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Immunology and Infection

Construcción de fagos sintético muestra fabulosa biblioteca con diversidad a medida

doi: 10.3791/57357 Published: May 1, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe un procedimiento detallado para la construcción de una biblioteca de fago que aparecen anticuerpos sintéticos con diversidad a medida. Anticuerpos sintéticos tienen amplias aplicaciones desde la investigación básica para diagnósticos de enfermedad y terapéutica.

Abstract

Demanda de anticuerpos monoclonales (mAbs) en investigación básica y medicina está aumentando cada año. Tecnología de hibridoma ha sido el método dominante para el desarrollo de mAb desde su primer informe en 1975. Como una tecnología alternativa, métodos de exhibición phage para mAb desarrollo son cada vez más atractivos puesto que Humira, el primer anticuerpo derivado de phage y uno de los superventas mAbs, fue aprobado para el tratamiento clínico de la artritis reumatoide en 2002. Como no animal basado en tecnología de desarrollo de mAb, exhibición phage omite la inmunogenicidad del antígeno, humanización y mantenimiento animal que se requiere del desarrollo de anticuerpos hibridomas tradicional basado en la tecnología. En este protocolo, se describe un método para la construcción de bibliotecas Fab fago muestra sintéticas con diversidades de9-10 1010 con una única electroporación. Este protocolo consta de: 1) preparación de células competentes electro alta eficiencia; 2) extracción de uracil-ADN monocatenario (ssDNA-dU); 3) el método de Kunkel basa mutagénesis dirigida por oligonucleótidos; 4) electroporación y cálculo del tamaño de la biblioteca; 5) enzima-ligado del inmunosorbente ensayo proteína basada en A/L (ELISA) para doblar y la evaluación de la diversidad funcional; y 6) análisis de la secuencia del ADN de la diversidad.

Introduction

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mAbs tienen amplias aplicaciones que van desde la investigación básica a la terapia y el diagnóstico de la enfermedad. A partir de 2016, mAbs más de 60 han sido aprobados por la administración de la droga (FDA) y alimentos de Estados Unidos para el tratamiento clínico de enfermedades autoinmunes, cáncer y enfermedades infecciosas1,2.

En 1975 Kohler y Milstein reportaron una técnica para la generación continua de anticuerpos de una especificidad clonal solo de una fuente celular denominada "Hibridomas" y esta técnica se ha convertido posteriormente en un eje fundamental en la medicina y la industria3 ,4. Generación de mAbs por este método requiere varios pasos, incluyendo la producción de antígeno, ratón vacunación, extracción de los linfocitos B, fusión de las células B con células de mieloma para formar células de hibridoma inmortal, selección de clones y para aplicaciones terapéuticas, humanización es necesaria para evitar el anticuerpo humano del anti-ratón (HAMA)4,5. Sin embargo, para esta tecnología, incluyendo toxinas, patógenos y proteínas altamente conservadas de los antígenos son relativamente ineficaces en accionar en vivo respuesta inmune para mAb producción5.

En 1978, Hutchison et al. divulgó el uso de un oligonucleótido a mutagénesis directa de un residuo en una sola hebra bacteriófago virus6. En 1985, Smith informó que fragmentos génicos extranjeros se pueden fusionar de marco con el gene que codifica la proteína de la cápsida del fago III y así pueden verse en la superficie de fagos sin comprometer su infectividad7. Estos pioneros trabajos sentaron las bases para la posterior construcción de las bibliotecas de fagos que aparecen anticuerpos en inmune, ingenuo, y forma sintética con los formatos de fragmento variable de cadena simple (scFv) y fragmento de antígeno-que ata (Fab) para terapéutica mAb desarrollo8,9. Desde el punto de vista técnico, desarrollo de anticuerpos basados en pantalla de fago ofrece un enfoque complementario al desarrollo mAb basados en hibridomas que puede ayudar a eludir las limitaciones de que algunos antígenos pueden presentar y la humanización del proceso los anticuerpos derivados de hibridoma a menudo requieren5. A partir de 2016, 6 mAbs de derivados de exhibición phage han sido aprobados en el mercado, incluyendo Humira, uno de los más exitosos mAbs utilizados para el tratamiento de la artritis reumatoide, y muchos candidatos de anticuerpos derivados de exhibición phage están en diversas etapas clínicas investigación10.

Para inmune ingenuo phage anticuerpo las bibliotecas y, la diversidad de determinantes de complementariedad (CDRs) de regiones de cadena ligera y pesada se deriva del repertorio inmune natural (es decir, de las células de B). Por el contrario, la diversidad de CDR ' s en las bibliotecas de anticuerpos sintéticos phage es totalmente artificial. Enfoques sintéticos para la construcción de la Biblioteca proporcionan un control preciso sobre el diseño de la diversidad de la secuencia y ofrecen oportunidades para el estudio de mecanismos de la estructura del anticuerpo y función11,12. Además, el marco para las bibliotecas sintético puede optimizarse antes de la construcción de la biblioteca para facilitar aguas abajo, el desarrollo industrial a gran escala11,12.

En 1985, Kunkel informó de un enfoque de mutagénesis basadas en plantillas de ADN (ssDNA) monocatenario introducir mutaciones sitio-dirigida en bacteriófago M13 eficientemente13. Este enfoque fue utilizado posteriormente para la construcción de bibliotecas de fagos que aparecen. Oligonucleótidos de DNA químicamente sintetizados diseñados para introducir diversidad en Fab CDRs se incorporan en un phagemid con una plantilla de columna vertebral del anticuerpo. En este proceso, la phagemid se expresa como una ssDNA que contiene uracilo (dU-ssDNA) y los oligonucleótidos son recocidos en la ECCD y extendidos para sintetizar ADN de doble cadena (dsDNA) en presencia de polimerasa de la DNA T7 y ligase de la DNA de T4. Finalmente, ds-DNA generado puede introducirse en Escherichia coli por la electroporación.

Para alta diversidad, construcción de biblioteca muestran en fago, electroporación de alta tensión de una mezcla de dos componentes de células electro-competentes y covalente dsDNA circular cerrada (CCC-dsDNA) debe ser preparado cuidadosamente. Sidhu et al modificar la preparación de células competentes de electro y el ADN de los métodos tradicionales y de diversidad de biblioteca mejorado en gran medida14.

En este protocolo, se describe un método para la construcción de bibliotecas Fab fago muestra sintéticas con diversidades de9-10 1010 con una única electroporación. La figura 1 muestra un resumen de la biblioteca construcción incluyendo: 1) preparación de células competentes electro alta eficiencia; 2) extracción de dU-ssDNA; 3) el método de Kunkel basa mutagénesis dirigida por oligonucleótidos; 4) electroporación y cálculo del tamaño de la biblioteca; 5) proteína A/L basado en ELISA para doblar y la evaluación de la diversidad funcional; y 6) análisis de la secuencia del ADN de la diversidad. Todos los reactivos, cepas y equipos se enumeran en la tabla de materiales. La tabla 1 muestra la configuración del reactivo.

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Protocol

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Nota: Filtro estériles consejos deben usarse a lo largo de tratándose de fago para evitar la contaminación a pistola pipeta y alrededores. Campana o área aséptica debe usarse experimentos de manejo con bacterias y fagos. Área de experimento de fago se debe limpiar usando 2% sodio dodecil sulfato (SDS) seguido de etanol al 70% para evitar la contaminación phage. Para hacer diluciones seriadas en este protocolo, puede usarse puntas nuevas para cada dilución.

1. preparación de células competentes Electro SS320 e. Coli

  1. Pre-warm placa de agar LB/tet (preparados y almacenados a 4 ° C por menos de 1 semana - viejo) en incubadora de 37 ° C por 1 h. utiliza un asa de inoculación estéril o la punta estéril a racha a un stock de glicerol de células de e. coli SS320 sobre la placa de agar LB/tet precalentada en una direc de zig-zag ción suavemente a lo largo de la superficie de la placa. Incube la placa en la incubadora de 37 ° C durante la noche para unos 12-15 h.
  2. Al día siguiente, use una punta estéril o asa de inoculación estéril para recoger una colonia solo bien separada a lo largo de la línea de zig-zag e inocular en 10 mL de medio de 2YT/tet en un tubo de fondo redondo de 50mL por inmersión el lazo en el medio y agitando brevemente.
  3. Incubar a 37 ° C con agitación a 200 rpm durante unos 3-4 h hasta OD600 a alrededor de 0.4-0.8 (registro de fase de crecimiento). Monitor OD600 en 2 h. Durante este período, precalentar 5 placas de agar LB/tet (preparados y almacenados a 4 ° C por menos de 1 semana - la vieja) en una incubadora de 37 ° C durante al menos 1 h.
  4. Añadir 20 fago de ayudante de M13KO7 μL del stock de laboratorio con título alrededor de 1 x 1013 Colonia formando unidad (UFC) /mL en 180 μL de estéril 1 X PBS en autoclave tubos de 1,5 mL para preparar 10 diluciones seriadas diez veces.
  5. Alícuota de 4 mL 2YT esterilizado y líquido agar superior en 5 X 14 mL alrededor de tubos, etiquetar cada tubo con una dilución de la quinta a la novena de la dilución diez veces, respectivamente e incubar en una incubadora de 65 ° C para mantener el agar superior 2YT en estado líquido.
  6. Mezcla 500 μL de fase logarítmica SS320 de e. coli las células en el tubo de dilución de M13KO7 (elija la quinta dilución multiplicó por diez a la novena dilución diez veces) e incubar en una incubadora de 37 ° C durante 5-10 minutos.
  7. Durante la incubación de paso 1.6, transferir 2YT agar superior de paso 1.5 a temperatura ambiente (RT) se enfríe por unos 5 min a 42 ° c aproximadamente. Muñeca interna de uso para probar la temperatura del agar superior 2YT; debe permanecer como líquido. Transferir cada mezcla de dilución de paso 1.5 a cada tubo de agar superior 2YT correspondiente. Apriete la tapa de cada tubo y mezcle girando hacia abajo varias veces suavemente y brevemente para evitar la generación de burbujas.
  8. Cuidadosamente vierta cada mezcla en el borde de una placa de agar LB/tet pre-warm (en el paso 1.3) e incline la placa ligeramente para completamente y uniformemente llena el plato con la mezcla, evitando la introducción de burbujas. Mantener las placas a temperatura ambiente por unos 5-10 min para solidificar el agar superior dentro de cada placa e incubar las placas de agar superior 2YT a 37 ° C durante la noche alrededor de 15 a 18 h.
  9. Elegir la placa de dilución después de crecimiento durante la noche de paso 1.8 con alrededor de 100-200 las placas medianas, solo, bien separadas para la inoculación de la placa. Use una mano para sostener la placa de agar contra una fuente de luz y la otra mano para sostener una pistola pipeta cargada con una pipeta estéril durante mucho tiempo a verticalmente en el agar superior y recoger una placa única y bien separada.
    1. Incline la punta ligeramente para separar el agar superior con la placa. Pipeta de arriba y abajo varias veces para desplazar el agar con la placa en un tubo de cultivo de 14 mL de fondo redondo previamente cargado con 1 mL de medio de 2YT/kan/tet (ver tabla 1).
    2. Repita este procedimiento para seleccionar 3-5 placas en total. El propósito de escoger varias placas es para inoculación exitosa, como una placa puede ser débil y relativamente pequeño en comparación con una colonia de bacterias. Crecen las placas de 8 h a 37 ° C con agitación a 200 rpm.
  10. Transferir a un tubo de cultivo cultura en 50 mL de medio de 2YT/kan/tet en un matraz de 250 mL desconcertado. Crecen a 37 ° C con agitación a 200 rpm durante la noche por alrededor de 12 h.
  11. Sembrar tres frascos desconcertados de 2 L con 900 mL de medio superbroth/tet/kan cada con 5 mL del cultivo durante la noche. Incubar a 37 ° C con agitación a 200 rpm por 6-7 h para OD600 alrededor de 0.6-0.8.
  12. Enfríe los tres frascos de cultivo bacteriano en un baño de hielo durante 5 minutos con agitación constante suave con la mano. Los pasos siguientes deben hacerse en una habitación fría, con hielo, con soluciones prechilled y equipos.
  13. Utilice una absorbancia tejido toalla para secar el vidrio exterior de cada matraz; Use una mano a través de la botella de 1 L esterilizado centrífuga de banco y la otra mano para verter el medio suavemente de cada frasco en cada botella de centrífuga.
  14. Centrifugado a 5.000 x g y 4 ° C por 10 minutos para que sedimenten las bacterias.
  15. Tras centrifugación, cuidadosamente decante el sobrenadante en un vaso esterilizado residuos de 5 L.
  16. Llenar cada frasco con 100 mL de filtrado estéril 1,0 mM HEPES, pH 7,4 y añadir una barra de agitación magnética esterilizado a cada frasco para facilitar la resuspensión del pellet en 200 rpm. Remolino y desalojar la pastilla entera de la pared de la botella cada varios minutos durante la agitación magnética. Una vez que el precipitado se disuelve, llene cada botella con un adicional 400 mL de filtrado estéril 1,0 mM HEPES, pH 7,4.
  17. Centrifugar a 5.000 x g y 4 ° C durante 10 minutos, decantar el sobrenadante, conservar la barra de agitación en la botella.
  18. Repita los pasos 1.16 a 1.17 una vez.
  19. Resuspender cada precipitado en 500 mL de filtrado estéril, 10% glicerol ultrapuro con la ayuda de las barras de agitación. Remolino y desalojar la pastilla entera de la pared de la botella cada varios minutos durante la agitación magnética.
  20. Centrifugar y decantar como en el paso 1.17. Repita el paso 1.19 una vez. Utilice pinzas esterilizadas de brazo largo para quitar la barra de agitación.
  21. Centrifugar a 5.000 x g y 4 ° C por 15 min, decantar el sobrenadante y eliminar cualquier resto del sobrenadante de cada botella de centrífuga con una pipeta.
  22. Añadir 3,0 mL de glicerol al 10% ultrapura a una botella y con cuidado Resuspender el precipitado mediante pipeteo. Transferir la suspensión a la botella siguiente y repita hasta que todos los diabolos se resuspendió y se combinan en una botella. Aproximadamente 6 mL de células altamente concentrados se obtienen con una concentración de alrededor de 3 x 1011 UFC/mL.
  23. Pre-enfriar tubos esterilizado microcentrífuga de 1,5 mL y caja de almacenamiento de un tubo de 96 pocillos sin división a-80 ° C durante al menos 1 h antes de este paso. Transferir los tubos de microcentrífuga refrigerada previamente a la cámara fría en el hielo antes de pipetear alícuotas de la suspensión de pellet de células. Utilice una pipeta para alícuota 350 μL de la suspensión celular en cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  24. Transferencia de las alícuotas en un contenedor de caja de espuma llenado de nitrógeno líquido para la congelación de flash (3-5 min).
    1. Transporte de la caja de la espuma con nitrógeno líquido a un congelador de-80 ° C (ver paso 1.23).
    2. Retire la caja de almacenaje del tubo de microcentrífuga de 1,5 mL del congelador de-80 ° C (ver paso 1.23) y puesto en el hielo.
    3. Rápidamente usar una malla metálica para tamizar las alícuotas de nitrógeno líquido y colocarlas en la caja de almacenamiento de información de tubo. Tienda a-80 ° C.
      PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido puede causar quemaduras y debe tener cuidado para proteger su seguridad. Utilice un phagemid de la columna vertebral de la Fab para comprobar la eficacia de las células electro-competente preparadas (la columna vertebral Fab phagemid debe ser en agua ultrapura (MilliQ) a 400 ng/μL). Descongelar 1 μg de la columna vertebral Fab phagemid en 10 μl de agua ultrapura y una alícuota de 350 μL de SS320 electro-competente en el hielo y prechill una cubeta de electroporación de 0.2 cm hueco en el hielo.
  25. Añadir las células de SS320 electro competente 350 μL a lo 10 μl del ADN después de descongelar y mezclar mediante pipeteo varias veces manteniendo la mezcla en hielo. Evitar la introducción de burbujas.
  26. Caliente previamente 15 mL de medio SOC en un tubo de 50mL en un baño de agua de 37 ° C por al menos 30 min antes de la electroporación. Transferir la mezcla 360 μL en la cubeta y realice electroporación siguiendo las instrucciones del fabricante.
  27. Inmediatamente rescatar las células después de la electroporación agregando 1 mL de medio SOC precalentado (del paso 1,27) y pipetear. Transferir el medio de la cubeta a un matraz de 125 mL precargada con 5 mL de precalentado SOC.
  28. Enjuagar la cubeta dos veces, cada vez con 1 mL de medio SOC precalentado y transferencia al medio en el matraz de 125mL (ver paso 1,27). Agregar a precalentado medio SOC hasta un volumen final de 10 mL en el matraz de 125mL.
  29. Incubar el cultivo celular de 10 mL por 30 min a 37 ° C con agitación a 200 rpm.
  30. Hacer diluciones seriadas para determinar la eficiencia de transfección y tasa de infección previa por M13KO7.
    1. Utilice una pipeta multicanal para añadir 180 μL de 2YT medios en cada pocillo de una sola columna de una placa de 96 pocillos.
    2. Hacer diez veces serial 8 diluciones: transferir 20 μL de la cultura de paso 1,29 para el primer pozo de la placa, mezclar mediante pipeteo y transferir 20 μL de la mezcla a otro bien. Repita este paso hasta el final de la dilución serial.
    3. Placa 10 μL de cada dilución seriada en las placas LB/carb y kan/LB LB/tet por duplicado.
    4. Incubar durante una noche a 37 ° C.
    5. Fórmula de cálculo de eficiencia: suponga que M es el número de la Colonia medio contado desde el doblez diluido 10N (N es de 1-8). La eficiencia de transfección de e. coli SS320 célula electro-competente de la columna vertebral Fab phagemid de placa de LB/carb es igual a M X 10N + 3 UFC/μg. La tasa de infección previa de M13KO7 se calcula la relación de las colonias en LB/kan y LB/TTE. Se estima que el porcentaje de células competentes de e. coli SS320 transfectadas con la columna vertebral Fab phagemid la relación de colonias en LB/carb y LB/kan.

2. preparación de ssDNA que contiene uracilo (dU-ssDNA) de la plantilla de Phagemid

Nota: Un divulgado previamente columna vertebral Fab phagemid fue utilizado como plantilla para dU-ssDNA preparación15. La arquitectura de la columna vertebral Fab phagemid se muestra en la figura 2. Un plásmido spin kit (QIAprep Spin M13) se utiliza para la extracción de dU-ssDNA con ligeras modificaciones.

  1. Caliente previamente una placa LB/cmp (preparados y almacenados a 4 ° C por menos de 1 semana - la vieja) en una incubadora de 37 ° C durante 1 h. raya a un stock de glicerol de CJ236 células de e. coli (u otra cepa de dut−/ung−) lazos estériles o puntas sobre la placa precalentada del LB/cmp. Incubar la placa a 37 ° C durante la noche alrededor 12-15 h.
  2. Escoger una colonia solo con una punta estéril y sembrar en 2 mL de medio de 2YT/cmp en un tubo de fondo redondo polipropileno de 14 mL.
  3. Incubar el medio a 37 ° C con agitación a 200 rpm durante 3-4 h hasta OD600 a alrededor de 0.4-0.8 (registro de fase de crecimiento).
  4. Añadir fago de 5-10 μL de plantilla columna vertebral Fab en la cultura e incubar a 37 ° C con agitación a 200 rpm por 30 min permitir la infección por fagos.
  5. Después de la incubación, use una punta estéril a racha a 10 μL de cultivo sobre una placa de LB/carb precalentada a 37 ° C. Incubar a 37 ° C durante la noche alrededor 12-15 h.
  6. Escoge una sola Colonia de la CJ236 de e. coli que contienen columna vertebral Fab phagemid a sembrar una cultura de arrancador de 2YT/carb/cmp de 3 mL en un tubo de fondo redondo polipropileno 14-mL y crecen a 37 ° C con agitación a 200 rpm durante la noche por alrededor de 12 h.
  7. Inocular la cultura de arrancador de 0.3 mL en 30 mL 2YT/carb/cmp en un frasco de 250 mL desconcertado.
  8. Incubar el cultivo de células a 37 ° C con agitación a 200 rpm durante 3-4 h hasta OD600 a alrededor de 0.4-0.8 (registro de fase de crecimiento).
  9. Agregar el M13KO7 (título común, laboratorio de aproximadamente 1 x 1013 UFC/mL) a la cultura de paso 2.8 con una multiplicidad de infección (MOI) de aproximadamente 10 y la concentración final de M13KO7 es aproximadamente 1 x 1010 UFC/mL.
  10. Incubar a 37 ° C durante 1 h y 200 rpm.
  11. La cultura de pellets por centrifugación en un tubo de fondo redondo de 50 mL a 5.000 x g y 25 ° C por 20 min.
  12. Decantar el sobrenadante y resuspender el precipitado con 30 mL de 2YT fresco, carb/kan, uridina. Transferir la resuspensión en una nueva botella de 250 mL desconcertada.
  13. Incubar a 200 r.p.m. y 25 º C durante 22-24 h.
  14. Transferir la cultura de paso 2.13 en un tubo de fondo redondo de 50 mL y centrifugar el cultivo a 12.000 x g por 20 min para separar los fagos sobrenadante del precipitado de células bacterianas. Transferir el sobrenadante del phage a un nuevo tubo de fondo redondo de 50 mL y añadir 1/5 del volumen final de PEG/NaCl solución para precipitar el phage. Mezclar bien e incubar en hielo durante 30 min precipitar las partículas de fago.
  15. Centrifugar a 12.000 x g y 4 ° C durante 30 minutos decantar el sobrenadante y centrifugar a 4.000 x g y 4 ° C por 2 min aspiración el sobrenadante restante.
  16. Resuspender el precipitado de fago en 2 mL de filtrado estéril de 1 X PBS y transferencia a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar a 12.000 x g durante 5 minutos en una microcentrífuga de sobremesa para quitar cualquier residuo bacteriano restantes y transferir el sobrenadante del phage a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y almacenar a 4 ° C.
  17. Comprobar la eficacia de la incorporación de uracilo en CJ236 de e. coli a través de la comparación de lado a lado con e. coli SS320.
    1. Añadir 180 μL de 2YT medios a cada pocillo de una sola fila de una placa de 96 pocillos.
    2. Hacer diez 10 veces serie diluciones: 20 μL de los fagos sobrenadante de transferencia para el primer pozo de la placa, mezclar mediante pipeteo y transferir 20 μL de la mezcla a otro bien. Repita este paso hasta el final de la dilución serial.
    3. Añadir 10 μL del fago de último ocho diluciones seriadas para infectar a 90 μL de CJ236 de e. coli y e. coli SS320 en fase logarítmica (OD600 = 0.4-0.8). Incubar a 37 ° C durante 30 min con suave agitación.
    4. Placa 10 μL de la dilución serial de cada infección en CJ236 de e. coli y e. coli SS320 en placas 2YT/Carb por duplicado.
    5. Incubar durante una noche a 37 ° C.
    6. Fórmula de cálculo del título: suponga que M es el número de la Colonia medio contado desde el doblez diluido 10N (N es de 1-10). El título de CJ236 de e. coli o e. coli SS320 es igual a M X 10N + 2 UFC/mL. Estimar la eficacia de la incorporación de uracilo la relación del título de CJ236 de e. coli y e. coli SS320.
  18. Volumen 1/100 de la solución de precipitación phage MP en el sobrenadante en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL de fago y gire hacia abajo suavemente para mezclar varias veces. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 2 min Phage se precipitan las partículas desde el medio de cultivo, y por lo tanto, una solución turbia debe ser visible en este momento.
  19. Aplicar la muestra de paso 2.18 a una columna de la vuelta del plásmido (e.g., QIAprep) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. La capacidad de unión de la columna uno vuelta para ssDNA puede alcanzar al menos 10 μg. Centrifugar a 6.000 × g y 25 ° C para 30 s en una microcentrífuga de sobremesa. Deseche el fluir-por que es en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Partículas de fago permanecen ligadas a la matriz columna en esta etapa.
  20. Añadir 0,7 mL de la UT-MLB fago lisis y tampón de unión (ver discusión) a la columna e incubar a RT para al menos 1 minuto.  Centrifugar a 6.000 x g y 25 ° C para 30 s y descartar el flujo a través.
  21. Añadir otro 0,7 mL de la solución de UT-MLB e incubar a temperatura ambiente durante al menos 1 minuto.
  22. Centrifugue a 6.000 × g durante 30 s. descarte el flujo a través. En esta etapa, la proteína de la capa de fago se separa de la dU-ssDNA, que permanece ligada a la matriz columna.
  23. Añadir 0,7 mL de lavado buffer PE que contienen etanol siguiendo las instrucciones del fabricante. Centrifugar a 6.000 g × 30 s y descartar el flujo a través.
  24. Repita el paso 2.23, luego centrifugar una vez más a 6.000 × g durante 30 s para quitar el tampón residual PE.
  25. Transfiera la columna a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL y añadir 100 μL de tampón de elución EB (10 mM Tris· CL, pH 8,5) en el centro de la membrana de la columna.
  26. Incubar a temperatura ambiente por 10 min y centrifugar a 6.000 × g durante 1 min eluir el dU-ssDNA. Aproximadamente, se puede obtener cultura de 1.5-2.5 μg ssDNA/dU/mL.
  27. Análisis de la DNA eluída por electrophoresing 1 μL en una agarosa al 1% TAE de gel. El ADN debe aparecer como una banda única predominante con no manchar.
  28. Determinar la concentración de ADN midiendo la absorbancia en un espectrofotómetro nanodrop a 260 nm (un260 = 1.0 para 33 ng/μL de ssDNA). Las concentraciones típicas dU-ssDNA son dentro de 200-500 ng/μL.

3. método del Kunkel basado en mutagénesis dirigida por oligonucleótidos

Notas: Es recomendable realizar reacciones en pequeña escala antes de reacciones de gran escala para asegurar la calidad de los componentes del oligonucleótido y reacción mutágenas. Una caricatura del método de Kunkel oligonucleótidos dirigido mutagénesis se muestra en la figura 3. Varias diversidades de aminoácido se introducen en regiones CDRH1, CDRH2, CDRH3 y CDRL3 con IMGT numeración nomenclatura16 (tabla 2). La diversidad teórica del aminoácido de cada CDR, diversidad total teórica de aminoácidos y secuencias de oligonucleótidos se enumeran en la tabla 2.

  1. Fosforilación de oligonucleótidos con kinase de T4 Polinucleótido
    1. Combinar 0,6 μg de oligonucleótidos mutagénicos, diseñado para mutar a un solo CDR, con 2 μL de 10 X buffer, 2 μL de 10 mM ATP y 1 μL 100 mM DTT, TM. Añadir ultrapura de H2O a un volumen total de 18 μL en un tubo de 1,5 mL. Para la construcción de la biblioteca, se establecen 4 reacciones de fosforilación separado y paralelo correspondientes a CDRH1, CDRH2, CDRH3 y CDRL3, respectivamente.
    2. Agregar 20 U (2 uL) de la quinasa de T4 Polinucleótido a cada tubo e incubar durante 1 h a 37 ° C (reacción 1 en la tabla 3). Uso inmediato para el recocido.
  2. Recocido de oligonucleótidos para la plantilla
    1. 20 μg de dU-ssDNA plantilla, añadir 25 μL de tampón de TM X 10, 20 μL de cada solución de oligonucleótidos fosforilada y ultrapura de H2O a un volumen final de 250 μL en un tubo de 0,5 mL. Mezclar bien y transferir a tubos de PCR de 0,20 mL (50 μL) como reacción 2 en la tabla 3. Estas cantidades de ADN proporcionan un cociente molar de 3:1 entre oligonucleótidos y plantilla, suponiendo que la relación de la longitud del oligonucleótido y plantilla es 1: 100.
    2. Incubar la reacción en una máquina PCR a 90 ° C por 3 min, 50 º C por 3 min y a 20 ° C durante 5 minutos.
  3. Síntesis enzimática de CCC-dsDNA
    1. A la mezcla de oligonucleótidos/plantilla 250 μL recocido, añadir 10 μL de 10 mM ATP, 10 μL de mezcla de dNTP de 25 mM, 15 μL de 100 mM DTT, Weiss 30 unidades T4 ADN ligasa y 30 U T7 DNA polimerasa 3 reacción en la tabla 3.
    2. Incubar la reacción en el tubo de 1,5 mL a 20 ° C durante la noche.
    3. Lavar y concentrar el CCC-dsDNA sintetizada en un dispositivo de filtro centrífugo de 0.5 mL con una membrana de tamaño de poro de 30 kDa a TA.
      1. Transferir la mezcla de reacción durante la noche en el dispositivo de filtro y añadir ultrapura de H2O a volumen final de 400 μl. Gira a 14.000 × g por 10 min; el volumen es menos de 50 μL.
      2. Deseche el flujo a través, añadir 400 μL de la poste-limpieza de H2O en el filtro y exprimir en 14.000 × g por 10 min.
      3. Repetir el punto 3.3.3.2 una vez más.
      4. Coloque el filtro hacia abajo en un tubo de microcentrífuga limpio para recuperar el CCC-dsDNA. Centrifugado a 1.000 x g durante 2 min; el volumen recuperado es generalmente alrededor 20-40 μL. El CCC-dsDNA recuperado puede ser utilizado inmediatamente para la electroporación de e. coli o congelado a-20 ° C para su uso posterior. Normalmente de 20-40 μg CCC DNA puede obtenerse.
    4. Electrophorese 1,0 μL del producto de la reacción eluídas junto a la plantilla dU-ssDNA para visualizar el resultado de la reacción.

4. electroporación y cálculo del tamaño de la biblioteca

  1. Chill el CCC-dsDNA purificada (20 μg en un volumen máximo de 50 μL) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y una cubeta de electroporación de 0.2 cm hueco en el hielo.
  2. Precalentar 20 mL de medio SOC en un tubo de centrífuga cónico polipropileno de 50mL en baño de agua de 37 ° C durante al menos 30 minutos.
  3. Descongelar una alícuota de 350 μL de electro-competentes de e. coli SS320 en hielo. Añadir las células a la ADN y la mezcla bien transfiriendo varias veces. Evitar la introducción de burbujas.
  4. Transferir la mezcla a la cubeta y realice electroporación siguiendo las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, cuando se utiliza el sistema de electroporación de BTX ECM-630, los ajustes pertinentes son 2,5 kV intensidad de campo, 125 de Ω de resistencia y capacitancia μf 50.
  5. Inmediatamente rescatar las células electroporated agregando 1 mL de medio SOC precalentado y transferir a 17 mL de medio SOC en un matraz de 125mL. Enjuagar la cubeta dos veces con 1 mL de medio SOC y transferencia al mismo matraz (volumen final es de 20 mL).
  6. Incubar durante 30 min a 37 ° C con agitación a 200 rpm.
  7. Determinar la eficacia de la electroporación.
    1. Añadir 180 μL de 2YT medios en cada pocillo de una sola columna de una placa de 96 pocillos.
    2. Hacer diez veces serial 8 diluciones: transferencia 20 μL de la cultura 20 mL para el primer pozo de la placa, mezclar con pipeteo y transferir 20 μL de la mezcla a otro bien. Repita este paso hasta el final de la dilución serial.
    3. Placa 10 μL de cada una de las diluciones seriadas en una placa LB/carb por duplicado. Placa de 100 μl restantes de cada una de las diluciones seriadas en placas LB/carb separadas para Colonia Conde verificación. Estas placas también proporcionará clones solo para el análisis de ELISA y secuencia (véase sección 5).
    4. Incubar durante una noche a 37 ° C.
    5. Contar las colonias de los duplicados μL 10 en la placa de LB/carb. Suponga que M es la media Colonia número contado en 10N doble placa LB/carb (N es de 1-8). El tamaño de la biblioteca total es igual a 2 M X 10 colonias deN + 3 .
  8. Parte alícuota de la cultura del paso 4.6 igualmente en dos L 2 frascos desconcertados, cada que contiene 500 mL de medio 2YT/carb/kan para la generación de la librería de fagos.
  9. Incubar a 37 ° C con agitación a 200 rpm durante la noche para unas 16 h.
  10. Transferencia de la cultura a dos botellas de 1 L esterilizado centrífuga y centrifugar durante 30 min a 12.000 × g a 4 ° C.
  11. Transferir el sobrenadante a dos nuevas botellas de 1 L esterilizado centrífuga y añadir 1/5 del volumen final de PEG/NaCl solución para precipitar el phage. Incubar en hielo durante 30 minutos.
  12. Centrifugar por 30 min a 12.000 × g a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y evitar disturbar de la pelotilla de fago. Vuelta durante 1 min a 4.000 x g y eliminar el sobrenadante restante con una pipeta.
  13. Resuspender el precipitado de fago con 20 mL de filtrado estéril 1 X PBS tampón y traslado a un nuevo tubo de 50 mL.
  14. La materia insoluble de pellets por centrifugación por 5 minutos a 12.000 x g a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mL.
  15. Medir la concentración de fagos por espectrofotómetro (OD268 = 1.0 para una solución de 5 X 1012 phage/mL).
  16. Ajustar la concentración de fagos a 5 X 1012 phage/mL 1 X PBS con 10% de glicerol ultrapuro.
  17. Alícuota 1 mL de solución de fago por tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Utilizar las bibliotecas inmediatamente para batea o almacenar a-80 ° C.

5. la calidad evaluación de la proteína A de L enlace ELISA análisis y secuenciación de

  1. Escoge aleatoriamente 96 solo colonias en placa de LB/carb de paso 4.7.3 en una placa de 96 profundo bien de la cultura que contiene 800 μL de 2YT/carb en cada pozo. Incubar durante 3-4 h a 37 ° C con agitación a 1.000 rpm a OD600 = 0.4-0.8.
  2. Añada 100 μL de M13KO7 (11 de 1 X 10 ufc/mL) a cada pozo de una profundidad de 96 bien la placa con una pipeta multicanal de la cultura. Incubar a 37 ° C con agitación a 1.000 rpm durante 1 hora.
  3. Añada 100 μL de 2YT con 10 X concentración de kanamicina (500 μg/mL) en cada pocillo con una pipeta multicanal. Incubar durante una noche a 37 ° C con agitación a 1.000 rpm.
  4. Disolver la proteína L a 1 μg/mL de 1 X PBS. Abrigo 3/4 de los pozos de una placa de poliestireno Unión a proteínas alta de 384 pozos con 30 μL/pocillo de la solución de la proteína L. Incubar durante una noche a 4 ° C.
  5. Deseche la solución de recubrimiento de proteína L durante la noche en el paso 5.4. Añadir 50 μl de M-SAFT (la solución al bloqueo) a todos los pocillos de la placa poliestireno de 384-bien alta Unión a proteínas con una pipeta multicanal. Incubar las placas en un agitador de microplacas durante 1 h a TA.
  6. Desactivación de la cultura una noche de paso 5.3 en una placa de cultivo de 96 pozos profundos a 3.000 x g durante 10 min a 4 ° C. El fago se encuentra en el sobrenadante.
  7. Deseche la solución de bloqueo de paso 5.5. Añadir 15 μL de M-Saft y 15 μL de cada sobrenadante de fagos (paso 5.6) a 3 de los pozos de L recubierto de proteína como triplicado y 1 sin recubrimiento así como negativa el control utilizando una pipeta multicanal. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h con agitación a 200 rpm.
  8. Deseche la solución de fago. Lave la placa 6 veces con 80 μL de SAFT por una arandela de placa automatizada.
  9. Añadir 15 μL de M-Saft y 15 μL de proteína A-HRP (1:1, 500 diluido en 1 X PBS) a cada pocillo con una pipeta multicanal e incube a temperatura ambiente durante 1 h con agitación a 200 rpm aproximadamente.
  10. Deseche la solución de la proteína A-HRP/M-SAFT. Lave la placa 6 veces con 80 μL de SAFT.
  11. Añadir Substrato TMB (30 μL/pocillo) con una pipeta multicanal e incubar durante 2-3 min hasta que el color se desarrolla. Detener la reacción con 1.0 M H3PO4 (30 μL/pocillo).
  12. Leer las placas mediante espectrofotometría a 450 nm. Clones positivos se definen como aquellos que presentan una relación promedio de la absorbancia de OD450 de pozos proteína L para el bien mayor que 3.0 M-SAFT.
  13. En una profundidad de 96, infectar 50 μL de SS320 en 2YT/tet en fase logarítmica con 5 μL de los fagos mismo utilizado para la prueba de ELISA (paso 5.6) por 30 min a TA.
  14. Agregar 950 μL de 2YT/carb en el 96-profundo bien de paso 5.13 e incubar durante una noche a 37 ° C con agitación a 1.000 rpm.
  15. Extracto de phagemid ADN por kit de extracción de ADN de mini-prep. Utilizar los iniciadores upstream de VL (5'-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3') y VH (5'-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3') para el análisis de la secuencia estimar la diversidad de la secuencia de biblioteca.

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Representative Results

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Siguiendo el diagrama de flujo de la construcción de la fabulosa biblioteca (ver figura 1), preparamos M13KO7 ayudante phage previamente infectado SS320 de e. coli células electro-competentes. La eficacia de estas células electro-competentes se estima como el 2 X 109 UFC/μg cuando se utilizó la espina dorsal de la Fab phagemid para la construcción de la biblioteca (figura 4).

La eficacia de la incorporación de uracilo en comparación de la titulación en las células CJ236 de e. coli y e. coli SS320 se comprobó. Las células CJ236 de e. coli y e. coli SS320 fueron infectadas por fagos que dU-ssDNA. E. coli SS320 tiene enzimas (dUTPase y uracil glicosilasa) que pueden degradar de uracilo que contiene ADN, mientras que CJ236 de e. coli carece de estas enzimas no pueden degradar ADN que contiene uracilo. Para lograr una eficiencia de incorporación aceptable uracilo, títulos de e. coli CJ236 deben ser al menos 104 veces más altos que los de e. coli SS320. De lo contrario la población de tipo salvaje aumentará en la biblioteca de anticuerpos construidos debido a la incorporación de uracilo ineficiente. Figura 5 demostraron que la concentración de e. coli CJ236 es aproximadamente 3 X 105 veces mayores que el de e. coli SS320, indicando una incorporación eficiente uracilo en fago ssDNA.

A continuación, preparamos y había extraído dU-ssDNA. Se comprueba la pureza de dU-ssDNA por electroforesis en gel de agarosa (figura 6). Luego se llevó a cabo la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos y se evaluó la eficacia de la conversión de dU-ssDNA a CCC-ADN (figura 6). Tres productos con menor movilidad que dU-ssDNA se pueden visualizar en el gel como la banda de correr más rápido (CCC-dsDNA), la media débil banda (Mellado) y la banda de funcionamiento más lento (desplazados de filamento de ADN).

Después de la electroporación en SS320 de e. coli , se estimó el tamaño de la biblioteca de la placa de incubación durante la noche (ver paso 4.7.5). El tamaño promedio de la biblioteca era de 5 X 109 a partir de diluciones seriadas duplicados en placas de LB/carb (figura 7). Sin embargo, el tamaño estimado en este paso puede contener fago que no mostrar fábricas debido a la presencia de un mutágeno ' frameshift ' stop codon o mostrar Fabs mal plegadas. Secuenciación y ELISA fueron utilizados para estimar la diversidad funcional de la biblioteca construida. fueron enviados 96 clones individuales escogidos al azar para el análisis de la secuencia. La tabla 4 muestra que 90 de los 96 clones individuales escogidos al azar fueron ordenados con éxito, que contiene 70 clones sin un codón de parada prematuro (53 clones con al menos un mutante de la CDR) y 17 clones con la secuencia wild type y 20 clones con un codón de parada prematuro en diferentes regiones. Dentro de los 70 clones, mutantes tasas de CDRH1, CDRH2, CDRH3 y CDRL3 son 50%, 57%, 53% y 56%, respectivamente, mientras que la tasa de mutante con al menos un CDR es 76%. En los 20 clones con un codón de parada prematuro (90%), el codón de parada prematuro se deriva principalmente del mutágeno ' frameshift ' de los primers de mutagénesis de oligonucleótidos, incluyendo 45% (CDRH1), 10% (CDRH2), 15% (CDRH3) y 20% (CDRL3).

Para detectar la pantalla del Fab correctamente doblada, una proteína A / L basado en ELISA se empleó como es sabido que la proteína A y proteína L pueden reconocer plegamiento correcto de la marco VH y VL, respectivamente17,18. De acuerdo con el análisis de la secuencia, el ensayo de ELISA por triplicado (figura 8) mostraron que los 20 clones con un codón de parada prematuro fueron todos negativos mientras que los 17 clones con una secuencia de tipo salvaje fueron todas positivos cuando la proporción de positiva fue establecer empíricamente en 3.0. Para los 53 clones con al menos un mutante de CDR, 43 clones fueron positivos en ELISA mientras 10 clones fueron negativos; Esto indica que la mayoría de los clones fueron bien doblada mientras que los CDRs de los 10 clones pueden tener efectos perjudiciales para la Fab plegable. En total, 43 clones de los 90 clones (48%) fueron bien doblados y contienen a al menos un mutante de CDR. Así, la diversidad funcional del aminoácido de la biblioteca construida basada en la proteína A / análisis ELISA L y secuencia era estimado para ser 2.4 X 109 (es decir, el 48% de 5 X 109).

Figure 1
Figura 1: Resumen de la construcción de la biblioteca Fab aparece phage. Construcción de biblioteca Fab fago muestra sigue una serie básica de pasos. Implica preparación de células bacterianas competentes electro de alta eficiencia, extracción de dU ssDNA, mutagénesis de oligonucleótidos dirigidos de método de Kunkel, electroporación y cálculo de fagos tamaño fabulosa biblioteca, evaluación funcional por proteína / L ELISA y ADN la secuencia de análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: arquitectura de Phagemid para la construcción de la fabulosa biblioteca. Las características básicas de la columna vertebral de phagemid consisten en orígenes de monocatenario (f1 ori) y ADN bicatenario (dsDNA ori) replicación y un gen de resistencia a la ampicilina/carbenicilina (AmpR). Para la fabulosa exhibición, bajo el control del promotor de la fosfatasa alcalina (PhoA), el phagemid contiene un cassette bicistronic unidad expresión y secreción de: cadena (LC) que consiste en una señal de secreción, VL (región variable de cadena ligera), CL (constante de la luz región de cadena ligera) y etiqueta C-terminal de la bandera; y la cadena pesada (HC) que consiste en una señal de secreción, VH (región variable de cadena pesada) y CH1 (1 del región constante de cadena pesada) fusionada con una proteína de menor capa phage p3. Montaje de la cadena ligera y pesada cadena en Fab en el periplasma de e. coli dirige la exhibición de la Fab en la superficie de fagos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: esquema del método de Kunkel basado en mutagénesis dirigida por oligonucleótidos. En este protocolo, se utilizó método de Kunkel para preparar la plantilla dU-ssDNA. Oligonucleótidos para CDRH1, CDRH2, CDRH3 y CDRL3 con diversidad de diseño son fosforilados, recocidos a la plantilla y utiliza para convertir ss-DNA en CCC-dsDNA. Después de la electroporación en e. coli SS320 células electro-competente, del heterodúplex ADN es reparado el tipo salvaje o la forma mutante; Debido a la presencia de uracilo en el filamento del tipo salvaje, el proceso de reparación favorece la forma mutante, y por lo tanto, la forma mutante domina la biblioteca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Estimación de la M13KO7 infectados la eficacia de la célula electro-competentes de e. coli SS320. Un vector de la columna vertebral de phagemid fue utilizado para comprobar la eficacia de la electroporación las células competentes. Fórmula para calcular la eficiencia es la siguiente: suponga que M es el número de la Colonia medio contado a partir del doblez más diluido 10N (N es de 1-8) por duplicado. E. coli SS320 eficiencia de placa LB/carb es igual a M X 10N + 3 UFC/μg. La eficacia de las células electro-competente es alrededor de 2 X 109 UFC / μg. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Evaluación de la incorporación de uracilo en ssDNA por la infección del fago de las células CJ236 de e. coli y e. coli SS320. Basado en el método de Kunkel, la eficacia de la incorporación de uracilo está marcada por la comparación del título de infección de fagos en las células CJ236 de e. coli y e. coli SS320. La fórmula de cálculo del título es como sigue: suponga que M es el número de la Colonia medio contado a partir del doblez más diluido 10N (N es del 1-10), y que el título de CJ236 de e. coli o e. coli SS320 es igual a M X 10N + 2 UFC/mL. La eficacia de la incorporación del uracil puede estimarse la relación del título de CJ236 de e. coli y e. coli SS320. El título en e. coli CJ236 era 9 X 1012 UFC/mL, mientras que el título en e. coli SS320 era 3 X 107 UFC/mL. La relación del título de CJ236 de e. coli y e. coli SS320 fue 3 X 105. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: conversión de dU-ssDNA a CCC-ADN por mutagénesis dirigida por oligonucleótidos. Tras la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, se evaluó la eficiencia de conversión de dU-ssDNA a CCC DNA. dU-ssDNA fue convertida totalmente al dsDNA. La banda dominante es CCC-dsDNA mientras que hay una porción menor de dsDNA mellada y desplazado por el filamento de la DNA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: valoración de fagos para el cálculo del tamaño de la biblioteca. Después de la electroporación en SS320 de e. coli , se estimó el tamaño de la biblioteca de diluciones seriadas en placas de LB/carb. La fórmula de cálculo de tamaño es como sigue: suponga M es el número promedio de colonias contado a partir del doblez más diluido 10N de una placa de 2YT/Carb (N es de 1-8), el tamaño es igual a 2 M X 10N + 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: la proteína A de fago enlace ELISA L. Proteína L puede reconocer que el marco de la cadena ligera kappa bien doblado VL y la proteína una puede reconocen el marco de la cadena pesada bien doblado VH. Atascamiento de la Fab con la proteína L y A indica adecuado plegamiento de cadenas pesadas y cadenas ligeras. En Resumen, proteína L en triplicado y el control negativo M-SAFT se cubrieron a la placa, sobrenadantes de fago Fab de diferentes clones se incubaron con proteína L y M-SAFT, entonces después de lavado, proteína A-HRP fue utilizado capturar encuadernado phage Fab. Lecturas de fago ELISA demostradas 90 clones al azar escogidos con la lectura de la secuencia de la exitosa. Un umbral que representa el clon como positivo fue empíricamente definido donde el cociente del valor de la absorbancia de450 del OD de la proteína L (promedio triplicado con barra de error) versus control negativo fue más de 3.0. Se mostraron tres grupos basados en el análisis de la secuencia correspondiente a un mutante sin codón de parada en rojo (53 clones), tipo salvaje (WT) en azul (17 clones) y el mutante con el codón de parada en verde (20 clones). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Configuración de reactivos Componente Cantidad Comentarios/Descripción
Medio de 2YT Extracto de levadura 10 g Agua ultrapura para completar el volumen hasta 1.0 L, ajustar el pH a 7.0, autoclave.
Triptona 16 g
NaCl 5 g
Agar superior 2YT Extracto de levadura 10 g Añadir agua ultrapura para completar el volumen hasta 1,0 L y ajustar el pH a 7.0, calor para disolver, autoclave.
Triptona 16 g
NaCl 5 g
Agar granulado 7,5 g
Medio de 2YT/carb/cmp Carbenicilina 100 μg/mL
Cloramfenicol 10 μg/mL
Medio de 2YT/carb/kan/uridina Carbenicilina 100 μg/mL
Kanamicina 50 μg/mL
Uridina 0.25 μg/mL
Medio de 2YT/carb/tet Carbenicilina 100 μg/mL
Tetraciclina 10 μg/mL
Medio de 2YT/carb Carbenicilina 100 μg/mL
Medio de 2YT/kan Kanamicina 50 μg/mL
Medio de 2YT/kan/tet Kanamicina 50 μg/mL
Tetraciclina 10 μg/mL
Medio de 2YT/tet Tetraciclina 10 μg/mL
Medio de 2YT/cmp Cloramfenicol 10 μg/mL
Agar medio LB Extracto de levadura 5 g Agua ultrapura para completar el volumen hasta 1.0 L, ajustar el pH a 7.0, autoclave. Para LB agar, agregar 20 g de agar granulado, autoclave.
Triptona 10 g
NaCl 10 g
Placas LB/carb Agar LB 1L
Carbenicilina 100 μg/mL
Placas LB/tet Agar LB 1 L
Tetraciclina 10 μg/mL
Placas LB/cmp Cloramfenicol 10 μg/mL
Placas LB/kan Kanamicina 50 μg/mL
Medio SOC Extracto de levadura 5 g Añadir agua ultrapura para hacer subir el volumen a 1,0 L y ajustar el pH a 7.0, autoclave.
Triptona 20 g
NaCl 0.5 g
KCl 0,2 g
2.0 M de MgCl2 5,0 mL
1.0 glucosa M 20 mL
Medio superbroth Triptona 12 g Añadir agua ultrapura a 900 mL, autoclave, añadir 100 mL de autoclave 0,17 M KH2PO4, 0,72 M K2HPO4.
Extracto de levadura 24 g
Glicerol 5 mL
Medio de kan/TTE superbroth Kanamicina 50 μg/mL
Tetraciclina 10 μg/mL
1 X PBS NaCl 137 mM Ajustar pH a 7.2, autoclave.
KCl 3 mM
Na2HPO4 8 mM
KH2PO4 1,5 mM
Gel de agarosa TAE/al Tampón TAE
Agarosa 1% (p/v)
GelRed 1:10000 (v/v)
Sustrato TMB TMB 50% (v/v)
Sustrato de la peroxidasa H2O2 50% (v/v)
Buffer de M-SAFT 1 X PBS 100 ml
Tween-20 0,05% (v/v)
Leche en polvo descremada 5% (v/v)
5 X PEG/NaCl PEG-8000 20% (w/v) Agregue agua ultrapura para completar el volumen a 1L y autoclave.
NaCl 2.5 M
Buffer de SAFT 1 X PBS 1 L Filtro de 0,22 μm-esterilizar.
Tween-20 0,05% (v/v)
10 x buffer de TM MgCl2 0.1 M Ajustar el pH a 7.5.
Tris 0.5 M
1,0 mM HEPES, pH 7.4 1.0 M HEPES 4,0 mL Filtro de 0,22 μm-esterilizar.
Agua ultrapura 4.0 L
glicerol ultrapuro al 10% (v/v) Glicerol ultrapuro 100 ml Filtro de 0,22 μm-esterilizar.
Agua ultrapura 900 mL
Agua ultrapura H20 Libre de DNasa, RNasa, libre de pirógenos.

Tabla 1: Configuración de reactivo.

Table 2
Tabla 2: CDR diversidades y mutagénesis cartillas. Se muestran las secuencias de DNA de las regiones CDR para ser transformado en rojo; formatean de secuencias usando el código de nucleótidos de la IUPAC. "X" indica tri-nucleótidos de una mezcla diseñada para contener conjuntos de diferentes aminoácidos; "n" indica el número diferente de X. cinco cartillas con un número diferente de X fueron utilizado para diversificar CDRL3 o CDRH3, respectivamente, para generar la variable longitud de CDRL3 y CDRH3. Los números de residuo se definen mediante la nomenclatura IMGT. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Mutagénesis de método de Kunkel
Reacción 1. Fosforilación de oligonucleótidos con kinase de T4 Polinucleótido
Componente Cantidad Final
oligonucleótidos mutagénicos 0,6 μg
10 x buffer de TM 2 ΜL 1 X
10 mM ATP 2 ΜL 1 mM
100 mM TDT 1 ΜL 5 mM
Quinasa de T4 Polinucleótido (10 U/μL) 2 ΜL 20 U
Ultrapura H20 Hasta 20 μL
Ajuste de la reacción
Paso 1. 37 ° C por 1 h
Reacción 2. Recocido de oligonucleótidos para la plantilla
Componente Cantidad Final
plantilla de ssDNA dU 20 μg 20 μg
10 x buffer de TM 25 ΜL 1 X
fosforilada CDRH1 oligonucleótidos 20 ΜL 0,6 μg
fosforilada CDRH2 oligonucleótidos 20 ΜL 0,6 μg
fosforilada CDRH3 oligonucleótidos 20 ΜL 0,6 μg
fosforilada CDRL3 oligonucleótidos 20 ΜL 0,6 μg
Ultrapura H20 Hasta 250 μL
Ajuste de la reacción
Paso 1. 90 ° C durante 3 min.
Paso 2. 50 ° C durante 5 min.
Paso 3. 20 ° C durante 5 min.
Reacción 3. Síntesis enzimática de CCC-dsDNA
Componente Cantidad Final
mezclas de oligonucleótidos recocido/plantilla 250 ΜL
10 mM ATP 10 ΜL 346 μm de cada nucleótido
mezcla de dNTP (25 mM de cada nucleótido) 10 ΜL 865 μm de cada nucleótido
100 mM TDT 15 ΜL 5 mM
Ligase de la DNA de T4 1 ΜL 30 unidades de Weiss
Polimerasa de la DNA T7 3 ΜL 30 U
Ajuste de la reacción
Paso 1. 20 ° C para pasar la noche

Tabla 3: Procedimientos y componentes del método de Kunkel, basado en la reacción.

Grupo Número de clon Región Porcentaje
Ningún codón de parada prematuro 70 Mutación de CDRH1 50% (35/70)
Mutación de CDRH2 57% (40/70)
Mutación de CDRH3 53% (37/70)
Mutación de CDRL3 56% (39/70)
Al menos una mutación de la CDR 76% (53/70)
Codón de parada prematuro 20 CDRH1 de defecto 45% (9/20)
CDRH2 de defecto 10% (2/20)
CDRH3 de defecto 15% (3/20)
CDRL3 de defecto 20% (4/20)
Otro defecto 10% (2/20)

Tabla 4: Análisis de la secuencia de CDRH1, CDRH2, CDRH3 y CDRL3 de la biblioteca Fab sintético.

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Para la construcción de alta diversidad, fago muestra Fab bibliotecas, control de calidad puntos de control son necesarios para monitorear distintas etapas del proceso de construcción, incluyendo la capacidad de células electro-competentes, calidad de la plantilla dU ssDNA, eficiencia de CCC-dsDNA síntesis, título después de la electroporación, plegable Fab y diversidad de aminoácidos de CDRs por análisis de la secuencia de los clones de fago Fab.

Alto rendimiento y pureza de dU-ssDNA es esencial para la tasa alta de mutagénesis. En nuestra experiencia, inducción de fagos a 25 ° C durante la noche puede producir más dU-ssDNA que de la inducción de fagos a 37 ° C durante la noche. Esto está de acuerdo con un anterior informe19. Con respecto a la extracción de ssDNA, el plásmido inicial Spin kit (QIAprep) contenía MLB para Unión y lisis de los fagos. Más tarde, MLB fue descontinuada con razón desconocida y reemplazada por PB. Se encontró que la producción de dU-ssDNA es mucho más baja del tratamiento de la PB en comparación con la del tratamiento de la MLB. En este protocolo, se utilizó un reactivo llamado UT-MLB20 reemplazar MLB y que la producción de dU-ssDNA es similar a la del Kit inicial de la vuelta.

Como CDRH3 y CDRL3 son las regiones más diversas para el reconocimiento de antígeno21, introducir una diversidad a medida con un conjunto específico de aminoácido combinaciones y proporciones y para eliminar el sesgo de la redundancia e introducidos por codones degenerados como codones de parada NNK (N, equimolar de/c/G/T; K, equimolar de G/T), trímero codón oligonucleótidos basadas en phosphoramidite22 con exactamente un codón trímero correspondiente a un aminoácido específico fueron diseñados para CDRH3 y CDRL3. Por otra parte, longitudes variables de oligonucleótidos CDRH3 y CDRL3 fueron utilizados para aumentar aún más las diferencias.

Después de la síntesis enzimática de CCC-dsDNA, generalmente se observan tres bandas por electroforesis en gel de agarosa y las bandas deben ser claras sin borrón de transferencia. Entre ellos, la banda de correr más rápido es la CCC-dsDNA que puede producir una tasa de mutación alta (80%) después de la electroporación23. La banda de funcionamiento más lento es el ADN de hebra desplazada que surge de la actividad inherente de desplazamiento de cadena de polimerasa de la DNA T7 y tiene una mutación baja tasa (alrededor del 20%)23. La banda débil media es mellada ADN después de la extensión debido a la insuficiente actividad de ligase de la DNA de T4 o fosforilación de oligonucleótidos insuficiente.

Una piscina de muestra pequeña de la secuencia se utilizó para estimar la diversidad de la biblioteca aunque no24. Para estimar con precisión la diversidad real, próxima generación sequencing (NGS) puede ser una buena opción en minería la profundidad de la diversidad de la biblioteca construido25. En la práctica, debido a los retos actuales de NGS tecnología incluso Lee longitud, precisión, costo y alto rendimiento, la secuenciación de la biblioteca de phage Fab usada en este protocolo con la longitud de alrededor de 950 bp que abarca CDRH1, CDRH2, CDRH3 y CDRL3 no es alcanzables; sin embargo, es posible estimar el scFv (alrededor 700 bp) diversidad de biblioteca dentro de la gama de millones24,25. Otro estándar clave para evaluar la diversidad de la biblioteca construida es utilizar la biblioteca de pan contra muchos tipos diferentes de antígenos y calcular los clones positivos capturados desde diversidad de biblioteca está directamente correlacionada con la tasa de éxito del antígeno panorámica de26. Plataforma de selección de alto rendimiento es ideal para ello y los lectores pueden referirse a un protocolo detallado divulgado por Miersch et al. 27

Teóricamente, pueden usar bibliotecas de anticuerpos sintéticos muestran en fago con diversidad a medida a cualquier antígeno y por lo tanto tienen amplias aplicaciones. Actualmente, empresas como tecnología del anticuerpo de Cambridge (CAT), MedImmune, Genentech, Dyax, Bioinvent, Pfizer y MorphoSys dependen en gran medida plataformas de la exhibición phage para anticuerpos terapéuticos desarrollo28. Por otra parte, muchas patentes de tecnología phage display base han caducado29. Sin duda, esto desatará el máximo potencial de la tecnología de anticuerpos muestran en fago.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecemos Dr. Frederic Fellouse del laboratorio de Sidhu para comentarios críticos en la construcción de biblioteca de Kunkel método basado sintético phage Fab. Los autores aprecian la Sra. Alevtina Pavlenco y otros miembros del laboratorio Sidhu ayuda valiosa de la preparación competente de electro de alta eficiencia de células de e. coli y de alta calidad dU-ssDNA. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Grant No.: 81572698, 31771006) a DW y por la Universidad de ShanghaiTech (Grant No.: F-0301-13-005) al laboratorio de ingeniería de anticuerpos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1.0 M H3PO4 Fisher AC29570
1.0 M Tris, pH 8.0 Invitrogen 15568-025
10 mM ATP Invitrogen 18330-019
100 mM dithiothreitol Fisher BP172
100 mM dNTP mix GE Healthcare 28-4065-60 solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-76-02
50X TAE Invitrogen 24710030
Agarose Fisher BP160
Carbenicillin, carb Sigma C1389 100 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL.
Chloramphenicol, cmp Sigma C0378 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9620G
Granulated agar VWR J637-500G
H2O2 peroxidase substrate Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-65-02
K2HPO4 Sigma 795488
Kanamycin, kan Fisher AC61129 50 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL.
KH2PO4 Sigma P2222
Na2HPO4 Sigma 94046
NaCl Alfa Aesar U19C015
Nanodrop Fisher ND2000C
NaOH Fisher SS256 ! CAUTION NaOH causes burns.
NON-Fat Powdered Milk Sangon Biotech A600669
PEG-8000 Fisher BP233
Protein A-HRP conjugate Invitrogen 101123
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 22704
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Recombinant Protein L Fisher 77679
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203S
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T7 DNA polymerase New England Biolabs M0274S
Tetracycline, tet Sigma T7660 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
Tryptone Fisher 0123-07-5
Tween-20 Sigma P2287
Ultrapure glycerol Invitrogen 15514-011
Uridine Sigma U3750 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL.
Yeast extract VWR DF0127-08
Name Company Catalog Number Comments
Strains
E.coli CJ236 New England Biolabs E4141 Genotype: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA.
E.coli SS320 Lucigen 60512 Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.
M13KO7 New England Biolabs N0315S
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2-cm gap electroporation cuvette BTX
96-well 2mL Deep-well plates Fisher 278743
96-well Maxisorp immunoplates Nunc 151759
Baffled flasks Corning
Benchtop centrifuge Eppendorf 5811000096
Centrifuge bottles Nalgene
ECM-630 electroporator BTX
Magnetic stir bars Nalgene
Thermo Fisher centrifuge Fisher
High speed shaker TAITEK MBR-034P
Microplate shaker QILINBEIER QB-9002
Liquid handler for 96 and 384 wells RAININ
Mutil-channel pipette RAININ E4XLS
Amicon concentrator Merck UFC803096

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References

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Construcción de fagos sintético muestra fabulosa biblioteca con diversidad a medida
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Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).More

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).

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