Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

בניית Phage סינתטי מוצגת ספריית Fab עם גיוון המותאמים

doi: 10.3791/57357 Published: May 1, 2018
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר הליך מפורט להקמת ספרייה המוצג phage נוגדן סינתטי עם גיוון מחויטת. נוגדנים סינתטי יש יישומים רבים של מחקר בסיסי אבחון המחלה, הרפוי.

Abstract

הביקוש נוגדנים חד-שבטיים (mAbs) מחקר בסיסי ורפואה הולך וגדל מדי שנה. ליפידים הטכנולוגיה כבר השיטה הדומיננטית לפיתוח mAb מאז את הדו ח הראשון שלה בשנת 1975. כמו טכנולוגיה חלופית, שיטות תצוגה phage לפיתוח mAb הן יותר ויותר אטרקטיבי מאז Humira, הנוגדן הראשון נגזר phage ואחד mAbs הנמכר, אושרה לטיפול קליני של דלקת מפרקים שגרונית בשנת 2002. חיה-שאינו מבוסס טכנולוגיית פיתוח mAb, התצוגה phage עוקף אנטיגן immunogenicity, האנשה ותחזוקה בעלי חיים הדרושים של ליפידים מסורתי המבוסס על טכנולוגיית פיתוח נוגדן. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לבנייה של ספריות Fab המוצג phage סינתטי עם הבדלים של 109-1010 השגה עם אלקטרופורציה יחיד. פרוטוקול זה מורכב: 1) הכנה תא אלקטרו-המוסמכת יעילות גבוהה; 2) הפקת המכילות אורציל דנ א חד גדילי (דו-ssDNA); 3) השיטה של Kunkel המבוסס על oligonucleotide מכוון מוטגנזה מכוונת; 4) אלקטרופורציה, חישוב של גודל הספרייה; 5) חלבון מבוססת על A/L מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) לקיפול והערכה פונקציונלי; ו- 6) ניתוח רצף הדנ א של גיוון.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

mAbs יש שימושים רחב החל מחקר בסיסי אבחון המחלה, הרפוי. נכון לשנת 2016, mAbs יותר מ- 60 אושרו על ידי ארצות הברית המזון סמים המינהל (USFDA) לטיפול קלינית של מחלות אוטואימוניות, סרטן, מחלות זיהומיות1,2.

בשנת 1975, קולר, מילשטיין דיווח טכניקה לדור רציפה של נוגדנים היחודיות המשובטים יחיד ממקור הסלולר המכונה 'hybridomas', טכניקה זו לאחר מכן הפכה לאבן פינה ברפואה ובתעשייה3 ,4. דור של mAbs בשיטה זו דורש צעדים שונים כולל ייצור אנטיגן, חיסון עכבר, מיצוי של B לימפוציטים, פיוז'ן של תאי B עם תאי מיאלומה כדי ליצור תאים ליפידים בן אלמוות, שיבוט בחירה, ליישומים טיפוליים, האנשה נדרש להימנע אנטי-העכבר אנושית נוגדנים (חמה)4,5. עם זאת, לטכנולוגיה הזו, אנטיגנים כולל רעלנים, פתוגנים של חלבונים גבוהה שנשמרת אינם יעילים יחסית מפעילה ויוו תגובה חיסונית mAb הפקה5.

בשנת 1978, האצ'יסון. et al. דיווח על השימוש oligonucleotide ישירה מוטגנזה מכוונת של משקע וירוס חד גדילי bacteriophage6. בשנת 1985, סמית דיווחו שברי גנים זרים יכולים להיות התמזגו במסגרת עם הגן קידוד phage המעיל החלבון השלישי ובכך ניתן להציג על פני phage מבלי להתפשר על שלה infectivity7. אלה חלוצי עבודות הניח בסיס לבנייה עוקבות של נוגדן המוצג phage בספריות תמים החיסון, וטפסים סינתטיים עם התבניות של המקטע משתנה יחיד-שרשרת (scFv) וגם אנטיגן מחייב פרגמנט (Fab) עבור טיפולית mAb פיתוח8,9. מ מנקודת מבט טכנית, פיתוח נוגדן מבוסס התצוגה phage מציעה גישה המשלימה לפיתוח מבוסס-ליפידים mAb שיכול לעזור לעקוף את המגבלות שאנטיגנים מסוימים יכול להוות, האנשה לעבד את זה ליפידים-derived נוגדנים לעיתים קרובות דורשים5. החל 2016, mAbs, נגזר תצוגה ל- 6 phage אושרו במשק לרבות Humira, לאחד mAbs המצליח ביותר משמש לטיפול בדלקת מפרקים שגרונית, מועמדים רבים של נוגדן נגזר התצוגה phage הינם כרגע בשלבים שונים של ניסויים קליניים החקירה10.

לספריות החיסון ותמימה phage נוגדן, המגוון של משלימים את החסר-קביעת אזורים (Cdr) בשרשרת קל וכבד נגזר מן הרפרטואר החיסון הטבעי (כלומר, מתאי B). לעומת זאת, המגוון של Cdr בספריות נוגדן phage סינתטית היא מלאכותית לחלוטין. גישות סינתטי בניית הספרייה לספק שליטה מדויקת על העיצוב של רצף גיוון להציע הזדמנויות ללימודים מכניסטית של נוגדן מבנה, לתפקד11,12. יתר על כן, ניתן למטב את המסגרת עבור ספריות סינתטי לפני הבנייה הספריה כדי להקל על במורד הזרם, בפיתוח תעשייתי רחב היקף11,12.

בשנת 1985, Kunkel דיווח בגישה מוטגנזה מכוונת המבוססים על תבנית חד גדילי הדנ א (ssDNA) כדי להציג את האתר מכוון מוטציות לתוך M13 bacteriophage ביעילות13. גישה זו היה שימוש נרחב לאחר מכן להקמת ספריות phage המוצג. Oligonucleotides DNA מסונתז כימית שנועד להציג את המגוון לתוך Fab Cdr משולבים של phagemid עם תבנית עמוד השדרה של נוגדן. בתהליך זה, phagemid מבוטאת ssDNA המכילים אורציל (דו-ssDNA), oligonucleotides הם annealed אל Cdr והרחבה לסנתז DNA גדילי כפול (dsDNA) בנוכחות T7 DNA פולימראז ו T4 DNA ליגאז. לבסוף, ds-DNA שנוצר יכול להיות מוחדרים Escherichia coli מאת אלקטרופורציה.

גיוון גבוהה, ספריית המוצג phage הבנייה, מתח גבוה אלקטרופורציה תערובת שני תאים אלקטרו-מוסמך, covalently dsDNA עגול סגור (CCC-dsDNA) צריך להיות מוכן בקפידה. . Sidhu et al. ששינה את הכנת תאים אלקטרו-המוסמכת ודנ א שיטות מסורתיות, ספריה משופרת באופן משמעותי גיוון14.

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לבנייה של ספריות Fab המוצג phage סינתטי עם הבדלים של 109-1010 השגה עם אלקטרופורציה יחיד. איור 1 מציג סקירה של ספריית הבנייה כולל: 1) הכנה תא אלקטרו-המוסמכת יעילות גבוהה; 2) הפקת דו-ssDNA; 3) השיטה של Kunkel המבוסס על oligonucleotide מכוון מוטגנזה מכוונת; 4) אלקטרופורציה, חישוב של גודל הספרייה; 5) חלבון A/L-מבוסס אליסה לקיפול והערכה פונקציונלי; ו- 6) ניתוח רצף הדנ א של גיוון. כל ריאגנטים, זנים, ציוד מפורטים בטבלה של החומר. טבלה 1 מציגה את הכיוונון מגיב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הערה: מסנן סטרילי טיפים יש להשתמש בכל רחבי בהתמודדות עם phage כדי למנוע הדבקות פיפטה האקדח וסביבתה. באזור aseptic או הוד חייב לשמש בעת טיפול עם חיידקים, phage ניסויים. אזור ניסוי phage יש לנקות באמצעות 2% dodecyl סולפט נתרן (מרחביות) ואחריו אתנול 70% כדי למנוע זיהום phage. עבור ביצוע דילולים טורי פרוטוקול זה, עצות חדשות אמור לשמש לכל דילול.

1. e. Coli SS320 תא אלקטרו-המוסמכת הכנה

  1. חם מראש צלחת אגר ליברות/ט (מוכן ומאוחסן ב 4 ° C עבור פחות מ- 1 - בן שבועיים)-37 מעלות צלזיוס חממה עבור ה 1 להשתמש לולאה חיסון סטרילי או עצה סטרילי כדי פס החוצה מניה גליצרול של e. coli SS320 כדוריות על צלחת אגר ליברות/ט מראש ומחוממת direc זיג-זג tion בעדינות לאורך פני השטח של הצלחת. דגירה לצלחת-חממה 37 ° C בלילה עבור בסביבות 12-15 h.
  2. למחרת, השתמש לולאה חיסון סטרילי או עצה סטרילי כדי לאסוף מושבה בודדת מופרדים היטב לאורך הקו זיג-זג ואת לחסן לתוך 10 מ"ל של מדיום 2YT/ט בצינור תחתית עגולה 50-mL חיטט הלולאה המדיום, זע בקצרה.
  3. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות ב rpm 200 עבור בסביבות 3-4 h עד OD600 הוא הגיע ב בסביבות 0.4-0.8 (יומן שלב הצמיחה). צג OD600 ב- 2 h. במהלך תקופה זו, לחמם 5 פלטות אגר ליברות/ט (מוכן ומאוחסן ב 4 ° C עבור פחות מ- 1 - בן שבועיים) בחממה 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה.
  4. להוסיף 20 μL M13KO7 עוזר phage במלאי המעבדה עם כייל נוגדנים בסביבות 1 x 1013 המושבה ויוצרים יחידה (cfu) /mL לתוך μL 180 עקר 1 X PBS בלוק 1.5-mL צינורות להכין 10 דילולים טורי ten-fold.
  5. Aliquot 4 mL 2YT בלוק, נוזלי אגר העליונה לתוך 5 X 14 מ ל סביב צינורות התחתון, תווית כל שפופרת עם דילול אחת החל מהמאה החמישית עד התשיעי של דילול ten-fold, בהתאמה, דגירה ב חממה 65 ° C כדי לשמר את 2YT אגר העליון במצב נוזלי.
  6. 500 מיקס μL קטע יומן e. coli SS320 תאים לתוך הצינור דילול M13KO7 (לבחור החמישי דילול ten-fold כדי התשיעית דילול ten-fold) דגירה ב חממה 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
  7. במהלך שלב 1.6, להעביר 2YT העליון אגר מ שלב 1.5 לטמפרטורת החדר (RT) כדי להתקרר למשך בערך 5 דקות כדי כ 42 מעלות צלזיוס. השתמש היד הפנימית כדי לבדוק את הטמפרטורה של אגר העליון 2YT; זה צריך להישאר כמו נוזל. העברה כל דילול תערובת מהשלב 1.5 כל שפופרת אגר העליון 2YT המתאימים. להדק את המכסה של כל שפופרת ומערבבים על ידי מתהפך מספר פעמים בעדינות, בקצרה כדי למנוע בועה הדור.
  8. בזהירות שופכים את כל התערובת לאורך הקצה של צלחת אגר ליברות/ט חמה מראש (מתוך שלב 1.3), הטה את הצלחת מעט כדי לחלוטין ובצורה שווה למלא את הצלחת עם התערובת תוך הימנעות המבוא של בועות. שמור את הצלחות ב- RT בסביבות 5-10 דקות כדי לחזק את אגר העליון בתוך כל צלחת, דגירה הלוחות המובילים אגר 2YT ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה עבור בסביבות 15-18 h.
  9. בחר את הצלחת דילול לאחר צמיחה לילה מ שלב 1.8 עם סביב 100-200 שלטי בינוניות, יחיד, מופרדים היטב עבור חיסון פלאק. להשתמש ביד אחת כדי להחזיק את הצלחת אגר נגד מקור אור, ואת היד השנייה לאחוז בנשק פיפטה נטען עם טיפ פיפטה זמן סטרילי אנכית לדקור לתוך אגר העליון, ולאסוף את שלט יחיד, מופרדים היטב.
    1. שיפוע-הטיפ פיפטה מעט כדי להפריד בין אגר העליון עם שלט. פיפטה לאורך מספר פעמים להוציא את אגר עם רובד לתוך צינור תרבות התחתון עגול 14-mL טעון מראש עם 1 מ ל 2YT/קאן/ט בינוני (ראה טבלה 1).
    2. חזור על הליך זה כדי בוחר הפלאק 3-5 סה. מטרת בוחר הפלאק מספר נועד להבטיח חיסון מוצלחת, כמו שלט יכול להיות חלש ועייף קטן יחסית בהשוואה מושבת חיידקים. לגדול הפלאק עבור 8 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד.
  10. העברת שפופרת של תרבות. גודלים 50 מ של 2YT/קאן/ט בינוני בבקבוקון במבוכה 250 מל. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד בן לילה עבור בסביבות 12 שעות.
  11. לחסן שלושה 2-L במבוכה מבחנות המכילות 900 מל superbroth/ט/קאן בינוני לכל 5 מ של התרבות לילה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד במשך 6-7 h כדי OD600 סביב 0.6-0.8.
  12. מקררים שלוש המבחנות התרבות חיידקי באמבט קרח במשך חמש דקות עם עדינה מתמדת מתערבל בעבודת יד. השלבים הבאים צריך להיעשות בחדר קר, על קרח, עם פתרונות prechilled וציוד.
  13. השתמש ספיגת רקמת מגבת לייבוש הזכוכית החיצונית של כל הבקבוק; השתמש יד אחת כדי להטות את הבקבוק צנטריפוגה בלוק 1-L על הספסל ואת היד השנייה לשפוך האמצעי בעדינות את הבקבוק כל לתוך כל בקבוק צנטריפוגה.
  14. ספין ב 5000 g × ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות הצניפה החיידק.
  15. בעקבות צנטריפוגה, decant בעדינות את תגובת שיקוע לתוך גביע פסולת בלוק 5-L.
  16. למלא כל בקבוק עם 100 מ של סטרילי-מסוננים 1.0 מ מ HEPES, pH 7.4, ולהוסיף בר בלוק מערבבים מגנטי כל בקבוק כדי לסייע resuspension צנפה-200 סל ד. מערבולת ועוקרות בגדר כולו מהקיר בקבוק בכל מספר דקות במהלך בחישה מגנטית. ברגע בגדר התפרקה, למלא כל בקבוק 400 מיליליטר סטרילי-מסוננים 1.0 מ מ HEPES, pH 7.4 נוספים.
  17. צנטריפוגה ב 5000 g × ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות Decant תגובת שיקוע, שמירה על הבר מערבבים בבקבוק.
  18. חזור על שלבים 1.16 כדי 1.17 פעם אחת.
  19. Resuspend כל גלולה ב 500 מ"ל של 10% סטרילי-מסוננים, הנדסה גנטית גליצרול בעזרת פסי מערבבים. מערבולת ועוקרות בגדר כולו מהקיר בקבוק בכל מספר דקות במהלך בחישה מגנטית.
  20. צנטריפוגה, decant כמו שלב 1.17. חזור על שלב 1.19 פעם אחת. להשתמש מלקחיים בלוק ארוך מסעדים כדי להסיר הבר מערבבים.
  21. צנטריפוגה-5000 × g ו 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות Decant תגובת שיקוע ולהסיר עקבות הנותרים של תגובת שיקוע כל בקבוק צנטריפוגה עם פיפטה.
  22. להוסיף מ 3.0 ל 10% גליצרול הנדסה גנטית בקבוק אחד, בעדינות resuspend בגדר על-ידי pipetting. להעביר את המתלים של הבקבוק הבא וחזור עד כל של כדורי resuspended, בשילוב בבקבוק אחד. כ- 6 מ של תאים מרוכז מתקבלים עם כייל של בערך 3 x 1011 cfu/mL.
  23. מראש מקררים microcentrifuge בלוק 1.5-mL צינורות, שפופרת 96-ובכן אחת תיבת אחסון ללא חוצצים ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה לפני צעד זה. העברת הצינורות microcentrifuge מראש צוננת החדר הקרה על הקרח לפני pipetting aliquots של ההשעיה צניפה תא. השתמש פיפטה כדי aliquot μL 350 תא השעיה לתוך כל שפופרת microcentrifuge 1.5 mL.
  24. להעביר את aliquots לתוך הקצף תיבת מיכל מלא עם חנקן נוזלי עבור פלאש קפוא (3-5 דקות).
    1. להעביר את תיבת קצף עם חנקן נוזלי כדי מקפיא-80 ° C (ראה שלב 1.23).
    2. הסר את תיבת אחסון של צינור 1.5-mL microcentrifuge מהמקפיא-80 ° C (ראה שלב 1.23) ולשים על קרח.
    3. להשתמש במהירות מתכת רשת שינוי כדי ניפוי aliquots של חנקן נוזלי ומניחים אותם בתיבת אחסון שפופרת. חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
      התראה: חנקן נוזלי יכול לגרום לכוויות, חייבים להקפיד על הגנה בטיחות. השתמש phagemid של עמוד השדרה Fab כדי לבדוק את היעילות של תאים אלקטרו-המוסמכת מוכן (עמוד השדרה ללונג phagemid המניה צריך להיות במים (MilliQ) הנדסה גנטית ב 400 ng/µL). הפשרת μg 1 של phagemid עמוד השדרה Fab במים הנדסה גנטית µL 10 ו aliquot 350 μL של SS320 אלקטרו-המוסמכת על קרח, prechill cuvette אלקטרופורציה הפער 0.2 ס מ על קרח.
  25. להוסיף μL 350 תאים אלקטרו-כשיר SS320 ה-DNA 10 µL לאחר מפשיר ומערבבים על ידי pipetting מספר פעמים תוך כדי שמירה על תערובות על קרח. הימנע היכרות עם בועות.
  26. לחמם 15 מ"ל של מדיום SOC בשפופרת 50-mL באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות לפני אלקטרופורציה. להעביר את התערובת 360 μL cuvette ולבצע אלקטרופורציה ההוראות של היצרן.
  27. מיד להציל את התאים לאחר אלקטרופורציה על-ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום SOC ומחוממת מראש (מתוך שלב 1.27) pipetting. להעביר את המדיום cuvette בקבוקון 125-mL טעון מראש עם 5 מ של מספר הביטוח הלאומי מראש ומחוממת
  28. לשטוף את cuvette פעמיים, כל פעם עם 1 מ"ל של מדיום SOC מראש ומחוממת ו להעביר בינוני את הבקבוק 125 מ"ל (ראה שלב 1.27). להוסיף בינוני SOC מראש ומחוממת נפח סופי של 10 מ"ל עד הבקבוק 125-mL.
  29. דגירה התרבות התא 10-mL במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד.
  30. להפוך דילולים טורי כדי לקבוע את יעילות תרביות תאים ואת שיעור ההידבקות טרום M13KO7.
    1. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להוסיף 180 μL של התקשורת 2YT כל טוב של עמודה יחידה של צלחת 96-microwell.
    2. להפוך 8 פי עשרה טורי דילולים: להעביר 20 μL של תרבות צעד 1.29 הבאר הראשונה של הצלחת, מיקס על ידי pipetting ולאחר להעביר 20 μL של התערובת הבא. טוב. חזור על שלב זה עד הסוף של דילול טורי.
    3. צלחת 10 μL של כל דילול טורית על לוחות ליברות/פחמימות, ליברות/קאן ו LB/ט ב כפילויות.
    4. דגירה בין לילה ב 37 º C.
    5. נוסחת חישוב יעילות: בהנחה M הוא המספר הממוצע המושבה למנות את הקיפול מדולל 10N (N הוא מ- 1-8). E. coli SS320 תא אלקטרו-המוסמכת תרביות תאים יעילות phagemid עמוד השדרה Fab מ LB/פחמימות בצלחת שווה 10 מ' XN + 3 cfu/µg. שיעור הזיהום טרום M13KO7 מוערך של היחס בין המושבות ליברות/קאן ו LB/ט. האחוז של e. coli SS320 המוסמכת תאים transfected עם phagemid עמוד השדרה Fab מוערך של היחס בין מושבות ליברות/פחמימות ו LB/קאן.

2. מכינים את ssDNA המכילים אורציל (דו-ssDNA) מן התבנית Phagemid

הערה: A דיווח בעבר עמוד השדרה ללונג phagemid שימש את התבנית הכנה דו-ssDNA15. הארכיטקטורה של phagemid עמוד השדרה Fab מוצג באיור2. ערכת ספין פלסמיד (QIAprep ספין M13) משמש עבור הפקת דו-ssDNA עם שינויים קלים.

  1. צלחת ליברות/cmp (מוכן ומאוחסן ב 4 ° C עבור פחות מ- 1 - בן שבועיים) בחממה 37 ° C עבור ה 1 פס החוצה מלאי גליצרול של e. coli CJ236 תאים (או עוד מאמץ dut−/ung−) לחמם עם לולאות סטרילי או טיפים לצלחת ליברות/cmp ומחוממת מראש. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה עבור בסביבות 12-15 h.
  2. לבחור מושבה בודדת עם טיפ סטרילי, לחסן לתוך 2 מ של 2YT/cmp במדיום צינור עגול-התחתון 14-mL פוליפרופילן.
  3. דגירה המדיום ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות ב rpm 200 עבור 3-4 h עד OD600 הוא הגיע ב בסביבות 0.4-0.8 (יומן שלב הצמיחה).
  4. להוסיף 5-10 phage μL של עמוד השדרה Fab תבנית לתוך התרבות, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל"ד למשך 30 דקות לאפשר phage זיהום.
  5. לאחר דגירה, השתמש טיפ סטרילי פס החוצה 10 μL של תרבות לצלחת ליברות/פחמימות ומחוממת מראש ב- 37 מעלות צלזיוס. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה עבור בסביבות 12-15 h.
  6. לבחור מושבה בודדת של phagemid עמוד השדרה Fab המכיל e. coli CJ236 לחסן תרבות starter של 3 mL 2YT/פחמימות/cmp צינור עגול-התחתון פוליפרופילן 14-mL, ולגדול ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד בן לילה עבור בסביבות 12 שעות.
  7. לחסן את התרבות starter 0.3 mL לתוך 30 מ ל 2YT/פחמימות/cmp בבקבוק 250-mL במבוכה.
  8. דגירה של תרבית תאים ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות ב rpm 200 עבור 3-4 h עד OD600 הוא הגיע ב בסביבות 0.4-0.8 (יומן שלב הצמיחה).
  9. להוסיף את M13KO7 (מעבדה, מניות, כייל של 1 x 1013 cfu/mL) לתרבות של צעד 2.8 עם ריבוי של זיהום (MOI) של 10 והוא כייל הסופי של M13KO7 כ עונה 1 פרק 1010 cfu/mL.
  10. דגירה-200 סל ד ו- 37 מעלות לשעה.
  11. גלולה התרבות על ידי צנטריפוגה צינור עגול-התחתון 50-mL-5000 × g ו 25 º C למשך 20 דקות.
  12. Decant את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם 30 מ של טרי 2YT/פחמימות/קאן/uridine. להעביר את resuspension לתוך בקבוק 250-mL החדש במבוכה.
  13. דגירה-200 סל ד ו- 25 ° C עבור h 22-24.
  14. העברת התרבות משלב 2.13 לתוך צינור עגול-התחתון 50-mL, centrifuge התרבות ב g × 12,000 במשך 20 דקות כדי להפריד את phage supernatant צנפה תא החיידק. להעביר את phage supernatant לתוך צינור עגול-התחתון 50-mL ולהוסיף 1/5 הנפח הסופי של פג/NaCl פתרון, כדי לזרז את phage. מערבבים היטב, דגירה על קרח למשך 30 דקות לזרז את החלקיקים phage.
  15. צנטריפוגה ב 12,000 × g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות Decant תגובת שיקוע, צנטריפוגה-4,000 × g ו 4 ° C עבור 2 דק. תשאף את תגובת שיקוע הנותרים.
  16. Resuspend בגדר phage ב 2 מ ל 1 סטרילי-מסוננים-PBS והעברת צינורות microcentrifuge 1.5-mL. צנטריפוגה-12,000 g × עבור 5 דקות ב- microcentrifuge benchtop הסרת כל לכלוך חיידקי הנותרת, להעביר את phage supernatant צינורות microcentrifuge 1.5-mL החדש ולאחסן ב 4 º C.
  17. בדוק את היעילות התאגדות אורציל ב e. coli CJ236 באמצעות השוואה לצד השני עם SS320 e. coli .
    1. להוסיף μL 180 של מדיה 2YT כל טוב של שורה בודדת של צלחת 96-ובכן.
    2. להפוך את עשר 10-fold טורי דילולים: להעביר 20 μL של supernatant phage הבאר הראשונה של הצלחת, לערבב על ידי pipetting, להעביר μL 20 של התערובת הבא. טוב. חזור על שלב זה עד הסוף של דילול טורי.
    3. להוסיף 10 μL של phage מתוך שמונה אחרונה דילולים טורי להדביק μL 90 CJ236 e. coli ו e. coli SS320 בשלב יומן (OD600 = 0.4-0.8). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ייבוש עדין.
    4. צלחת 10 μL של דילול טורי של כל זיהום חיידקי CJ236 e. coli SS320 על הצלחות 2YT/פחמימות כפילויות.
    5. דגירה בין לילה ב 37 º C.
    6. נוסחת חישוב כייל נוגדנים: בהנחה M הוא המספר הממוצע המושבה למנות את הקיפול מדולל 10N (N הוא מ- 1-10). כייל e. coli CJ236 או e. coli SS320 שווה 10 מ' XN + 2 cfu/mL. להעריך את היעילות של התאגדות אורציל מן היחס כייל של e. coli CJ236 ו- e. coli SS320.
  18. להוסיף נפח 1/100 מערכו של המאגר משקעים phage MP לתוך phage supernatant 1.5-mL microcentrifuge צינורות והפעל upside מטה בעדינות לערבב במשך מספר פעמים. תקופת דגירה-RT לפחות 2 דק Phage חלקיקים הם זירז של המדיום תרבות, לפיכך, פתרון מעונן צריך להיות גלוי בשלב זה.
  19. החלת הדוגמה מהצעד 2.18 על עמודה ספין פלסמיד (למשל, QIAprep) צינור 1.5-mL microcentrifuge. יכולת איגוד של עמודה ספין אחד ssDNA יכולים להגיע לפחות 10 µg. צנטריפוגה-6,000 × g ו- 25 ° C ל 30 s ב- microcentrifuge benchtop. למחוק את הזרימה דרך אשר יש במבחנה microcentrifuge 1.5-mL. Phage חלקיקים להישאר כבול אל המטריקס עמודה בשלב זה.
  20. להוסיף העמודה 0.7 מ של UT-MLB phage פירוק ושל איגוד מאגר (ראה דיון), תקופת דגירה-RT לפחות 1 דקות.  צנטריפוגה ב 6,000 x g ו- 25 ° C עבור 30 s ו להשליך הזרימה דרך.
  21. להוסיף עוד מ ל 0.7 המאגר UT-MLB, תקופת דגירה-RT לפחות 1 דקות.
  22. Centrifuge ב 6,000 × g עבור ביטול ס' 30 של הזרימה דרך. בשלב זה, מופרד החלבון המעיל phage דו-ssDNA, אשר נשאר כבול אל המטריקס עמודה.
  23. הוסף 0.7 מ של שטיפת מאגר PE המכיל אתנול ההוראות של היצרן. צנטריפוגה ב g 6,000 × 30 s ו להשליך הזרימה דרך.
  24. חזור על שלב 2.23 ולאחר מכן צנטריפוגה פעם נוספת ב 6,000 × g ב-30 s כדי להסיר שאריות מאגר PE.
  25. להעביר את העמודה צינור 1.5-mL microcentrifuge ולהוסיף μL 100 • תנאי מאגר EB (10 מ מ Tris· CL, pH 8.5) למרכז של קרום עמודה.
  26. תקופת דגירה-RT של 10 min וצנטריפוגה ב 6,000 × g עבור 1 דקות עד elute דו-ssDNA. כ, ניתן לקבל 1.5-2.5 μg דו-ssDNA/mL תרבות.
  27. ניתוח הדנ א eluted על ידי electrophoresing 1 μL על agarose 1% ג'ל טה. ה-DNA אמור להופיע עם הלהקה בעיקר יחיד עם לא מורחת.
  28. לקבוע את ריכוז הדנ א על ידי מדידת ספיגת על ספקטרופוטומטרים nanodrop-260 ננומטר (260 = 1.0 33 ng/μL של ssDNA). ריכוזי dU טיפוסי-ssDNA נמצאים במרחק 200-500 ng/μL.

3. השיטה של Kunkel המבוסס על Oligonucleotide מכוון מוטגנזה מכוונת

הערות: רצוי לערוך תגובות בקנה מידה קטן לפני קנה מידה מלא תגובות כדי להבטיח את איכות המרכיבים מוטגניות oligonucleotide ותגובה. קריקטורה של השיטה של Kunkel המבוסס על oligonucleotide מכוון מוטגנזה מכוונת מוצג באיור3. הבדלים חומצת אמינו שונות הם הציגו לתוך אזורים CDRH1, CDRH2, CDRH3 ו- CDRL3 עם IMGT מספור במינוח16 (טבלה 2). חומצת אמינו תיאורטי מגוון CDR כל המגוון הכולל חומצת אמינו תיאורטי, רצפים oligonucleotide מפורטים בטבלה 2.

  1. זרחון oligonucleotide עם T4 polynucleotide קינאז
    1. לשלב 0.6 μg של oligonucleotides מוטגן, שתוכנן להפוך למוטציות CDR יחיד, עם 2 μL 10 X מאגר TM, 2 μL 10 מ מ ATP ו 1 μL 100 מ מ DTT. להוסיף הנדסה גנטית H2O הנפח הכולל של μL 18 צינור 1.5-mL. להקמת ספריה, תגובות מקביל ונפרד זירחון 4 מוגדרים המתאים CDRH1, CDRH2, CDRH3 ו- CDRL3, בהתאמה.
    2. הוסף 20 U (2 uL) של T4 קינאז polynucleotide לכל צינור, תקופת דגירה של h 1 ° 37 C (תגובה 1 בטבלה3). השתמש באופן מיידי עבור חישול.
  2. חישול של oligonucleotides על תבנית
    1. כדי μg 20 של דו-ssDNA תבנית, להוסיף 25 μL מאגר X TM 10, 20 μL של כל פתרון phosphorylated oligonucleotide, ו- H הנדסה גנטית2O נפח סופי של 250 μL בשפופרת 0.5-mL. מערבבים היטב ולהעביר לתוך 0.20 mL המבחנות (50 μL כל) תגובה 2 בטבלה3. למשוואה DNA מספקים טוחנת יחס של 3:1 בין oligonucleotide לבין תבנית, בהנחה כי היחס אורך של oligonucleotide ושל התבנית הוא 1: 100.
    2. דגירה התגובה במכונת ה-PCR ב 90 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 50 º C למשך 3 דקות, ו- 20 º C למשך 5 דקות.
  3. סינתזה אנזימטי של CCC-dsDNA
    1. לתערובת oligonucleotide/תבנית 250 μL annealed, להוסיף 10 μL 10 מ מ ATP, 10 μL של 25 מ מ dNTP מיקס, μL 15 מ"מ DTT, 30 וייס T4 יחידות ה-DNA ליגאז ו 30 U T7 DNA פולימראז 3 התגובה בטבלה3.
    2. דגירה התגובה בצינור 1.5-mL ב 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    3. רוחצים את התרכז CCC-dsDNA מסונתזת את התקן 0.5-mL צנטריפוגלי מסנן עם קרום גודל הנקבוביות 30 kDa-RT.
      1. להעביר את התערובת תגובת לילה המכשיר מסנן ולהוסיף הנדסה גנטית H2O 400 µL נפח סופי. ספין-14,000 g × 10 דקות; אמצעי האחסון נמצא פחות מ- 50 μL.
      2. למחוק את הזרימה, להוסיף µL 400 של הנדסה גנטית H2O המסנן ויסתובב ב g × 14,000 למשך 10 דקות.
      3. חזור על שלב 3.3.3.2 פעם נוספת.
      4. מקם את המסנן הפוך צינור נקי microcentrifuge לשחזר את CCC-dsDNA. ספין ב 1,000 × g למשך 2 דקות; אמצעי האחסון התאושש בדרך כלל בסביבות 20-40 μL. ניתן להשתמש מיד אלקטרופורציה של e. coli התאושש קכ ק-dsDNA או קפוא ב-20 ° C לשימוש מאוחר יותר. בדרך כלל 20-40 μg CCC-DNA ניתן להשיג.
    4. Electrophorese µL 1.0 של המוצר התגובה eluted לצד התבנית דו-ssDNA לדמיין את התוצאה של התגובה.

