو للتعليقات الانتقادية كونكيل للأسلوب على أساس بالعاثية القوات المسلحة البوروندية الاصطناعية بناء المكتبة. الكتاب نقدر السيدة اليفتينا بافلينكو وأعضاء آخرين من مختبر سيدهو لمساعدة قيمة من إعداد المختصة الكهربائية ذات الكفاءة العالية كولاي الخلايا وعالية الجودة دو-سدنى. هذا العمل تدعمه "مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية" (منحة رقم: 81572698، 31771006) إلى جاف ومن جامعة شانغايتيتش (رقم المنحة: و-0301-13-005) إلى "مختبر لجسم الهندسة".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1.0 M H3PO4 Fisher AC29570
1.0 M Tris, pH 8.0 Invitrogen 15568-025
10 mM ATP Invitrogen 18330-019
100 mM dithiothreitol Fisher BP172
100 mM dNTP mix GE Healthcare 28-4065-60 solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-76-02
50X TAE Invitrogen 24710030
Agarose Fisher BP160
Carbenicillin, carb Sigma C1389 100 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL.
Chloramphenicol, cmp Sigma C0378 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9620G
Granulated agar VWR J637-500G
H2O2 peroxidase substrate Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-65-02
K2HPO4 Sigma 795488
Kanamycin, kan Fisher AC61129 50 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL.
KH2PO4 Sigma P2222
Na2HPO4 Sigma 94046
NaCl Alfa Aesar U19C015
Nanodrop Fisher ND2000C
NaOH Fisher SS256 ! CAUTION NaOH causes burns.
NON-Fat Powdered Milk Sangon Biotech A600669
PEG-8000 Fisher BP233
Protein A-HRP conjugate Invitrogen 101123
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 22704
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Recombinant Protein L Fisher 77679
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203S
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T7 DNA polymerase New England Biolabs M0274S
Tetracycline, tet Sigma T7660 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
Tryptone Fisher 0123-07-5
Tween-20 Sigma P2287
Ultrapure glycerol Invitrogen 15514-011
Uridine Sigma U3750 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL.
Yeast extract VWR DF0127-08
Name Company Catalog Number Comments
Strains
E.coli CJ236 New England Biolabs E4141 Genotype: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA.
E.coli SS320 Lucigen 60512 Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.
M13KO7 New England Biolabs N0315S
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2-cm gap electroporation cuvette BTX
96-well 2mL Deep-well plates Fisher 278743
96-well Maxisorp immunoplates Nunc 151759
Baffled flasks Corning
Benchtop centrifuge Eppendorf 5811000096
Centrifuge bottles Nalgene
ECM-630 electroporator BTX
Magnetic stir bars Nalgene
Thermo Fisher centrifuge Fisher
High speed shaker TAITEK MBR-034P
Microplate shaker QILINBEIER QB-9002
Liquid handler for 96 and 384 wells RAININ
Mutil-channel pipette RAININ E4XLS
Amicon concentrator Merck UFC803096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. (2017).
  2. Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9, (2), 167-181 (2017).
  3. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, (5517), 495-497 (1975).
  4. Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21, (11), 966-973 (1999).
  5. Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34, (12), 960-969 (2016).
  6. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253, (18), 6551-6560 (1978).
  7. Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228, (4705), 1315-1317 (1985).
  8. Sidhu, S. S. Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. CRC Press. (2005).
  9. Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (16), 8950-8954 (2000).
  10. Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8, (7), 1177-1194 (2016).
  11. Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2, (12), 682-688 (2006).
  12. Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
  13. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, (2), 488-492 (1985).
  14. Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
  15. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425, (4), 803-811 (2013).
  16. Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27, (1), 55-77 (2003).
  17. Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9, (8), 679-687 (2001).
  18. Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (10), 5399-5404 (2000).
  19. Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58, (1), 10-17 (2012).
  20. Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
  21. Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31, (3), 169-217 (1994).
  22. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22, (25), 5600-5607 (1994).
  23. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).
  24. Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12, (5), e0177574 (2017).
  25. Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring? Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
  26. Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81, (4), 645-670 (1979).
  27. Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492 (2015).
  28. Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16, (5), 3675-3700 (2011).
  29. Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics - the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28, (5), 538-544 (2011).
بناء بالعاثية الاصطناعية عرض مكتبة القوات المسلحة البوروندية مع التنوع مصممة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).More

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter