Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Opførelsen af syntetiske Phage vises Fab bibliotek med skræddersyede mangfoldighed

doi: 10.3791/57357 Published: May 1, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver en detaljeret procedure for opførelsen af en phage-vises syntetisk antistof bibliotek med skræddersyede mangfoldighed. Syntetisk antistoffer har bredt programmer fra grundforskning til sygdom diagnostik og terapi.

Abstract

Behovet for monoklonale antistoffer (papagøjesyge) i grundforskning og medicin stiger årligt. Hybridom teknologi har været den dominerende metode til mAb udvikling siden sin første rapport i 1975. Som en alternativ teknologi er phage display metoder for mAb udvikling i stigende grad attraktivt da Humira, den første phage-afledte antistof og en af de bedst sælgende mAbs, blev godkendt for klinisk behandling af reumatoid arthritis i 2002. Som en ikke-animalsk baseret mAb udvikling teknologi, omgår phage display antigen immunogenicitet, menneskeliggørelse og animalske vedligeholdelse, der kræves fra traditionelle hybridom teknologi baseret antistof udvikling. I denne protokol beskriver vi en metode til konstruktion af syntetiske phage-vises Fab biblioteker med EDD 109-1010 fås med en enkelt elektroporation. Denne protokol består af: 1) højeffektiv electro-kompetente celle forberedelse; 2) udvinding af uracil-holdige enkeltstrenget DNA (dU-ssDNA); 3) Kunkel metode baseret oligonukleotid-directed mutagenese; 4) elektroporation og beregning af bibliotek størrelse; 5) protein A/L-baserede enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) for foldning og funktionelle mangfoldighed evaluering; og 6) DNA Sekvensanalyse af forskellighed.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

mAbs har bredt programmer lige fra grundforskning til sygdom diagnostik og terapi. I 2016, er mere end 60 mAbs blevet godkendt af USA 's Food and Drug Administration (USFDA) til klinisk behandling af autoimmune sygdomme, cancer og infektionssygdomme1,2.

I 1975 rapporterede Kohler og Milstein en teknik til kontinuerlig produktion af antistoffer af en enkelt klonede specificitet fra en cellulær kilde omtales som 'hybridomer' og denne teknik er efterfølgende blevet en hjørnesten i medicin og industri3 ,4. Generation af mAbs ved denne metode kræver forskellige foranstaltninger herunder antigen produktion, mus immunisering, udvinding af B-lymfocytter, fusion af B-celler med myelomatose celler til at danne udødelige hybridom celler, klon udvalg, og til terapeutisk anvendelse, menneskeliggørelse er forpligtet til at undgå menneskelig anti-mus antistof (HAMA)4,5. Men for denne teknologi, antigener herunder toksiner, patogener og meget velbevarede proteiner er relativt ineffektive i udløser en i vivo immunrespons for mAb produktion5.

I 1978 rapporterede Hutchison et al. brugen af en oligonukleotid til direkte mutagenese af rester i en enkelt-strenget bacteriophage virus6. I 1985 rapporterede Smith, at udenlandske gen fragmenter kan være smeltet i rammen med det gen, der koder phage frakke protein III og kan således vises på phage overflade uden akkord dens smitteevne7. Disse pionérarbejde lagt et fundament for den efterfølgende opførelse af phage-vises antistof biblioteker i immun, naiv, og syntetisk danner med formater af single-kæde variable fragment (scFv) og antigen-bindende fragment (Fab) for terapeutisk mAb udvikling8,9. Fra et teknisk synspunkt phage display-baserede antistof udvikling tilbyder en supplerende tilgang til hybridom-baserede mAb udvikling, der kan bidrage til at omgå de begrænsninger, nogle antigener kan udgøre og menneskeliggørelse proces, der hybridom-afledte antistoffer kræver ofte5. I 2016, 6 phage display-afledte mAbs er blevet godkendt på markedet herunder Humira, en af de mest succesfulde mAbs anvendes til behandling af reumatoid arthritis, og mange phage display-afledte antistof kandidater er i øjeblikket på forskellige stadier af kliniske undersøgelsen10.

For immunforsvaret og naive phage antistof biblioteker, mangfoldighed af komplementaritet-bestemmende områder (CdR) i lette og tunge kæde er afledt fra naturlige immun repertoire (dvs.fra B-celler). Derimod er mangfoldighed af CDR i syntetisk phage antistof biblioteker helt kunstig. Syntetisk tilgange til biblioteket konstruktion giver præcis kontrol over design af sekvens mangfoldighed og muligheder for Mekanistiske undersøgelser af antistof struktur og funktion11,12. Desuden kan rammer for syntetisk biblioteker optimeres før bibliotek opbygning at lette nedstrøms, omfattende industriel udvikling11,12.

I 1985, Kunkel rapporterede en enkeltstrenget DNA (ssDNA) skabelon-baseret mutagenese tilgang at indføre site-directed mutationer i M13 bacteriophage effektivt13. Denne tilgang blev efterfølgende anvendes bredt til opførelse af phage-vises biblioteker. Kemisk syntetiseret DNA oligonukleotider designet til at indføre mangfoldighed i Fab CdR er indarbejdet i et phagemid med et antistof rygraden skabelon. I denne proces, phagemid er udtrykt som en uracil-holdige ssDNA (dU-ssDNA) og oligonukleotider udglødet på en CDR og udvidet til at syntetisere dobbelt-strenget DNA (dsDNA) T7 DNA polymerase og T4 DNA ligase. Endelig kan genererede ds-DNA føres ind Escherichia coli af elektroporation.

Høj mangfoldighed, phage-vises bibliotek opbygning, høj spænding elektroporation af en to-komponent blanding af electro-kompetente celler og kovalent bør lukkede cirkulære dsDNA (CCC-dsDNA) forberedes omhyggeligt. Sidhu et al. ændrede forberedelse af electro-kompetente celler og DNA fra traditionelle metoder og stærkt forbedret bibliotek mangfoldighed14.

I denne protokol beskriver vi en metode til konstruktion af syntetiske phage-vises Fab biblioteker med EDD 109-1010 fås med en enkelt elektroporation. Figur 1 viser en oversigt over biblioteket konstruktion herunder: 1) højeffektiv electro-kompetente celle forberedelse; 2) udvinding af dU-ssDNA; 3) Kunkel metode baseret oligonukleotid-directed mutagenese; 4) elektroporation og beregning af bibliotek størrelse; 5) protein A/L-baserede ELISA for foldning og funktionelle mangfoldighed evaluering; og 6) DNA Sekvensanalyse af forskellighed. Alle reagenser, stammer og udstyr er angivet i materialets tabel. Tabel 1 viser opsætningen reagens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bemærk: Filteret sterile tips skal bruges i hele når der beskæftiger sig med phage for at undgå kontaminering pipette pistol og omegn. Aseptisk område eller hætte skal bruges når håndtering med bakterier og phage eksperimenter. Phage eksperiment område skal renses op ved hjælp af 2% sodium dodecyl sulfat (SDS) efterfulgt af 70% ethanol til phage kontaminering. For at gøre serielle fortyndinger i denne protokol, skal nye tips bruges til hver fortynding.

1. E. Coli SS320 Electro-kompetente celle forberedelse

  1. Pre varm LB/tet agar plade (tilberedt og opbevaret på 4 ° C for mindre end 1 - uger gamle) på 37 ° C inkubator for 1 h. bruge en steril podning løkke eller sterile tip til streak ud en glycerol bestand af E. coli SS320 celler på forhånd varmede LB/tet agar plade i en zig-zag direk tion forsigtigt langs overfladen af pladen. Inkuber plade på 37 ° C inkubator natten for omkring 12-15 h.
  2. Den følgende dag, bruge en steril podning løkke eller sterile tip til at vælge et godt adskilt enkelt koloni langs linjen zig-zag og podes i 10 mL af 2YT/tet medium i et 50mL rund bund rør ved dypning i løkken i mediet og omrøring kort.
  3. Der inkuberes ved 37 ° C under omrystning på 200 rpm i omkring 3-4 timer, indtil OD600 er nået på omkring 0,4-0,8 (log fase vækst). Monitor OD600 på 2 h. I denne periode, før varme 5 LB/tet agar plader (tilberedt og opbevaret på 4 ° C for mindre end 1 - uger gamle) i et 37 ° C inkubator i mindst 1 time.
  4. Tilføj 20 μL M13KO7 helper phage fra lab lager med titer omkring 1 x 1013 kolonidannende enhed (cfu) /mL i 180 μl sterilt 1 X PBS i autoklaveres 1,5 mL rør til at forberede 10 billeddetaljerne serielle fortyndinger.
  5. Alikvot 4 mL autoklaveres og flydende 2YT top agar til 5 X 14 mL rund bund rør, etiket hver tube med én fortynding fra femte til niende billeddetaljerne fortynding, henholdsvis, og inkuberes i en 65 ° C inkubator til at opretholde den 2YT top agar i flydende tilstand.
  6. Mix 500 μL af log fase E. coli SS320 celler ind i M13KO7 fortynding røret (Vælg femte billeddetaljerne fortynding til niende billeddetaljerne fortynding) og Inkuber i et 37 ° C inkubator for 5-10 min.
  7. Under inkubation af trin 1,6, overføre 2YT top agar fra trin 1,5 til stuetemperatur (RT) til at køle ned i omkring 5 min til ca 42 ° C. Brug indre håndled til at teste temperatur på 2YT top agar; Det skal forblive som væske. Overføre hver fortynding blanding fra trin 1,5 til hver tilsvarende 2YT top agar tube. Stramme låget af hver tube og blandes ved at vende op og ned flere gange forsigtigt og kort for at undgå boble generation.
  8. Omhyggeligt hæld hver blanding langs kanten af en pre varm LB/tet agar plade (fra trin 1.3) og skrå plade lidt for at fuldt ud og jævnt fyld pladen med blandingen samtidig undgå indførelsen af bobler. Holde pladerne på RT for omkring 5-10 min til at befæste den øverste agar inden for hver plade, og der inkuberes 2YT top agar plader ved 37 ° C natten over i ca 15-18 h.
  9. Vælg fortynding plade efter natten vækst fra trin 1.8 med omkring 100-200 mellemstor, enkelt, vel adskilte plaques til plaque podning. Brug én hånd til at holde agar plade mod en lyskilde, og anden hånden til at holde en pipette pistolen indlæst med en lang steril pipette tip til lodret stikke ind i den øverste agar, og indsamle en enkelt og godt adskilt plak.
    1. Skråkant, pipette spidsen lidt for at adskille top agar med plaque. Pipetteres op og ned flere gange for at løsne agar med plaque i en 14-mL rund bund kultur tube præinstalleret med 1 mL af kan-2YT-tet medium (Se tabel 1).
    2. Gentag denne fremgangsmåde for at vælge 3-5 plaques i alt. Formålet med picking flere plaques er at sikre vellykket podning, som en plak kan være svag og relativt lille i sammenligning med en bakterier koloni. Vokse plaques i 8 timer ved 37 ° C under omrystning på 200 rpm.
  10. Overføre et rør af voksende kultur i 50 mL af kan-2YT-tet medium i en 250 mL forbløffet kolbe. Vokse ved 37 ° C under omrystning på 200 rpm natten for omkring 12 timer.
  11. Podes tre 2-L forbløffet kolber indeholdende 900 mL superbroth/tet/kan medium, hver med 5 mL af overnight kultur. Der inkuberes ved 37 ° C under omrystning på 200 rpm for 6-7 h til OD600 omkring 0,6-0,8.
  12. Chill de tre kolber af bakteriekulturen i isbad i 5 min med blid konstant hvirvlende i hånden. Følgende trin skal ske i et koldt rum, på is, med prechilled løsninger og udstyr.
  13. Brug absorbans væv håndklæde til at tørre det ydre glas hver kolbe; Brug én hånd for at skråtstille 1-L autoklaveres centrifuge flasken på bænken og anden side at hælde medium forsigtigt fra hver kolbe i hver centrifuge flaske.
  14. Spin på 5.000 × g og 4 ° C i 10 min at sammenpresse bakterier.
  15. Efter centrifugering, forsigtigt dekanteres det i en 5-L autoklaveres affald bægerglas.
  16. Fyld hver flaske med 100 mL sterilt-filtreret 1,0 mm HEPES, pH 7,4, og tilføje en autoklaveres magnetiske rør bar til hver flaske til støtte i pellet resuspension på 200 rpm. Swirl og løsne hele toerstoffet fra flaske væggen hver flere minutter under den magnetiske omrøring. Når bundfaldet er opløst, fyldes hver flaske med en yderligere 400 mL sterilt-filtreret 1,0 mm HEPES, pH 7,4.
  17. Der centrifugeres ved 5.000 × g og 4 ° C i 10 min. Decant supernatanten, bevarer røre bar i flasken.
  18. Gentag trin 1,16 til 1.17 én gang.
  19. Resuspend hver pellet i 500 mL steril-filtreret, 10% ultrarent glycerol ved hjælp af rør barer. Swirl og løsne hele toerstoffet fra flaske væggen hver flere minutter under den magnetiske omrøring.
  20. Der centrifugeres og dekanteres som i trin 1.17. Gentag trin 1.19 én gang. Brug lange arm autoklaveres pincet til at fjerne rør bar.
  21. Der centrifugeres ved 5.000 × g og 4 ° C i 15 min. Decant supernatanten og fjerne eventuelle resterende spor af supernatanten fra hver centrifuge flaske med en pipette.
  22. Tilføje 3,0 mL 10% ultrarent glycerol til én flaske og forsigtigt resuspenderes af pipettering. Overføre suspension til den næste flaske og Gentag indtil alle af pellets er genopslemmes og kombineret i én flaske. Ca. 6 mL højkoncentreret celler er fremstillet med en titer på ca 3 x 1011 cfu/mL.
  23. Pre chill 1,5 mL autoklaveres microcentrifuge rør og en 96-brønd tube opbevaringsboks uden dividers ved-80 ° C i mindst 1 time før dette trin. Overføre pre kølet microcentrifuge rør til det kolde værelse på ice før pipettering delprøver af pellet cellesuspension. Bruge en pipette til alikvot 350 μl af cellesuspension til hver 1,5 mL microcentrifuge rør.
  24. Overføre delprøver til en skum kasse container fyldt med flydende nitrogen til flash frysning (3-5 min).
    1. Transport boksen skum med flydende nitrogen til en-80 ° C fryser (Se trin 1.23).
    2. Fjerne 1,5 mL microcentrifuge tube opbevaringsboks fra-80 ° C fryser (Se trin 1.23) og lagt på is.
    3. Hurtigt bruge en metal maske sigten delprøver fra flydende kvælstof og placere dem i boksen tube opbevaring. Opbevares ved-80 ° C.
      Forsigtig: Flydende kvælstof kan forårsage forbrændinger og pleje skal tages for sikkerhedsbeskyttelse. Bruge en Fab rygrad phagemid til at kontrollere effektiviteten af de forberedte electro-kompetente celler (Fab rygrad phagemid lager bør i ultrarent (MilliQ) vand på 400 ng/µL). Tø 1 μg af Fab rygrad phagemid i 10 µL ultrarent vand og en 350 μl alikvot af electro-kompetente SS320 på is, og prechill en 0,2 cm hul elektroporation kuvette på is.
  25. Tilføjes 10 µL DNA 350 μl electro-kompetente SS320 celler efter optøning og mix af pipettering flere gange samtidig holde blandinger på is. Undgå at indføre bobler.
  26. Pre varm 15 mL af SOC medium i en 50mL tube i vandbad 37 ° C i mindst 30 min før elektroporation. Overføre 360 μL blandingen til en kuvette og udføre elektroporation efter fabrikantens anvisninger.
  27. Straks rescue cellerne efter elektroporation ved tilsætning af 1 mL pre varmede SOC medium (fra trin 1,27) og pipettering. Overføre mediet fra kuvette til 125 mL kolbe forudindlæste med 5 mL af pre varmede SOC.
  28. Skyl kuvette to gange, hver gang med 1 mL af pre varmede SOC medium og overføre mellemlang 125mL kolben (Se trin 1,27). Tilføje pre varmede SOC medium til en endelige rumfang på 10 mL, 125mL kolbe.
  29. Ruger 10 mL cellekultur i 30 minutter ved 37 ° C under omrystning på 200 rpm.
  30. Gøre serielle fortyndinger at bestemme Transfektion effektivitet og M13KO7 før infektion sats.
    1. Brug en multikanal-pipette til at tilføje 180 μL af 2YT media til hver brønd med en enkelt kolonne i en 96-microwell plade.
    2. Gør 8 tifold serielle fortyndinger: 20 μL af kultur overføres fra trin 1,29 til det første hul i pladen, mix af pipettering, og overføre 20 μL af blandingen til næste godt. Gentag dette trin til slutningen af seriel fortynding.
    3. Plade 10 μL af hver seriel fortynding på LB/carb, LB/kan og LB/tet pladerne i to eksemplarer.
    4. Der inkuberes natten over ved 37 ° C.
    5. Formel til beregning af effektivitet: antage, at M er den gennemsnitlige koloni nummer regnes fra den fortyndede fold 10N (N er fra 1-8). E. coli SS320 electro-kompetente celle Transfektion effektivitet af Fab rygrad phagemid fra LB/carb plade er lig med M X 10N + 3 cfu/µg. M13KO7 før infektion sats er anslået fra forholdet mellem kolonierne i LB/kan og LB/tet. Procentdelen af E. coli SS320 kompetente celler transfekteret med Fab rygrad phagemid anslås fra forholdet mellem kolonierne i LB/carb og LB/kan.