4. אלקטרופורציה וחישוב של גודל הספרייה

  1. . תירגע מטוהרים של CCC-dsDNA (20 μg באמצעי אחסון מרבי של 50 μL) צינור 1.5-mL microcentrifuge ו cuvette אלקטרופורציה הפער 0.2 ס מ על קרח.
  2. לחמם 20 מ"ל של התקשורת SOC שפופרת צנטרפוגה חרוט פוליפרופילן 50-mL באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.
  3. להפשיר aliquot 350 μL של אלקטרו-המוסמכת e. coli SS320 על הקרח. להוסיף תאי ה-DNA ו לערבב ביסודיות על ידי pipetting מספר פעמים. הימנע היכרות עם בועות.
  4. להעביר את התערובת cuvette ולבצע אלקטרופורציה ההוראות של היצרן. לדוגמה, כאשר המערכת אלקטרופורציה BTX ECM-630 משמשת, ההגדרות הרלוונטיות הן 2.5 kV שדה כוח, התנגדות Ω 125 ו- 50 µF קיבול.
  5. מיד להציל את התאים electroporated על-ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום SOC ומחוממת מראש והעברת לתוך 17 מ של מדיום SOC בבקבוקון 125-mL. לשטוף את cuvette פעמיים עם 1 מ"ל של SOC בינונית, העברת את. הבקבוק זהה (נפח סופי הוא 20 מ ל).
  6. תקופת דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד.
  7. לקבוע את היעילות אלקטרופורציה.
    1. להוסיף μL 180 של מדיה 2YT כל טוב של עמודה יחידה של צלחת 96-microwell.
    2. להפוך 8 כוחנו טורי דילולים: להעביר 20 μL של התרבות 20-mL הבאר הראשונה של הצלחת, לערבב עם pipetting, להעביר μL 20 של התערובת הבא. טוב. חזור על שלב זה עד הסוף של דילול טורי.
    3. צלחת 10 μL של כל אחד דילולים טורי בצלחת ליברות/פחמימות ב כפילויות. צלחת 100 µL שנותרו מכל אחת דילולים טורית על גבי צלחות נפרדות ליברות/פחמימות בשביל המושבה ספירת להצליב. הצלחות האלה גם לספק יחיד שיבוטים אליסה וניתוח רצף (ראה סעיף 5).
    4. דגירה בין לילה ב 37 º C.
    5. לספור את המושבות של הכפילויות μL 10 בצלחת ליברות/פחמימות. מניחים M היא המושבה ממוצע 10 שנספר על מספרN קפל ליברות/פחמימות בצלחת (N הוא מ- 1-8). גודל הספרייה הכולל שווה 2 מ' X 10N + 3 מושבות.
  8. Aliquot התרבות מהשלב 4.6 באופן שווה לתוך שני 2-L במבוכה מבחנות, המכילים כל אחד 500 מ של 2YT/פחמימות/קאן בינוני לדור ספריית phage.
  9. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד בן לילה עבור בסביבות 16 h.
  10. להעביר את התרבות שני בקבוקים צנטריפוגה בלוק 1-L, צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 12,000 g × ב 4 º C.
  11. להעביר את תגובת שיקוע שני בקבוקים 1-L צנטריפוגה בלוק חדש ולהוסיף 1/5 הנפח הסופי של פג/NaCl פתרון, כדי לזרז את phage. דגירה על קרח למשך 30 דקות.
  12. צנטריפוגה עבור 30 min ב 12,000 × g ו- 4 מעלות צלזיוס. בזהירות decant את תגובת שיקוע, להימנע מהפרעה של בגדר phage. ספין עבור 1 דקות ב- 4,000 x g ולהסיר את תגובת שיקוע הנותרים עם פיפטה.
  13. Resuspend בגדר phage עם 20 מ של סטרילי-מסוננים מאגר X PBS 1 והעברת צינור 50-mL.
  14. גלולה העניין לא מסיסים על ידי צריך שתוציאו עבור 5 דקות ב 12,000 × g ו- 4 מעלות צלזיוס. להעביר את תגובת שיקוע צינור 50-mL.
  15. למדוד את ריכוז phage על ידי ספקטרופוטומטרים (OD268 = 1.0 עבור פתרון של 5 X 1012 phage/mL).
  16. התאם את הריכוז phage 5 X 1012 phage/מ ב- PBS X 1 עם 10% גליצרול הנדסה גנטית.
  17. Aliquot 1 מ"ל של phage פתרון למחזור microcentrifuge 1.5-mL. להשתמש את הספריות מיד גלילה רציפה או לאחסן ב- 80 ° c

5. איכות הערכה על ידי חלבון א' / L ישיר איגוד אליסה Assay, רצף

  1. נבחר באקראי 96 מושבות בודד בצלחת ליברות/פחמימות מהשלב 4.7.3 לצלחת תרבות 96-עמוק טוב המכיל μL 800 של 2YT/פחמימות כל היטב. תקופת דגירה של 3-4 h ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-1,000 סל ד כדי OD600 = 0.4-0.8.
  2. להוסיף 100 μL של M13KO7 (עונה 1 פרק 1011 cfu/mL) כדי כל טוב של 96-עמוק טוב תרבות צלחת עם פיפטה רב-ערוצי. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-1,000 סל ד לשעה.
  3. להוסיף 100 μL של 2YT המכיל X 10, ריכוז kanamycin (500 μg/mL) על כל טוב עם פיפטה רב-ערוצי. דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-1000 סל ד.
  4. להמיס חלבון L כדי µg/mL 1 ב- 1 X PBS. המעיל 3/4 מן הבארות בצלחת פוליסטירן מחייב חלבון גבוהה 384-טוב עם µL 30/טוב של הפתרון חלבון L. דגירה בין לילה ב 4 º C.
  5. לבטל את הפתרון ציפוי חלבון L לילה מהשלב 5.4. להוסיף 50 µL של M-PBST (הפתרון חסימה) על כל הבארות בצלחת פוליסטירן מחייב חלבון גבוהה 384-ובכן עם פיפטה רב-ערוצי. דגירה הלוחות על מטרף microplate עבור h 1-RT.
  6. ספין למטה התרבות לילה מ שלב 5.3 בצלחת עמוקה 96-ובכן תרבות ב x 3000 g 10 דקות ב 4 º C. Phage נמצא תגובת שיקוע.
  7. לבטל את הפתרון חסימה מהשלב 5.5. להוסיף 3 הבארות L מצופה חלבון בשלושה עותקים, וכן 1 שאינם מצופים היטב כמו שליטה שלילי בעזרת פיפטה רב-ערוצי μL 15 של M-PBST וμl 15 של כל phage supernatant (שלב 5.6). תקופת דגירה-RT של 1 h ברעידות-200 סל ד.
  8. לבטל את הפתרון phage. לשטוף את הצלחת 6 פעמים עם 80 μL של PBST על ידי דסקית צלחת אוטומטיות.
  9. הוסף μL 15 של M-PBST, 15 μL של חלבון A-HRP (1:1, 500 מדולל ב- 1 X PBS) כל טוב עם פיפטה רב-ערוצי ולאחר תקופת דגירה-RT של 1 h ברעידות-כ 200 סל"ד.
  10. לבטל את הפתרון חלבון A-HRP/M-PBST. לשטוף את הצלחת 6 פעמים עם 80 μL של PBST.
  11. הוסף שוייץ המצע (30 μL טוב) עם פיפטה רב-ערוצי ולאחר תקופת דגירה של 2-3 דקות עד הצבע מפתחת. לעצור את התגובה עם 1.0 M H3פו4 (30 μL טוב).
  12. לקרוא את הצלחות spectrophotometrically-450 ננומטר. שיבוטים חיוביים מוגדרים אלה שהפגינו יחס הממוצע של ספיגת450 יתר של חלבון L בארות M-PBST טוב גדול מ- 3.0.
  13. ב 96-עמוק, להדביק 50 μL של SS320 2YT/ט בשלב יומן עם 5 μL של phage באותו המשמש את אליסה (שלב 5.6) במשך 30 דקות ב- RT.
  14. להוסיף μL 950 של 2YT/פחמימות תוך 96-ובכן משלב 5.13, דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-1000 סל ד.
  15. לחלץ את phagemid ה-DNA על-ידי ערכת חילוץ DNA הכנה המצומצמת. להשתמש את primers נגד הזרם של VL (5'-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3') ו- VH (5'-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3') לניתוח רצף להעריך את הגיוון רצף של הספרייה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בעקבות את תרשים זרימה הקמת ספריה ללונג (ראה איור 1), הכנו המסייע M13KO7 תאים אלקטרו-המוסמכת של e. coli SS320 phage מראש נגוע. היעילות של תאים אלקטרו-המוסמכת אלה מוערך כמו 2 X 109 cfu/µg כאשר עמוד השדרה Fab phagemid לבנייה הספרייה שימשה (איור 4).

אורציל התאגדות יעילות על ידי השוואה של כייל נוגדנים בתאים CJ236 e. coli ו- e. coli SS320 נבדקה. התאים CJ236 e. coli ו- e. coli SS320 נדבקו phage מחסה דו-ssDNA. E. coli SS320 יש אנזימים (glycosylase dUTPase, אורציל) יכול לבזות אורציל המכילה DNA, בעוד e. coli CJ236 חסר אנזימים אלה לא יכול לבזות DNA המכיל אורציל. כדי להשיג יעילות התאגדות קביל אורציל, titers מ- e. coli CJ236 צריך להיות לפחות 104 פעמים גבוה יותר מאשר אלה של e. coli SS320. אחרת האוכלוסייה פראי-סוג יגדל בספריה נוגדן בנוי עקב התאגדות אורציל לא יעיל. איור 5 הראה כי כייל של e. coli CJ236 הוא גבוה מזה של e. coli SS320, כ- 3 X 105 פעמים המציין ההתאגדות אורציל יעיל לתוך phage ssDNA.

בשלב הבא, אנו מוכנים, מופק דו-ssDNA. טוהר דו-ssDNA נבדקת על ידי אלקטרופורזה בג'ל agarose (איור 6). מוטגנזה מכוונת oligonucleotide מכוון נערך ואז היעילות של ההמרה דו-ssDNA ל- CCC-DNA הוערך (איור 6). שלושה מוצרים עם תנועתיות נמוכה מ- dU-ssDNA, ניתן לאבחן על הג'ל כולל הלהקה ריצה המהירה (CCC-dsDNA), הלהקה חלש האמצעי (פס עצור) שהלהקה האיטיים לרוץ (שנעקרו גדיל DNA).

לאחר אלקטרופורציה לתוך SS320 e. coli , הוערך גודל הספרייה מהצלחת הדגירה לילה (ראה שלב 4.7.5). גודל הספרייה הממוצע היה 5 X 109 מ דילולים טורי כפולים על צלחות ליברות/פחמימות (איור 7). עם זאת, הגודל המוערך בשלב זה עשוי להכיל phage מוצג פאבס בשל נוכחותם של frameshift או קודון, או להציג misfolded פאבס. רצף ELISA שימשו להערכת תפקודי המגוון של ספריית נבנה. 96 שיבוטים שנבחרו באופן אקראי אחת נשלחו לניתוח רצף. בטבלה 4 מראה כי 90 מתוך שיבוטים שנבחרו באופן אקראי 96 יחיד היו בהצלחה רציף, ואשר מכיל 70 שיבוטים ללא codon עצירה מוקדמת (53 שיבוטים עם מוטציה CDR אחד לפחות) ו- 17 שיבוטים עם הרצף פראי-סוג של שיבוטים 20 עם מוקדמת stop codon על אזורים שונים. בתוך שיבוטים 70, מוטציה של CDRH1, CDRH2, CDRH3 CDRL3 תעריפי 50%, 57%, 53% ו- 56%, בהתאמה, בעוד קצב המוטציות עם CDR אחד לפחות הוא 76%. ב שיבוטים 20 עם מוקדמת stop codon (90%), מוקדמת stop codon נבעה בעיקר frameshift של מוטגנזה מכוונת לנוקלאוטידים, כולל 45% (CDRH1), 10% (CDRH2), 15% (CDRH3) ו- 20% (CDRL3).

כדי לזהות את התצוגה של פאבס מקופל כיאות, חלבון A / L המבוסס על אליסה הועסק כפי שהוא מוכר חלבון A וחלבון L יכול לזהות נכונה קיפול של VH מסגרת ומסגרת VL, בהתאמה17,18. מסכים עם הניתוח רצף, וזמינותו אליסה שהפקידים (איור 8) הראה כי שיבוטים 20 עם codon עצירה מוקדמת היו שליליות בזמן שיבוטים 17 עם פראי-סוג רצף חיובי כאשר היה יחס חיובי מדעית לקבוע 3.0. עבור שיבוטים 53 עם מוטציה CDR אחד לפחות, 43 שיבוטים היו חיוביות ב- ELISA בעוד 10 שיבוטים היו שליליים; אפשרות זו מציינת כי רוב השיבוטים קופלו טוב בזמן Cdr מן שיבוטים 10 יכול לקבל השפעות מזיקות על קיפול Fab. בסך הכל, שיבוטים 43 מתוך שיבוטים 90 (48%) ובכן קופלו, הכיל מוטציה CDR אחד לפחות. לפיכך, המגוון חומצת אמינו פונקציונלי של הספרייה נבנה בהתבסס על חלבון א' / אליסה L וניתוח רצף נאמדת 2.4 X 109 (קרי, 48% 5 X 109).

Figure 1
איור 1: סקירה הקמת ספריה Fab המוצג phage. המוצג phage ספריית Fab הבנייה בעקבות סדרת צעדים בסיסיים. זה כולל הכנה של תאים חיידקיים אלקטרו-המוסמכת יעילות גבוהה, מיצוי של דו-ssDNA, שיטת המבוסס על oligonucleotide מכוון מוטגנזה מכוונת של Kunkel, אלקטרופורציה חישוב phage גודל הספרייה Fab, הערכה תפקודית על ידי חלבון א' / L ELISA, ו- DNA רצף ניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: Phagemid אדריכלות להקמת ספריה Fab. התכונות הבסיסיות של עמוד השדרה phagemid מורכב מקורותיה של חד-גדילי (אורי f1) ו- DNA גדילי כפול (אורי dsDNA) שכפול, ג'ין ההתנגדות של אמפיצילין/carbenicillin (AmpR). לתצוגה Fab, תחת השליטה של האמרגן phosphatase אלקליין (PhoA), מכיל phagemid קסטה bicistronic הביטוי כונן, הפרשת: אור שרשרת (LC) המורכב אות הפרשת, VL (אזור משתנה של שרשרת אור), קלרנית (קבוע אזור של שרשרת אור), ו- C-מסוף דגל התג; שרשרת כבדה (HC) המורכב של הפרשת אות, VH (משתנה אזור של שרשרת כבדה), וכן CH1 (קבוע אזור 1 של שרשרת כבדה) התמזגו עם חלבון המעיל קטין phage p3. הרכבה של שרשרת אור, שרשרת כבדה לתוך Fab בתוך periplasm e. coli מנחה את התצוגה של Fab על פני phage. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תיאור סכמטי של השיטה של Kunkel מבוסס מוטגנזה מכוונת מכוון oligonucleotide. ב פרוטוקול זה, השתמשנו בשיטה של Kunkel להכין תבנית דו-ssDNA. Oligonucleotides CDRH1, CDRH2, CDRH3 של CDRL3 עם גיוון מעוצב הן phosphorylated, annealed לתבנית, המשמש להמרת ss-DNA CCC-dsDNA. בעקבות אלקטרופורציה לתוך e. coli SS320 כדוריות אלקטרו-המוסמכת, ה-DNA heteroduplex יתוקן הסוג הפרוע או הטופס mutant; בשל נוכחותם של אורציל ב סטרנד פראי סוג, תהליך התיקון מיטיבה את הטופס mutant, לפיכך, הטופס mutant חולש על הספרייה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: אומדן M13KO7 מראש נגוע e. coli SS320 תא אלקטרו-המוסמכת יעילות. וקטור עמוד השדרה phagemid שימש כדי לבדוק את היעילות אלקטרופורציה של התאים המוסמכת. הנוסחה לחישוב את היעילות הוא כדלקמן: בהנחה M הוא המספר הממוצע המושבה למנות את הקיפול מדולל ביותר 10N (N הוא מ- 1-8) ב כפילויות. E. coli SS320 יעילות מ LB/פחמימות בצלחת שווה 10 מ' XN + 3 cfu/µg. היעילות של תאים אלקטרו-מוסמך הוא בסביבות 2 X 109 cfu / µg. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: הערכה של אורציל השתלבות ssDNA על-ידי phage זיהום של CJ236 e. coli ו- e. coli SS320 כדוריות. מבוסס על השיטה של Kunkel, היעילות התאגדות אורציל נבדקת על ידי השוואה של כייל נוגדנים לזיהום phage בתאים CJ236 e. coli ו- e. coli SS320. הנוסחה לחישוב כייל נוגדנים היא כדלקמן: בהנחה M הוא המספר הממוצע המושבה למנות את הקיפול מדולל ביותר 10N (N הוא מ- 1-10), כייל e. coli CJ236 או SS320 e. coli הוא שווה ל- 10 מ' XN + 2 cfu/mL. היעילות של התאגדות אורציל יכול להיות מוערך מן היחס כייל של e. coli CJ236 ו- e. coli SS320. כייל ב e. coli CJ236 היה 9 X 1012 cfu/mL, ואילו כייל ב e. coli SS320 היה 3 X 107 cfu/mL.... היחס כייל של e. coli CJ236 ו- e. coli SS320 היה 3 X 105. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: המרה של דו-ssDNA ל- CCC-DNA על ידי מוטגנזה מכוונת מכוון oligonucleotide. בעקבות מוטגנזה מכוונת מכוון oligonucleotide, הוערך יעילות המרה דו-ssDNA CCC-DNA. דו-ssDNA הוסב לגמרי dsDNA. הלהקה הדומיננטי הוא CCC-dsDNA עוד יש חלק קטן dsDNA עצור, שנעקרו גדיל ה-DNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: Phage טיטור עבור חישוב של גודל הספרייה. לאחר אלקטרופורציה לתוך SS320 e. coli , הוערך גודל הספרייה של דילולים טורית על צלחות ליברות/פחמימות. הנוסחה לחישוב גודל הוא כדלקמן: מניחים M הוא המספר הממוצע המושבה למנות את הקיפול מדולל ביותר 10N מצלחת 2YT/פחמימות (N הוא מ- 1-8), גודל שווה ל- 2 מ' X 10N + 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: חלבון א' / L ישיר איגוד phage אליסה. חלבון אני יכול לזהות שמסגרת שרשרת בהיר kappa מקופלת היטב VL, חלבון יכול לזהות במסגרת שרשרת כבדה מקופלת היטב VH. איגוד של Fab עם חלבון L ו- A מציין קיפול נאותה של שרשרת כבדה והן שרשרת אור. בקצרה, חלבון L שהפקידים ופקד שלילי של M-PBST היו מצופה לצלחת, phage ללונג supernatants מן שיבוטים שונים היו מודגרות עם חלבון L ו- M-PBST, ואז לאחר השטיפה חלבון ש-a-HRP שימש כדי ללכוד phage Fab מאוגד. Phage אליסה קריאות הראה 90 שיבוטים שנבחרו באופן אקראי עם readout רצף מוצלח. קו סף המייצג השיבוט כחיובית היה מדעית מוגדרת שבה היחס בין OD450 ערך ספיגת החלבון L (ממוצע של משולש עם קו שגיאה) לעומת שליטה שלילי היה יותר מ 3.0. שלוש קבוצות מבוסס על ניתוח רצף הוצגו, המתאים מוטציה בלי stop codon באדום (53 שיבוטים), פראי סוג (WT) כחול (17 שיבוטים), וכן מוטציות עם stop codon בירוק (20 שיבוטים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ריאגנט ההתקנה רכיב כמות הערות/תיאור
2YT בינוני תמצית שמרים 10 גרם להוסיף מים הנדסה גנטית כדי לבצע את עוצמת הקול 1.0 L, להתאים את ה-pH אל 7.0, החיטוי.
טריפטון 16 גרם
NaCl 5 g
אגר העליון 2YT תמצית שמרים 10 גרם מוסיפים מים הנדסה גנטית כדי ליצור נפח ל' 1.0 ולהתאים pH אל 7.0, חום להתמוסס, החיטוי.
טריפטון 16 גרם
NaCl 5 g
אגר מגורען 7.5 גר'
2YT/פחמימות/cmp בינוני Carbenicillin Μg/מ
כלורמפניקול 10 μg/mL
2YT/פחמימות/קאן/uridine בינוני Carbenicillin Μg/מ
Kanamycin 50 μg/mL
Uridine 0.25 μg/mL
2YT/פחמימות/ט בינוני Carbenicillin Μg/מ
טטרציקלין 10 μg/mL
2YT/פחמימות בינוני Carbenicilin Μg/מ
2YT/קאן בינוני Kanamycin 50 μg/mL
2YT/קאן/ט בינוני Kanamycin 50 μg/mL
טטרציקלין 10 μg/mL
2YT/ט בינוני טטרציקלין 10 μg/mL
2YT/cmp בינוני כלורמפניקול 10 μg/mL
אגר בינוני ליברות תמצית שמרים 5 g להוסיף מים הנדסה גנטית כדי לבצע את עוצמת הקול 1.0 L, להתאים את ה-pH אל 7.0, החיטוי. LB אגר, להוסיף 20 גרם של אגר מגורען, החיטוי.
טריפטון 10 גרם
NaCl 10 גרם
צלחות ליברות/פחמימות LB אגר 1 ליטר
Carbenicillin Μg/מ
צלחות ליברות/ט LB אגר 1 ליטר
טטרציקלין 10 μg/mL
LB/cmp צלחות כלורמפניקול 10 μg/mL
LB/קאן צלחות Kanamycin 50 μg/mL
SOC בינוני תמצית שמרים 5 g להוסיף מים הנדסה גנטית כדי ליצור למעלה לאמצעי האחסון 1.0 L ולהתאים pH אל 7.0, החיטוי.
טריפטון 20 גרם
NaCl 0.5 ג'י
אשלגן כלורי 0.2 g
2.0 MgCl מ'2 5.0 mL
1.0 גלוקוז M 20 מ
Superbroth בינוני טריפטון 12 גרם להוסיף מים הנדסה גנטית עד 900 מ"ל, החיטוי, להוסיף 100 מ של בלוק 0.17 מ' ח'2PO4, 0.72 M K-2-HPO-4.
תמצית שמרים 24 g
גליצרול 5 מ
Superbroth קאן/ט בינוני Kanamycin 50 μg/mL
טטרציקלין 10 μg/mL
1 X PBS NaCl מ מ 137 להתאים את ה-pH ל 7.2, החיטוי.
אשלגן כלורי 3 מ מ
נה2HPO4 8 מ מ
2פו ח'4 1.5 מ מ
טה/agarose ג'ל מאגר טאה
Agarose 1% (w/v)
GelRed 1:10000 (וי/v)
שוייץ המצע שוייץ 50% (v/v)
H2O2 peroxidase המצע 50% (v/v)
מאגר M-PBST 1 X PBS 100 מ
Tween-20 0.05% (v/v)
אבקת חלב דל שומן 5% (v/v)
פג X 5/NaCl... פג-8000 20% (w/v) מוסיפים מים הנדסה גנטית כדי ליצור נפח 1 ליטר, תא לחץ.
NaCl 2.5 מ'
מאגר PBST 1 X PBS 1 ליטר 0.22 μm מסנן-לעקר.
Tween-20 0.05% (v/v)
10 X מאגר TM MgCl2 0.1 M להתאים את ה-pH 7.5.
טריס 0.5 מ'
1.0 מ מ HEPES, pH 7.4 1.0 M HEPES מ ל 4.0 0.22 μm מסנן-לעקר.
מים הנדסה גנטית 4.0 L
10% (v/v) גליצרול הנדסה גנטית גליצרול הנדסה גנטית 100 מ 0.22 μm מסנן-לעקר.
מים הנדסה גנטית 900 מל
מים הנדסה גנטית H20 Dnase-חופשית, נטולת Rnase, ללא Pyrogen.

טבלה 1: ריאגנט כיוונון.

Table 2
בטבלה 2: הבדלים CDR ו מוטגנזה מכוונת תחל. רצפי דנ א של האזורים CDR כדי להיות מוטציה מוצגים באדום; רצפים מעוצבים באמצעות הקוד נוקלאוטיד סיסטמטי. "X" מציין tri-נוקלאוטיד תערובת שנועדה להכיל קבוצות חומצת אמינו שונות; "n" מציין מספר שונה של אקס חמש תחל עם מספר שונה של X שימשו כדי לגוון CDRL3 או CDRH3, בהתאמה, כדי ליצור אורך משתנה של CDRL3 ושל CDRH3. המספרים שאריות מוגדרים על-ידי המינוח IMGT. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.

מוטגנזה מכוונת שיטה מבוססת של Kunkel
תגובה 1. זרחון oligonucleotide עם T4 polynucleotide קינאז
רכיב כמות סופי
oligonucleotides כגורמי מוטציה 0.6 μg
10 X מאגר TM 2 ΜL 1 X
10 מ מ ATP 2 ΜL 1 מ מ
100 מ מ DTT 1 ΜL 5 מ מ
T4 polynucleotide קינאז (U 10/μL) 2 ΜL 20 U
הנדסה גנטית H20 ΜL עד 20
התגובה הגדרה
שלב 1. 37 ° C עבור 1 h
תגובה 2. חישול של oligonucleotides על תבנית
רכיב כמות סופי
תבנית דו-ssDNA 20 μg 20 μg
10 X מאגר TM 25 ΜL 1 X
phosphorylated CDRH1 oligonucleotides 20 ΜL 0.6 μg
phosphorylated CDRH2 oligonucleotides 20 ΜL 0.6 μg
phosphorylated CDRH3 oligonucleotides 20 ΜL 0.6 μg
phosphorylated CDRL3 oligonucleotides 20 ΜL 0.6 μg
הנדסה גנטית H20 עד 250 μL
התגובה הגדרה
שלב 1. 90 º C למשך 3 דקות
שלב 2. 50 מעלות למשך 5 דקות
שלב 3. 20 ° C למשך 5 דקות
תגובה 3. סינתזה אנזימטי של CCC-dsDNA
רכיב כמות סופי
oligonucleotides annealed/תבנית תערובות 250 ΜL
10 מ מ ATP 10 ΜL 346 מיקרומטר של כל נוקלאוטיד
מיקס dNTP (25 מ מ של כל נוקלאוטיד) 10 ΜL מיקרומטר 865 של כל נוקלאוטיד
100 מ מ DTT 15 ΜL 5 מ מ
T4 DNA ליגאז 1 ΜL 30 יחידות וייס
T7 DNA פולימראז 3 ΜL 30 U
התגובה הגדרה
שלב 1. 20 ° C הלילה

טבלה 3: הליכים ורכיבים של השיטה של Kunkel המבוסס על התגובה.

קבוצה מספר שיבוט אזור אחוז
אין מוקדמת stop codon 70 מוטציה CDRH1 50% (35/70)
מוטציה CDRH2 57% (40/70)
מוטציה CDRH3 53% (37/70)
מוטציה CDRL3 56% (39/70)
מוטציה CDR אחד לפחות 76% (53/70)
מוקדמת stop codon 20 פגם CDRH1 45% (9/20)
פגם CDRH2 10% (2/20)
פגם CDRH3 15% (3/20)
פגם CDRL3 20% (4/20)
הפגם השני 10% (2/20)

טבלה 4: ניתוח רצף של CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL3 Fab מהספריה סינתטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כדי לבנות גיוון גבוהה, המוצג phage ספריות Fab, בקרת איכות נקודות ביקורת יש צורך לעקוב אחר השלבים השונים של תהליך הבנייה, לרבות את כשירות של תאים אלקטרו-מוסמך, איכות של תבנית דו-ssDNA, היעילות של CCC-dsDNA סינתזה, כייל נוגדנים לאחר אלקטרופורציה קיפול Fab, חומצת אמינו המגוון של Cdr על ידי ניתוח רצף של Fab-phage שיבוטים.

תשואה גבוהה והטוהר של דו-ssDNA חיוני עבור קצב מוטגנזה מכוונת גבוה. מניסיוננו, אינדוקציה phage 25 ° c בלילה ניתן תשואות דו-ssDNA יותר מזה של אינדוקציה phage ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. . זה מסכים עם הדו ח הקודם19... בנוגע ssDNA החילוץ, פלסמיד הראשונית ספין קיט (QIAprep) כלול ונבחרות על פירוק phage ואיגוד. מאוחר יותר, MLB הופסק עם מסיבה לא ידועה, הוחלף על ידי PB. מצאנו כי התשואה של דו-ssDNA הוא נמוך בהרבה מטיפול PB לעומת זאת מטיפול MLB. ב פרוטוקול זה, השתמשנו ריאגנט בשם UT-MLB20 כדי להחליף MLB ומצא שהתשואה של דו-ssDNA דומה לזו הערכה ראשונית ספין.

כמו CDRH3 ו- CDRL3 הם האזורים המגוונים ביותר עבור זיהוי אנטיגן21, להציג מגוון המותאמים עם קבוצה ספציפית של חומצת אמינו שילובים, יחסי, וכדי להסיר יתירות דעה קדומה או עצירה-codons לראשונה על ידי codons מפגרות כגון NNK (N, equimolar של ג / / G/T; K, equimolar של G/T), trimer codon מבוססי phosphoramidite oligonucleotides22 עם אחד בדיוק codon trimer המתאים לאחד חומצת אמינו ספציפית תוכננו עבור CDRH3 ו- CDRL3. יתר על כן, משתנה אורך oligonucleotides CDRH3, CDRL3 שימשו כדי להגביר עוד יותר הבדלים.

לאחר הסינתזה אנזימטי של CCC-dsDNA, בדרך כלל שלוש להקות הם נצפו על ידי agarose בג'ל, הלהקות צריכה להיות ברורה בלי השמצות. ביניהם, הלהקה ריצה המהירה ביותר היא CCC-dsDNA זה ניתן תשואות קצב מוטציה גבוה (בסביבות 80%) לאחר אלקטרופורציה23. שהלהקה האיטיים לרוץ נמצא דנ שנעקרו סטרנד נובע מפעילות הגלום סטרנד-תזוזה של ה-T7 DNA פולימראז ויש לו קצב (בסביבות 20%) של מוטציה נמוך23. הלהקה חלש האמצעי הוא מחוסל דנ א לאחר הארכה בשל מחסור T4 DNA ליגאז פעילות או זרחון oligonucleotide לא מספיק.

בריכה מדגם קטן רצף שימש כדי להעריך את הגיוון ספריה אך לא מדויק24. כדי להעריך במדויק את המגוון האמיתי, הדור הבא רצף (הגדרות) יכול להיות אופציה טובה בכרייה העומק גיוון של ספריית נבנה25. בפועל, בשל האתגרים הנוכחיים של המיתרים הטכנולוגיה כולל לקרוא אורך, דיוק, עלות, תפוקה גבוהה, הרצף של הספרייה Fab phage בשימוש פרוטוקול זה עם אורך בסביבות 950 bp המתפרסות על-פני CDRH1, CDRH2, CDRH3 ו- CDRL3 אינה השגה; זאת, ניתן לאמוד את scFv (כ-700 bp) ספריית גיוון בטווח של מיליונים24,25. עוד מפתח סטנדרטי כדי להעריך את המגוון של ספריית נבנה היא להשתמש בספריה ' ' פאן נגד סוגים רבים ושונים של אנטיגנים ולחישוב שיבוטים חיובי בשבי מאז ספריית גיוון קשורה ישירות עם שיעור מוצלח של אנטיגן פאנינג26. תפוקה גבוהה בחירת פלטפורמה הוא גם מתאים למטרה זו, הקוראים יכולים להפנות פרוטוקול מפורט שדווחו על-ידי. Miersch et al. 27

באופן תיאורטי, ספריות המוצג phage נוגדן סינתטי עם גיוון המותאמים ניתן לכוון כל אנטיגן, ולכן יש יישומים רבים. כיום, חברות כולל טכנולוגיה נוגדן קיימברידג ' (חתול), MedImmune, Genentech, Dyax, Bioinvent, פייזר, MorphoSys יסתמכו על פלטפורמות התצוגה phage נוגדן טיפולית פיתוח28. יתר על כן, רבים phage התצוגה core טכנולוגיה פטנטים פגו29. אין ספק, זה יהיה לשחרר את הפוטנציאל המרבי של נוגדן המוצג phage טכנולוגיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מעריך ד ר פרדריק Fellouse מן המעבדה Sidhu עבור תגובות ביקורתיות של Kunkel שיטה מבוססת phage Fab סינתטי ספריית הבנייה. המחברים מעריך את גברת משה סגל Pavlenco וחברים אחרים מן המעבדה Sidhu לעזרה יקר של הכנת יעילות גבוהה אלקטרו-המוסמכת תאים e. coli , באיכות גבוהה דו-ssDNA. עבודה זו נתמכה על ידי קרן מדעי הטבע הלאומי של סין (מענק מס: 81572698, 31771006) DW, על ידי אוניברסיטת ShanghaiTech (מענק מס: F-0301 בשידור-13-005) כדי מעבדה של נוגדן הנדסה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1.0 M H3PO4 Fisher AC29570
1.0 M Tris, pH 8.0 Invitrogen 15568-025
10 mM ATP Invitrogen 18330-019
100 mM dithiothreitol Fisher BP172
100 mM dNTP mix GE Healthcare 28-4065-60 solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-76-02
50X TAE Invitrogen 24710030
Agarose Fisher BP160
Carbenicillin, carb Sigma C1389 100 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL.
Chloramphenicol, cmp Sigma C0378 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9620G
Granulated agar VWR J637-500G
H2O2 peroxidase substrate Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-65-02
K2HPO4 Sigma 795488
Kanamycin, kan Fisher AC61129 50 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL.
KH2PO4 Sigma P2222
Na2HPO4 Sigma 94046
NaCl Alfa Aesar U19C015
Nanodrop Fisher ND2000C
NaOH Fisher SS256 ! CAUTION NaOH causes burns.
NON-Fat Powdered Milk Sangon Biotech A600669
PEG-8000 Fisher BP233
Protein A-HRP conjugate Invitrogen 101123
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 22704
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Recombinant Protein L Fisher 77679
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203S
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T7 DNA polymerase New England Biolabs M0274S
Tetracycline, tet Sigma T7660 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
Tryptone Fisher 0123-07-5
Tween-20 Sigma P2287
Ultrapure glycerol Invitrogen 15514-011
Uridine Sigma U3750 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL.
Yeast extract VWR DF0127-08
Name Company Catalog Number Comments
Strains
E.coli CJ236 New England Biolabs E4141 Genotype: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA.
E.coli SS320 Lucigen 60512 Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.
M13KO7 New England Biolabs N0315S
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2-cm gap electroporation cuvette BTX
96-well 2mL Deep-well plates Fisher 278743
96-well Maxisorp immunoplates Nunc 151759
Baffled flasks Corning
Benchtop centrifuge Eppendorf 5811000096
Centrifuge bottles Nalgene
ECM-630 electroporator BTX
Magnetic stir bars Nalgene
Thermo Fisher centrifuge Fisher
High speed shaker TAITEK MBR-034P
Microplate shaker QILINBEIER QB-9002
Liquid handler for 96 and 384 wells RAININ
Mutil-channel pipette RAININ E4XLS
Amicon concentrator Merck UFC803096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. (2017).
  2. Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9, (2), 167-181 (2017).
  3. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, (5517), 495-497 (1975).
  4. Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21, (11), 966-973 (1999).
  5. Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34, (12), 960-969 (2016).
  6. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253, (18), 6551-6560 (1978).
  7. Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228, (4705), 1315-1317 (1985).
  8. Sidhu, S. S. Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. CRC Press. (2005).
  9. Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (16), 8950-8954 (2000).
  10. Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8, (7), 1177-1194 (2016).
  11. Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2, (12), 682-688 (2006).
  12. Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
  13. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, (2), 488-492 (1985).
  14. Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
  15. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425, (4), 803-811 (2013).
  16. Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27, (1), 55-77 (2003).
  17. Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9, (8), 679-687 (2001).
  18. Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (10), 5399-5404 (2000).
  19. Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58, (1), 10-17 (2012).
  20. Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
  21. Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31, (3), 169-217 (1994).
  22. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22, (25), 5600-5607 (1994).
  23. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).
  24. Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12, (5), e0177574 (2017).
  25. Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring? Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
  26. Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81, (4), 645-670 (1979).
  27. Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492 (2015).
  28. Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16, (5), 3675-3700 (2011).
  29. Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics - the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28, (5), 538-544 (2011).
בניית Phage סינתטי מוצגת ספריית Fab עם גיוון המותאמים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).More

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter