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Immunology and Infection

Bau von synthetischen Phagen Fab Bibliothek mit maßgeschneiderten Vielfalt angezeigt

doi: 10.3791/57357 Published: May 1, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren für den Bau einer synthetischen Antikörper Phagen angezeigt-Bibliothek mit maßgeschneiderten Vielfalt. Synthetischen Antikörper haben breite Anwendungen von der Grundlagenforschung zur Krankheit Diagnostik und Therapie.

Abstract

Nachfrage für monoklonale Antikörper (MAK) in Grundlagenforschung und Medizin steigt jährlich. Hybridom-Technologie wurde die dominierende Methode für mAb Entwicklung seit seinen ersten Bericht im Jahr 1975. Als eine alternative Technologie sind Phagen-Display-Methoden für mAb Entwicklung zunehmend attraktiv, da Humira, der ersten Phagen abgeleitet Antikörper und eines der meistverkauften mAbs, für die klinische Behandlung der rheumatoiden Arthritis im Jahr 2002 genehmigt wurde. Als ein nicht-tierischen mAb Entwicklungstechnologie basiert, umgeht Phagen-Display Antigen Immunogenität, Humanisierung und tierischen Wartung, die von traditionellen Hybridom-Technologie basieren Antikörperentwicklung erforderlich sind. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Bau von synthetischen Phagen angezeigt Fab Bibliotheken mit Vielfalt von 109-1010 mit einem einzigen Elektroporation erhältlich. Dieses Protokoll besteht aus: 1) Hochleistungs-Elektro-kompetente Zellen Vorbereitung; (2) Extraktion von Uracil-haltigen einzelsträngiger DNA (dU-SsDNA); (3) Kunkels Methode basiert Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese; (4) Electroporation und Berechnung der bibliotheksgröße; (5) Protein A/L-based Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) zum Falten und funktionelle Diversität Bewertung; und 6) DNA-Sequenzanalyse der Vielfalt.

Introduction

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mAbs haben breite Anwendungen von Grundlagenforschung bis hin zu Krankheit, Diagnostik und Therapie. Ab 2016 sind mehr als 60 mAbs durch die U.s. Food and Drug Administration (USFDA) für die klinische Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Krebs und Infektionskrankheiten1,2zugelassen.

Im Jahr 1975 berichtet, Kohler und Milstein, eine Technik für die kontinuierliche Erzeugung von Antikörpern eine einzelne klonalen Spezifität aus einer zellulären Quelle genannt "hybridome" und diese Technik später ein Eckstein in Medizin und Industrie3 geworden ist ,4. Generation von mAbs durch diese Methode erfordert verschiedene Schritte einschließlich Antigen Produktion, Maus Immunisierung, Gewinnung von B-Lymphozyten, Verschmelzung von B-Zellen mit Myelom-Zellen unsterblich Hybridoma Zellen, Klon-Auswahl, zu bilden und für therapeutische Anwendungen, Humanisierung ist erforderlich, um menschliche Anti-Maus-Antikörper (HAMA)4,5zu vermeiden. Für diese Technologie sind Antigene wie Toxine, Krankheitserreger und hoch konservierte Proteine jedoch relativ unwirksam bei der Auslösung einer Immunantwort in Vivo , mAb Produktion5.

Im Jahr 1978 berichtet Hutchison Et Al. die Verwendung von ein Oligonukleotid, direkte Mutagenese ein Rückstand in eine einsträngige Bakteriophagen Virus6. 1985 berichtete Smith, dass Fremd-gen-Fragmente können im Frame mit dem Gen Kodierung Phagen Hüllprotein III verschmolzen werden und somit auf der Phagen-Oberfläche angezeigt werden, können ohne seine Infektiosität7. Diese bahnbrechenden Werke einen Grundstein für den späteren Bau des Phagen angezeigt Antikörperbibliotheken in immun, naiv und synthetischen bildet mit den Formaten von Single-Chain Variable Fragment (ScFv) und Antigen-bindenen Fragment (Fab) für therapeutische mAb Development8,9. Aus technischer Sicht Phagen-Display-basierten Antikörper-Entwicklung bietet einen ergänzenden Ansatz für mAb Hybridom-basierte Entwicklung, die dazu beitragen kann, um die Beschränkungen zu umgehen, die einige Antigene darstellen können und die Humanisierung zu verarbeiten Hybridom abgeleitet Antikörper erfordern oft5. Ab 2016 6 Phage Display abgeleitet mAbs auf dem Markt, einschließlich Humira, eines der erfolgreichsten mAbs verwendet für die Behandlung der rheumatoiden Arthritis zugelassen und viele Phagen-Display abgeleitet Antikörper-Kandidaten befinden sich in verschiedenen Stadien der klinischen Untersuchung10.

Für immun- und naiv Phagen Antikörperbibliotheken, die Vielfalt der Komplementarität bestimmen Regionen (CDRs) in leichte und schwere Kette leitet sich aus dem natürlichen immun-Repertoire (d.h., von B-Zellen). Im Gegensatz dazu ist die Vielfalt der CDRs in synthetischen Phagen Antikörperbibliotheken völlig künstlich. Synthetische Ansätze zur Bibliotheksbau bieten präzise Kontrolle über das Design der Sequenz Vielfalt und bieten Möglichkeiten für mechanistische Studien der Antikörper-Struktur und Funktion11,12. Darüber hinaus kann der Rahmen für synthetische Bibliotheken vor Bibliotheksbau flussabwärts, groß angelegte industrielle Entwicklung11,12zu erleichtern optimiert werden.

1985, Kunkel berichtet einen einsträngige DNA (SsDNA) Template-basierte Mutagenese Ansatz effizient einzuführen Site-verwiesene Mutationen in Bakteriophage M1313. Dieser Ansatz wurde später für den Bau von Phagen angezeigt Bibliotheken verbreitet. Chemisch synthetisierten DNA Oligonucleotides entwickelt, um Vielfalt in Fab CDRs sind ein Phagemid mit einem Antikörper Rückgrat Template integriert. In diesem Prozess der Phagemid wird als ein Uracil-haltigen SsDNA (dU-SsDNA) ausgedrückt und die Oligonucleotides sind geglüht auf die CDRs und erweitert, um doppelsträngige DNA (DsDNA) im Beisein von T7 DNA Polymerase und T4 DNA-Ligase zu synthetisieren. Schließlich kann generierte ds-DNA durch Elektroporation in Escherichia coli eingebracht werden.

Für hohe Diversität, Phagen angezeigt Bibliotheksbau, Hochspannungs-Elektroporation von einer zwei-Komponenten-Mischung aus Electro-kompetente Zellen und kovalent sollten geschlossene kreisförmige DsDNA (CCC-DsDNA) sorgfältig vorbereitet werden. Sidhu Et Al. modifiziert die Vorbereitung von Electro-kompetente Zellen und DNA von traditionellen Methoden und stark verbesserte Bibliothek Vielfalt14.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Bau von synthetischen Phagen angezeigt Fab Bibliotheken mit Vielfalt von 109-1010 mit einem einzigen Elektroporation erhältlich. Abbildung 1 zeigt eine Übersicht der Bibliothek Bau einschließlich: 1) Hochleistungs-Elektro-kompetente Zellen Vorbereitung; (2) Gewinnung von dU-SsDNA; (3) Kunkels Methode basiert Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese; (4) Electroporation und Berechnung der bibliotheksgröße; (5) Protein A/L-based ELISA zum Falten und funktionelle Diversität Bewertung; und 6) DNA-Sequenzanalyse der Vielfalt. Alle Reagenzien, Stämme und Ausrüstung sind in der Tabelle des Materialsaufgeführt. Tabelle 1 zeigt das Reagenz-Setup.

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Protocol

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Hinweis: Sterile Filterspitzen müssen im ganzen verwendet werden beim Umgang mit Phagen zur Vermeidung von Kontaminationen, Pipette Pistole und Umgebung. Aseptischen Bereich oder Haube muss beim Umgang mit Bakterien und Phagen Experimente verwendet werden. Phagen-Experiment-Bereich muss mit 2 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) gefolgt von 70 % igem Ethanol zur Vermeidung von Kontaminationen Phagen bereinigt werden. Für die Herstellung von Verdünnungsreihen in diesem Protokoll, sollten neue Tipps für jede Verdünnung verwendet werden.

1. E. Coli SS320 Elektro-kompetente Zellen Vorbereitung

  1. Pre-warme LB/Tet nährbodenplatte (vorbereitet und gespeicherte bei 4 ° C für weniger als 1 Woche alt) bei 37 ° C Inkubator für 1 h verwenden einen sterilen Impfschlinge oder sterilen Tipp zu Streifen, einem Glycerin bestand von E. Coli SS320 Zellen auf die vorgewärmten LB/Tet-Agar-Platte in einer Zick-Zack-Richtung Tion sanft entlang der Oberfläche der Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C Inkubator über Nacht für ca. 12-15 h.
  2. Können Sie am folgenden Tag, einen sterilen Impfschlinge oder sterilen Tipp Wählen Sie eine gut getrennte einzelnen Kolonie entlang der Zick-Zack-Linie und impfen in 10 mL 2YT/Tet Medium in einem 50mL Rundboden Röhrchen durch Eintauchen der Schleife in das Medium und kurz rühren.
  3. Inkubation bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min für ca. 3-4 Std. bis OD600 bei rund 0,4-0,8 (Phase Vergrößerung) erreicht ist. Monitor OD600 bei 2 h. Während dieser Zeit wärmen Sie 5 LB/Tet Agarplatten (vorbereitet und gespeicherte bei 4 ° C für weniger als 1 Woche alt) in einem Inkubator 37 ° C für mindestens 1 h vor.
  4. Fügen Sie 20 μL M13KO7 Helfer Phagen aus Lab Lager mit Titer ca. 1 x 1013 koloniebildenden Einheit (KBE) /mL in 180 μL der sterilen 1 X PBS in autoklaviert 1,5 mL Röhrchen 10 vorbereiten um das Zehnfache Verdünnungsreihen.
  5. Aliquoten 4 mL autoklaviert und flüssigen 2YT obere Agar in 5 X 14 mL unten Rundrohr, jedes Rohr mit einer Verdünnung von der fünften bis zur neunten der Zehnfache Verdünnung bzw. beschriften und brüten in einem 65 ° C Inkubator 2YT obere Agar in flüssigem Zustand zu halten.
  6. Mix 500 μL der Log-Phase SS320 E. Coli Zellen in M13KO7 Verdünnung Rohr (Wählen Sie der fünfte Zehnfache Verdünnung bis zur neunten Zehnfache Verdünnung) und in einem Inkubator 37 ° C für ca. 5-10 min inkubieren.
  7. Während der Inkubation der Schritt 1.6 übertragen Sie 2YT obere Agar von Schritt 1.5 auf Raumtemperatur (RT) für etwa 5 min auf ca. 42 ° c abkühlen lassen Verwenden Sie inneren Handgelenk, um Temperatur von 2YT obere Agar zu testen; Es sollte bleiben als Flüssigkeit. Übertragen Sie jedes Verdünnung Mischung aus Schritt 1.5 auf jede entsprechende 2YT obere Agar Röhre. Ziehen Sie den Deckel des jedes Rohr und Mischen von auf den Kopf drehen mehrmals sanft und kurz um die Blase zu vermeiden.
  8. Sorgfältig jeden Teig entlang der Kante des Pre-warme LB/Tet Agarplatte (aus Schritt 1.3) und neigen sich die Platte leicht an, um vollständig und gleichmäßig die Platte mit der Mischung füllen, während die Einführung von Luftblasen zu vermeiden. Halten Sie die Platten bei RT für ca. 5-10 min zu festigen die obere Agar innerhalb jeder Platte und inkubieren Sie die 2YT obere Agar-Platten bei 37 ° C über Nacht für ca. 15-18 Uhr.
  9. Wählen Sie die Verdünnung Platte nach Übernachtung Wachstum Schritt 1,8 mit rund 100-200 durchschnittlicher Größe, einheitliche, gut getrennte Plaketten für Plaque Inokulation. Verwenden Sie einerseits die Agarplatte gegen eine Lichtquelle und andererseits eine Pipette-Pistole mit einer langen sterilen PIPETTENSPITZE, vertikal in die obere Agar zu erstechen geladen zu halten zu halten, und sammeln Sie eine Gedenktafel für Einzel- und gut getrennte zu.
    1. Neigen Sie die PIPETTENSPITZE leicht um obere Agar mit Plakette zu trennen. Pipette nach oben und unten mehrmals, Agar mit Plakette in ein 14 mL Rundboden Kultur Röhrchen mit 1 mL 2YT/kan/Tet Medium vorinstalliertem zu verdrängen (siehe Tabelle 1).
    2. Wiederholen Sie dieses Verfahren, um insgesamt ca. 3-5 Plaketten holen. Der Zweck der Kommissionierung mehrere Plaketten besteht darin erfolgreiche Impfung, wie eine Gedenktafel schwach und relativ gering im Vergleich mit einer Bakterienkolonie sein kann. Die Plaketten für 8 h bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min zu wachsen.
  10. Transfer einer Röhre Kultur in 50 mL 2YT/kan/Tet Medium in einem 250-mL-ratlos-Kolben hineinzuwachsen. Bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min für ca. 12 h über Nacht wachsen.
  11. Drei 2-L ratlos Fläschchen mit 900 mL Superbroth/Tet/kan Medium mit 5 mL der Übernacht-Kultur zu impfen. Inkubation bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min für ca. 6-7 h OD600 um 0,6-0,8.
  12. Kühlen Sie die drei Kolben der Bakterienkultur im Eisbad für 5 min mit sanften ständige Verwirbelung von hand. Die folgenden Schritte sollten in einem kalten Raum, auf Eis, mit prechilled Lösungen und Ausrüstung erfolgen.
  13. Verwenden Sie Absorption Gewebe Handtuch zum Trocknen Sie des äußere Glas von jedem Kolben; Verwenden Sie einerseits um die autoklaviert Zentrifuge 1-L-Flasche auf Bank und andererseits das Medium leicht aus jeder Flasche in jede Zentrifuge Flasche Gießen schräg.
  14. Drehen Sie bei 5.000 × g und 4 ° C für 10 min bis zum pellet-der Bakterien.
  15. Nach Zentrifugation sanft Dekantieren des Überstands in ein 5-L autoklaviert Abfall Becherglas.
  16. Füllen Sie jede Flasche mit 100 mL steril filtriert 1,0 mM HEPES, pH 7,4, und jede Flasche bei Pellet Wiederfreisetzung bei 200 u/min fügen Sie eine Bar autoklaviert magnetische rühren hinzu. Wirbeln Sie und vertreiben Sie die gesamte Pellet aus der Flaschenwand alle mehrere Minuten während der magnetischen rühren. Wenn die Tablette aufgelöst ist, füllen Sie jede Flasche mit einem zusätzlichen 400 mL steril filtriert 1,0 mm HEPES, pH 7.4.
  17. Zentrifuge bei 5.000 × g und 4 ° C für 10 min. Dekantieren des Überstandes, Beibehaltung der Stir Bar in der Flasche.
  18. Wiederholen Sie die Schritte 1.16, 1.17 einmal.
  19. Jedes Pellet in 500 mL steril filtriert, 10 % ultrapure Glycerin mit Hilfe der rühren Bars aufzuwirbeln. Wirbeln Sie und vertreiben Sie die gesamte Pellet aus der Flaschenwand alle mehrere Minuten während der magnetischen rühren.
  20. Zentrifugieren Sie und Dekantieren Sie wie in Schritt 1.17. Wiederholen Sie Schritt 1.19 einmal. Verwenden Sie Long-Arm autoklaviert Zange um die Stir Bar entfernen.
  21. Zentrifugieren bei 5.000 × g und 4 ° C für 15 min. Dekantieren des Überstandes und verbliebenen Spuren des Überstands von jeder Flasche Zentrifuge mit einer Pipette zu entfernen.
  22. Eine Flasche 3,0 mL 10 % ultrapure Glycerin hinzufügen und leicht Aufschwemmen der Pellets durch pipettieren. Übertragen Sie die Suspension auf die nächste Flasche und wiederholen Sie, bis alle Pellets sind Nukleinsäuretablette und in einer Flasche kombiniert. Ca. 6 mL hochkonzentrierte Zellen werden mit einem Titer von 3 x 1011 KBE/mL erzielt.
  23. Pre-chill 1,5 mL autoklaviert Mikrozentrifugenröhrchen und einer 96-Well-Rohr Aufbewahrungsbox ohne Trennwände bei-80 ° C für mindestens 1 h vor diesem Schritt. Überweisen Sie vorgekühlt Mikrozentrifugenröhrchen in den kalten Raum auf dem Eis vor pipettieren Aliquote Pellet Zellsuspension. Verwenden Sie eine Pipette zum aliquoten 350 μl Zellsuspension in jeder 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
  24. Übertragen Sie die Aliquote in einen Schaum Box gefüllten Behälter mit flüssigem Stickstoff für Blitz einfrieren (3-5 min).
    1. Die Schaum-Box mit flüssigem Stickstoff bis-80 ° C Gefrierschrank zu transportieren (siehe Schritt 1,23).
    2. Entfernen Sie die Aufbewahrungsbox 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch von-80 ° C Gefrierschrank (siehe Schritt 1,23) und auf Eis gelegt.
    3. Verwenden Sie schnell ein Metallgitter, um die Aliquote von flüssigem Stickstoff durch ein Sieb und legen Sie sie in die Röhre-Aufbewahrungsbox. Shop bei-80 ° C.
      Achtung: Flüssiger Stickstoff kann zu Verbrennungen führen und muss darauf geachtet werden, für Sicherheitsschutz. Verwenden Sie ein Fab Rückgrat Phagemid, um die Effizienz der vorbereiteten Elektro-kompetente Zellen prüfen (Fab Rückgrat Phagemid Lager sollte in Reinstwasser (MilliQ) bei 400 ng/µL). 1 μg des Fab Rückgrat Phagemid 10 µL Reinstwasser und eine 350 μL Aliquote des Elektro-kompetente SS320 auf Eis Auftauen, und prechill ein Abstand 0,2 cm Elektroporation Küvette auf Eis.
  25. Die 350 μL Elektro-kompetente SS320 Zellen an die 10 µL DNA nach dem Auftauen und mischen durch pipettieren mehrmals unter Beibehaltung der Mischungen auf Eis. Einführung von Luftblasen zu vermeiden.
  26. Wärmen Sie 15 mL SOC Medium in ein 50-mL-Tube im Wasserbad 37 ° C für mindestens 30 min vor der Elektroporation vor. Übertragen Sie die 360 μl-Mischung auf die Küvette und durchführen Sie Elektroporation nach den Anweisungen des Herstellers.
  27. Sofort retten Sie die Zellen nach Electroporation durch Hinzufügen von 1 mL vorgewärmten SOC-Medium (aus Schritt 1,27) und pipettieren. Übertragen Sie das Medium aus der Küvette auf eine 125-mL-Flasche vorbelastet mit 5 mL vorgewärmten Soc.
  28. Spülen Sie die Küvette zweimal, jeweils mit 1 mL vorgewärmten SOC-Medium und Medium zu übertragen, um die 125-mL-Flasche (siehe Schritt 1,27). Fügen Sie vorgewärmt SOC-Medium zu einem Endvolumen von 10 mL bis 125-mL-Flasche.
  29. Inkubieren Sie die 10-mL-Zellkultur für 30 min bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min.
  30. Stellen Sie Verdünnungsreihen, Transfektion Effizienz und M13KO7 Pre-Infektionsrate zu bestimmen.
    1. Verwenden Sie eine Multi-Kanal-Pipette, 180 μL 2YT Medien in jede Vertiefung einer einzelnen Spalte einer 96 Microwell-Platte hinzuzufügen.
    2. Machen 8 verzehnfacht serielle Verdünnungen: 20 μL der Kultur von 1,29 Schritt zu dem ersten Brunnen der Platte, die Mischung von pipettieren, und übertragen 20 μL der Mischung zum nächsten gut. Wiederholen Sie diesen Schritt bis zum Ende der serielle Verdünnung.
    3. Platte 10 μL jeder serielle Verdünnung auf den LB/Carb, LB/kan und LB/Tet Platten in zweifacher Ausfertigung.
    4. Über Nacht bei 37 ° c inkubieren
    5. Effizienz-Berechnungsformel: davon ausgehen, dass M die durchschnittliche Kolonie Anzahl gezählt von der verdünnte Falte 10N (N ist von 1-8). Die E. Coli SS320 Elektro-kompetente Transfektion Zelleffizienz von Fab Rückgrat Phagemid von LB/Carb Platte ist gleich 10 M XN + 3 KBE/µg. Die M13KO7 Pre-Infektionsrate wird aus dem Verhältnis der Kolonien in LB/kan und LB/Tet geschätzt. Der Anteil der E. Coli SS320 zuständigen Zellen mit Fab Rückgrat Phagemid transfiziert wird aus dem Verhältnis der Kolonien in LB/Carb und LB/kan geschätzt.

2. Vorbereitung von Uracil-haltigen SsDNA (dU-SsDNA) aus der Phagemid Vorlage

Hinweis: A berichtete zuvor, dass Fab Rückgrat Phagemid diente als Vorlage für dU-SsDNA Vorbereitung15. Die Architektur des Fab Rückgrat Phagemid ist in Abbildung 2dargestellt. Eine Plasmid-Spin-Kit (QIAprep Spin M13) dient zur Gewinnung von dU-SsDNA mit geringfügigen Änderungen.

  1. Vorwärmen einer LB/Cmp-Platte (vorbereitet und gespeicherte bei 4 ° C für weniger als 1 Woche alt) in einem Inkubator 37 ° C für 1 h Streifen aus einem Glycerin bestand von E. Coli CJ236 Zellen (oder eine andere Dut−/Ung− Belastung) mit sterilen Schleifen oder Tipps auf den vorgewärmten Teller LB/Cmp. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C über Nacht für ca. 12-15 h.
  2. Wählen Sie eine einzelne Kolonie mit einer sterilen Spitze und in 2 mL 2YT/Cmp Medium in einem 14-mL Polypropylen Rundboden Röhrchen zu impfen.
  3. Inkubieren Sie das Medium bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min für 3-4 h bis OD600 bei rund 0,4-0,8 (Phase Vergrößerung) erreicht ist.
  4. 5-10 μL Phagen Fab Rückgrat Vorlage hinzufügen, in die Kultur und Inkubation bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min für 30 min Phagen Infektion zu ermöglichen.
  5. Verwenden Sie nach der Inkubation eine sterile Spitze zu Streifen, 10 μL der Kultur auf einem vorgewärmten Teller LB/Carb bei 37 ° C. Inkubation bei 37 ° C über Nacht für ca. 12-15 h.
  6. Wählen Sie eine einzelne Kolonie von E. Coli CJ236 enthaltenden Fab Rückgrat Phagemid impfen eine Starterkultur von 3 mL 2YT/Carb/Cmp in einem 14-mL Polypropylen Rundboden Röhrchen, und bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min für ca. 12 h über Nacht wachsen.
  7. Impfen Sie die 0,3 mL Starterkultur in 30 mL 2YT/Carb/Cmp in einer verblüfft 250-mL-Flasche.
  8. Inkubieren Sie die Zellkultur bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min für 3-4 h bis OD600 bei rund 0,4-0,8 (Phase Vergrößerung) erreicht ist.
  9. Fügen Sie die M13KO7 (Lab Lager, Titer von ca. 1 x 1013 KBE/mL) auf die Kultur von Schritt 2.8 mit einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von ca. 10 und die endgültige Titer von M13KO7 ist ca. 1 x 1010 KBE/mL.
  10. Bei 200 u/min und 37 ° C für 1 h inkubieren.
  11. Pellet-die Kultur durch Zentrifugieren in einem 50 mL Rundboden Röhrchen bei 5.000 × g und 25 ° C für 20 Minuten.
  12. Überstand abgießen und das Pellet mit 30 mL frische 2YT/Carb/kan/Uridin aufzuwirbeln. Übertragen Sie die Wiederfreisetzung in eine neue verblüfft 250-mL-Flasche.
  13. Bei 200 u/min und 25 ° C für 22-24 h inkubieren.
  14. Übertragen Sie die Kultur von Schritt 2.13 in ein 50 mL Rundboden Röhrchen und Zentrifugieren der Kultur bei 12.000 × g für 20 min um die Phagen überstand von Bakterienzelle Pellet zu trennen. Übertragen Sie die Phagen überstand in ein neues 50 mL Rundboden Röhrchen geben und 1/5 der letzte Band der PEG/NaCl-Lösung, die Phagen auszufällen. Mischen Sie gut und inkubieren Sie für 30 min, überstürzen sich die Phagen Partikel auf Eis.
  15. Zentrifuge bei 12.000 × g und 4 ° C für 30 min. Dekantieren des Überstandes und Zentrifuge bei 4.000 × g und 4 ° C für 2 min. Aspirieren den restlichen überstand.
  16. Das Phagen-Pellet in 2 mL steril gefiltert 1 X PBS und Übertragung auf 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen aufzuwirbeln. Zentrifugieren Sie bei 12.000 × g für 5 min in einem Benchtop Microcentrifuge alle übrigen bakteriellen Ablagerungen zu entfernen und die Phagen überstand auf neue 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und speichern bei 4 ° c
  17. Prüfen Sie Uracil Einbindung in E. Coli CJ236 durch Gegenüberstellung mit E. Coli SS320.
    1. Geben Sie 180 μL 2YT Medien in jeweils einer einzelnen Zeile einer 96-Well-Platte.
    2. Machen zehn 10-fach serielle Verdünnungen: 20 μL der Phagen überstand zum ersten Brunnen der Platte zu übertragen, durch pipettieren mischen und 20 μL der Mischung gut zur nächsten zu übertragen. Wiederholen Sie diesen Schritt bis zum Ende der serielle Verdünnung.
    3. Fügen Sie 10 μL des Phagen aus letzten acht Verdünnungsreihen, 90 μL der E. Coli CJ236 und E. Coli SS320 in Log-Phase zu infizieren (OD600 = 0,4-0,8). Inkubation bei 37 ° C für 30 min mit sanft schütteln.
    4. Platte 10 μL aus die serielle Verdünnung der jede Infektion in E. Coli CJ236 und E. Coli SS320 auf 2YT/Carb Platten in zweifacher Ausfertigung.
    5. Über Nacht bei 37 ° c inkubieren
    6. Titer Berechnungsformel: davon ausgehen, dass M die durchschnittliche Kolonie Anzahl gezählt von der verdünnte Falte 10N (N ist von 1 bis 10). Der Titer von E. Coli CJ236 oder E. Coli SS320 entspricht 10 M XN + 2 KBE/mL. Schätzen Sie die Effizienz von Uracil-Aufnahme aus dem Titer-Verhältnis von E. Coli CJ236 und E. Coli SS320.
  18. Volumen Sie 1/100 des Phagen Niederschlag Puffers MP in der Phagen überstand in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und drehen Sie Kopf vorsichtig, um mehrmals zu mischen. Mindestens 2 min. Phagen Partikel aus dem Kulturmedium ausgefällt werden bei RT inkubieren, und daher sollte eine trübe Lösung an dieser Stelle sichtbar sein.
  19. Die Probe aus Schritt 2.18 auf ein Plasmid-Spin-Spalte (z. B.QIAprep) in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch anwenden. Die Bindungskapazität von einem Dreh-Spalte für SsDNA erreichen mindestens 10 µg. Zentrifuge bei 6.000 × g und 25 ° C für 30 s in einem Benchtop Microcentrifuge. Entsorgen Sie den Durchfluss in 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Phagen Partikel bleiben in diesem Stadium auf die Spalte Matrix gebunden.
  20. Die Spalte 0,7 mL der UT-MLB-Phagen-Lyse und Bindung Puffer (siehe Diskussion) hinzufügen und mindestens 1 min bei RT inkubieren.  Zentrifugieren Sie bei 6.000 x g und 25 ° C für 30 s und entsorgen der durchströmten.
  21. Fügen Sie eine weitere 0,7 mL des Puffers UT-MLB und mindestens 1 min bei RT inkubieren.
  22. Zentrifugieren Sie bei 6.000 × g 30 S. verwerfen der durchströmten. In diesem Stadium ist die Phagen-Hüllprotein von dU-SsDNA, getrennt, die an der Spalte Matrix gebunden bleibt.
  23. Fügen Sie 0,7 mL waschen Puffer PE mit Ethanol nach den Anweisungen des Herstellers. Zentrifugieren Sie bei 6.000 × g für 30 s und entsorgen der durchströmten.
  24. Wiederholen Sie Schritt 2.23, dann nochmals Zentrifugieren bei 6.000 × g für 30 s, verbleibende Puffer PE zu entfernen.
  25. Übertragen Sie die Spalte zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch geben Sie und 100 μL der Elution Puffer EB (10 mM Tris· CL, pH 8,5) in die Mitte der Spalte Membran.
  26. Inkubation bei RT für 10 min und Zentrifuge bei 6.000 × g für 1 min zum dU-SsDNA eluieren. Rund, erhalten Sie 1,5-2,5 μg dU-SsDNA/mL Kultur.
  27. Analysieren der eluierten DNS electrophoresing 1 μl auf ein 1 % Agarose gel-TAE. Die DNA sollte als ein überwiegend single-Band kein Verschmieren angezeigt werden.
  28. Die DNA-Konzentration zu bestimmen, durch Messung der Extinktion auf einem Spektralphotometer Nanodrop bei 260 nm (ein260 = 1,0 für 33 ng/μl SsDNA). Typisch dU SsDNA Konzentrationen sind innerhalb von 200-500 ng/μl.

(3) Kunkels Methode basiert Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese

Hinweise: Es ist ratsam, kleine Reaktionen vor Vollausschlag Reaktionen um die Qualität der mutagenen Oligonukleotid und Reaktion führen. Eine Karikatur von Kunkels Methode basiert directed Oligonukleotid-Mutagenesis in Abbildung 3dargestellt ist. Verschiedenen Aminosäure Unterschiede sind in CDRH1, CDRH2, CDRH3 und CDRL3 Regionen mit IMGT Nummerierung Nomenklatur16 (Tabelle 2) eingeführt. Die theoretische Aminosäure Vielfalt der einzelnen CDR, total theoretische Aminosäure Vielfalt und Oligonukleotid-Sequenzen sind in Tabelle 2aufgeführt.

  1. Oligonukleotid Phosphorylierung mit T4-Polynukleotid-kinase
    1. 0.6 μg Mutagene Oligonukleotide, entworfen, um eine einzelne CDR mit 2 μl 10 X TM-Puffer, 2 μl 10 mM ATP und 1 μl 100 mM DTT mutieren zu kombinieren. Einem Gesamtvolumen von 18 μl in einem 1,5-mL-Tube ultrapure H2O hinzufügen. Für den Bibliotheksbau sind 4 separate und parallele Phosphorylierung Reaktionen richten Sie entsprechend CDRH1, CDRH2, CDRH3 und CDRL3.
    2. Fügen Sie 20 U (2 uL) der T4-Polynukleotid-Kinase zu jedem Rohr und inkubieren Sie für 1 h bei 37 ° C (Reaktion 1 in Tabelle 3). Einsatz sofort zum Glühen.
  2. Glühen von der Oligonukleotide an der Vorlage
    1. 20 μg dU SsDNA Vorlage fügen Sie 25 μl 10 X TM-Puffer, 20 μL jeder phosphorylierten Oligonukleotid-Lösung und hochreinen H2O zu einem Endvolumen von 250 μl in einem 0,5 mL Röhrchen hinzu. Gut mischen und als Reaktion 2 in Tabelle 3in 0,20 mL PCR Tubes (50 μL) übertragen. Diese DNA-Mengen bieten eine molare Verhältnis von 3:1 zwischen Oligonukleotid und Vorlage, vorausgesetzt, dass das Längenverhältnis Oligonukleotid und Vorlage 1: 100.
    2. Die Reaktion in einer PCR-Maschine bei 90 ° C für 3 min, 50 ° C für 3 min inkubieren und 20 ° C für 5 Minuten.
  3. Enzymatische Synthese der CCC-dsDNA
    1. Die 250 μL geglüht Oligonukleotid/Vorlage Mischung fügen Sie 10 μl 10 mm ATP, 10 μl 25 mM dNTP-Mix, 15 μl 100 mm DTT, 30 Weiss Einheiten T4 DNA-Ligase und 30 U T7 DNA-Polymerase als Reaktion 3 in Tabelle 3 hinzu.
    2. Inkubieren Sie die Reaktion in der 1,5-mL-Tube bei 20 ° C über Nacht.
    3. Waschen Sie und konzentrieren Sie die synthetisierte CCC-DsDNA in einem 0,5 mL zentrifugale Filter-Gerät mit einer 30 kDa Pore Größe Membran bei RT
      1. 400 µL Endvolumen ultrapure H2O hinzufügen und über Nacht Reaktionsgemisch auf das Filter-Gerät übertragen. Drehen Sie mit 14.000 × g für 10 min.; das Volumen beträgt weniger als 50 μL.
      2. Verwerfen der Durchströmung, 400 µL des hochreinen H2O in den Filter hinzufügen und mit 14.000 × g für 10 min. drehen.
      3. Wiederholen Sie Schritt 3.3.3.2 einmal mehr.
      4. Legen Sie den Filter umgedreht in einem sauberen Microcentrifuge Schlauch CCC-DsDNA wiederherstellen. Schleudern Sie bei 1000 × g für 2 min; Das wiederhergestellte Volumen beträgt normalerweise rund 20-40 μL. Die wiederhergestellten CCC-DsDNA kann sofort für Elektroporation von E. Coli verwendet oder bei-20 ° C für eine spätere Verwendung eingefroren. CCC-DNA erhalten Sie normalerweise 20-40 μg.
    4. Electrophorese 1,0 µL des eluierten reaktionsproduktes neben dU SsDNA Vorlage, um das Ergebnis der Reaktion visualisieren.

4. Electroporation und Berechnung der Größe der Bibliothek

  1. Die gereinigten CCC-DsDNA Chill (20 μg in einem maximalen Volumen von 50 μL) in einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und einem Abstand 0,2 cm Elektroporation Küvette auf Eis.
  2. Wärmen Sie 20 mL SOC Medien in ein 50mL Polypropylen konische Zentrifugenröhrchen in 37 ° C Wasserbad mindestens 30 min lang vor.
  3. Tauwetter ein 350 μL aliquoten von Electro-kompetente E. Coli SS320 auf Eis. Hinzufügen der Zellen die DNA und die Mischung gründlich durch pipettieren mehrmals. Einführung von Luftblasen zu vermeiden.
  4. Übertragen Sie die Mischung auf die Küvette und durchführen Sie Elektroporation nach den Anweisungen des Herstellers. Wenn das BTX ECM-630-Elektroporation-System verwendet wird, sind die entsprechenden Einstellungen beispielsweise 2,5 kV Feldstärke, 125 Ω Widerstand und 50 µF Kapazität.
  5. Sofort zu retten die elektroporiert Zellen durch Hinzufügen von 1 mL vorgewärmten SOC-Medium und in 17 mL SOC Medium in einem 125-mL-Kolben übertragen. Spülen Sie die Küvette zweimal mit 1 mL der SOC-Medium und Übertragung in den gleichen Kolben (Endvolumen beträgt 20 mL).
  6. 30 min bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min inkubieren.
  7. Die Elektroporation Effizienz zu bestimmen.
    1. Jede Vertiefung einer einzelnen Spalte einer 96 Microwell-Platte 180 μL 2YT Medien hinzufügen.
    2. Machen 8 um das Zehnfache serielle Verdünnungen: 20 μL der 20-mL-Kultur auf die erste Bohrung der Platte übertragen, mischen mit pipettieren und 20 μL der Mischung gut zur nächsten zu übertragen. Wiederholen Sie diesen Schritt bis zum Ende der serielle Verdünnung.
    3. Platte 10 μL der einzelnen Verdünnungsreihen auf einer LB/Carb-Platte in doppelter Ausführung. Platte 100 µL verbleibenden aller Verdünnungsreihen auf separaten LB/Carb-Teller für Kolonie Graf Cross-Check. Diese Platten bieten auch einzelne Klone für ELISA und Sequenz-Analyse (siehe Abschnitt 5).
    4. Über Nacht bei 37 ° c inkubieren
    5. Zählen Sie die Kolonien von 10 μL Duplikate auf dem Teller LB/Carb. Davon ausgehen Sie, dass M der durchschnittliche Kolonie Zahl gezählten auf 10N Falten LB/Carb Platte ist (N ist von 1-8). Die gesamte bibliotheksgröße ist gleich 2 M X 10N + 3 Kolonien.
  8. Aliquot der Kultur vom Schritt 4.6 ebenso in zwei 2-L ratlos Fläschchen, jeweils mit 500 mL 2YT/Carb/kan Medium für Phagen-Bibliothek-Generation.
  9. Inkubation bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min über Nacht für ca. 16 h.
  10. Übertragen Sie die Kultur auf zwei 1-L autoklaviert Zentrifuge Flaschen und Zentrifuge für 30 min bei 12.000 × g bei 4 ° c
  11. Übertragen den überstand zwei neue autoklaviert Zentrifuge 1-L-Flaschen und fügen Sie 1/5 der letzte Band der PEG/NaCl-Lösung, die Phagen auszufällen. Inkubation für 30 min auf Eis.
  12. Zentrifuge für 30 min bei 12.000 × g und 4 ° C. Sorgfältig abgießen Sie den überstand und nicht zu stören des Pellet-Phagen. Für 1 min bei 4.000 x g drehen und Entfernen des restlichen Überstands mit einer Pipette.
  13. Aufschwemmen des Phagen-Pellets mit 20 mL 1 X PBS-Puffer steril filtriert und Übertragung auf eine neue 50-mL-Tube.
  14. Pellet-die Unlösliche Angelegenheit durch Zentrifugieren für 5 min bei 12.000 × g und 4 ° C. Übertragen Sie den überstand auf eine neue 50-mL-Tube.
  15. Die Phagen-Konzentration von Spektralphotometer Messen (OD268 = 1,0 für eine Lösung von 5 X 1012 Phagen/mL).
  16. Passen Sie die Phagen-Konzentration bis 5 X 1012 Phagen/mL in 1 X PBS mit 10 % ultrapure Glycerin.
  17. Aliquoten 1 mL der Lösung Phagen pro 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Die Bibliotheken für Schwenken sofort verwenden oder speichern bei-80 ° C.

(5) Qualitätsbeurteilung von Protein A / L direkte Bindung ELISA-Assay und Sequenzierung

  1. Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie 96 einzelne Kolonien auf LB/Carb Teller aus Schritt 4.7.3 in eine 96-tief gut Kultur-Platte mit 800 μl 2YT/Carb in jede Vertiefung aus. 3-4 h bei 37 ° C mit schütteln bei 1.000 u/min OD600 inkubieren = 0,4-0,8.
  2. 100 μl der M13KO7 hinzufügen (1 X 1011 KBE/mL) in jede Vertiefung eines 96-tiefen Kultur gut Platte mit einer Mehrkanal-Pipette. Inkubation bei 37 ° C mit schütteln bei 1.000 u/min für 1 h.
  3. Fügen Sie 100 μL der 2YT mit 10 X Konzentration von Kanamycin (500 μg/mL) in jede Vertiefung mit einer Mehrkanal-Pipette. Über Nacht bei 37 ° C mit schütteln bei 1.000 u/min inkubieren.
  4. 1 µg/mL in 1 X PBS-Protein L auflösen. 3/4 Mantel der Brunnen eine 384-Well hohe Proteinbindung Polystyrol-Platte mit 30 µL/Well die Proteinlösung L. Über Nacht bei 4 ° c inkubieren
  5. Entsorgen Sie die Übernachtung L Beschichtung Proteinlösung aus Schritt 5.4. Fügen Sie 50 µL M-PBST (die blockierende Lösung) aller Brunnen in der 384-Well hohen Proteinbindung Polystyrol-Platte mit einer Mehrkanal-Pipette. Inkubieren Sie die Platten auf einer Mikrotestplatte Shaker für 1 h bei RT
  6. Spin-down über Nacht Kultur aus Schritt 5.3 in einer Kultur tief 96-Well-Platte bei 3.000 x g für 10 min bei 4 ° C. Das Bakterium ist im überstand.
  7. Entsorgen Sie die blockierende Lösung aus Schritt 5.5. 3 der Protein L beschichtet Brunnen als dreifacher Ausfertigung und 1 unbeschichteten auch negative Steuerung mit einem Mehrkanal-Pipette fügen Sie 15 μl des M-PBST und 15 μl jeder Phage überstand (Schritt 5.6 hinzu). 1 h unter Schütteln bei 200 u/min bei RT inkubieren.
  8. Die Phagen-Lösung zu verwerfen. Waschen Sie die Platte 6 Mal mit 80 μL der PBST durch eine automatisierte Platte Scheibe.
  9. Jeder Brunnen mit einer Mehrkanal-Pipette 15 μl des M-PBST und 15 μl der Protein A-HRP (1:1, 500 in 1 X PBS verdünnt) hinzu, und 1 h unter Schütteln bei ca. 200 u/min bei RT inkubieren.
  10. Die Protein A-HRP/M-PBST-Lösung zu verwerfen. Waschen Sie die Platte 6 Mal mit 80 μL der PBST.
  11. Fügen Sie TMB-Substrat (30 μl/Well) mit einer Mehrkanal-Pipette hinzu und 2-3 min inkubieren Sie, bis die Farbe entwickelt. Stoppen Sie die Reaktion mit 1,0 M H3PO4 (30 μl/Well).
  12. Lesen Sie die Platten spektralphotometrisch bei 450 nm. Positive Klone sind definiert als diejenigen, die eine durchschnittliche Verhältnis der OD450 Absorption von Protein L-Brunnen, der auch größer als 3,0 M-PBST aufweisen.
  13. Infizieren Sie in einer 96-tiefen, 50 μL der SS320 in 2YT/Tet bei Log-Phase mit 5 μL der gleichen Phagen verwendet für ELISA (Schritt 5.6) für 30 min bei RT
  14. 950 μL der 2YT/Carb in den 96-Tiefe gut aus Schritt 5.13 hinzufügen und über Nacht bei 37 ° C mit schütteln bei 1.000 u/min inkubieren.
  15. Extrahieren Sie die Phagemid DNA durch Mini-Vorbereitung DNA-Extraktion Kit. Verwenden Sie die upstream Primer VL (5'-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3 ") und VH (5'-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3") für die Sequenzanalyse, die Bibliothek Sequenz Vielfalt zu schätzen.

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Representative Results

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Nach dem Flussdiagramm der Fab Bibliotheksbau (siehe Abbildung 1), wir vorbereitet M13KO7 Helfer Phagen bereits infiziert E. Coli SS320 Elektro-kompetente Zellen. Die Effizienz dieser Electro-kompetente Zellen wird als 2 X 109 KBE/µg geschätzt, wenn das Fab Phagemid Rückgrat für Bibliotheksbau verwendet wurde (Abbildung 4).

Die Uracil Einbeziehung Effizienz wurde durch Vergleich der Titer in E. Coli CJ236 und E. Coli SS320 Zellen überprüft. Die E. Coli CJ236 und E. Coli SS320 Zellen wurden durch Phagen beherbergen dU SsDNA infiziert. E. Coli SS320 hat Enzyme (dUTPase und Uracil Glycosylase), die Uracil-haltigen DNA, während E. Coli CJ236 diese Enzyme fehlen und Uracil-haltigen DNA zersetzen kann nicht abbauen können. Um einen akzeptablen Uracil Einbeziehung Wirkungsgrad zu erreichen, müssen Titer von E. Coli CJ236 mindestens 104 -mal höher als die von E. Coli SS320. Sonst wird die konstruierten Antikörperbibliothek aufgrund ineffizienter Uracil Einbeziehung die Wildtyp Bevölkerung Zunahme. Abbildung 5 zeigte, dass der Titer von E. Coli CJ236 ca. 3 X 105 mal höher als die von E. Coli SS320, eine effiziente Uracil-Integration in Phagen SsDNA angibt.

Als nächstes haben wir vorbereitet und dU SsDNA extrahiert. Die dU-SsDNA Reinheit wird durch Agarose-Gelelektrophorese (Abbildung 6) überprüft. Dann das Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese durchgeführt wurde und die Effizienz der dU SsDNA Umstellung auf CCC-DNA wurde untersucht (Abbildung 6). Drei Produkte mit niedriger Motilität als dU SsDNA können auf das Gel einschließlich der schnellsten Lauf Band (CCC-DsDNA), die mittleren schwachen Band (geklaut) und die langsamsten Lauf Band (DNA Strang verschoben) visualisiert werden.

Nach Electroporation in E. Coli SS320, schätzte die Größe der Bibliothek von der Übernachtung Inkubation Platte (siehe Schritt 4.7.5). Die durchschnittliche bibliotheksgröße war 5 X 109 von doppelten Verdünnungsreihen auf LB/Carb Platten (Abbildung 7). Die geschätzte Größe bei diesem Schritt kann jedoch Phagen, die nicht anzeigen Fabs aufgrund des Vorhandenseins von einem Frameshift oder Codon zu stoppen, oder anzeigen fehlgefaltete Fabs enthalten. Sequenzierung und ELISA wurden verwendet, um die Funktionsvielfalt des konstruierten Bibliothek zu schätzen. 96 zufällig ausgewählten einzelnen Klone wurden zur Sequenzierung Analyse geschickt. Tabelle 4 zeigt, dass 90 von 96 zufällig ausgewählten einzelnen Klone erfolgreich 70 Klone ohne ein vorzeitiges Stopcodon (53 Klone mit mindestens einer CDR-Mutante) und 17 Klone mit Wildtyp Sequenz und 20 Klone mit enthält sequenziert wurden, ein vorzeitige Stopcodon in verschiedenen Regionen. Innerhalb der 70 Klone sind mutierte Raten von CDRH1, CDRH2, CDRH3 und CDRL3 50 %, 57 %, 53 % und 56 %, während die mutierten mit mindestens einem CDR 76 % liegt. In den 20 Klone mit ein vorzeitiges Stopcodon (90 %) wurde das vorzeitige Stopcodon hauptsächlich von Frameshift Oligonukleotid Mutagenese Zündkapseln, darunter 45 % (CDRH1), 10 % (CDRH2), 15 % (CDRH3) und 20 % (CDRL3) abgeleitet.

Um die Anzeige der richtig gefalteten Fabs, ein Protein A zu erkennen / L basierte ELISA war beschäftigt, es ist bekannt, dass Protein A und Protein L erkennen können korrekte Faltung des Frameworks VH und VL Rahmen, bzw.17,18. Im Einvernehmen mit der Sequenzierung Analyse zeigten der ELISA-Test in dreifacher Ausfertigung (Abbildung 8), dass die 20 Klone mit ein vorzeitiges Stopcodon alle negativ waren, während die 17 Klone mit einem Wildtyp Sequenz alle positiv waren, als das positive Verhältnis war empirisch bei 3,0 festgelegt. Für die 53 Klone mit mindestens einer CDR-Mutante waren 43 Klone im ELISA positiv, während 10 Klone negativ waren; Dies bedeutet, dass die meisten Klone gut gefaltet wurden, während die CDRs von 10 Klone nachteilig auf Fab Faltung auswirken können. Insgesamt 43 Klone aus den 90 Klone (48 %) waren gut gefaltet und enthalten mindestens eine CDR-Mutant. So die funktionelle Aminosäure-Vielfalt der konstruierte Bibliothek basieren auf Protein A / L ELISA und Sequenz-Analyse wurden schätzungsweise 2,4 X 109 (d. h.48 % der 5 X 10-9).

Figure 1
Abbildung 1: Übersicht über die Phagen angezeigt Fab Bibliotheksbau. Phagen angezeigt Fab Bibliotheksbau folgt eine einfache Abfolge von Schritten. Es geht um Herstellung von Hochleistungs-Elektro-kompetente Bakterienzellen, Gewinnung von dU-SsDNA, Kunkels beruhende Methode Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese, Elektroporation und Berechnung des Phagen Fab bibliotheksgröße, funktionale Bewertung durch Protein A / L ELISA und DNA-Sequenz-Analyse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Phagemid Architektur für die Fab Bibliotheksbau. Die Grundzüge der Phagemid Rückgrat bestehen Ursprung des einzelsträngige (f1 Ori) und (DsDNA Ori) doppelsträngige DNA Replikation und einem Ampicillin/Carbenicillin-Resistenz-Gen (AmpR). Für die Fab Anzeige unter der Kontrolle des Veranstalters alkalische Phosphatase (PhoA), die Phagemid enthält eine Bicistronic Kassette Laufwerk Expression und Sekretion von: leichte Kette (LC) bestehend aus einer Sekretion Signal, VL (Variable Region der leichten Kette), CL (Konstante Region der leichten Kette), und C-terminalen Flagge Tag; und schwere Kette (HC) bestehend aus einem Sekret Signal, VH (Variable Region der schweren Kette) und CH1 (Konstante Region 1 der schweren Kette) mit einem p3 Phagen kleinere Hüllprotein verschmolzen. Montage der Lichterkette und schwere Kette in Fab in E. Coli Periplasma leitet die Anzeige der Fab auf der Oberfläche von Phagen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Schematische Darstellung des Kunkels Methode basierte Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese. In diesem Protokoll verwendeten wir Kunkels Methode dU SsDNA Vorlage vorbereiten. Oligonukleotide für CDRH1, CDRH2, CDRH3 und CDRL3 mit gestalteten Vielfalt sind phosphoryliert, geglüht zur Vorlage und zum Konvertieren von ss-DNA nach CCC-DsDNA benutzt. Nach Electroporation in E. Coli SS320 Elektro-kompetente Zellen ist die Heteroduplex DNA entweder dem Wildtyp oder die mutierte Form repariert; Aufgrund des Vorhandenseins von Uracil in der Wildtyp-Strang des Reparaturvorgangs begünstigt die mutierte Form, und somit die mutierte Form dominiert der Bibliothek. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Einschätzung der M13KO7 bereits infiziert E. Coli SS320 Elektro-kompetente Zelleffizienz. Ein Phagemid Rückgrat Vektor wurde verwendet, um die Elektroporation Effizienz der zuständigen Zellen zu prüfen. Formel zur Berechnung der Effizienz lautet wie folgt: davon ausgehen, dass M die durchschnittliche Kolonie Anzahl gezählt, von der meisten verdünnten Falte 10N (N ist von 1-8) in zweifacher Ausfertigung. E. Coli SS320 Effizienz von LB/Carb Platte ist gleich 10 M XN + 3 KBE/µg. Die Effizienz der Electro-kompetente Zellen ist ca. 2 X 109 KBE / µg. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Bewertung der Uracil Einbindung in SsDNA durch Phagen Infektion von E. Coli CJ236 und E. Coli SS320 Zellen. Basierend auf Kunkels Methode, Uracil Einbeziehung Effizienz wird durch Vergleich der Phagen Infektion Titer in E. Coli CJ236 und E. Coli SS320 Zellen überprüft. Die Titer Berechnungsformel lautet wie folgt: davon ausgehen, dass M die durchschnittliche Kolonie Anzahl gezählt, von der meisten verdünnten Falte 10N (N ist von 1 bis 10), und dass die Titer von E. Coli CJ236 oder E. Coli SS320 M X 10N + 2 KBE/mL entspricht. Die Effizienz von Uracil Aufnahme kann aus dem Verhältnis der Titer von E. Coli CJ236 und E. Coli SS320 geschätzt werden. Der Titer in E. Coli CJ236 war 9 X 1012 KBE/mL während der Titer in E. Coli SS320 3 X 107 KBE/mL. Das Verhältnis der Titer von E. Coli CJ236 und E. Coli SS320 war 3 X 10-5. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Umwandlung des dU-SsDNA und CCC-DNA durch Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese. Nach Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese wurde die Effizienz des dU-SsDNA Umstellung auf CCC-DNA untersucht. dU-SsDNA wurde komplett gegen DsDNA umgewandelt. Die dominante Band ist CCC-DsDNA, zwar gibt es eine kleine Portion geklaut DsDNA und DNA-Strang verdrängt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Phagen Titration für die Berechnung der bibliotheksgröße. Nach Electroporation in E. Coli SS320 schätzte die Größe der Bibliothek von Verdünnungsreihen auf LB/Carb Platten. Die Größe Berechnungsformel lautet wie folgt: M ist die durchschnittliche Kolonie Zahl gezählt, von der meisten verdünnten Falte 10N aus einer 2YT/Carb-Platte (N ist von 1-8), Größe ist gleich 2 M X 10N + 3zu übernehmen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8: Protein A / L direkte Bindung Phagen ELISA. Protein L erkennt den Rahmen gut gefaltete Kappa Lichterkette VL und Protein eine Dose Rahmen gut gefaltete schwere Kette VH erkennen. Bindung von Fab mit Protein L und A zeigt korrekte Faltung der schweren Kette und Lichterkette. Kurz gesagt, Protein L in dreifacher Ausfertigung und die Negativkontrolle M-PBST wurden auf die Platte beschichtet, Fab Phagen Überstände aus verschiedene Klone inkubiert mit Protein L und M-PBST, dann nach dem Waschen, Protein, das A-HRP verwendet wurde, um gebundene Fab Phagen zu erfassen. Phagen ELISA Lesungen zeigte 90 zufällig ausgewählten Klone mit erfolgreiche Sequenzierung auslesen. Eine Schwelle-Linie, die den Klon als positiv wurde empirisch definiert, wo das Verhältnis der OD450 Absorption Wert von Protein L (Durchschnitt von dreifacher Ausfertigung mit Fehlerbalken) versus negative Kontrolle mehr als 3.0 war. Drei Gruppen basierend auf Sequenzierung Analyse wurden gezeigt, eine Mutante ohne Stopp-Codon in rot (53 Klone), Wildtyp (WT) in blau (17-Klone) und Mutant mit Stopp-Codon in grün (20 Klone) entspricht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Reagenz-setup Komponente Betrag Kommentare/Beschreibung
2YT medium Hefeextrakt 10 g Reinstwasser, stellen Sie die Lautstärke bis 1,0 L, pH 7.0, anpassen hinzufügen Autoklaven.
TRYPTONE 16 g
NaCl 5 g
2YT obere agar Hefeextrakt 10 g Fügen Sie Reinstwasser stellen Sie die Lautstärke bis 1,0 L und pH-Wert 7,0, Hitze auflösen, Autoklaven passen.
TRYPTONE 16 g
NaCl 5 g
Granulierter agar 7,5 g
2YT/Carb/Cmp-medium Carbenicillin 100 μg/mL
Chloramphenicol 10 μg/mL
2YT/Carb/kan/Uridin medium Carbenicillin 100 μg/mL
Kanamycin 50 μg/mL
Uridin 0,25 µg/mL
2YT/Carb/Tet medium Carbenicillin 100 μg/mL
Tetracyclin 10 μg/mL
2YT/Carb medium Carbenicilin 100 μg/mL
2YT/kan medium Kanamycin 50 μg/mL
2YT/kan/Tet medium Kanamycin 50 μg/mL
Tetracyclin 10 μg/mL
2YT/Tet medium Tetracyclin 10 μg/mL
2YT/Cmp-medium Chloramphenicol 10 μg/mL
LB-Medium-agar Hefeextrakt 5 g Reinstwasser, stellen Sie die Lautstärke bis 1,0 L, pH 7.0, anpassen hinzufügen Autoklaven. Für LB-Agar, fügen Sie 20 g granulierten Agar Autoklaven.
TRYPTONE 10 g
NaCl 10 g
LB/Carb Platten LB-agar 1L
Carbenicillin 100 μg/mL
LB/Tet Platten LB-agar 1 L
Tetracyclin 10 μg/mL
LB/Cmp-Platten Chloramphenicol 10 μg/mL
LB/kan Platten Kanamycin 50 μg/mL
SOC-medium Hefeextrakt 5 g Fügen Sie Reinstwasser damit die Lautstärke bis 1,0 L und justieren pH 7.0, Autoklaven.
TRYPTONE 20 g
NaCl 0,5 g
KCl 0,2 g
2.0 M MgCl2 5,0 mL
1.0 M Glukose 20 mL
Superbroth medium TRYPTONE 12 g Hochreines Wasser hinzufügen, um 900 mL, Autoklaven, 100 mL autoklaviert 0,17 M KH2PO4, 0,72 M K2HPO4hinzugeben.
Hefeextrakt 24 g
Glycerin 5 mL
Superbroth kan/Tet medium Kanamycin 50 μg/mL
Tetracyclin 10 μg/mL
1 X PBS NaCl 137 mM Anpassen der pH-Wert auf 7.2, Autoklaven.
KCl 3 mM
Na2HPO4 8 mM
KH2PO4 1,5 mM
TAE/Agarose-gel TAE-Puffer
Agarose 1 % (w/V)
GelRed 1: 10000 (V/V)
TMB-Substrat TMB 50 % (V/V)
H2O2 Peroxidase Substrat 50 % (V/V)
M-PBST Puffer 1 X PBS 100 ml
Tween-20 0,05 % (V/V)
Fettfreie Trockenmilch 5 % (V/V)
5 X PEG/NaCl PEG-8000 20 % (w/V) Hochreines Wasser aufdrehen, 1 L und Autoklaven zu fügen.
NaCl 2,5 M
PBST Puffer 1 X PBS 1 L 0,22-μm-Filter-sterilisieren.
Tween-20 0,05 % (V/V)
10 x TM-Puffer MgCl2 0,1 M PH-Wert auf 7,5 anpassen.
Tris 0,5 M
1,0 mM HEPES, pH-Wert 7,4 1.0 M HEPES 4,0 mL 0,22-μm-Filter-sterilisieren.
Reinstwasser 4.0 L
hochreine Glycerin 10 % (V/V) Hochreine Glycerin 100 ml 0,22-μm-Filter-sterilisieren.
Reinstwasser 900 mL
Reinstwasser H20 DNase-frei, Rnase-freie, Pyrogenfreie.

Tabelle 1: Reagenz-Setup.

Table 2
Tabelle 2: CDR Diversitäten und Mutagenese Zündkapseln. Die DNA-Sequenzen der Regionen CDR mutierbar sind in rot dargestellt; Sequenzen werden mit dem IUPAC-Nukleotid-Code formatiert. "X" bedeutet Tri-Nukleotid aus einer Mischung entwickelt, um unterschiedliche Aminosäure-Sets enthalten; "n" bedeutet, dass unterschiedliche Anzahl von X. fünf Primer mit einer unterschiedlichen Anzahl von X verwendet wurden, CDRL3 oder CDRH3, bzw. zu diversifizieren, um Variable Länge der CDRL3 und CDRH3 zu generieren. Die Rückstände Zahlen werden durch die IMGT Nomenklatur definiert. Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Kunkels beruhende Methode Mutagenese
Reaktion 1. Oligonukleotid Phosphorylierung mit T4-Polynukleotid-kinase
Komponente Betrag Endgültige
Mutagene Oligonukleotide 0.6 μg
10 x TM-Puffer 2 ΜL 1 X
10 mM ATP 2 ΜL 1 mM
100 mM DVB-t 1 ΜL 5 mM
T4-Polynukleotid-Kinase (10 U/μl) 2 ΜL 20 U
Hochreine H20 Bis zu 20 μL
Reaktion-Einstellung
Schritt 1. 37 ° C für 1 h
Reaktion 2. Glühen von der Oligonukleotide an der Vorlage
Komponente Betrag Endgültige
dU-SsDNA Vorlage 20 μg 20 μg
10 x TM-Puffer 25 ΜL 1 X
phosphorylierten CDRH1 Oligonukleotide 20 ΜL 0.6 μg
phosphorylierten CDRH2 Oligonukleotide 20 ΜL 0.6 μg
phosphorylierten CDRH3 Oligonukleotide 20 ΜL 0.6 μg
phosphorylierten CDRL3 Oligonukleotide 20 ΜL 0.6 μg
Hochreine H20 Bis zu 250 μl
Reaktion-Einstellung
Schritt 1. 90 ° C für 3 min
Schritt 2. 50 ° C für 5 min
Schritt 3. 20 ° C für 5 min
Reaktion 3. Enzymatische Synthese der CCC-dsDNA
Komponente Betrag Endgültige
geglühten Oligonukleotide/Vorlage Mischungen 250 ΜL
10 mM ATP 10 ΜL 346 µM jedes Nukleotid
dNTP-Mix (25 mM von jedem Nukleotid) 10 ΜL 865 µM jedes Nukleotid
100 mM DVB-t 15 ΜL 5 mM
T4 DNA-ligase 1 ΜL 30 Weiss-Einheiten
T7-DNA-polymerase 3 ΜL 30 U
Reaktion-Einstellung
Schritt 1. 20 ° C über Nacht

Tabelle 3: Verfahren und Komponenten der Kunkels Methode basierte Reaktion.

Gruppe Klon-Anzahl Region Prozentsatz
Keine vorzeitige Stopcodon 70 CDRH1 mutation 50 % (35/70)
CDRH2 mutation 57 % (40/70)
CDRH3 mutation 53 % (37/70)
CDRL3 mutation 56 % (39/70)
Mindestens eine CDR-mutation 76 % (53/70)
Vorzeitige Stopcodon 20 CDRH1 defekt 45 % (9/20)
CDRH2 defekt 10 % (2/20)
CDRH3 defekt 15 % (3/20)
CDRL3 defekt 20 % (4/20)
Andere Fehler 10 % (2/20)

Tabelle 4: Sequenzanalyse der CDRH1, CDRH2, CDRH3 und CDRL3 aus der synthetischen Fab Bibliothek.

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Discussion

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Hohe Diversität, Phagen angezeigt Fab Bibliotheken, Qualitätskontrolle zu konstruieren sind Check-Points nötig, um verschiedene Phasen des Bauprozesses, einschließlich die Kompetenz der Elektro-kompetente Zellen, Qualität der Vorlage dU SsDNA, Effizienz der Überwachung CCC-DsDNA Synthese, Titer nach Elektroporation, Fab Falten und Aminosäure-Vielfalt der CDRs durch Sequenzanalyse der Fab-Phagen-Klone.

Hohe Ausbeute und Reinheit des dU-SsDNA ist wichtig für hohe Mutagenese Rate. Nach unserer Erfahrung kann mehr dU SsDNA als die Phagen Induktion bei 25 ° C über Nacht von Phagen Induktion bei 37 ° C über Nacht erzielt werden. Dies ist im Einvernehmen mit einem vorherigen Bericht19. Über SsDNA-Extraktion enthielt die erste Plasmid Spin Kit (QIAprep) MLB für Phagen Lyse und Bindung. Später, wurde MLB mit unerfindlichen Gründen eingestellt und durch PB ersetzt. Wir fanden, dass die Ausbeute an dU SsDNA von PB-Behandlung gegenüber von MLB Behandlung wesentlich niedriger ist. In diesem Protokoll haben wir ein Reagenz genannt UT-MLB20 ersetzen MLB und fanden, dass die Ausbeute an dU SsDNA aus dem ersten Spin Kit ähnelt.

Als CDRH3 und CDRL3 sind die vielfältigsten Regionen für Antigen Anerkennung21, eine maßgeschneiderte Vielfalt mit einem bestimmten Satz von Aminosäure-Kombinationen und Verhältnisse einzuführen und Redundanz Bias und Stop-Codons eingeführt durch Entartete Codons wie entfernen Nitrosamins (N, äquimolaren mit a/c/G/T; K, äquimolaren G/t), Trimer Codon phosphoramidit-basierte Oligonukleotide22 mit genau einem Trimer Codon entspricht einer bestimmten Aminosäure für CDRH3 und CDRL3 entwickelt wurden. Variable Längen von CDRH3 und CDRL3 Oligonukleotide wurden darüber hinaus zur Vielfalt weiter zu erhöhen.

Nach enzymatische Synthese der CCC-DsDNA sollte in der Regel drei Bands werden von Agarose-Gelelektrophorese beobachtet und die Bands klar ohne Abstrich. Dazu gehört die schnellsten Lauf Band der CCC-DsDNA, die eine hohe Mutationsrate (ca. 80 %) nach Electroporation23ergeben kann. Die langsamsten Lauf Band ist die Strang verdrängt DNA, das ergibt sich aus der inhärenten Strang-Übersprungshandlung von T7 DNA Polymerase und hat eine niedrige Mutation von (etwa 20 %)23. Das mittlere schwache Band ist DNA nach Verlängerung aufgrund unzureichender T4 DNA-Ligase Tätigkeit oder unzureichende Oligonukleotid Phosphorylierung geklaut.

Ein kleinen Sequenzierung Probe Pool wurde verwendet, um die Bibliothek Vielfalt obwohl nicht genau24schätzen. Um die echte Vielfalt genau abschätzen zu können, möglicherweise die nächste Generation sequencing (NGS) eine gute Wahl im Bergbau der Vielfalt Tiefe der konstruierte Bibliothek25. In der Praxis aufgrund der aktuellen Herausforderungen der NGS Technologie einschließlich Lesen Länge, Genauigkeit, Kosten und hohem Durchsatz, die Sequenzierung der Fab Phagen-Bibliothek verwendet, die in diesem Protokoll mit einer Länge von rund 950 bp überspannt, CDRH1, CDRH2, CDRH3 und CDRL3 ist nicht erreichbar; Es ist jedoch möglich, die ScFv zu schätzen (rund 700 bp) Bibliothek Vielfalt innerhalb des Bereichs von Millionen24,25. Ein weiterer wichtiger Standard, die Vielfalt der konstruierte Bibliothek zu bewerten ist die Verwendung der Bibliothek gegen viele verschiedene Arten von Antigenen schwenken und berechnen die positive Klone erfasst, da Bibliothek Vielfalt direkt mit der erfolgreichen Antigen korreliert Schwenken26. Hochdurchsatz-Auswahl-Plattform eignet sich gut für diesen Zweck und Leser können beziehen sich auf ein detailliertes Protokoll von Miersch Et Al. berichtet 27

Theoretisch können Phagen angezeigt synthetische Antikörperbibliotheken mit maßgeschneiderten Vielfalt, Ziel jedes Antigen und damit breite Anwendungen verwendet werden. Derzeit Unternehmen wie Cambridge Antikörper-Technologie (CAT), MedImmune, Genentech, Dyax, Bioinvent, Pfizer und MorphoSys auf Phagen-Display-Plattformen für therapeutische Antikörper Entwicklung28angewiesen. Darüber hinaus sind viele Phagen-Display Core Technologie-Patente29abgelaufen. Ohne Zweifel wird dies das maximale Potential der Phagen angezeigt Antikörpertechnologie entfesseln.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren schätzen Dr. Frederic Fellouse aus dem Sidhu Labor für kritische Anmerkungen auf Kunkels beruhende Methode synthetische Fab Phagen Bibliotheksbau. Die Autoren schätzen Frau Alevtina Pavlenco und weiteren Mitgliedern aus dem Sidhu Labor für wertvolle Hilfe von Hochleistungs-Elektro-kompetente Vorbereitung E. Coli Zellen und hochwertige dU-SsDNA. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Natural Science Foundation of China (Grant No.: 81572698, 31771006), DW und der ShanghaiTech Universität (Grant No.: F-0301-13-005) Labor der Antikörper Technik.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1.0 M H3PO4 Fisher AC29570
1.0 M Tris, pH 8.0 Invitrogen 15568-025
10 mM ATP Invitrogen 18330-019
100 mM dithiothreitol Fisher BP172
100 mM dNTP mix GE Healthcare 28-4065-60 solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-76-02
50X TAE Invitrogen 24710030
Agarose Fisher BP160
Carbenicillin, carb Sigma C1389 100 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL.
Chloramphenicol, cmp Sigma C0378 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9620G
Granulated agar VWR J637-500G
H2O2 peroxidase substrate Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-65-02
K2HPO4 Sigma 795488
Kanamycin, kan Fisher AC61129 50 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL.
KH2PO4 Sigma P2222
Na2HPO4 Sigma 94046
NaCl Alfa Aesar U19C015
Nanodrop Fisher ND2000C
NaOH Fisher SS256 ! CAUTION NaOH causes burns.
NON-Fat Powdered Milk Sangon Biotech A600669
PEG-8000 Fisher BP233
Protein A-HRP conjugate Invitrogen 101123
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 22704
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Recombinant Protein L Fisher 77679
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203S
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T7 DNA polymerase New England Biolabs M0274S
Tetracycline, tet Sigma T7660 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
Tryptone Fisher 0123-07-5
Tween-20 Sigma P2287
Ultrapure glycerol Invitrogen 15514-011
Uridine Sigma U3750 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL.
Yeast extract VWR DF0127-08
Name Company Catalog Number Comments
Strains
E.coli CJ236 New England Biolabs E4141 Genotype: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA.
E.coli SS320 Lucigen 60512 Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.
M13KO7 New England Biolabs N0315S
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2-cm gap electroporation cuvette BTX
96-well 2mL Deep-well plates Fisher 278743
96-well Maxisorp immunoplates Nunc 151759
Baffled flasks Corning
Benchtop centrifuge Eppendorf 5811000096
Centrifuge bottles Nalgene
ECM-630 electroporator BTX
Magnetic stir bars Nalgene
Thermo Fisher centrifuge Fisher
High speed shaker TAITEK MBR-034P
Microplate shaker QILINBEIER QB-9002
Liquid handler for 96 and 384 wells RAININ
Mutil-channel pipette RAININ E4XLS
Amicon concentrator Merck UFC803096

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References

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Bau von synthetischen Phagen Fab Bibliothek mit maßgeschneiderten Vielfalt angezeigt
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Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).More

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).

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