Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bouw van synthetische Phage weergegeven Fab bibliotheek met op maat gemaakte diversiteit

doi: 10.3791/57357 Published: May 1, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde procedure voor de bouw van een bibliotheek van synthetische antilichaam faag-weergegeven met op maat gemaakte diversiteit. Synthetische antilichamen hebben brede toepassingen van fundamenteel onderzoek om de diagnose van de ziekte en therapeutics.

Abstract

Vraag naar monoclonal antilichamen (mAbs) in fundamenteel onderzoek en geneeskunde groeit jaarlijks. Hybridoma technologie is de dominante methode voor mAb development sinds haar eerste verslag in 1975. Als een alternatieve technologie zijn faag display methoden voor mAb ontwikkeling steeds aantrekkelijker omdat Humira, het eerste faag afkomstige antilichaam en één van de best verkochte mAbs, goedgekeurd voor de klinische behandeling van reumatoïde artritis in 2002. Als een proefdiervrije mAb ontwikkeling technologie gebaseerde, mijdt faag display antigeen immunogeniciteit, humanisering en dierlijke onderhoud die worden vereist van de ontwikkeling van het antilichaam van de technologie op basis van traditionele hybridoma. In dit protocol beschrijven we een methode voor de bouw van synthetische faag-weergegeven Fab bibliotheken met diversiteit van 109-1010 verkrijgbaar met een enkel electroporation. Dit protocol bestaat uit: 1) hoogrendabele electro-bevoegde cel voorbereiding; 2) extractie van uracil-bevattende single-stranded DNA (dU-ssDNA); 3) Kunkel methode gebaseerd oligonucleotide gerichte mutagenese; 4) electroporation en berekening van de grootte van de bibliotheek; 5) eiwit A/L gebaseerde enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) voor het vouwen en functionele diversiteit evaluatie; en 6) DNA sequentieanalyse van diversiteit.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

mAbs heeft brede toepassingen variërend van fundamenteel onderzoek tot de diagnose van de ziekte en therapeutics. Vanaf 2016 zijn meer dan 60 mAbs goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (USFDA) voor de klinische behandeling van auto-immuunziekten, kanker en infectieziekten1,2.

In 1975 rapporteerde Kohler en Milstein een techniek voor de continue generatie van antilichamen van een enkele klonen specificiteit van een cellulaire bron aangeduid als 'hybridomas' en deze techniek is later uitgegroeid tot een hoeksteen in geneeskunde en industrie3 ,4. Generatie van mAbs door deze methode vereist een paar stappen, met inbegrip van de productie van antigeen muis immunisatie, winning van B-lymfocyten, fusie van B-cellen met myeloma cellen vormen onsterfelijke hybridoma cellen, selectie van de kloon, en voor therapeutische toepassingen, humanisering is vereist om te voorkomen dat menselijke anti-muis-antilichamen (HAMA)4,5. Echter, voor deze technologie, antigenen met inbegrip van toxines, pathogenen en zeer geconserveerde eiwitten zijn relatief niet effectief in het genereren van een immuunrespons in vivo voor mAb productie5.

In 1978 gemeld Hutchison et al. het gebruik van een oligonucleotide aan directe mutagenese van een residu in een single-stranded bacteriofaag virus6. In 1985, Smith gemeld dat buitenlandse gene fragmenten kunnen worden gesmolten in het frame met het gen codering faag vacht eiwit III en kunnen dus worden weergegeven op het oppervlak van de bacteriofaag zonder afbreuk te doen aan haar infectiviteit7. Deze baanbrekende werken een basis gelegd voor de latere aanleg van phage-weergegeven antilichaam bibliotheken in immuun, naïef, en synthetische vormt met de formaten van single-keten variabele fragment (scFv) en antigeen-bindende fragment (Fab) voor therapeutische mAb development8,9. Van de technisch oogpunt, de ontwikkeling van het antilichaam weergave gebaseerde van de bacteriofaag biedt een complementaire benadering van hybridoma gebaseerde mAb ontwikkeling dat bijdragen kan tot het omzeilen van de beperkingen die sommige antigenen kunnen opleveren en de humanisering proces dat hybridoma afkomstige antilichamen vereisen vaak5. Vanaf 2016, 6 faag display afkomstige mAbs zijn goedgekeurd in de markt met inbegrip van Humira, een van de meest succesvolle mAbs gebruikt voor de behandeling van reumatoïde artritis, en vele faag display afkomstige antilichaam kandidaten zijn momenteel in diverse stadia van klinische onderzoek10.

Voor immuun- en naïef faag antilichaam bibliotheken, de diversiteit van complementariteit-bepalen regio's (CDR) in lichte en zware keten is afgeleid van het natuurlijke immuunsysteem repertoire (d.w.z., van B-cellen). De diversiteit van CDR in synthetische faag antilichaam bibliotheken is daarentegen volledig kunstmatige. Synthetische benaderingen van bibliotheek bouw bieden nauwkeurige controle over het ontwerp van de reeks diversiteit en bieden mogelijkheden voor mechanistische studies van antilichaam structuur en werken11,12. Bovendien kan het kader voor synthetische bibliotheken worden geoptimaliseerd voor bibliotheek bouw om stroomafwaarts, grootschalige industriële ontwikkeling11,12.

In 1985, Kunkel rapporteerde een single-stranded DNA (ssDNA) mutagenese sjabloon gebaseerde benadering om plaats-geleide mutaties in M13 bacteriofaag efficiënt13. Deze aanpak werd vervolgens op grote schaal gebruikt voor de bouw van bibliotheken faag-weergegeven. Chemisch gesynthetiseerd DNA oligonucleotides ontworpen om diversiteit in Fab CDR worden opgenomen in een phagemid met een antilichaam ruggengraat sjabloon. In dit proces, de phagemid wordt uitgedrukt als een uracil-bevattende ssDNA (dU-ssDNA) en de oligonucleotides worden gegloeid op de CDR en verruimd en double-stranded DNA (dsDNA) in aanwezigheid van DNA van T7 polymerase en T4 DNA ligase synthetiseren. Tot slot kan gegenereerde ds-DNA in Escherichia coli door electroporation worden binnengebracht.

Voor hoge diversiteit, faag-weergegeven bibliotheek bouw, hoog-voltage electroporation van een tweecomponenten mengsel van electro-bevoegde cellen en covalent moet gesloten circulaire dsDNA (CCC-dsDNA) zorgvuldig worden voorbereid. Sidhu et al. bewerkt voor de bereiding van electro-bevoegde cellen en DNA op basis van traditionele methoden en sterk verbeterde bibliotheek diversiteit14.

In dit protocol beschrijven we een methode voor de bouw van synthetische faag-weergegeven Fab bibliotheken met diversiteit van 109-1010 verkrijgbaar met een enkel electroporation. Figuur 1 toont een overzicht van de bibliotheek bouw waaronder: 1) hoogrendabele electro-bevoegde cel voorbereiding; 2) extractie van dU-ssDNA; 3) Kunkel methode gebaseerd oligonucleotide gerichte mutagenese; 4) electroporation en berekening van de grootte van de bibliotheek; 5) eiwit A/L gebaseerde ELISA voor het vouwen en functionele diversiteit evaluatie; en 6) DNA sequentieanalyse van diversiteit. In de materiaal tabelstaan alle reagentia, stammen en apparatuur. Tabel 1 toont de reagens setup.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Opmerking: Filter steriele tips moeten gebruikt worden tijdens bij de behandeling van phage om verontreiniging Pipetteer pistool te omgeving te voorkomen. Aseptische gebied of kap moet worden gebruikt bij behandeling met bacteriën en phage experimenten. Phage experiment gebied moet worden schoongemaakt met behulp van 2% natrium dodecyl sulfaat (SDS) gevolgd door 70% ethanol faag verontreiniging te vermijden. Voor het maken van seriële verdunningen in dit protocol, nieuwe tips dient voor elke verdunning.

1. E. Coli SS320 Electro-bevoegde cel voorbereiding

  1. Vooraf warm LB/tet agarplaat (voorbereid en opgeslagen bij 4 ° C voor minder dan 1 - week oud) bij 37 ° C incubator voor 1 h. gebruiken een steriele inoculatie lus of steriele tip aan streak uit een voorraad van glycerol van E. coli SS320 cellen op de voorverwarmde LB/tet agar bord in een zigzag-anker direc tion zachtjes langs het oppervlak van de plaat. Incubeer de plaat bij 37 ° C incubator's nachts voor ongeveer 12-15 h.
  2. De volgende dag, gebruik een steriele inoculatie lus of steriele tip om te kiezen van een goed gescheiden één kolonie langs de zig-zag-lijn en enten in 10 mL voor 2YT/tet medium in een 50mL ronde onderkant-buis door dompelen de lus in het medium en kort te roeren.
  3. Incubeer bij 37 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut gedurende ongeveer 3-4 uur tot OD600 is bereikt op rond 0,4-0,8 (log fase groei). Monitor OD600 bij 2 h. Tijdens deze periode, warme vooraf 5 LB/tet agar platen (voorbereid en opgeslagen bij 4 ° C voor minder dan 1 - week oud) in een incubator 37 ° C gedurende ten minste 1 uur.
  4. Toevoegen van 20 μL M13KO7 helper faag uit lab voorraad met titer rond 1 x 1013 kolonievormende eenheid (cfu) /mL in 180 μL van steriele 1 X PBS in gesteriliseerde met autoclaaf 1.5-mL buizen te bereiden 10 tienvoudige seriële verdunningen.
  5. Aliquot 4 mL gesteriliseerde met autoclaaf en vloeibare 2YT top agar in 5 X 14 mL ronde onderkant buizen, label van elke buis met een verdunning van het vijfde tot het negende van het tienvoudige verdunning, respectievelijk, en broeden in een incubator 65 ° C te handhaven van de 2YT top agar in de vloeibare toestand.
  6. Mix 500 μL van log fase E. coli SS320 cellen in de buis van de verdunning M13KO7 (Kies de vijfde tienvoudige verdunning naar de negende tienvoudige verdunning) en broeden in een incubator 37 ° C gedurende 5-10 minuten.
  7. Tijdens de incubatie van stap 1.6, 2YT top agar van stap 1.5 overbrengen naar kamertemperatuur (RT) om af te koelen gedurende ongeveer 5 minuten tot ongeveer 42 ° C. Innerlijke pols gebruiken voor het testen van de temperatuur van de bovenste agar 2YT; het moet als vloeistof. Elke verdunning mengsel van stap 1.5 overbrengen aan elke overeenkomstige 2YT top agar buis. Draai de deksel van elke buis en meng door het draaien ondersteboven meermaals zacht en kort te vermijden zeepbel generatie.
  8. Zorgvuldig giet van ieder mengsel langs de rand van een vooraf warm LB/tet agarplaat (uit stap 1.3) en hellen de plaat iets om volledig en gelijkmatig de plaat te vullen met het mengsel terwijl het vermijden van de invoering van bubbels. Houd de platen op RT voor ongeveer 5-10 min om de hoogste agar binnen elke plaat stollen en Incubeer de platen van de bovenste agar 2YT bij 37 ° C's nachts voor ongeveer 15-18 h.
  9. Kies de plaat verdunning na overnachting groei vanaf stap 1.8 met rond 100-200 middelgrote, single, goed gescheiden platen voor inoculatie van de plaque. Gebruik één hand te houden de agarplaat tegen een lichtbron, alsmede de andere kant te houden van een pipet pistool geladen met een lang steriel pipet-tip om verticaal stab in de bovenste agar, en het verzamelen van een enkelvoudige en goed gescheiden plaque.
    1. Hellen de pipet tip lichtjes van elkaar te scheiden van de bovenste agar met plaque. Pipetteer op en neer meerdere malen te verjagen van de agar met plaque in een ronde bodem van 14 mL cultuur buis voorgeladen met 1 mL van 2YT/kan/tet medium (Zie tabel 1).
    2. Herhaal deze procedure om het kiezen van 3-5 plaques in totaal. Het doel van het plukken van de verschillende platen is om succesvolle inoculatie, zoals een plaquette te flauw en relatief klein in vergelijking met een kolonie bacteriën. Groeien de plaques gedurende 8 uur bij 37 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
  10. Overdracht van een buis van het kweken van cultuur in 50 mL voor 2YT/kan/tet medium in een maatkolf van 250 mL verbijsterd. Groeien bij 37 ° C met schudden bij 200 rpm's nachts gedurende ongeveer 12 uur.
  11. Drie 2-L verbijsterd kolven met 900 mL van superbroth/tet/kan medium, elk met 5 mL van de overnachting cultuur worden geënt. Incubeer bij 37 ° C met schudden bij 200 t/min voor 6-7 h OD600 rond 0.6-0.8.
  12. Chill de drie kolven van bacteriecultuur in een ijsbad voor 5 min met zachte constante wervelende met de hand. De volgende stappen moeten gebeuren in een koude kamer, op ijs, met prechilled oplossingen en apparatuur.
  13. Gebruik van absorptie weefsel handdoek drogen het buitenste glas van iedere kolf; Gebruik één hand om te hellen de fles 1-L gesteriliseerde met autoclaaf centrifuge op de Bank en de andere hand te giet het medium zachtjes uit elke kolf in elke fles centrifuge.
  14. Draai bij 5.000 × g en 4 ° C gedurende 10 minuten om de bacteriën. pellet
  15. Na centrifugeren, decanteren zachtjes de bovendrijvende substantie in een gesteriliseerde met autoclaaf afval bekerglas van 5-L.
  16. Elke fles vullen met 100 mL steriele gefiltreerd 1,0 mM HEPES, pH 7.4, en voeg een gesteriliseerde met autoclaaf magnetische roer bar aan elke fles om te helpen bij pellet resuspensie van 200 toeren per minuut. Swirl en verjagen de hele pellet van de muur van de fles iedere enkele minuten tijdens de magnetische roeren. Zodra de pellet is opgelost, vul elke fles met een extra 400 mL steriele gefiltreerd 1,0 mM HEPES, pH 7.4.
  17. Centrifugeer bij 5.000 × g en 4 ° C voor 10 min. Decant het supernatant, behoud van de roer-bar in de fles.
  18. Herhaal stap 1.16 aan 1.17 eens.
  19. Resuspendeer elke pellet in steriele-gefilterd, 10% ultrazuiver glycerol 500 mL met behulp van de roer-bars. Swirl en verjagen de hele pellet van de muur van de fles iedere enkele minuten tijdens de magnetische roeren.
  20. Centrifugeren en decanteren zoals in stap 1.17. Herhaal stap 1.19 eens. Gebruik lange arm gesteriliseerde met autoclaaf pincet te verwijderen van de roer-bar.
  21. Centrifugeer bij 5.000 × g- en 4 ° C gedurende 15 min. Decant het supernatant en verwijder eventuele resterende sporen van supernatant van elke fles van de centrifuge met een pipet.
  22. 3,0 mL 10% ultrazuiver glycerol toevoegen aan één fles en zachtjes resuspendeer de pellet door pipetteren. Spoel de suspensie tot de volgende fles en herhaal tot alle van de pellets zijn geresuspendeerde en gecombineerd in één fles. Ongeveer 6 mL sterk geconcentreerde cellen worden verkregen met een titer van ongeveer 3 x 1011 cfu/mL.
  23. Vooraf chill 1.5-mL gesteriliseerde met autoclaaf microcentrifuge buizen en een buis van de 96-Wells opbergdoos zonder scheidingswand bij-80 ° C gedurende ten minste 1 uur voordat u deze stap. Draagt de vooraf gekoeld microcentrifuge buizen aan de koude kamer op ijs voordat pipetteren aliquots van de celsuspensie pellet. Gebruik een pipet aan aliquoot 350 μL van celsuspensie in elke 1,5 mL microcentrifuge buis.
  24. Breng de aliquots in een schuim doos container gevuld met vloeibare stikstof voor flash bevriezing (3-5 min).
    1. Vervoer van het schuim doos met vloeibare stikstof naar een vriezer-80 ° C (zie stap 1.23).
    2. Verwijderen van de 1.5-mL microcentrifuge buis opbergdoos uit de diepvries-80 ° C (zie stap 1.23) en zet op ijs.
    3. Snel gebruiken een metalen gaas te zeef de aliquots van vloeibare stikstof en plaats ze in de buis opbergdoos. Winkel bij-80 ° C.
      Let op: De vloeibare stikstof kan brandwonden veroorzaken en moet worden gezorgd voor de bescherming van de veiligheid. Gebruik een Fab ruggengraat phagemid om de efficiëntie van de bereid electro-bevoegde cellen (de Fab ruggengraat phagemid voorraad moet in ultrazuiver (MilliQ) water bij 400 ng/µL) te controleren. Ontdooi de Fab ruggengraat phagemid in 10 µL ultrazuiver water 1 μg en een hoeveelheid 350 μL van electro-bevoegde SS320 op ijs, en prechill een cuvet electroporation 0,2 cm tussenruimte op het ijs.
  25. De 350 μL electro-bevoegde SS320 cellen toevoegen aan de 10 µL DNA na het ontdooien en meng door het meerdere malen pipetteren terwijl het mengsel op het ijs. Vermijd invoering van bubbels.
  26. Vooraf warm 15 mL SOC voedingsbodem in een 50mL-buis in een waterbad 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten voordat electroporation. Het mengsel van 360 μL overbrengen in de meetcel en electroporation na instructies van de fabrikant uit te voeren.
  27. Onmiddellijk de cellen na electroporation door toevoeging van 1 mL voorverwarmde SOC voedingsbodem (uit stap 1,27) en pipetteren te redden. Het medium van de Cuvet overbrengen in een vooraf geladen met 5 mL voorverwarmde SOC. kolf van 125 mL
  28. Spoel de cuvette tweemaal, telkens met 1 mL van voorverwarmde SOC medium en het medium overbrengen in de kolf van 125mL (zie stap 1,27). Voeg voorverwarmde SOC middellange tot een eindvolume van 10 mL de maatkolf van 125mL.
  29. Incubeer de celcultuur van 10 mL gedurende 30 minuten bij 37 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
  30. Seriële verdunningen om de efficiëntie van de transfectie en M13KO7 pre besmettingstarief maken
    1. Gebruik een pipet meerkanaals 180 μL van 2YT media toevoegen aan elk putje van één kolom van een 96-microwell-plaat.
    2. Maken 8 vertienvoudigd seriële verdunningen: overdracht 20 μL van cultuur uit stap 1.29 aan het eerste putje van de plaat, mix door pipetteren en overdracht 20 μL van het mengsel naar het volgende goed. Herhaal deze stap tot het einde van de seriële verdunning.
    3. Plaat 10 μL van elke seriële verdunning op de LB/carb, LB/kan en LB/tet platen in tweevoud.
    4. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
    5. Efficiëntie berekeningsformule: veronderstel dat M het nummer van de gemiddelde kolonie gerekend vanaf de verdunde vouw 10N is (N is van 1-8). De E. coli SS320 electro-bevoegde cel transfectie efficiëntie van de phagemid van de Fab ruggengraat van LB/carb plaat is gelijk aan M X 10N + 3 cfu/µg. De M13KO7 pre besmettingstarief naar schatting van de verhouding van de kolonies in LB/kan en LB/tet. Het percentage van E. coli SS320 bevoegde cellen transfected met de Fab ruggengraat phagemid naar schatting van de verhouding van de kolonies in LB/carb en LB/kan.

2. voorbereiding Uracil-bevattende ssDNA (dU-ssDNA) uit de sjabloon Phagemid

Opmerking: A eerder gemeld Fab ruggengraat phagemid werd gebruikt als de sjabloon voor de dU-ssDNA voorbereiding15. De architectuur van de Fab ruggengraat phagemid is afgebeeld in Figuur 2. Een plasmide spin kit (QIAprep Spin M13) wordt gebruikt voor de winning van dU-ssDNA met lichte wijzigingen.

  1. Vooraf warm een LB/cmp-plaat (voorbereid en opgeslagen bij 4 ° C voor minder dan 1 - week oud) in een 37 ° C incubator voor 1 h. Streak uit een voorraad van glycerol van E. coli CJ236 cellen (of een andere stam van de dut−/ung−) met steriele lussen of tips op de voorverwarmde LB/cmp-bord. Incubeer de plaat bij 37 ° C's nachts voor ongeveer 12-15 h.
  2. Kies een één kolonie met een steriele tip en enten in 2 mL van 2YT/cmp medium in een 14-mL polypropyleen ronde-onderkant-buis.
  3. Incubeer het medium bij 37 ° C met schudden bij 200 t/min voor 3-4 h tot OD600 is bereikt op rond 0,4-0,8 (log fase groei).
  4. 5-10 μl faag van Fab ruggengraat sjabloon toevoegen in de cultuur en Incubeer bij 37 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten om faag infectie.
  5. Na incubatie, gebruiken een steriele tip aan streak uit 10 μL van cultuur op een voorverwarmde LB/carb-bord bij 37 ° C. Incubeer bij 37 ° C's nachts voor ongeveer 12-15 h.
  6. Kies een één kolonie van de E. coli CJ236 met Fab ruggengraat phagemid een starter cultuur van 3 mL 2YT/carb/cmp in een polypropyleen ronde-onderkant-buis van 14 mL beënten, en groeien bij 37 ° C met schudden bij 200 rpm's nachts gedurende ongeveer 12 uur.
  7. Beënt de 0.3 mL starter cultuur in 30 mL 2YT/carb/cmp in een verbijsterd fles van 250 mL.
  8. Incubeer de celcultuur bij 37 ° C met schudden bij 200 t/min voor 3-4 h tot OD600 is bereikt op rond 0,4-0,8 (log fase groei).
  9. Toevoegen van de M13KO7 (lab voorraad, titer van ongeveer 1 x 1013 cfu/mL) aan de cultuur van stap 2.8 met een menigvuldigheid van infectie (MOI) van ongeveer 10 en de laatste titer van M13KO7 is ongeveer 1 x 1010 cfu/mL.
  10. Incubeer bij 200 rpm en 37 ° C gedurende 1 uur.
  11. Pellet de cultuur door in een 50 mL ronde-onderkant-buis bij 5.000 × g en 25 ° C gedurende 20 minuten centrifugeren.
  12. Giet het supernatant en resuspendeer de pellet met 30 mL verse 2YT/carb/kan/uridine. Breng de hersuspensie in een nieuwe verbijsterd fles van 250 mL.
  13. Incubeer bij 200 rpm en 25 ° C voor 22-24 h.
  14. De cultuur van stap 2.13 overboeken naar een ronde-onderkant-buis van 50 mL en de cultuur bij 12.000 × g gedurende 20 minuten centrifugeren om te scheiden van de bacteriofaag supernatant van de bacteriële cel pellet. Breng de bacteriofaag supernatant in een nieuwe ronde onderkant-buis van 50 mL en voeg 1/5 het eindvolume van PEG/NaCl oplossing te precipiteren de bacteriofaag. Meng goed en incubeer op ijs voor 30 min te precipiteren de phage deeltjes.
  15. Centrifugeer bij 12.000 × g en 4 ° C gedurende 30 min. Decant het supernatant en centrifugeer bij 4.000 × g- en 4 ° C gedurende 2 min. gecombineerd het resterende supernatant.
  16. Resuspendeer de pellet bacteriofaag in 2 mL steriele gefiltreerd 1 X PBS en transfer naar 1.5-mL microcentrifuge buizen. Centrifugeer bij 12.000 × g gedurende 5 min. in een benchtop microcentrifuge te verwijderen van alle resterende bacteriële puin en de bacteriofaag supernatant overbrengen naar nieuwe 1.5-mL microcentrifuge buizen en bewaren bij 4 ° C.
  17. Controleer de efficiëntie van de opneming uracil in E. coli CJ236 via side by side vergelijking met E. coli SS320.
    1. 180 μL van 2YT media toevoegen aan elk putje van één rij van een 96-wells-plaat.
    2. Maak tien 10-fold seriële verdunningen: 20 μL van de bacteriofaag supernatant overbrengen in het eerste putje van de plaat, Meng door pipetteren en overdracht 20 μL van het mengsel naar het volgende goed. Herhaal deze stap tot het einde van de seriële verdunning.
    3. 10 μL van bacteriofaag uit de laatste acht seriële verdunningen te infecteren 90 μL van E. coli CJ236 en E. coli SS320 in logboek fase toevoegen (OD600 = 0,4-0,8). Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten met zacht schudden.
    4. Plaat 10 μL van de seriële verdunning van elke infectie in E. coli CJ236 en E. coli SS320 op 2YT/Carb platen in tweevoud.
    5. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
    6. Titer berekeningsformule: veronderstel dat M het nummer van de gemiddelde kolonie gerekend vanaf de verdunde vouw 10N is (N is van 1-10). De titer van E. coli CJ236 of E. coli SS320 is gelijk aan M X 10N + 2 cfu/mL. Schatten van de efficiëntie van uracil opneming van de verhouding tussen de titer van E. coli CJ236 en E. coli SS320.
  18. Voeg 1/100 volume van de bacteriofaag neerslag buffer MP in de bacteriofaag supernatant in 1.5-mL microcentrifuge buizen, en tover ondersteboven zachtjes om te mengen meerdere malen. Incubeer bij RT gedurende ten minste 2 min. Phage deeltjes zijn neergeslagen uit het kweekmedium, en dus een bewolkt oplossing op dit moment zichtbaar moet zijn.
  19. Toepassen op het monster uit stap 2.18 een plasmide spin kolom (bijvoorbeeldQIAprep) in een buis 1.5-mL microcentrifuge. De bindingscapaciteit van een spin kolom voor ssDNA kan bereiken ten minste 10 µg. Centrifuge op 6000 × g en 25 ° C gedurende 30 s in een benchtop-microcentrifuge. Gooi de doorstroom die in de 1.5-mL microcentrifuge buis. Phage deeltjes blijven gebonden aan de matrijs van de kolom in dit stadium.
  20. 0,7 mL van de UT-MLB faag lysis en bindende buffer (Zie discussie) toevoegen aan de kolom en Incubeer bij RT gedurende ten minste 1 min.  Centrifugeer bij 6.000 x g en 25 ° C gedurende 30 s en negeren de doorstroming.
  21. Voeg een ander 0,7 mL van de UT-MLB-buffer en Incubeer bij RT gedurende ten minste 1 min.
  22. Centrifugeer bij 6.000 × g gedurende 30 s. negeren de doorstroming. In dit stadium is de bacteriofaag vacht eiwit gescheiden van de dU-ssDNA, die gebonden aan de matrix van de kolom blijft.
  23. Voeg 0,7 mL wassen buffer PE met ethanol na instructies van de fabrikant. Centrifugeer bij 6.000 × g gedurende 30 s en negeren de doorstroming.
  24. Herhaal stap 2.23 en Centrifugeer nogmaals bij 6.000 × g voor 30 s residuele buffer PE verwijderen.
  25. Overdracht van de kolom naar een nieuwe 1.5-mL microcentrifuge buis en voeg 100 μl van elutie buffer EB (10 mM Tris· CL, pH 8,5) naar het midden van de kolom membraan.
  26. Incubeer bij RT gedurende 10 min en centrifuge bij 6.000 × g gedurende 1 minuut aan elueer de dU-ssDNA. Ongeveer kan 1,5 tot 2,5 μg dU-ssDNA/mL cultuur worden verkregen.
  27. Het analyseren van de eluted DNA door electrophoresing 1 μL op een 1% agarose gel van TAE. Het DNA moet worden weergegeven als een overwegend één band met geen smeren.
  28. Bepalen van de concentratie van DNA door het meten van de extinctie op een spectrofotometer nanodrop op 260 nm (een260 = 1.0 voor 33 ng/μL van ssDNA). Typische dU-ssDNA concentraties liggen op 200-500 ng/μL.

3. Kunkel methode gebaseerd Oligonucleotide gerichte mutagenese

Opmerkingen: Het is raadzaam om uit te voeren van kleinschalige reacties vóór schaaleindwaarde reacties om de kwaliteit van de mutagene oligonucleotide en reactie componenten. Een cartoon van Kunkel van methode gebaseerd gerichte oligonucleotide mutagenese is afgebeeld in Figuur 3. Verschillende aminozuur diversiteit worden in CDRH1, CDRH2, CDRH3 en CDRL3 regio's binnengebracht met IMGT nummering nomenclatuur16 (tabel 2). De theoretische aminozuur diversiteit van elke CDR, totale theoretische aminozuur diversiteit en oligonucleotide sequenties zijn vermeld in tabel 2.

  1. Oligonucleotide fosforylatie met T4 polynucleotide kinase
    1. Combineren van 0,6 μg mutagene oligonucleotides, ontworpen om een enkele CDR, met 2 μL 10 X TM buffer 2 μL 10 mM ATP en 1 μL 100 mM DTT muteren. Ultrazuiver H2O aan een totaal volume van 18 μL in een tube 1.5-mL toevoegen. 4 aparte en parallelle fosforylatie reacties zijn voor de bouw van de bibliotheek, zo ingesteld dat in dat geval overeenkomt met CDRH1, CDRH2, CDRH3 en CDRL3, respectievelijk.
    2. Toevoegen van 20 U (2 uL) van T4 polynucleotide kinase aan elk tube en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C (reactie 1 in tabel 3). Gebruik onmiddellijk voor gloeien.
  2. Gloeien van de oligonucleotides aan de sjabloon
    1. 20 μg dU-ssDNA sjabloon, toevoegen 25 μL van 10 X TM buffer, 20 μL van elke gefosforyleerd oligonucleotide oplossing en ultrapure H2O tot een eindvolume van 250 μL in een 0,5 mL-buis. Meng goed en Pipetteer in 0,20 mL PCR buizen (van elk 50 μl) als reactie 2 in tabel 3. Deze hoeveelheden DNA bieden een molaire verhouding van 3:1 tussen oligonucleotide en sjabloon, ervan uitgaande dat de verhouding van de lengte van oligonucleotide en sjabloon 1:100.
    2. Incubeer de reactie in een PCR machine bij 90 ° C gedurende 3 minuten, 50 ° C gedurende 3 minuten, en 20 ° C gedurende 5 minuten.
  3. Enzymatische synthese van CCC-dsDNA
    1. Toevoegen aan het mengsel van 250 μL gegloeid oligonucleotide/sjabloon, 10 μL van 10 mM ATP, 10 μL van 25 mM dNTP mix 15 μL van 100 mM DTT, 30 Weiss eenheden T4 DNA ligase en 30 U T7 DNA-polymerase als reactie 3 in tabel 3.
    2. Incubeer de reactie in de buis van de 1.5-mL bij 20 ° C's nachts.
    3. Wassen en de gesynthetiseerde CCC-dsDNA concentreren in een 0,5 mL centrifugaal filter-apparaat met een 30 kDa porie grootte membraan op RT.
      1. De overnachting reactiemengsel overbrengen in het filter apparaat en voeg ultrazuiver H2O aan 400 µL eindvolume. Draaien op 14.000 × g gedurende 10 minuten; het volume is minder dan 50 μl.
      2. Negeren van de stroom door, Voeg 400 µL van ultrazuiver H2O in de filter en draaien op 14.000 × g gedurende 10 minuten.
      3. Herhaal nogmaals stap 3.3.3.2.
      4. Plaats de filter ondersteboven in een schone microcentrifuge buis om te herstellen van de CCC-dsDNA. Spin bij 1000 × g gedurende 2 min; het herstelde volume is over het algemeen rond de 20-40 μL. De herstelde CCC-dsDNA kan onmiddellijk gebruikt voor electroporation van E. coli of bevroren bij-20 ° C voor later gebruik. Normaal 20-40 μg CCC-DNA kan worden verkregen.
    4. Electrophorese 1,0 µL van de geëlueerd reactieproduct naast de dU-ssDNA-sjabloon te visualiseren van het resultaat van de reactie.

4. Electroporation en berekening van de grootte van de bibliotheek

  1. Chill de gezuiverde CCC-dsDNA (20 μg in een maximumvolume van 50 μl) in een buis 1.5-mL microcentrifuge en een cuvet electroporation 0,2 cm tussenruimte op het ijs.
  2. Vooraf warm 20 mL SOC media in een 50mL polypropyleen conische centrifugebuis in het waterbad 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten.
  3. Ontdooi een aliquot 350 μL van electro-bevoegde E. coli SS320 op ijs. De cellen toevoegen aan het DNA en meng grondig door pipetteren meerdere malen. Vermijd invoering van bubbels.
  4. Het mengsel overbrengen in de meetcel en electroporation na instructies van de fabrikant uit te voeren. Wanneer de BTX ECM-630 electroporation systeem wordt gebruikt, zijn de relevante instellingen bijvoorbeeld 2,5 kV veldsterkte, 125 Ω weerstand en 50 µF capaciteit.
  5. Onmiddellijk de electroporated cellen te redden door toevoeging van 1 mL voorverwarmde SOC voedingsbodem en overgeplaatst naar 17 mL voor SOC medium in een kolf van 125mL. Spoel de cuvette tweemaal met 1 mL van SOC medium en overdracht aan de dezelfde maatkolf (eindvolume is 20 mL).
  6. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
  7. Bepaal de electroporation efficiëntie.
    1. 180 μL van 2YT media toevoegen aan elk putje van één kolom van een 96-microwell-plaat.
    2. Maken 8 tien keer seriële verdunningen: overdracht 20 μL van de 20-mL cultuur aan het eerste putje van de plaat, meng met pipetteren en overdracht 20 μL van het mengsel naar het volgende goed. Herhaal deze stap tot het einde van de seriële verdunning.
    3. Plaat 10 μL van elk van de seriële verdunningen op een LB/carb plaat in tweevoud. Plaat 100 µL resterende middelen van elk van de seriële verdunningen op afzonderlijke LB/carb platen voor kolonie graaf toetsing. Deze platen zal ook voorzien in één klonen ELISA en volgorde analyse (zie punt 5).
    4. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
    5. Het tellen van de kolonies van de 10 μL duplicaten op de plaat LB/carb. Veronderstel dat M de gemiddelde kolonie getal getelde op 10N vouwen LB/carb plaat (N is van 1-8). De totale bibliotheek grootte is gelijk aan 2 M X 10N + 3 -kolonies.
  8. Aliquot de cultuur uit stap 4.6 even in twee 2-L verbijsterd kolven, elk met 500 mL van 2YT/carb/kan medium voor faag bibliotheek generatie.
  9. Incubeer bij 37 ° C met schudden bij 200 rpm's nachts voor ongeveer 16 h.
  10. De cultuur overbrengen met twee 1-L gesteriliseerde met autoclaaf centrifuge flessen en Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 12.000 × g bij 4 ° C.
  11. Het supernatant overbrengen in twee nieuwe 1-L gesteriliseerde met autoclaaf centrifuge flessen en voeg 1/5 het eindvolume van PEG/NaCl oplossing te precipiteren de bacteriofaag. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
  12. Centrifugeer gedurende 30 min op 12.000 × g- en 4 ° C. Zorgvuldig de bovendrijvende vloeistof decanteren en dat niet wordt verstoord van de bacteriofaag pellet. Spin voor 1 min bij 4000 x g en verwijder het resterende supernatant met een pipet.
  13. Resuspendeer de pellet faag met 20 mL steriele gefiltreerd 1 X PBS buffer en overdracht aan een nieuwe 50 mL-buis.
  14. De onoplosbare zaak pellet door centrifugeren voor 5 min op 12.000 × g- en 4 ° C. Het supernatant overbrengen in een nieuwe 50 mL-buis.
  15. De faag concentratie door spectrofotometer meten (OD268 = 1.0 voor een oplossing van 5 X 1012 faag/mL).
  16. Pas de bacteriofaag tot 5 X 1012 faag/mL in 1 X PBS met 10% ultrazuiver glycerol.
  17. Aliquot 1 mL van phage oplossing per 1.5-mL microcentrifuge buis. Gebruik de bibliotheken onmiddellijk voor pannen of Bewaar bij-80 ° C.

5. beoordeling door EiwitA / L Direct bindende ELISA Assay en Sequencing

  1. Willekeurig kiezen 96 enkele kolonies op LB/carb plaat uit stap 4.7.3 in een 96-diep goed cultuur plaat met 800 μL van 2YT/carb in elk putje. Incubeer gedurende 3-4 uur bij 37 ° C met schudden bij 1.000 tpm tot OD600 = 0,4-0,8.
  2. Voeg 100 μl van M13KO7 (1 X 1011 cfu/mL) aan elk putje van een 96-diepe cultuur goed plaat met een meerkanaalspipet. Incubeer bij 37 ° C met schudden bij 1000 omwentelingen per minuut gedurende 1 uur.
  3. Voeg 100 μl van 2YT 10 X concentratie van kanamycine (500 μg/mL) met aan elk putje met een meerkanaalspipet. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C met schudden bij 1000 omwentelingen per minuut.
  4. Ontbinden eiwit L tot 1 µg/mL in 1 X PBS. 3/4 jas van de putten in een 384-well hoge binding aan eiwitten polystyreen plaat met 30 µL per putje van de eiwitten L oplossing. Na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
  5. Gooi de overnachting eiwit L coating oplossing van stap 5.4. Voeg 50 µL van M-PBST (de blokkerende oplossing) aan alle van de putten in de hoge 384-well-binding aan eiwitten polystyreen plaat met een meerkanaalspipet. Incubeer de platen op een microplate-shaker voor 1 h op RT.
  6. Spin down de overnachting cultuur uit stap 5.3 in een cultuur van diep 96-wells-plaat bij 3000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. De faag is het supernatant.
  7. Gooi de blokkerende oplossing van stap 5.5. 15 μL van M-PBST en 15 μL van elke bacteriofaag supernatant (stap 5.6) toevoegen aan 3 van de eiwitten L gecoat wells als drievoud en 1 niet-gecoate goed als negatieve controle met behulp van een meerkanaalspipet. Incubeer bij RT gedurende 1 h met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
  8. Gooi de bacteriofaag oplossing. De plaat 6 keer met 80 μL van PBST door een geautomatiseerd plaat-wasmachine te wassen.
  9. 15 μL van M-PBST en 15 μL van eiwit A-HRP (1:1, 500 verdund in 1 X PBS) toevoegen aan elk putje met een meerkanaalspipet en Incubeer bij RT voor 1 h met het schudden van ongeveer 200 toeren per minuut.
  10. Gooi de eiwit A-HRP/M-PBST oplossing. Wassen van de plaat 6 keer met 80 μL van PBST.
  11. Voeg TMB substraat (30 μl per putje) met een meerkanaalspipet en incubeer gedurende 2-3 minuten tot de kleur ontwikkelt. Stop de reactie met 1,0 M H3PO4 (30 μl per putje).
  12. Lees de platen spectrophotometrically bij 450 nm. Positieve klonen worden gedefinieerd als degenen die een gemiddelde verhouding van OD450 absorptie van eiwitten L putten aan de M-PBST goed groter dan 3.0 vertonen.
  13. In een 96-diepe Nou, infecteren 50 μl van SS320 in 2YT/tet in logboek fase met 5 μL van de dezelfde bacteriofaag gebruikt voor de ELISA (stap 5.6) gedurende 30 minuten op RT.
  14. Voeg 950 μL van 2YT/carb in de 96-diepe goed uit stap 5.13 en na een nacht bebroeden bij 37 ° C met schudden bij 1000 omwentelingen per minuut.
  15. Pak de phagemid van DNA door Mini prep DNA extractie kit. Gebruik van de upstream inleidingen van VL (5'-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3') en VH (5'-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3') voor sequentieanalyse te schatten van de diversiteit van de reeks bibliotheek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Na het stroomschema van de Fab bibliotheek bouw (Zie Figuur 1), wij bereid M13KO7 helper faag vooraf besmet E. coli SS320 electro-bevoegde cellen. De efficiëntie van deze electro-bevoegde cellen wordt geraamd op 2 X 109 cfu/µg toen de ruggengraat van de Fab phagemid voor bouw van library werd gebruikt (Figuur 4).

De efficiëntie van de opneming uracil werd door vergelijking van de titer in zowel E. coli CJ236 en E. coli SS320 cellen gecontroleerd. De cellen van E. coli CJ236 en E. coli SS320 waren besmet door faag dU-ssDNA herbergen. E. coli SS320 heeft enzymen (dUTPase en uracil glycosylase) die kunnen worden afgebroken uracil-bevattende DNA, terwijl E. coli CJ236 deze enzymen mist en DNA uracil-bevattende kan niet degraderen. Om te bereiken een aanvaardbaar uracil opneming efficiëntie, moeten titers van E. coli CJ236 ten minste 104 keer hoger dan die van E. coli SS320. Anders is de wild-type bevolking zal toenemen in de bibliotheek gebouwd antilichaam als gevolg van inefficiënte uracil opneming. Figuur 5 toonde aan dat de titer van E. coli CJ236 is ongeveer 3 X 10,5 keer hoger dan die van E. coli SS320, met vermelding van de opneming van een efficiënte uracil in phage ssDNA.

Vervolgens wij bereid en geëxtraheerd dU-ssDNA. De zuiverheid van de dU-ssDNA wordt gecontroleerd door agarose gelelektroforese (Figuur 6). Dan de oligonucleotide gerichte mutagenese werd uitgevoerd en de efficiëntie van de dU-ssDNA-bekering tot CCC-DNA werd geëvalueerd (Figuur 6). Drie producten met lagere motiliteit dan dU-ssDNA kunnen worden gevisualiseerd op de gel met inbegrip van de snelst-lopende band (CCC-dsDNA), de zwakke middenband (gejat band), en de langzaamste lopende band (strand-ontheemd DNA).

Na electroporation in E. coli SS320, schatte de grootte van de bibliotheek van de overnachting incubatie-plaat (zie stap 4.7.5). De grootte van de gemiddelde bibliotheek is 5 X 10,9 uit dubbele seriële verdunningen op LB/carb platen (Figuur 7). De geschatte omvang bij deze stap kan echter de bacteriofaag die niet weergeven Fabs als gevolg van de aanwezigheid van een frameshift of stop codon of weergeven van misfolded Fabs bevatten. Sequencen en ELISA werden gebruikt om de schatten van de functionele diversiteit van opgebouwde bibliotheek. 96 willekeurig geplukte enkele klonen werden gestuurd voor sequentie-analyse. Tabel 4 toont dat 90 uit de 96 willekeurig geplukte enkele klonen met succes werden sequenced, waarin 70 klonen zonder een voortijdige stop codon (53 klonen met ten minste één CDR mutant) en 17 klonen met de wild-type opeenvolging en 20 klonen met een voortijdige stop codon op verschillende regio's. Binnen de 70 klonen zijn mutant tarieven van CDRH1, CDRH2, CDRH3 en CDRL3 50%, 57%, 53% en 56%, respectievelijk, terwijl de mutant met ten minste één CDR 76 bedraagt %. In de 20 klonen met een voortijdige stop codon (90%), is het voorbarig stop codon voornamelijk afgeleid van de frameshift van oligonucleotide primers in mutagenese, met inbegrip van 45% (CDRH1), 10% (CDRH2), 15% (CDRH3) en 20% (CDRL3).

Om te ontdekken de weergave van goed gevouwen Fabs, een EiwitA / L gebaseerd ELISA werkte zoals het is bekend dat EiwitA en eiwit L herkent juiste vouwen van het kader van de VH en VL kader, respectievelijk17,18. In overleg met de sequentie-analyse bleek de analyse van de ELISA in drievoud (Figuur 8) dat de 20 klonen met een voortijdige stop codon allemaal negatief waren, terwijl de 17 klonen met een opeenvolging van wild-type allemaal positief waren toen de positieve verhouding empirisch vastgesteld op 3.0. Voor de 53 klonen met ten minste één CDR mutant waren 43 klonen positief in de ELISA terwijl 10 klonen negatief waren; Dit geeft aan dat de meeste van de klonen goed gevouwen werden terwijl de CDR van de 10 klonen kunnen nadelige gevolgen voor Fab vouwen hebben. In totaal 43 klonen uit de 90 klonen (48%) waren goed gevouwen en bevatte ten minste één CDR mutant. Aldus, de diversiteit van de functionele aminozuur van de opgebouwde bibliotheek gebaseerd op EiwitA / L ELISA en volgorde analyse werd geschat op 2.4 X 109 (d.w.z., 48% van 5 X 109).

Figure 1
Figuur 1: overzicht van de bouw van de Fab bibliotheek faag-weergegeven. Faag-weergegeven Fab bibliotheek bouw volgt een fundamentele reeks stappen. Het gaat om voorbereiding van hoogrenderende electro-bevoegde bacteriële cellen, extractie van dU-ssDNA, Kunkel van methode gebaseerd oligonucleotide gerichte mutagenese, electroporation en berekening van bacteriofaag Fab bibliotheek grootte, functionele evaluatie door EiwitA / L ELISA, en DNA-sequentie analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Phagemid-het platform voor de bouw van de Fab bibliotheek. De basisfuncties van de ruggengraat van het phagemid bestaan van oorsprong van single-stranded (f1 ori) en double-stranded (dsDNA ori) DNA replicatie en een gen weerstand ampicilline/carbenicillin (AmpR). Fab weergegeven, onder de controle van de alkalische fosfatase promotor (PhoA), de phagemid bevat een bicistronic cassette drive expressie en secretie van: lichte keten (LC), bestaande uit een secretie signaal, VL (variabele regio lichtketting), CL (constante regio van lichte keten), en C-terminal vlag tag; en zware ketting (HC) bestaande uit een secretie signaal, VH (variabele regio zware ketting) en CH1 (constante regio 1 zware ketting) gefuseerd met een p3 faag kleine vacht eiwit. Vergadering van de lichtketting en zware ketting in Fab binnen de E. coli periplasma regisseert de weergave van Fab op het oppervlak van de phage. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: schematische voorstelling van de Kunkel methode gebaseerd oligonucleotide gerichte mutagenese. In dit protocol gebruikten we Kunkel de methode ter voorbereiding van de dU-ssDNA sjabloon. Oligonucleotides voor CDRH1, CDRH2, CDRH3 en CDRL3 met ontworpen diversiteit zijn phosphorylated gegloeid aan de sjabloon, en gebruikt voor het converteren van ss-DNA naar CCC-dsDNA. Na electroporation in E. coli SS320 electro-bevoegde cellen, het heteroduplex-DNA wordt hersteld naar de wild-type of de mutant formulier; Als gevolg van de aanwezigheid van uracil in het wild type onderdeel, het herstelproces gunsten de gemuteerde vorm, en dus de gemuteerde vorm domineert de bibliotheek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Schatting van de M13KO7 vooraf besmet E. coli SS320 electro-bevoegde cel efficiëntie. Een vector van de ruggengraat phagemid werd gebruikt om de efficiëntie van de electroporation van de bevoegde cellen te controleren. Formule voor het berekenen van de efficiëntie is als volgt: neem aan dat M het getal van de gemiddelde kolonie gerekend vanaf de meest verdunde vouw 10N is (N is van 1-8) in tweevoud. E. coli SS320 efficiëntie van LB/carb plaat is gelijk aan M X 10N + 3 cfu/µg. De efficiëntie van de electro-bevoegde cellen is ongeveer 2 X 109 cfu / µg. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Beoordeling van uracil opneming in ssDNA door faag infectie met E. coli , CJ236 en E. coli SS320 cellen. Op basis van Kunkel de methode, de efficiëntie van de opneming uracil wordt gecontroleerd door vergelijking van phage infectie titer in zowel E. coli CJ236 en E. coli SS320 cellen. De berekeningsformule titer is als volgt: neem aan dat M het getal van de gemiddelde kolonie gerekend vanaf de meest verdunde vouw 10N is (N is van 1-10), en dat de titer van E. coli CJ236 of E. coli SS320 gelijk aan M X 10N + 2 cfu/mL is. De efficiëntie van uracil opneming kan worden geschat uit de verhouding van de titer van E. coli CJ236 en E. coli SS320. De titer in E. coli CJ236 was 9 X 1012 cfu/mL terwijl de titer in E. coli SS320 3 X 107 cfu/mL. De verhouding van de titer van E. coli CJ236 en E. coli SS320 was 3 X 10,5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: conversie van dU-ssDNA naar CCC-DNA door oligonucleotide gerichte mutagenese. Naar aanleiding van oligonucleotide gerichte mutagenese, de doelmatigheid van dU-ssDNA-bekering tot CCC-DNA werd geëvalueerd. dU-ssDNA is volledig geconverteerd naar dsDNA. De dominante band is CCC-dsDNA terwijl er een kleine gedeelte van gejat dsDNA en strand-ontheemd DNA is. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: Phage titratie voor berekening van de grootte van de bibliotheek. Na electroporation in E. coli SS320 schatte de grootte van de bibliotheek van seriële verdunningen op LB/carb platen. De berekeningsformule van grootte is als volgt: neem aan dat M is het nummer van de gemiddelde kolonie gerekend vanaf de meest verdunde vouw 10N uit een plaat van de 2YT/Carb (N is van 1-8), grootte is gelijk aan 2 M X 10N + 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: EiwitA / L direct bindende faag ELISA. Eiwit L herkent dat het kader van goed gevouwen kappa lichtketting VL en eiwit een blikje herkennen het kader van goed gevouwen zware ketting VH. Binding van Fab met eiwit L en A geeft aan goede vouwing van zowel zware ketting en lichtketting. Kortom, eiwit L in drievoud en de negatieve controle M-PBST werden bekleed aan de plaat, Fab faag supernatant van verschillende klonen werden geïncubeerd met eiwitten L en M-PBST, dan na het wassen, eiwit die a-HRP werd gebruikt voor het vastleggen van afhankelijke Fab phage. Phage ELISA lezingen toonde 90 willekeurig geplukte klonen met succesvolle sequencing uitlezing. Een drempel regel vertegenwoordigt de kloon als positief werd empirisch gedefinieerd waar de verhouding tussen OD450 extinctie waarde uit eiwitten L (gemiddeld drievoud met foutbalk) versus negatieve controle was meer dan 3.0. Drie groepen op basis van sequencing analyse werden getoond, overeenkomt met een mutant zonder stop codon in het rood (53 klonen), wild type (WT) in blauw (17 klonen) en mutant met stop codon in het groen (20 klonen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Reagens setup Component Bedrag opmerkingen en beschrijvingen
2YT medium Gistextract 10 g Ultrazuiver water te maken het volume tot 1,0 L, pH 7.0, aanpassen toevoegen autoclaaf.
Trypton 16 g
NaCl 5 g
2YT top agar Gistextract 10 g Voeg ultrazuiver water om het volume tot 1,0 L en pH 7.0, warmte te ontbinden, autoclaaf aanpassen.
Trypton 16 g
NaCl 5 g
Gekorrelde agar 7.5 g
2YT/carb/cmp medium Carbenicillin 100 μg/mL
Chlooramfenicol 10 μg/mL
2YT/carb/kan/uridine medium Carbenicillin 100 μg/mL
Kanamycine 50 μg/mL
Uridine 0,25 μg/mL
2YT/carb/tet medium Carbenicillin 100 μg/mL
Tetracycline 10 μg/mL
2YT/carb medium Carbenicilin 100 μg/mL
2YT/kan medium Kanamycine 50 μg/mL
2YT/kan/tet medium Kanamycine 50 μg/mL
Tetracycline 10 μg/mL
2YT/tet medium Tetracycline 10 μg/mL
2YT/cmp medium Chlooramfenicol 10 μg/mL
LB middellange agar Gistextract 5 g Ultrazuiver water te maken het volume tot 1,0 L, pH 7.0, aanpassen toevoegen autoclaaf. Voor LB agar, Voeg 20 g gekorrelde agar, autoclaaf.
Trypton 10 g
NaCl 10 g
LB/carb platen LB-agar 1L
Carbenicillin 100 μg/mL
LB/tet platen LB-agar 1 L
Tetracycline 10 μg/mL
LB/cmp platen Chlooramfenicol 10 μg/mL
LB/kan platen Kanamycine 50 μg/mL
SOC medium Gistextract 5 g Voeg ultrazuiver water om te maken op het volume tot 1,0 L en pas van pH 7.0, autoclaaf.
Trypton 20 g
NaCl 0.5 g
KCl 0,2 g
2.0 M MgCl2 5,0 mL
1.0 M glucose 20 mL
Superbroth medium Trypton 12 g Ultrazuiver water toevoegen tot 900 mL, autoclaaf, voeg 100 mL gesteriliseerde met autoclaaf 0,17 M KH2PO4, 0,72 M K2HPO4.
Gistextract 24 g
Glycerol 5 mL
Superbroth kan/tet medium Kanamycine 50 μg/mL
Tetracycline 10 μg/mL
1 X PBS NaCl 137 mM Breng pH op 7,2, autoclaaf.
KCl 3 mM
NB2HPO4 8 mM
KH2PO4 1,5 mM
TAE/agarose gel TAE-buffer
Agarose 1% (m/v)
GelRed 1:10000 (v/v)
TMB substraat TMB 50% (v/v)
H2O2 peroxidase substraat 50% (v/v)
M-PBST buffer 1 X PBS 100 ml
Tween-20 0,05% (v/v)
Vetvrije melkpoeder 5% (v/v)
5 X PEG/NaCl PEG-8000 20% (m/v) Ultrazuiver water om het volume aan 1L en autoclaaf toevoegen.
NaCl 2.5 M
PBST buffer 1 X PBS 1 L 0,22 μm filter-steriliseren.
Tween-20 0,05% (v/v)
10 x TM buffer MgCl2 0,1 M Breng de pH op 7.5.
Tris 0,5 M
1,0 mM HEPES, pH 7.4 1.0 M HEPES 4,0 mL 0,22 μm filter-steriliseren.
Ultrazuiver water 4.0 L
10% (v/v) ultrazuiver glycerol Ultrazuiver glycerol 100 ml 0,22 μm filter-steriliseren.
Ultrazuiver water 900 mL
Ultrazuiver water H20 DNase-vrije, Rnase-gratis, pyrogeen-gratis.

Tabel 1: Reagens setup.

Table 2
Tabel 2: CDR diversiteit en mutagenese inleidingen. De DNA-sequenties van de CDR regio worden gemuteerd worden weergegeven in het rood; sequenties zijn opgemaakt met behulp van de IUPAC-nucleotide code. "X" geeft aan tri-nucleotide uit een mengsel ter bevatten verschillende aminozuur sets; "n" geeft aan verschillend aantal X. vijf inleidingen met een verschillend aantal X werden gebruikt om te diversifiëren van CDRL3 of CDRH3, respectievelijk, voor het genereren van variabele lengte van CDRL3 en CDRH3. De residu-getallen worden gedefinieerd door de IMGT-nomenclatuur. Klik hier om te downloaden van deze tabel.

Kunkel van methode gebaseerd mutagenese
Reactie 1. Oligonucleotide fosforylatie met T4 polynucleotide kinase
Component Bedrag Laatste
mutageen oligonucleotides 0,6 μg
10 x TM buffer 2 ΜL 1 X
10 mM ATP 2 ΜL 1 mM
100 mM DTT 1 ΜL 5 mM
T4 polynucleotide kinase (10 U/μl) 2 ΜL 20 U
Ultrazuiver H20 Maximaal 20 μL
Reactie instelling
Stap 1. 37 ° C gedurende 1 h
Reactie 2. Gloeien van de oligonucleotides aan de sjabloon
Component Bedrag Laatste
dU-ssDNA-sjabloon 20 μg 20 μg
10 x TM buffer 25 ΜL 1 X
gefosforyleerd CDRH1 oligonucleotides 20 ΜL 0,6 μg
gefosforyleerd CDRH2 oligonucleotides 20 ΜL 0,6 μg
gefosforyleerd CDRH3 oligonucleotides 20 ΜL 0,6 μg
gefosforyleerd CDRL3 oligonucleotides 20 ΜL 0,6 μg
Ultrazuiver H20 Maximaal 250 μL
Reactie instelling
Stap 1. 90 ° C gedurende 3 min
Stap 2. 50 ° C gedurende 5 minuten
Stap 3. 20 ° C gedurende 5 minuten
Reactie 3. Enzymatische synthese van CCC-dsDNA
Component Bedrag Laatste
gegloeide oligonucleotides/sjabloon mengsels 250 ΜL
10 mM ATP 10 ΜL 346 µM van elk nucleotide
dNTP mix (25 mM van elk nucleotide) 10 ΜL 865 µM van elk nucleotide
100 mM DTT 15 ΜL 5 mM
T4 DNA ligase 1 ΜL 30 Weiss eenheden
T7 DNA-polymerase 3 ΜL 30 U
Reactie instelling
Stap 1. 20 ° C voor overnachting

Tabel 3: Procedures en onderdelen van de Kunkel methode gebaseerde reactie.

Groep Kloon nummer Regio Percentage
Geen voortijdige stop codon 70 CDRH1 mutatie 50% (35/70)
CDRH2 mutatie 57% (40/70)
CDRH3 mutatie 53% (37/70)
CDRL3 mutatie 56% (39/70)
Ten minste één CDR mutatie 76% (53/70)
Voortijdige stop codon 20 CDRH1 defect 45% (9/20)
CDRH2 defect 10% (2/20)
CDRH3 defect 15% (3/20)
CDRL3 defect 20% (4/20)
Andere defect 10% (2/20)

Tabel 4: Sequentieanalyse van CDRH1, CDRH2, CDRH3 en CDRL3 uit de synthetische Fab bibliotheek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Voor de bouw van hoge diversiteit, faag-weergegeven Fab Bibliotheken, kwaliteitscontrole zijn controleposten nodig om te controleren van de verschillende fasen van het bouwproces, met inbegrip van de bevoegdheid van electro-bevoegde cellen, kwaliteit van de dU-ssDNA-sjabloon, efficiëntie van CCC-dsDNA synthese, titer na electroporation, Fab vouwen en diversiteit van het aminozuur van CDR door sequentieanalyse van Fab-faag klonen.

Hoge opbrengst en zuiverheid van de dU-ssDNA is essentieel voor hoge mutagenese tarief. In onze ervaring, kan de bacteriofaag inductie bij 25 ° C's nachts meer dU-ssDNA dan die van phage inductie bij 37 ° C's nachts opleveren. Dit is in overeenstemming met een vorige verslag19. Met betrekking tot ssDNA extractie bevatte de eerste plasmide Spin kit (QIAprep) MLB voor lysis van de bacteriofaag en bindend. Later werd MLB met onbekende reden stopgezet en vervangen door PB. We vonden dat de opbrengst van de dU-ssDNA veel lager van PB behandeling ten opzichte van die uit de MLB behandeling is. In dit protocol gebruikten we een reagens met de naam UT-MLB20 te vervangen MLB en vond dat het rendement van de dU-ssDNA is vergelijkbaar met die van de eerste Spin Kit.

Als CDRH3 en CDRL3 zijn de meest uiteenlopende regio's voor antigeen erkenning21, om een op maat gemaakte diversiteit met een specifieke set van aminozuur combinaties en ratio's, en te verwijderen van redundantie bias en stop-codonen geïntroduceerd door ontaarde codonen zoals NNK (N, mengsel van airco/G/T; K, mengsel van G/T), trimeer codon phosphoramidite gebaseerde oligonucleotides22 met precies één trimeer codon overeenkomt met een specifiek aminozuur werden ontworpen voor CDRH3 en CDRL3. Bovendien werden variabele lengtes van CDRH3 en CDRL3 oligonucleotides gebruikt om de EDD-Fractie verder te verhogen.

Na enzymatische synthese van CCC-dsDNA, over het algemeen drie bands worden waargenomen door de Elektroforese van het gel van de agarose en de bands moet duidelijk zonder uitstrijkje. Onder hen is de snelst-lopende band de CCC-dsDNA die een hoge mutaties (ongeveer 80%) na electroporation23kan opleveren. De langzaamste lopende band is het strand-ontheemd DNA dat voortvloeit uit de inherente strand-verplaatsing activiteit van DNA van T7 polymerase en heeft een lage mutatie tarief (ongeveer 20%)23. De zwakke middenband is gejat DNA na uitbreiding als gevolg van onvoldoende T4 DNA ligase activiteit of onvoldoende oligonucleotide fosforylering.

Een kleine sequencing monster pool werd gebruikt voor het schatten van de diversiteit van de bibliotheek, hoewel niet nauwkeurig24. Voor het inschatten van de echte diversiteit nauwkeurig, wellicht volgende generatie sequencing (NGS) een goede optie in de mijnbouw van de diepte van de diversiteit van de opgebouwde bibliotheek25. In de praktijk, als gevolg van de huidige uitdagingen van NGS technologie inclusief lezen lengte, nauwkeurigheid, kosten en hoge-doorvoer, de volgorde van de Fab faag-bibliotheek gebruikt in dit protocol met de lengte van ongeveer 950 bp verspreid over CDRH1, CDRH2, CDRH3 en CDRL3 is niet haalbaar; Nochtans, is het mogelijk om te schatten van de scFv (ongeveer 700 bp) bibliotheek diversiteit binnen het bereik van miljoenen24,25. Een andere belangrijke norm om te evalueren van de diversiteit van opgebouwde bibliotheek is het gebruik van de bibliotheek pan tegen vele verschillende types van antigenen en het berekenen van de positieve klonen gevangen omdat bibliotheek diversiteit is direct gecorreleerd met de succesvolle koers van antigeen pannen26. Hoge-doorvoer selectie platform is zeer geschikt voor dit doel en lezers kunnen verwijzen naar een gedetailleerd protocol gemeld door Mirsch et al. 27

Theoretisch, faag-weergegeven synthetische antilichaam bibliotheken met op maat gemaakte diversiteit kunnen worden gebruikt om te richten op een antigeen en dus hebben brede toepassingen. Op dit moment afhankelijk bedrijven met inbegrip van Cambridge Antibody Technology (kat), MedImmune Genentech, Dyax, Bioinvent, Pfizer en MorphoSys sterk zijn van phage display platforms voor therapeutisch antilichaam ontwikkeling28. Bovendien zijn veel faag display kern technologische patenten verlopen29. Ongetwijfeld zal dit het maximale potentieel van antilichaam faag-weergegeven technologie ontketenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs waarderen Dr. Frederic Fellouse van het Sidhu laboratorium voor kritische opmerkingen over Kunkel van methode gebaseerd synthetische Fab faag bibliotheek bouw. De auteurs waarderen Mrs. Alevtina Pavlenco en andere leden van de Sidhu lab voor waardevolle hulp van de voorbereiding van hoogrenderende electro-bevoegde E. coli cellen en hoge kwaliteit dU-ssDNA. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No.: 81572698, 31771006) DW en door ShanghaiTech University (Grant No.: F-0301-13-005) laboratorium van antilichaam engineering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1.0 M H3PO4 Fisher AC29570
1.0 M Tris, pH 8.0 Invitrogen 15568-025
10 mM ATP Invitrogen 18330-019
100 mM dithiothreitol Fisher BP172
100 mM dNTP mix GE Healthcare 28-4065-60 solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-76-02
50X TAE Invitrogen 24710030
Agarose Fisher BP160
Carbenicillin, carb Sigma C1389 100 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL.
Chloramphenicol, cmp Sigma C0378 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9620G
Granulated agar VWR J637-500G
H2O2 peroxidase substrate Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-65-02
K2HPO4 Sigma 795488
Kanamycin, kan Fisher AC61129 50 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL.
KH2PO4 Sigma P2222
Na2HPO4 Sigma 94046
NaCl Alfa Aesar U19C015
Nanodrop Fisher ND2000C
NaOH Fisher SS256 ! CAUTION NaOH causes burns.
NON-Fat Powdered Milk Sangon Biotech A600669
PEG-8000 Fisher BP233
Protein A-HRP conjugate Invitrogen 101123
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 22704
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Recombinant Protein L Fisher 77679
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203S
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T7 DNA polymerase New England Biolabs M0274S
Tetracycline, tet Sigma T7660 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
Tryptone Fisher 0123-07-5
Tween-20 Sigma P2287
Ultrapure glycerol Invitrogen 15514-011
Uridine Sigma U3750 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL.
Yeast extract VWR DF0127-08
Name Company Catalog Number Comments
Strains
E.coli CJ236 New England Biolabs E4141 Genotype: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA.
E.coli SS320 Lucigen 60512 Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.
M13KO7 New England Biolabs N0315S
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2-cm gap electroporation cuvette BTX
96-well 2mL Deep-well plates Fisher 278743
96-well Maxisorp immunoplates Nunc 151759
Baffled flasks Corning
Benchtop centrifuge Eppendorf 5811000096
Centrifuge bottles Nalgene
ECM-630 electroporator BTX
Magnetic stir bars Nalgene
Thermo Fisher centrifuge Fisher
High speed shaker TAITEK MBR-034P
Microplate shaker QILINBEIER QB-9002
Liquid handler for 96 and 384 wells RAININ
Mutil-channel pipette RAININ E4XLS
Amicon concentrator Merck UFC803096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. (2017).
  2. Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9, (2), 167-181 (2017).
  3. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, (5517), 495-497 (1975).
  4. Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21, (11), 966-973 (1999).
  5. Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34, (12), 960-969 (2016).
  6. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253, (18), 6551-6560 (1978).
  7. Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228, (4705), 1315-1317 (1985).
  8. Sidhu, S. S. Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. CRC Press. (2005).
  9. Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (16), 8950-8954 (2000).
  10. Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8, (7), 1177-1194 (2016).
  11. Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2, (12), 682-688 (2006).
  12. Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
  13. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, (2), 488-492 (1985).
  14. Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
  15. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425, (4), 803-811 (2013).
  16. Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27, (1), 55-77 (2003).
  17. Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9, (8), 679-687 (2001).
  18. Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (10), 5399-5404 (2000).
  19. Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58, (1), 10-17 (2012).
  20. Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
  21. Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31, (3), 169-217 (1994).
  22. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22, (25), 5600-5607 (1994).
  23. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).
  24. Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12, (5), e0177574 (2017).
  25. Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring? Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
  26. Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81, (4), 645-670 (1979).
  27. Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492 (2015).
  28. Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16, (5), 3675-3700 (2011).
  29. Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics - the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28, (5), 538-544 (2011).
Bouw van synthetische Phage weergegeven Fab bibliotheek met op maat gemaakte diversiteit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).More

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter