Summary
כיום, צביעת immunofluorescent על תאים קבוע הוא שיטת הבחירה לקביעת רמות הביטוי חלבון כאשר מידע מורפולוגי נחוץ גם. פרוטוקול זה שהוצגו במסמך זה מספק שיטה חלופית immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע.
Abstract
צביעת immunofluorescent נמצא כעת לשיטת הבחירה לקביעת רמות ביטוי החלבון במערכות תרבית תאים כאשר מידע מורפולוגי הוא גם הכרחי. הפרוטוקול של immunocytochemical מכתים על בלוקי תא פרפין-מוטבע, שהוצגו במסמך זה, היא אלטרנטיבה מעולה immunofluorescent מכתים בתאי קבוע-מוטבע פרפין. ב פרוטוקול זה, לתא כלא פרפין מתאי הלה הוכן בשיטת thromboplastin-פלזמה, immunocytochemistry בוצע על ההערכה של שני סמנים התפשטות, CKAP2 ו- Ki-67. הגרעינים cytoplasmic המורפולוגיה של תאי הלה היו השתמר היטב בשקופיות אגף. במקביל, הדפוסים מוכתמים CKAP2 ו- Ki-67 ב- immunocytochemistry היו די דומים לאלו immunohistochemical מכתים ברקמות סרטן פרפין. עם תרבית תאים ששונה תנאים, לרבות קדם דגירה של הלה תאים בתנאים ללא סרום, יוכל להעריך את ההשפעה תוך שמירה על מידע אדריכלי. לסיכום, immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע הוא אלטרנטיבה מצוינת immunofluorescent מכתים.
Introduction
במעבדות רוב, בלוקי תא פרפין-מוטבע נמצאים בשימוש נפוץ. במקום זאת, קבוע תאים בתרבית, פרפין-מוטבע לא התאים, הם מועסקים בלימודי הסבת subcellular. לאלו קבוע תאים בתרבית, שימש זריחה במקום chromogen. לכן, צביעת immunofluorescent נמצא כעת לשיטת הבחירה לקביעת רמות החלבון ביטוי במחקר העסקת תרבויות תא1. שקופיות שהוכנו עבור צביעת immunofluorescent, עם זאת, ניתן לצפות רק תחת מיקרוסקופ immunofluorescent, אשר עשויה להציג תמונות שונות לחלוטין מאלו המתבקשים תחת מטוס מיקרוסקופ2. בנוסף, שימור שקופיות עבור צביעת immunofluorescent דורש הגנה מפני אור בהיר, ולהיות אותות פלואורסצנט חלשים עם חשיפה חוזרת ונשנית עבור הדמיה בשל האובדן של אותות פלואורסצנט3. תוצאות immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע דומים למדי לאלה של אימונוהיסטוכימיה על רקמות פרפין-מוטבע4, הם יכולים בקלות להיות מתורגם המידע הקליני. לכן, immunocytochemistry יכול להיות חלופה מצוינת. עם זאת, אגף הכנה לא היתה פופולרית במעבדות מחקר בסיסי. ב פרוטוקול זה, ואז, הכנה אגף immunocytochemical מכתים ניתנים כדי לקדם את השימוש בשיטה זו בתחום של לימודי תרבות-תא.
הכנה אגף immunocytochemistry אינן שיטות עבודה ייחודיות ולאחר שכבר החלתם של אבחון קליני מחקר בסיסי4,5. למרות הכנה אגף שונים בשיטות היה דיווח על4,6 thromboplastin-הפלזמה שיטה היא פשוטה, חסכונית, וניתנת להתאמה בקלות. לכן, בפרוטוקול שהוצגו במאמר זה, thromboplastin-פלזמה שיטה4,5,6,7,8 משמש לייצור בלוקי תא פרפין-מוטבע.
במחקר הנוכחי, היו הפגינו את נהלי ההכנה של בלוקי תא thromboplastin-פלזמה ושיטת immunocytochemistry העסקת שני סמנים הפצת נתונים היסטוריים. סמן אחד הוא חלבון שלד התא-הקשורים 2 (CKAP2), אשר לאחרונה דווחה על סמן mitotic9,10,11; השני הוא Ki-67, המהווה סמן התפשטות הידועים12. ערכת נציג מוצג באיור1.
Protocol
פרוטוקול המחקר אושרה על ידי המוסדיים סקירה המנהלים של מרכז הסרטן הלאומי, קוריאה (NCCNCS-12-630).
1. משאבות (30 דקות)
- עבור התרבות של תאים הלה (CCL-2, בקרת האוויר), להשתמש 10 מ"ל מלאה DMEM בינוני (סרום שור עוברית 10%, 1% עט-דלקת) לצלחת תרבות 100 מ מ. כדי להכין סרום מורעבים תאים הלה, דגירה confluent תאים הלה DMEM ללא סרום שור העובר למשך 48 שעות, כפי שמתואר במחקר הקודם11.
- כדי לנתק את התאים, לשטוף אותם עם 2 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS), וכן להוסיף טריפסין EDTA 0.25% 2 מ"ל לכל מאכל תרבות 100 מ מ. לאחר מכן, תקופת דגירה של 2-3 דקות חממה2 CO ב 37 º C.
- הוסף 5 מ של בינוני DMEM מלאה לצלחת תרבות לבטל את הפעלתה של טריפסין, להעביר את התאים מנותקת צינור 15 מ"ל. לאחר מכן, centrifuge את התאים ב 300 גרם x 10 דקות ליצור גלולה.
- הסר את תגובת שיקוע ולאחר לשטוף את גלולה פעמיים עם PBS קר 2 מ"ל על ידי צנטריפוגה-300 גרם x 10 דקות.
- לאחר הסרת תגובת שיקוע, להוסיף 1 מ"ל אתנול 95% בגדר תא ומערבבים בגדר תא עם אתנול על-ידי vortexing. לשמור את התאים קבוע על הקרח עד ההכנה אגף.
2. אגף הכנה (1 h 30 דקות)
- עבור הכנת פלסמה קפואה aliquots, לאסוף פלזמה EDTA מהדם תורם בריא צנטריפוגה ב g 13,000 x במשך 10 דקות לאסוף פלזמה supernatant ו µL aliquot 200-400 כל לתוך microfuge צינורות. לאחסן את aliquots ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש. כאשר aliquots פלסמה קפואה מוכנים, לאחזר אותן, להפשיר הפלזמה על ידי דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- Centrifuge התאים קבוע ב 700 g x 10 דקות, ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע.
- מערבבים בגדר תא עם 2 טיפות (כ-200 µL) של פלזמה, 2 טיפות של thromboplastin, 2 טיפות של 0.025 M סידן כלורי. לאחר מכן, מערבבים אותם על-ידי pipetting.
- לאפשר את התערובת ליצור קריש תא בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, כפי שמוצג באיור 2A. לאחר מכן, לשטוף את הקריש תא עם PBS פעמיים על ידי מזיגת והסרה של PBS באמצעות פיפטה. . קריש הדם תא לבן הנציגה מוצג באיור 2B.
- להרטיב את פיסת נייר סינון עם פורמלין, לעטוף את הקריש תא עם נייר הסינון בטעימת מראש. ואז, למקם את התערובת קרוש עם pincette קלטת רקמות כפי שמוצג באיור 2C.
- מקום בקלטת רקמות בתוך צנצנת זכוכית המכיל 50 מ של פורמלין במאגר (פורמלין 10% ב- PBS) בן לילה ב 4 ° C עבור קיבעון פורמלין.
3. ברקמה והטבעה פרפין (לילה)
- לטעון את הקלטת הרקמה המכילה את הקריש תא פורמלין-קבוע בתוך מעבד רקמות בין לילה כפי שתואר לעיל11. עיבוד רקמה מיועדת להסרת מים ומיזוג תאים קבוע לפני פרפין הטבעה. למחקר ללא עיבוד רקמה, לבצע את הרקמה עיבוד ההליך כפי שמוצג בטבלה 1.
- הפעל מחוממת ההטבעה תחנת, ו- 60 דקות לאחר מכן, הבדיקה כי יש שעווה מותכת כייר מתכת ובזה (איור דו-ממדי).
- לקחת את הקריש נוצר תא בקלטת רקמות ולמקם אותו פרפין מותכת בתוך כייר מתכת.
- מקום בקלטת רקמה חדשה ללא המכסה לתבנית מתכת המכילה את התא ייקרש באמצע פרפין מותכת, ושופכים פרפין מותכת יותר את הקלטת רקמות ו על כייר מתכת. . אז, תן פרפין לחזק בצלחת קר במשך 30-60 שניות.
- להפריד את הקלטת רקמות כייר מתכת. . אז, לחסום את התא פרפין הוא מוכן immunocytochemistry. החץ באיור 2Eמציינים את הקריש תא מוטבע אגף פרפין-מוטבע.
4. הכנה של שקופיות Immunocytochemistry (1h)
- תחפש הקריש תא פרפין אגף באיזור, לחתוך פרוסות עם עוביים של 3-4 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום לחסום את התא. לשים את המקטעים פרפין בשקופיות זכוכית מצופים silane, כפי שמוצג באיור 2F.
- מקם את השקופיות סעיף בתנור 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להפוך את המקטעים לדבוק השקופיות.
5. Immunocytochemistry של בלוקי תא (6 שעות)
הערה: עבור immunocytochemical מכתים במקטעי אגף, הקיטים השונים יכול לשמש (ראו טבלה של חומרים). כל ערכות כאלה יש רגישויות שונות specificities בהתאם את השינויים שלהם.
- דגירה בסעיפים 50 מ של קסילן במשך 4 דקות לבטל את paraffinize.
- דגירה של שקופיות אתנול 100% למשך 2 דקות על התייבשות, ו פעמיים אתנול 95% ו- 80% אתנול למשך 2 דקות. לאחר מכן, הסר האתנול במים למשך 10 דקות.
- לאחזור אנטיגן, למקם את השקופיות במאגר צנצנת המכילה 40 מ"ל טריס-EDTA אחזור, pH 9.0, מרתיחים בסיר למשך 30 דקות.
- לשטוף את השקופיות תחת מים זורמים, דגירה אותם אתנול 95% 10 דקות ב 4 º C. לאחר מכן, לסמן את האזור מכתים תא בשקופיות עם עט פאפ כדי שניתן יהיה לזהותם בקלות.
- לשטוף את השקופיות בתוך תמיסת מלח באגירה טריס המכיל 0.2% Tween 20 (TBS-T), דגירה בבלוק מימן על-חמצני (ראה טבלה של חומרים) בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות להסיר את כל פעילות peroxidase שריד. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות ב- TBS-T שלוש פעמים למשך 2 דקות כל אחד.
- להכין נוגדן מדולל פתרון על ידי דילול נוגדן ראשוני בבלוק חלבון (ראה טבלה של חומרים). לדוגמה, CKAP2 נוגדן ראשוני יכול להיות מדולל מטריים, שבערך נוגדן של Ki-67. לאחר מכן, דגירה השקופיות µL 100 של נוגדן מדולל פתרון מאובטח.
- לאחר הרחצה TBS-T חמש פעמים למשך 2 דקות כל אחד, דגירה השקופיות משפר נוגדן ראשוני בערכה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
- לאחר הכביסה ב- TBS-T ארבע פעמים למשך 2 דקות כל אחד, להוסיף 2 טיפות HRP פולימר (נוגדנים משניים המסומנת חזרת peroxidase), דגירה השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- לאחר הרחצה TBS-T חמש פעמים במשך 2 דקות, להוסיף 100 µL של diaminobenzidine (DAB) פתרון (ראה טבלה של חומרים), דגירה השקופיות למשך 3 דקות.
- אחרי כביסה ב- TBS-T פעמיים, להוסיף 100 µL של פתרון Hematoxylin (התערובת של µL 100 של Hematoxylin ו- 600 µL של מים מזוקקים), דגירה של שקופיות 1 דקות.
- לאחר כביסה מייבשים השקופיות TBS-T פעם אחת, על ידי המקננת אתנול 95% למשך 2 דקות, טובלים ב 95% אתנול פעם טובלים ב- 100% אתנול פעמיים. לאחר מכן, דגירה השקופיות 40 מ ל קסילן בצנצנת זכוכית למשך 5 דקות.
- כאשר בשקופיות יבשים מתוך קסילן, הר על coverslips בהתאמה.
- לבחון את דפוסי ההגדלה באמצעות מיקרוסקופ אור.
Representative Results
בשקופית hematoxylin ואאוזין-מוכתם מהגוש תא פרפין-מוטבע (איור 3 אב'), רוב האטומים, הציטופלסמה של התאים שלמים, רומז שימור מורפולוגי הוא מעולה עם (פרוטוקול הנוכחי איור 3A). ב ההכתמה immunocytochemical, צביעת CKAP2 חיובית נצפתה כרומטין מרוכז, פלך mitotic ו הציטופלסמה (איור 4), כפי שדווחה בעבר10. Ki-67 מכתים נצפתה ב גרעינים תא, כמו הצפוי (איור 4). רק בתאים עם CKAP2 מכתים בכרומטין מרוכז (ראו החיצים באיור 4AB) היו תאים mitotic. תאים CKAP2-חיוביים רבים הוצגו בתאים הלה מאוד mitotic הוכנה לאחר דגירה שלם בינוני (איור 4A). לשם השוואה, היו כמה תאים CKAP2-חיוביות בתאים הלה מורעבים סרום (איור 4B). רוב התאים הלה mitotic מאוד היו Ki-67 חיובי (איור 4C). . Contrastingly, הקצב Ki-67-חיוביות בתאים הלה מורעבים סרום נשאר גבוה ככל ~ 50% (איור 4D). תוצאות אלה הן די דומות לאלה הקודם ח11, שמצביע על כך CKAP2 הוא אמין יותר התפשטות סמן בתאים סרטניים מאשר Ki-67.
תא לקוי מוכן בלוקים, הגרעינים מופרדים הציטופלסמה, ויש גם, resultantly, מורפולוגיות ההשתמרות הדלה. דגירה ארוך יותר-מאשר-לילה של תאים קבוע במקרר עלול לגרום תוצאות עניים כאלה. בעיה חשובה נוספת היא כי תאים לא מוכתמים היטב על ידי immunocytochemistry, על אף האמור המורפולוגיה מעולה. בעיה זו מתעוררת לעיתים קרובות יותר כאשר הקריש התא הוא קטן. בדרך כלל, עוצמת מכתימים הוא לא סדיר כפי שמוצג באיור 3B; אבל כאשר הקריש תא גדול, יש הרבה פחות סיכוי מכתים לא סדיר. לכן, ב פרוטוקול זה, הגדלנו את אמצעי האחסון של פלזמה, thromboplastin סידן כלורי כדי ליצור קריש דם תאים גדולים.
איור 1: ערכת הכנה-אגף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: איור של פרפין-אגף הכנה- (א) קריש דם בצינור thromboplastin-פלזמה התא. (B) קריש דם לאחר כביסה PBS תא TP. קריש דם על נייר סינון בטעימת תא (ג). (ד) רקמה-הטבעה תחנת עם שעווה מותכת. כייר מתכת (חץ) מחזיקה שעווה מותכת על התמצקות. (ה) פרפין-מוטבע תא קריש דם (חץ) מוטבע פרפין או אגף פרפין-מוטבע. (F) מדור פרפין דק על החלק האמצעי של שקופית מצופה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: אגף הכנה ואישור של איכות על ידי hematoxylin ואת אאוזין. immunostaining. (א) hematoxylin ואאוזין-מוכתם תמונה של הלה תאים במקטע פרפין-מוטבע-אגף. (ב) צביעת לא סדיר של Ki-67 ב- immunocytochemistry על לקוי של פרפין-מוטבע-אגף סעיף יתנכה גודל ברים הם μm 100 (א) ו (ב) 200. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: Immunocytochemical מכתים בבלוק פרפין-מוטבע תא עבור תאים הלה. (א) CKAP2 מכתים בתנאים מאוד mitotic. (ב) CKAP2 מכתים בתנאים מורעבים סרום. (ג) Ki-67 מכתים בתנאים מאוד mitotic. (ד) Ki-67 מכתים בתנאים מורעבים סרום. 100 μm סולם ברים מוצגים. ראשי חצים מצביעות על תאים CKAP2-חיוביות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| הליך | צעדים | פתרון | טמפרטורה/זמן |
| התייבשות | 1 | 70% אלכוהול | 15 min/RT |
| 2 | 80% אלכוהול | 15 min/RT | |
| 3 | אלכוהול 95% | 15 min/RT | |
| 4 | 100% אלכוהול | 15 min/RT | |
| ניקוי | 1 | קסילן | 60 דקות/4 ° C |
| 2 | קסילן | מינימום 10/RT | |
| 3 | קסילן | מינימום 10/RT | |
| 4 | קסילן | מינימום 10/RT | |
| * RT, בטמפרטורת החדר |
טבלה 1. הליך עיבוד רקמה.
Discussion
צביעת immunofluorescent על קבוע תאים בתרבית נמצא כעת לשיטת הבחירה לקביעת רמת ביטוי חלבונים בתאים תוך שמירה על מידע מורפולוגי1. עם זאת, immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע יכול להיות חלופה מצוינת. ההליכים מפורט עבור הכנת בלוקי תא פרפין-מוטבע ו- immunocytochemistry תוארו של פרוטוקול זה, אנו מקווים זה יכול להקל על היישום של immunocytochemistry במחקרים התא.
Immunocytochemistry יש מספר יתרונות על צביעת immunofluorescent. Immunofluorescent מכתים עבור תאים בדרך כלל דורש תאים בתרבית טרי, אבל בלוקי תא פרפין יכול להישמר בטמפרטורת החדר במשך שנים מספר13. בנוסף, immunocytochemistry על בלוקי תא יכולים לחקור דפוסי ביטוי תאיים על ידי העסקת הנוגדן אותו בשימוש שגרתי אימונוהיסטוכימיה ברקמות אנושיות4. יתר על כן, זה יכולים לחקור את השינויים רמות החלבון או שינויים posttranslational גם על ידי מראש המקננת תאים עם תרופות שונות או תחת תנאים שונים של תרבות11.
לעומת היתרונות של immunocytochemical מכתים, הכנת בלוקי תא פרפין-מוטבע לוקח זמן והוא יקר14. כמו כן, רוב מעבדות מחקר חסר ניסיון בטכניקה זו, שגיאות טכניות בנסיבות כאלה נפוצים. מהשגיאות הנפוצות ביותר הן ההשתמרות הדלה תא מורפולוגיה של עני או לא סדיר immunocytochemical מכתים במקטעי בלוק תא פרפין. אלה ואחרים רוב ניתן להימנע על ידי ביצוע בלוקי תא תחת התנאים תא הכי באמצעות פתרון מספיק כדי ליצור תא קרישי דם.
בתור הדגמה של הפרוטוקול הנוכחי, בלוקי תא הוכנו עבור תאים הלה, immunocytochemical מכתים בוצע עבור שני סמנים התפשטות, CKAP2 ו- Ki-67, כפי שדווחה בעבר11. עבור immunocytochemistry, התאים היו המניפולציה של דגירה בתקשורת עם ובלי סרום שור עוברית, השפעת סרום רעב יכול להיות שנצפו. יכול להיות מועסק אלה בלוקי תא פרפין-מוטבע מוכן עבור מספר גדול של נוגדנים, כי ניתן להכין שקופיות רבים לתא כלא באמצעות רק מיקרומטר-עבה-אגף מקטע 4-5 עבור כל שקופית. לכן, ניתן להעריך דפוסי ביטוי המתייחס שני תנאים שונים עם מספר נוגדנים שונים. Immunostaining תבניות עבור CKAP2, Ki-67 סרטן רקמות כבר דיווחו9,10,11,12. immunocytochemical מכתים תוצאות יוכל בקלות להעריך, כי דפוסי מכתימים היו דומים מאוד לאלה של אימונוהיסטוכימיה.
לסיכום, immunocytochemical מכתים על בלוקי תא פרפין יכול להיות אלטרנטיבה מצוינת מכתים immunofluorescent; יתר על כן, זה יכול להיות בקלות ובאמינות מועסק במחקר בסיסי עבור הביטוי פרופיל בשורות תאים תוך שמירה על מידע מורפולוגי.
Disclosures
כל המחברים הכריזו שאין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר כדי ק'-מ. ה מרכז הסרטן הלאומי, קוריאה (1510121), קרן מחקר לאומי, קוריאה (לא. NRF-2015R1A2A2A04007432).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HeLa Cells | ATCC | HeLa (ATCC CCL-2) | |
| Ki-67 Antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9106-S1 | |
| Paraffin | Leica | 39601006 | |
| Xylene | Fisher SCientific | 1330-20-7,100-41-4 | |
| Ethenol | GD Chem | DJ16016 | |
| Hematoxylin | Agilent | 10118581 | |
| DAB Quanto Kit | Thermo Fisher Scientific | TA-125-QHDX, QHCX 170405 | |
| Ultravision LP detection Kit | Thermo Fisher Scientific | PBQ141209, LPB141209, LPH141210 | Kit for immunocytochemistry; contains protein block |
| TintoRetriever Pressure Cooker | Bio SB Corporation | BSB 7008 | |
| Tris-buffered saline | iNtRON Biotechnology | IBS-BT008 | |
| Tween 20 | USB Corporation | 115106 | |
| Thromboplastin | Neoplastin Cl Plus | NC0591432 | |
| Tris-EDTA retrival Buffer | Dignostic Biosystem | E625-A | |
| Trypsin EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone Laboratories Inc | SH30910.03 | |
| DMEM | Hyclone Laboratories Inc | SH30243.01 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Ultra vision peroxide block H2O2 | Thermo Fisher Scientific | 02Q141212 | |
| Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific | 363313 | |
| Pap-Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-0155 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 21115-100ml | |
| Phosphate-buffered saline | PAA Laboratories | H21-002 | |
| Formalin | Daejung | 50-00-0 | |
| 15 ml tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| tissue processing cassette | Simport | M492-5 | |
| 100 mm culture dishes | BD Biosciences | 08-772E | |
| Glass Slide | Muto Pure Chemicals | 140712 | |
| Cover Glass | Marienfeld | 2262817 | |
| Glass Zar | Hyunil Lab-Mate | HIP-1027 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Class II Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series A2 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | Series A2 | |
| Tissue Processor | Leica BioSystem | TP1020 | |
| Microtome | Thermo Fisher Scientific | HM340E | |
| Microscope | Olympus | CX-21 | |
| Paraffin embedding station | Thermo Fisher Scientific | EC 350-1, EC 350-2 | |
| Tissue Section Bath (Round) | CellPath | HCP-JAW-0100-00AEU | |
| Fume Hood | Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd. | FH-150 |
References
- Bhattacharyya, D., Hammond, A. T., Glick, B. S. High-quality immunofluorescence of cultured cells. Methods Mol Biol. 619, 403-410 (2010).
- Brown, C. M. Fluorescence microscopy - Avoiding the pit falls. J Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).
- Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. J Invest Dermatol. 133, e4 (2013).
- Kulkarni, M. B., Desai, S. B., Ajit, D., Chinoy, R. F. The utility of the thromboplastin-plasma cell-block technique for fine-needle aspiration and serous effusions. Diagn Cytopathol. 37 (2), 86-90 (2009).
- Shivakumarswamy, U., Arakeri, S. U., Karigowdar, M. H., Yelikar, B. Diagnostic utility of the cell block method versus the conventional smear study in pleural fluid cytology. J Cytol. 29 (1), 11-15 (2012).
- Nathan, N. A., Narayan, E., Smith, M. M., Horn, M. J. Cell block cytology: Improved preparation and its efficacy in diagnostic cytology. Am J Clin Pathol. 114 (4), 599-606 (2000).
- Keyhani-Rofagha, S., Vesey-Shecket, M. Diagnostic value, feasibility, and validity of preparing cell blocks from fluid-based gynecologic cytology specimens. Cancer. 96, 204-209 (2002).
- Young, N. A., Naryshkin, S., Katz, S. M. Diagnostic value of electron microscopy on paraffin-embedded cytologic material. Diagn Cytopathol. 9, 282-290 (1993).
- Jin, Y., Murakumo, Y., Ueno, K., Hashimoto, M., Watanabe, T., Shimoyama, Y., et al. Identification of a mouse cytoskeleton-associated protein, CKAP2, with microtubule-stabilizing properties. Cancer Sci. 95 (10), 815-821 (2004).
- Hong, K. U., Choi, Y. -B., Lee, J. -H., Kim, H. -J., Kwon, H. -R., Seong, Y. -S., et al. Transient phosphorylation of tumor associated microtubule associated protein (TMAP)/cytoskeleton associated protein 2 (CKAP2) at Thr-596 during early phases of mitosis. Exp Mole Med. 40, 377-386 (2008).
- Sim, S. H., Bae, C. D., Kwon, Y., Hwang, H. -L., Poojan, S., Hong, H. -I., et al. CKAP2 (cytoskeleton-associated protein2) is a new prognostic marker in HER2-negative luminal type breast cancer. PLoS ONE. 12 (8), e0182107 (2017).
- Inwald, E. C., Klinkhammer-Schalke, M., Hofstadter, F., Zeman, F., Koller, M., Gerstenhauer, M., et al. Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients: results of a large population-based cohort of a cancer registry. Breast Cancer Res Treat. 139 (2), 539-552 (2013).
- Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods Mol Biol. 784, 155-167 (2011).
- Beutner, E. H. Immunofluorescent staining: The fluorescent antibody method. Microbiol Mol Biol Rev. 25 (1), 49-76 (1961).