2. forberedelse Uracil-holdige ssDNA (dU-ssDNA) fra skabelonen Phagemid

Bemærk: A tidligere rapporteret Fab rygrad phagemid blev brugt som skabelon til dU-ssDNA forberedelse15. Arkitektur af Fab rygrad phagemid er vist i figur 2. Et plasmid spin kit (QIAprep Spin M13) bruges til udvinding af dU-ssDNA med mindre ændringer.

  1. Pre varme en LB/cmp plade (tilberedt og opbevaret på 4 ° C for mindre end 1 - uger gamle) i et 37 ° C inkubator for 1 h. Streak ud en glycerol bestand af E. coli CJ236 celler (eller en anden dut−/ung− stamme) med steril sløjfer eller tips på forhånd varmede LB/cmp pladen. Inkuber plade ved 37 ° C natten over i omkring 12-15 timer.
  2. Vælge en enkelt koloni med en steril spids og podes i 2 mL af 2YT/cmp medium i 14 mL polypropylen runde-nederste rør.
  3. Inkuber medium ved 37 ° C under omrystning på 200 rpm i 3-4 timer, indtil OD600 er nået på omkring 0,4-0,8 (log fase vækst).
  4. Tilføj 5-10 μL phage af Fab rygraden skabelon i kultur, og der inkuberes ved 37 ° C under omrystning på 200 rpm for 30 min til at tillade phage infektion.
  5. Efter inkubation, bruge en steril tip til streak ud 10 μL af kultur på en pre varmede LB/carb tallerken ved 37 ° C. Der inkuberes ved 37 ° C natten over i omkring 12-15 timer.
  6. Vælge en enkelt koloni af E. coli CJ236 indeholdende Fab rygrad phagemid podes en igangsætter kultur af 3 mL 2YT/carb/cmp i 14 mL polypropylen runde-nederste rør, og vokse ved 37 ° C under omrystning på 200 rpm natten for omkring 12 timer.
  7. Podes 0,3 mL starter kultur i 30 mL 2YT/carb/cmp i en 250 mL forbløffet flaske.
  8. Inkuber cellekultur ved 37 ° C under omrystning på 200 rpm i 3-4 timer, indtil OD600 er nået på omkring 0,4-0,8 (log fase vækst).
  9. Tilføj M13KO7 (lab lager, titer på ca 1 x 1013 cfu/mL) til kultur fra trin 2.8 med en mangfoldighed af infektion (MOI) i ca. 10 og den endelige titer af M13KO7 er ca 1 x 1010 cfu/mL.
  10. Der inkuberes ved 200 rpm og 37 ° C i 1 time.
  11. Pellet kultur ved centrifugering i et 50 mL runde-nederste rør på 5.000 × g og 25 ° C i 20 min.
  12. Den dekanteres og resuspenderes med 30 mL frisk 2YT/carb/kan/uridine. Overføre ophvirvling ind i en ny 250 mL forbløffet flaske.
  13. Der inkuberes ved 200 rpm og 25 ° C i 22-24 h.
  14. Overføre kulturen fra trin 2.13 ind i en 50 mL runde-nederste rør og centrifugeres kultur på 12.000 × g i 20 min. for at adskille phage supernatanten fra bakteriel celle pellet. Overføre phage supernatanten ind i en ny 50 mL runde-nederste rør og tilsæt 1/5 PIND/NaCl løsning at udfælde phage endelige rumfang. Bland godt og der inkuberes i isbad i 30 min at udfælde phage partikler.
  15. Der centrifugeres ved 12.000 × g og 4 ° C i 30 min. Decant supernatanten og centrifugeres ved 4000 × g og 4 ° C i 2 min. Opsug den resterende supernatanten.
  16. Phage resuspenderes i 2 mL sterilt-filtreret 1 X PBS og overførsel til 1,5 mL microcentrifuge rør. Der centrifugeres ved 12.000 × g i 5 min i en benchtop microcentrifuge til at fjerne enhver resterende bakteriel snavs og overføre phage supernatanten til nye 1,5 mL microcentrifuge rør og opbevares ved 4 ° C.
  17. Kontrollere uracil indarbejdelse effektivitet i E. coli CJ236 gennem side om side sammenligning med E. coli SS320.
    1. Tilføj 180 μL af 2YT media til hver brønd med en enkelt række i en 96-brønd plade.
    2. Gøre ti 10-fold serielle fortyndinger: overføre 20 μL phage supernatanten til det første hul i pladen, mix af pipettering og overføre 20 μL af blandingen til næste godt. Gentag dette trin til slutningen af seriel fortynding.
    3. Tilsættes 10 μL phage fra sidste otte serielle fortyndinger at inficere 90 μL af E. coli CJ236 og E. coli SS320 i log fase (OD600 = 0,4-0,8). Der inkuberes ved 37 ° C i 30 min med blid ryster.
    4. Plade 10 μL fra seriel fortynding af hver infektion i E. coli CJ236 og E. coli SS320 på 2YT/Carb plader i to eksemplarer.
    5. Der inkuberes natten over ved 37 ° C.
    6. Titer beregningsformel: antage, at M er den gennemsnitlige koloni nummer regnes fra den fortyndede fold 10N (N er fra 1-10). Titer fra E. coli CJ236 eller E. coli SS320 er lig med M X 10N + 2 cfu/mL. Vurdere effektiviteten af uracil indarbejdelse fra titer forholdet af E. coli CJ236 og E. coli SS320.
  18. Tilføj 1/100 bind af phage nedbør buffer MP i phage supernatanten i 1,5 mL microcentrifuge rør, og drej hovedet forsigtigt for at blande for flere gange. Der inkuberes ved RT i mindst 2 min. Phage partikler er udfældet fra næringssubstratet, og således er en overskyet løsning skal være synlig på dette punkt.
  19. Anvende prøven fra trin 2.18 til et plasmid spin kolonne (f.eks.QIAprep) i 1,5 mL microcentrifuge rør. Den bindende kapacitet i ét spin kolonne for ssDNA kan nå mindst 10 µg. Centrifuge på 6.000 × g og 25 ° C til 30 s i en benchtop microcentrifuge. Kassér den gennemstrømnings-som er i 1,5 mL microcentrifuge røret. Phage partikler forbliver bundet til matrixen kolonne på dette stadium.
  20. Tilsættes 0,7 mL af UT-MLB phage lysis og binding buffer (Se diskussion) til kolonnen og inkuberes ved RT for mindst 1 min.  Der centrifugeres ved 6.000 x g og 25 ° C til 30 s og kassér gennemstrømnings.
  21. Tilføje en anden 0,7 mL af UT-MLB buffer og inkuberes ved RT for mindst 1 min.
  22. Centrifugeres ved 6.000 × g for 30 s. udsmid gennemstrømnings. På dette stadium, er phage frakke protein adskilt fra dU-ssDNA, som stadig er bundet til matrixen kolonne.
  23. Tilsættes 0,7 mL af wash buffer PE indeholder ethanol efter fabrikantens anvisninger. Der centrifugeres ved 6.000 × g for 30 s og kassér gennemstrømnings.
  24. Gentag trin 2.23, derefter centrifugeres igen ved 6.000 × g for 30 s til at fjerne resterende buffer PE.
  25. Overfør kolonnen til et nyt 1,5 mL microcentrifuge rør og tilsæt 100 μL af eluering buffer EB (10 mM Tris· CL, pH 8,5) til midten af den kolonne membran.
  26. Der inkuberes ved RT i 10 min og centrifugeres ved 6.000 × g i 1 min til elueres dU-ssDNA. Ca, 1,5-2,5 μg dU-ssDNA/mL kultur kan opnås.
  27. Analysere eluted DNA ved electrophoresing 1 μL på en 1% Agarosen TAE gel. DNA skal vises som et overvejende enkelt band med ingen udtværing.
  28. Bestemme DNA-koncentrationen ved at måle absorbans på Spektrofotometer nanodrop på 260 nm (en260 = 1,0 for 33 ng/μl af ssDNA). Typisk dU-ssDNA koncentrationer er inden for 200-500 ng/μl.

3. Kunkel metode baseret oligonukleotid-directed mutagenese

Noter: Det er tilrådeligt at foretage små reaktioner inden fuld skala reaktioner til at sikre kvaliteten af komponenterne af mutagene oligonukleotid og reaktion. En tegneserie af Kunkels metode baseret directed oligonukleotid-mutagenese er vist i figur 3. Forskellige aminosyre mangfoldighedens føres ind i CDRH1, CDRH2, CDRH3 og CDRL3 regioner med IMGT nummerering nomenklatur16 (tabel 2). Teoretisk aminosyre mangfoldighed af hver CDR, samlede teoretiske aminosyre mangfoldighed og oligonukleotid sekvenser er angivet i tabel 2.

  1. Oligonukleotid fosforylering med T4 polynucleotide kinase
    1. Kombinere 0,6 μg af mutagene oligonukleotider, designet til at mutere en enkelt CDR, med 2 μl 10 X TM buffer, 2 μl 10 mM ATP og 1 μL 100 mM DTT. Tilføje ultrarent H2O til en samlet maengde paa 18 μL i 1,5 mL rør. Bibliotek opbygningen, er 4 separate og parallelle fosforylering reaktioner konfigureret svarende til CDRH1, CDRH2, CDRH3 og CDRL3, henholdsvis.
    2. Tilføj 20 U (2 uL) af T4 polynucleotide kinase til hver tube og Inkuber i 1 time ved 37 ° C (reaktion 1 i tabel 3). Brug straks for afkølingen.
  2. Udglødning af oligonukleotider til skabelonen
    1. 20 μg af dU-ssDNA skabelon, tilføje 25 μl af 10 X TM buffer, 20 μL af hver fosforyleres oligonukleotid løsning, og laves H2O til en endelige mængden af 250 μL i 0,5 mL rør. Bland godt og overføre til 0,20 mL PCR rør (50 μl) som reaktion 2 i tabel 3. Disse DNA mængder giver en kindtand forholdet 3:1 mellem oligonukleotid og skabelon, antages det, at længde forholdet mellem oligonukleotid og skabelon er 1: 100.
    2. Inkuber reaktion i en PCR-maskine ved 90 ° C i 3 min, 50 ° C i 3 min og 20 ° C i 5 min.
  3. Enzymatisk syntese af CCC-dsDNA
    1. 250 μL udglødet oligonukleotid/skabelon blanding, tilføje 10 μl af 10 mM ATP, 10 μL af 25 mM dNTP mix, 15 μl af 100 mM DTT, 30 Weiss enheder T4 DNA ligase og 30 U T7 DNA polymerase som reaktion 3 i tabel 3.
    2. Inkuber reaktion i 1,5 mL tube ved 20 ° C natten over.
    3. Vask og koncentrere den syntetiserede CCC-dsDNA i 0,5 mL centrifugal filter enhed med en 30 kDa pore størrelse membran på RT.
      1. Overføre den overnight reaktionsblandingen til filter enhed og tilføje ultrarent H2O til 400 µL endelige rumfang. Spin på 14.000 × g i 10 min.; diskenheden er mindre end 50 μL.
      2. Kassér flow gennem, tilføje 400 µL af ultrarent H2O i filteret og spin på 14.000 × g i 10 min.
      3. Gentag trin 3.3.3.2 endnu.
      4. Placer filteret op og ned i en ren microcentrifuge tube at inddrive CCC-dsDNA. Spin ved 1.000 × g i 2 min. den gendannede diskenhed er normalt omkring 20-40 μL. De gendannede CCC-dsDNA kan anvendes straks for elektroporation af E. coli eller frosset ved-20 ° C til senere brug. Normalt 20-40 μg CCC-DNA kan opnås.
    4. Electrophorese 1,0 µL af elueres reaktionsprodukt sammen med skabelonen dU-ssDNA til at visualisere resultatet af reaktionen.

4. elektroporation og beregning af størrelsen bibliotek

  1. Chill den renset CCC-dsDNA (20 μg i en maksimal volumen af 50 μl) i en 1,5 mL microcentrifuge tube og en 0,2 cm hul elektroporation kuvette på is.
  2. Pre varm 20 mL af SOC medier i et 50mL polypropylen konisk centrifugeglas på 37 ° C vandbad i mindst 30 min.
  3. Tø en 350 μl alikvot af electro-kompetente E. coli SS320 på is. Føje celler til DNA og bland grundigt ved pipettering flere gange. Undgå at indføre bobler.
  4. Overfør blandingen til en kuvette og udføre elektroporation efter fabrikantens anvisninger. Eksempelvis når BTX ECM-630 elektroporation system benyttes, er de relevante indstillinger 2,5 kV feltstyrke, 125 Ω modstand og 50 µF kapacitans.
  5. Straks redde electroporated cellerne ved tilsætning af 1 mL af pre varmede SOC medium og overføre til 17 mL SOC medium i en 125mL kolbe. Skyl kuvette to gange med 1 mL af SOC medium og overførsel til den samme kolbe (endelige rumfang er 20 mL).
  6. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C under omrystning på 200 rpm.
  7. Bestemme elektroporation effektivitet.
    1. Tilføj 180 μL af 2YT media til hver brønd med en enkelt kolonne i en 96-microwell plade.
    2. Gør 8 ti gange serielle fortyndinger: overføre 20 μL af 20 mL kultur til det første hul i pladen, bland med pipettering og overføre 20 μL af blandingen til næste godt. Gentag dette trin til slutningen af seriel fortynding.
    3. Plade 10 μl af hver af de serielle fortyndinger på en LB/carb plade i to eksemplarer. Plade 100 µL resterende fra hvert af de serielle fortyndinger på separate LB/carb plader til kolonien count krydstjek. Disse plader giver også enkelt kloner til ELISA og sekvens analyse (Se afsnit 5).
    4. Der inkuberes natten over ved 37 ° C.
    5. Kolonierne fra de 10 μL dubletter på LB/carb plade. Antage, at M er den gennemsnitlige koloni antal optalte på 10N fold LB/carb plade (N er fra 1-8). Den samlede bibliotek størrelse er lig med 2 M X 10N + 3 kolonier.
  8. Alikvot kultur fra trin 4.6 lige til to 2-L forbløffet kolber, hver indeholdende 500 mL af 2YT/carb/kan medium for phage bibliotek generation.
  9. Der inkuberes ved 37 ° C under omrystning på 200 rpm natten til omkring 16 h.
  10. Overføre kulturen til to 1-L autoklaveres centrifuge flasker og centrifugeres i 30 min. ved 12.000 × g ved 4 ° C.
  11. Overføre supernatanten til to nye 1-L autoklaveres centrifuge flasker og tilføje 1/5 PIND/NaCl løsning at udfælde phage endelige rumfang. Der inkuberes i isbad i 30 min.
  12. Der centrifugeres i 30 min. ved 12.000 × g og 4 ° C. Omhyggeligt den dekanteres og undgå at forstyrre phage pellet. Spin for 1 min på 4.000 x g og fjerne de resterende supernatanten med en pipette.
  13. Phage resuspenderes med 20 mL sterilt-filtreret 1 X PBS buffer og overførsel til en ny 50 mL tube.
  14. Pellet den vanduopløselige stoffer ved centrifugering for 5 min på 12.000 × g og 4 ° C. Overføre supernatanten til en ny 50 mL tube.
  15. Måle phage koncentration af spektrofotometeret (OD268 = 1,0 for en løsning af 5 X 1012 phage/mL).
  16. Justere phage koncentration på 5 X 1012 phage/mL i 1 X PBS med 10% ultrarent glycerol.
  17. Alikvot 1 mL phage løsning pr. 1,5 mL microcentrifuge tube. Bruge bibliotekerne straks til panorering eller opbevares ved-80 ° C.

5. vurdering af Protein A / L direkte bindende ELISA Assay og sekventering

  1. Tilfældigt vælge 96 enkelt kolonier på LB/carb plade fra trin 4.7.3 til en 96-dybe godt kultur plade der indeholder 800 μL 2YT/carb i hver brønd. Inkuber i 3-4 timer ved 37 ° C under omrystning ved 1000 rpm til OD600 = 0,4-0,8.
  2. Tilsæt 100 μL af M13KO7 (1 X 1011 cfu/mL) til hvert hul i en 96-dyb godt kultur plade med en multikanalpipette. Der inkuberes ved 37 ° C under omrystning ved 1000 rpm i 1 time.
  3. Tilsæt 100 μl 2YT indeholdende 10 X koncentration af kanamycin (500 μg/mL) til hver brønd med en multikanalpipette. Der inkuberes natten over ved 37 ° C under omrystning ved 1000 rpm.
  4. Opløse protein L til 1 µg/mL i 1 X PBS. Frakke 3/4 af brøndene i en 384-godt høje protein-bindende polystyren plade med 30 µL/brønd af protein L løsning. Der inkuberes natten over ved 4 ° C.
  5. Kassér den overnight protein L belægning løsning fra trin 5.4. Tilsæt 50 µL af M-PBST (den blokerende løsning) til alle brønde i 384-godt høje protein-bindende polystyren pladen med en multikanalpipette. Inkuber plader på en mikrotiterplade shaker i 1 time på RT.
  6. Spin ned natten kultur fra trin 5.3 i en dyb 96-og kultur plade på 3.000 x g i 10 min. ved 4 ° C. Phage er i supernatanten.
  7. Kassér den blokerende løsning fra trin 5.5. Tilføje 15 μl af M-PBST og 15 μl af hver phage supernatanten (trin 5.6) til 3 af protein L coatede brønde som tre eksemplarer, og 1 ikke-belagt godt som negativ kontrol ved hjælp af en multikanalpipette. Der inkuberes ved RT i 1 h med rysten på 200 rpm.
  8. Kassér phage løsning. Vask pladen 6 gange med 80 μl af PBST af en automatiseret plade skive.
  9. Tilsæt 15 μl af M-PBST og 15 μl af Protein A-HRP (1:1, 500 fortyndet i 1 X PBS) til hver brønd med en multikanalpipette, og der inkuberes ved RT i 1 h med rysten på ca 200 rpm.
  10. Kassér Protein A-HRP/M-PBST løsningen. Vask pladen 6 gange med 80 μl af PBST.
  11. Tilføje TMB substrat (30 μL/brønd) med en multikanalpipette og inkuberes i 2-3 min, indtil farven udvikler. Stoppe reaktionen med 1,0 M H3PO4 (30 μL/brønd).
  12. Læs plader spektrofotometrisk ved 450 nm. Positive kloner er defineret som dem, der udviser en gennemsnitlig ratio OD450 absorbans af protein L brønde til M-PBST godt større end 3,0.
  13. I en 96-dyb, inficere 50 μL af SS320 i 2YT/tet på log fase med 5 μl af den samme phage bruges til ELISA (trin 5.6) til 30 min på RT.
  14. Tilføje 950 μL 2YT/carb i 96-dybt godt fra trin 5.13 og inkuberes natten over ved 37 ° C under omrystning ved 1000 rpm.
  15. Uddrag phagemid DNA af mini prep DNA udvinding kit. Bruge de upstream primere af VL (5'-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3') og VH (5'-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3') for Sekvensanalyse til at anslå bibliotek sekvens mangfoldighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Efter flowdiagram af Fab bibliotek konstruktion (Se figur 1), vi forberedte M13KO7 helper phage pre-inficeret E. coli SS320 electro-kompetente celler. Effektiviteten af disse electro-kompetente celler er anslået 2 X 109 cfu/µg når Fab phagemid rygraden for bibliotek opbygning blev brugt (figur 4).

Uracil indarbejdelse effektivitet blev ved sammenligning af titer i både E. coli CJ236 og E. coli SS320 celler kontrolleret. E. coli CJ236 og E. coli SS320 celler blev smittet af phage husly dU-ssDNA. E. coli SS320 har enzymer (dUTPase og uracil glycosylase), der kan forringe uracil-holdige DNA, mens E. coli CJ236 mangler disse enzymer og ikke forringe uracil-holdige DNA. For at opnå en acceptabel uracil indarbejdelse effektivitet, skal titers fra E. coli CJ236 være mindst 104 gange højere end dem fra E. coli SS320. Ellers vil vildtype befolkningen stige i biblioteket bygget antistof på grund af ineffektive uracil indlemmelse. Figur 5 viste at titer fra E. coli CJ236 er ca 3 X 105 gange højere end i E. coli SS320, der angiver en effektiv uracil iblanding i phage ssDNA.

Næste, vi forberedt og udvundet dU-ssDNA. DU-ssDNA renhed kontrolleres ved agarosegelelektroforese gelelektroforese (figur 6). Så den oligonukleotid-directed mutagenese blev gennemført og effektiviteten af dU-ssDNA omdannelse til CCC-DNA blev evalueret (figur 6). Tre produkter med lavere motilitet end dU-ssDNA kan visualiseres på gelen herunder hurtigste løb band (CCC-dsDNA), den midterste svage band (hakker band) og den langsomste-kører band (strand-fordrevet DNA).

Efter elektroporation i E. coli SS320, bibliotek størrelse blev anslået fra i natten inkubation plade (Se trin 4.7.5). Den gennemsnitlige bibliotek størrelse var 5 X 109 fra dublerede serielle fortyndinger på LB/carb plader (figur 7). Den skønnede størrelse på dette trin kan dog indeholde phage, der ikke vise funktionelle luftrumsblokke på grund af tilstedeværelsen af en frameshift eller stop codon eller vise fejlfoldede funktionelle luftrumsblokke. Sekventering og ELISA blev brugt til at estimere den funktionelle mangfoldighed af beregnede bibliotek. 96 tilfældigt plukkede enkelt kloner blev sendt til sekvensering analyse. Tabel 4 viser, at 90 ud af 96 tilfældigt plukkede enkelt kloner var med held sekventeret, som indeholder 70 kloner uden en tidlig stop codon (53 kloner med mindst én CDR mutant) og 17 kloner med vildtype sekvens og 20 kloner med en for tidligt stop codon på forskellige områder. Inden for 70 kloner er mutant CDRH1, CDRH2, CDRH3 og CDRL3 50%, 57%, 53% og 56%, henholdsvis, mens den mutant med mindst én CDR er 76%. I de 20 kloner med et for tidligt stop codon (90%) stammer for tidligt stop-codon hovedsageligt fra frameshift af oligonukleotid mutagenese primere, herunder 45% (CDRH1), 10% (CDRH2), 15% (CDRH3) og 20% (CDRL3).

At opdage visning af korrekt foldet funktionelle luftrumsblokke, et protein A / L baseret ELISA var ansat som det er kendt, at protein A og protein L kan genkende, ordentlig foldning af VH ramme og VL ramme, henholdsvis17,18. Enig i analysen, sekventering viste ELISA assay i tre eksemplarer (figur 8), at de 20 kloner med et for tidligt stop codon var alle negative, mens 17 kloner med en wild-type sekvens var alle positive, da de positive forhold var empirisk indstillet på 3,0. For de 53 kloner med mindst én CDR mutant var 43 kloner positive i ELISA, mens 10 kloner var negative. Dette indikerer, at de fleste af kloner var godt foldet mens CdR fra de 10 kloner kan have skadelige virkninger på Fab foldning. I alt 43 kloner ud af de 90 kloner (48%) var godt foldet og indeholdt mindst én CDR mutant. Således funktionelle aminosyre mangfoldighed af biblioteket bygget baseret på protein A / L ELISA og sekvens analyse blev anslået til 2.4 X 109 (dvs., 48% af 5 X 109).

Figure 1
Figur 1: oversigt over phage-vises Fab bibliotek konstruktion. Phage-vises Fab bibliotek opbygning følger en grundlæggende række trin. Det drejer sig om forberedelse af højeffektiv electro-kompetente bakterieceller, udvinding af dU-ssDNA, Kunkels metode baseret oligonukleotid-directed mutagenese, elektroporation og beregning af phage Fab bibliotek størrelse, funktionel evaluering af protein A / L ELISA og DNA sekvens analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Phagemid arkitektur for Fab bibliotek konstruktion. De grundlæggende funktioner i phagemid rygrad består af oprindelsen af enkeltstrenget (f1 ori) og dobbelt-strenget (dsDNA ori) DNA replikation, og en ampicillin/carbenicillin resistens gen (AmpR). For Fab display, under kontrol af alkalisk fosfatase promoter (PhoA), phagemid indeholder et bicistronic kassettebånd drev udtryk og sekretion af: lys kæde (LC) bestående af en sekretion signal, VL (variable region let kæde), CL (konstant region let kæde), og C-terminale flag tag; og tunge kæde (HC) bestående af en sekretion signal, VH (variable region af tunge kæde) og CH1 (konstant region 1 af tunge kæde) smeltet p3 phage mindre frakke protein. Samling af lys kæde og tunge kæde til Fab inden for E. coli periplasm dirigerer visning af Fab på phage overflade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: skematisk af Kunkels metode baseret oligonukleotid-directed mutagenese. I denne protokol brugte vi Kunkels metode til at forberede dU-ssDNA skabelon. Oligonukleotider for CDRH1, CDRH2, CDRH3 og CDRL3 med designet mangfoldighed er fosforyleret, udglødet til skabelonen og bruges til at konvertere ss-DNA til CCC-dsDNA. Efter elektroporation i E. coli SS320 electro-kompetente celler, heteroduplex DNA er repareret enten vilde type eller mutant form; På grund af tilstedeværelsen af uracil i vildtype strand, reparationsprocessen favoriserer mutant form og dermed, formen mutant dominerer biblioteket. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Vurdering af M13KO7 pre-inficeret E. coli SS320 electro-kompetente celle effektivitet. En phagemid rygrad vektor blev brugt til at kontrollere elektroporation effektiviteten af de kompetente celler. Formel til at beregne effektiviteten er som følger: antage, at M er den gennemsnitlige koloni nummer regnes fra den mest fortyndede fold 10N (N er fra 1-8) i to eksemplarer. E. coli SS320 effektivitet fra LB/carb plade er lig med M X 10N + 3 cfu/µg. Effektiviteten af de electro-kompetente celler er omkring 2 X 109 cfu / µg. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Vurdering af uracil indarbejdelse i ssDNA af phage infektion med E. coli CJ236 og E. coli SS320 celler. Baseret på Kunkels metode, uracil indarbejdelse effektivitet kontrolleres ved sammenligning af phage infektion titer i både E. coli CJ236 og E. coli SS320 celler. Formlen til beregning af titer er som følger: antage, at M er den gennemsnitlige koloni nummer regnes fra den mest fortyndede fold 10N (N er fra 1-10), og at titer fra E. coli CJ236 eller E. coli SS320 er lig med M X 10N + 2 cfu/mL. Effektiviteten af uracil indarbejdelse kan estimeres ud fra titer forholdet mellem E. coli CJ236 og E. coli SS320. Titer i E. coli CJ236 var 9 X 1012 cfu/mL, mens titer i E. coli SS320 var 3 X 107 cfu/mL. Titer forholdet mellem E. coli CJ236 og E. coli SS320 var 3 X 105. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: konvertering af dU-ssDNA til CCC-DNA ved oligonukleotid-directed mutagenese. Efter oligonukleotid-directed mutagenese, effektiviteten af dU-ssDNA omdannelse til CCC-DNA blev evalueret. dU-ssDNA var helt konverteret til dsDNA. Den dominerende band er CCC-dsDNA, mens der er en mindre del af hakker dsDNA og strand-fordrevet DNA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Phage titrering til beregning af bibliotek størrelse. Efter elektroporation i E. coli SS320, blev bibliotek størrelse anslået fra serielle fortyndinger på LB/carb plader. Formlen til beregning af størrelse er som følger: antager M er den gennemsnitlige koloni nummer regnes fra den mest fortyndede fold 10N fra en 2YT/Carb plade (N er fra 1-8), størrelse er lig med 2 M X 10N + 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Protein A / L direkte bindende phage ELISA. Protein L kan genkende de rammer for godt foldede kappa lys kæde VL og protein en kan genkende som led i godt foldede tunge kæde VH. Binding af Fab med protein L og A angiver ordentlig foldning af både tunge kæde og lys kæde. Kort sagt, protein L i tre eksemplarer og den negative kontrol M-PBST var belagt på pladen, Fab phage analysere fra forskellige kloner var inkuberes med protein L og M-PBST, derefter efter vask, protein A-HRP blev brugt til at fange bundne Fab phage. Phage ELISA aflæsninger viste 90 tilfældigt plukkede kloner med vellykkede sekventering udlæsning. En tærskel linje, der repræsenterer klon som positive var empirisk defineret, hvor forholdet mellem OD450 absorbans værdi fra protein L (gennemsnittet af tre eksemplarer med fejllinje) versus negative kontrol var mere end 3.0. Tre grupper baseret på sekvensering analyse var vist, svarende til en mutant uden stop codon i rød (53 kloner), vildtype (WT) i blå (17 kloner), og mutant med stop codon i grøn (20 kloner). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Opsætning af reagens Komponent Beløb bemærkninger/beskrivelse
2YT medium Gærekstrakt 10 g Der tilsættes ultrarent vand fyldes op til 1,0 L, justere pH 7.0, autoklave.
Trypton 16 g
NaCl 5 g
2YT top agar Gærekstrakt 10 g Tilsættes ultrarent vand fyldes op til 1,0 L og justere pH 7.0, varme krystallerne, autoklave.
Trypton 16 g
NaCl 5 g
Granuleret agar 7,5 g
2YT/carb/cmp medium Carbenicillin 100 μg/mL
Chloramphenicol 10 μg/mL
2YT/carb/kan/uridine medium Carbenicillin 100 μg/mL
Kanamycin 50 μg/mL
Uridine 0,25 μg/mL
Carb-2YT-tet medium Carbenicillin 100 μg/mL
Tetracyklin 10 μg/mL
2YT/carb medium Carbenicilin 100 μg/mL
2YT/kan medium Kanamycin 50 μg/mL
Kan-2YT-tet medium Kanamycin 50 μg/mL
Tetracyklin 10 μg/mL
2YT/tet medium Tetracyklin 10 μg/mL
2YT/cmp medium Chloramphenicol 10 μg/mL
LB medium agar Gærekstrakt 5 g Der tilsættes ultrarent vand fyldes op til 1,0 L, justere pH 7.0, autoklave. For LB agar, tilsættes 20 g granuleret agar, autoklave.
Trypton 10 g
NaCl 10 g
LB/carb plader LB agar 1L
Carbenicillin 100 μg/mL
LB/tet plader LB agar 1 L
Tetracyklin 10 μg/mL
LB/cmp plader Chloramphenicol 10 μg/mL
LB/kan plader Kanamycin 50 μg/mL
SOC medium Gærekstrakt 5 g Der tilsættes ultrarent vand for at gøre op volumen til 1,0 L og justere pH 7.0, autoklave.
Trypton 20 g
NaCl 0,5 g
KCl 0,2 g
2.0 M MgCl2 5,0 mL
1,0 M glukose 20 mL
Superbroth medium Trypton 12 g 900 mL, der tilsættes ultrarent vand autoklave, tilsættes 100 mL af autoklaveres 0,17 M KH2PO4, 0,72 M K2HPO4.
Gærekstrakt 24 g
Glycerol 5 mL
Superbroth kan/tet medium Kanamycin 50 μg/mL
Tetracyklin 10 μg/mL
1 X PBS NaCl 137 mM Justere pH til 7.2, autoklave.
KCl 3 mM
Na2HPO4 8 mM
KH2PO4 1,5 mM
TAE/agarosegel TAE buffer
Agarosen 1% (w/v)
GelRed 1: 10000 (v/v)
TMB-substratet TMB 50% (v/v)
H2O2 peroxidase substrat 50% (v/v)
M-PBST buffer 1 X PBS 100 ml
Tween-20 0,05% (v/v)
Fedtfrit mælkepulver 5% (v/v)
5 X PIND/NaCl PIND-8000 20% (w/v) Tilsættes ultrarent vand til fyldes op til 1L og autoklave.
NaCl 2.5 M
PBST buffer 1 X PBS 1 L 0,22 μm filter-sterilisere.
Tween-20 0,05% (v/v)
10 x TM buffer MgCl2 0,1 M Juster pH-værdien til 7,5.
Tris 0,5 M
1,0 mM HEPES, pH 7,4 1,0 M HEPES 4,0 mL 0,22 μm filter-sterilisere.
Ultrarent vand 4.0 L
10% (v/v) laves glycerol Laves glycerol 100 ml 0,22 μm filter-sterilisere.
Ultrarent vand 900 mL
Ultrarent vand H20 DNase-gratis, fri for Rnase, Pyrogen-fri.

Tabel 1: Reagens setup.

Table 2
Tabel 2: CDR EDD og mutagenese primere. DNA-sekvenser i regionerne CDR at være muteret er vist med rødt; sekvenser er formateret ved hjælp af IUPAC nukleotid kode. "X" angiver tri-nukleotid fra en blanding, der er konstrueret til at indeholde forskellige aminosyre sæt; "n" indikerer forskellige antal X. fem primere med et forskelligt antal X blev brugt til at sprede CDRL3 eller CDRH3, henholdsvis, at generere variabel længde af CDRL3 og CDRH3. Rest numre er defineret af IMGT nomenklaturen. Venligst klik her for at downloade denne tabel.

Kunkels metode baseret mutagenese
Reaktion 1. Oligonukleotid fosforylering med T4 polynucleotide kinase
Komponent Beløb Endelige
mutagene oligonukleotider 0,6 μg
10 x TM buffer 2 ΜL 1 X
10 mM ATP 2 ΜL 1 mM
100 mM DTT 1 ΜL 5 mM
T4 polynucleotide kinase (10 U/μL) 2 ΜL 20 U
Laves H20 Op til 20 μL
Reaktion indstilling
Trin 1. 37 ° C i 1 time
Reaktion 2. Udglødning af oligonukleotider til skabelonen
Komponent Beløb Endelige
dU-ssDNA skabelon 20 μg 20 μg
10 x TM buffer 25 ΜL 1 X
fosforyleres CDRH1 oligonukleotider 20 ΜL 0,6 μg
fosforyleres CDRH2 oligonukleotider 20 ΜL 0,6 μg
fosforyleres CDRH3 oligonukleotider 20 ΜL 0,6 μg
fosforyleres CDRL3 oligonukleotider 20 ΜL 0,6 μg
Laves H20 Op til 250 μL
Reaktion indstilling
Trin 1. 90 ° C i 3 min
Trin 2. 50 ° C i 5 min
Trin 3. 20 ° C i 5 min
Reaktion 3. Enzymatisk syntese af CCC-dsDNA
Komponent Beløb Endelige
udglødet oligonukleotider/skabelon blandinger 250 ΜL
10 mM ATP 10 ΜL 346 µM af hver nukleotid
dNTP mix (25 mM af hver nukleotid) 10 ΜL 865 µM af hver nukleotid
100 mM DTT 15 ΜL 5 mM
T4 DNA ligase 1 ΜL 30 Weiss enheder
T7 DNA polymerase 3 ΜL 30 U
Reaktion indstilling
Trin 1. 20 ° C for overnatning

Tabel 3: Procedurer og komponenter af Kunkels metode baseret reaktion.

Gruppe Klon antallet Regionen Procentdel
Ikke for tidligt stop codon 70 CDRH1 mutation 50% (35/70)
CDRH2 mutation 57% (40/70)
CDRH3 mutation 53% (37/70)
CDRL3 mutation 56% (39/70)
Mindst én CDR mutation 76% (53/70)
For tidligt stop codon 20 CDRH1 defekt 45% (9/20)
CDRH2 defekt 10% (2/20)
CDRH3 defekt 15% (3/20)
CDRL3 defekt 20% (4/20)
Andre defekt 10% (2/20)

Tabel 4: Sekvensanalyse af CDRH1, CDRH2, CDRH3 og CDRL3 fra den syntetiske Fab bibliotek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For at konstruere høj diversitet, phage-vises Fab biblioteker, kvalitetskontrol check point er nødvendige for at overvåge forskellige stadier af byggeprocessen, herunder kompetenceudvikling af electro-kompetente celler, kvaliteten af dU-ssDNA skabelon, effektiviteten af CCC-dsDNA syntese, titer efter elektroporation, Fab foldning og aminosyre mangfoldighed af CdR af Sekvensanalyse af Fab-phage kloner.

Højt udbytte og renheden af dU-ssDNA er afgørende for høj mutagenese sats. Vores erfaring, kan phage induktion ved 25 ° C natten give mere dU-ssDNA end fra phage induktion ved 37 ° C natten over. Dette er i overensstemmelse med en tidligere betænkning19. Vedrørende ssDNA udvinding indeholdt den oprindelige plasmid Spin kit (QIAprep) MLB phage lysis og bindende. Senere, blev MLB afbrudt med ukendt årsag og erstattet af PB. Vi fandt, at udbyttet af dU-ssDNA er meget lavere fra PB behandling forhold der fra MLB behandling. I denne protokol brugte vi et reagens opkaldt UT-MLB20 at erstatte MLB og fandt udbyttet af dU-ssDNA er lig den, fra den oprindelige Spin Kit.

Som CDRH3 og CDRL3 er de mest forskelligartede områder for antigen anerkendelse21, at indføre en skræddersyet mangfoldighed med et bestemt sæt af aminosyre kombinationer og nøgletal og fjerne redundans bias og stop-kodon indført ved Entartete kodon som Martin (N, equimolar/c/G/t; K, equimolar for G/T), trimer codon phosphoramidite-baserede oligonukleotider22 med nøjagtig én trimer codon svarer til en bestemt aminosyre er designet til CDRH3 og CDRL3. Desuden blev variabel længde af CDRH3 og CDRL3 oligonukleotider brugt til yderligere at øge EDD.

Efter enzymatisk syntese af CCC-dsDNA, generelt tre bands er observeret ved agarosegelelektroforese gelelektroforese og bands bør være klart uden smear. Blandt dem er den hurtigste-kører band CCC-dsDNA, der kan give en høj Mutationshastighed (omkring 80%) efter elektroporation23. Den langsomste-kører band er strand-fordrevet DNA, der udspringer af iboende strand-forskydning aktivitet af T7 DNA polymerase og har en lav mutation sats (ca 20%)23. Den midterste svage band er hakker DNA efter udvidelsen på grund af utilstrækkelig T4 DNA ligase aktivitet eller utilstrækkelig oligonukleotid fosforylering.

En lille sekventering prøve pool blev brugt til at estimere bibliotek mangfoldighed dog ikke nøjagtig24. Du skal vurdere den reelle mangfoldighed præcist, kan næste generation sequencing (NGS) være en god mulighed i minedrift mangfoldighed dybden af de beregnede bibliotek25. I praksis, på grund af de aktuelle udfordringer af NGS teknologi inklusive Læs længde, præcision, omkostninger og høj produktivitet, sekventering af Fab phage biblioteket anvendes i denne protokol med længde på omkring 950 bp spænder over CDRH1, CDRH2, CDRH3 og CDRL3 er ikke opnåelige; Det er dog muligt at estimere scFv (ca 700 bp) bibliotek mangfoldighed inden for rækkevidde af millioner24,25. En anden central standard at evaluere mangfoldigheden af beregnede bibliotek er at bruge biblioteket til at panorere mod mange forskellige typer af antigener og beregne de positive kloner fanget da biblioteket mangfoldighed er direkte korreleret med den succes rate af antigen panorering26. Høj overførselshastighed udvalg platform er velegnet til dette formål og læsere kan henvise til en detaljeret protokol rapporteret af Miersch et al. 27

Teoretisk, phage-vises syntetisk antistof biblioteker med skræddersyede mangfoldighed kan bruges til at målrette nogen antigen og dermed har brede anvendelsesmuligheder. Øjeblikket, selskaber, herunder Cambridge antistof teknologi (kat), MedImmune, Genentech, Dyax, Bioinvent, Pfizer, og MorphoSys er stærkt afhængige af phage display platforme for terapeutisk antistof udvikling28. Derudover har mange phage display kerne teknologi patenter udløbet29. Uden tvivl, vil dette udløse det maksimale potentiale af phage-vises antistof teknologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne værdsætter Dr. Frederic Fellouse fra Sidhu lab for kritiske kommentarer på Kunkels metode baseret syntetisk Fab phage bibliotek konstruktion. Forfatterne forstår Mrs Alevtina Pavlenco og andre medlemmer fra Sidhu lab for værdifuld hjælp til at forberede højeffektiv electro-kompetente E. coli celler og høj kvalitet dU-ssDNA. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant No.: 81572698, 31771006) til DW og ved ShanghaiTech Universitet (Grant No.: F-0301-13-005) til laboratoriet af antistof Engineering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1.0 M H3PO4 Fisher AC29570
1.0 M Tris, pH 8.0 Invitrogen 15568-025
10 mM ATP Invitrogen 18330-019
100 mM dithiothreitol Fisher BP172
100 mM dNTP mix GE Healthcare 28-4065-60 solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-76-02
50X TAE Invitrogen 24710030
Agarose Fisher BP160
Carbenicillin, carb Sigma C1389 100 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL.
Chloramphenicol, cmp Sigma C0378 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9620G
Granulated agar VWR J637-500G
H2O2 peroxidase substrate Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-65-02
K2HPO4 Sigma 795488
Kanamycin, kan Fisher AC61129 50 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL.
KH2PO4 Sigma P2222
Na2HPO4 Sigma 94046
NaCl Alfa Aesar U19C015
Nanodrop Fisher ND2000C
NaOH Fisher SS256 ! CAUTION NaOH causes burns.
NON-Fat Powdered Milk Sangon Biotech A600669
PEG-8000 Fisher BP233
Protein A-HRP conjugate Invitrogen 101123
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 22704
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Recombinant Protein L Fisher 77679
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203S
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T7 DNA polymerase New England Biolabs M0274S
Tetracycline, tet Sigma T7660 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
Tryptone Fisher 0123-07-5
Tween-20 Sigma P2287
Ultrapure glycerol Invitrogen 15514-011
Uridine Sigma U3750 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL.
Yeast extract VWR DF0127-08
Name Company Catalog Number Comments
Strains
E.coli CJ236 New England Biolabs E4141 Genotype: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA.
E.coli SS320 Lucigen 60512 Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.
M13KO7 New England Biolabs N0315S
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2-cm gap electroporation cuvette BTX
96-well 2mL Deep-well plates Fisher 278743
96-well Maxisorp immunoplates Nunc 151759
Baffled flasks Corning
Benchtop centrifuge Eppendorf 5811000096
Centrifuge bottles Nalgene
ECM-630 electroporator BTX
Magnetic stir bars Nalgene
Thermo Fisher centrifuge Fisher
High speed shaker TAITEK MBR-034P
Microplate shaker QILINBEIER QB-9002
Liquid handler for 96 and 384 wells RAININ
Mutil-channel pipette RAININ E4XLS
Amicon concentrator Merck UFC803096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. (2017).
  2. Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9, (2), 167-181 (2017).
  3. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, (5517), 495-497 (1975).
  4. Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21, (11), 966-973 (1999).
  5. Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34, (12), 960-969 (2016).
  6. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253, (18), 6551-6560 (1978).
  7. Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228, (4705), 1315-1317 (1985).
  8. Sidhu, S. S. Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. CRC Press. (2005).
  9. Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (16), 8950-8954 (2000).
  10. Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8, (7), 1177-1194 (2016).
  11. Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2, (12), 682-688 (2006).
  12. Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
  13. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, (2), 488-492 (1985).
  14. Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
  15. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425, (4), 803-811 (2013).
  16. Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27, (1), 55-77 (2003).
  17. Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9, (8), 679-687 (2001).
  18. Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (10), 5399-5404 (2000).
  19. Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58, (1), 10-17 (2012).
  20. Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
  21. Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31, (3), 169-217 (1994).
  22. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22, (25), 5600-5607 (1994).
  23. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).
  24. Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12, (5), e0177574 (2017).
  25. Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring? Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
  26. Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81, (4), 645-670 (1979).
  27. Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492 (2015).
  28. Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16, (5), 3675-3700 (2011).
  29. Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics - the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28, (5), 538-544 (2011).
Opførelsen af syntetiske Phage vises Fab bibliotek med skræddersyede mangfoldighed
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).More

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter