Summary
epicardium 세포와 심근 벽에 성장 요소를 제공 하 여 개발 및 심장의 수리에 중요 한 역할을 하고있다. 여기, 우리는 연구와 그들의 발달 및 성인 특성의 비교 문화 인간의 기본 epicardial 셀 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
Epicardium, 심근, 취재는 상피 세포 층 필수적인 역할 심장 개발 과정 뿐만 아니라 있다 복구 응답 심장의 허 혈 성 손상 후. 활성화 되 면, epicardial 세포 재생 심근 세포를 제공 하 엽 전환 (응급) 상피로 알려진 프로세스를 받 다. 또한,는 epicardium 필수 paracrine 요인의 분 비를 통해 기여 한다. 감사 하기 위해 완벽 하 게는 epicardium의 재생 잠재력, 인간 세포 모델이 필요 합니다. 여기 우리 소설 셀 문화 모델 인간 성인 그리고 태아 심장 조직에서 파생 하는 기본 epicardial 파생된 셀 (EPDCs)을 개설 한다. EPDCs를 분리 하는 epicardium 심장 표본의 외부에서 해 부 이며 단일 세포 현 탁 액으로 처리. 다음으로, EPDCs 도금 고가 5 키 억제제 그들의 상피 표현 형을 유지 하기 위해 SB431542를 포함 하는 EPDC 매체에서 경작. 구급 대는 TGFβ와 자극에 의해 유발 됩니다. 이 방법을 수 있도록, 처음으로, 제어 환경에서 인간의 epicardial 응급 과정의 연구 심장 재생을 원조 할지도 모른다 EPDCs의 secretome에서 더 많은 통찰력을 얻고 촉진 한다. 또한,이 균일 한 접근 인간 성인 그리고 태아 epicardial 행동의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다.
Introduction
Epicardium, 봉투는 마음 임을 심장 개발 및 수리 (Smits 외 에 검토에 대 한 중요 한 중요성의 단일 셀 상피 층 1).는 epicardium proepicardial 기관, 개발의 기초에 있는 작은 구조에서에서 발생 하는 발달. 마우스, 그리고 4 주 후 임신 인간에서 발달 하루 E9.5, 셀 시작이 콜리플라워 구조에서 마이그레이션할 개발 심근2를 커버. 단일 상피 세포 층이 형성 되 면 epicardial 셀의 일부 엽 전환 (응급) 상피를 겪 습. 응급, 중 셀 셀 셀 유착 등 상피의 특성을 잃게 되 고 그들에 게 개발 심근으로 마이그레이션할 수 있는 능력을 주는 엽 형을 얻을. 비록 후자는 두 셀 형성된 epicardial 파생된 셀 (EPDCs) 섬유 아 세포, 평활 근 세포, 그리고 잠재적으로 cardiomyocytes와 내 피 세포3를 포함 하 여 여러 심장 세포 유형으로 분화 할 수 있다 토론 (Smits 외 에 검토에 따라 인구 남아 4). 또한,는 epicardium 규제의 성장과 vascularization5,6,,78심근에 교육적 paracrine 신호를 제공 한다. 여러 학문은 장애인된 epicardial 형성 발달 결함 심장 근육9,10, 맥 관 구조11및 전도 시스템12, 필수 강조에 리드 설명 했다 심장의 형성에 epicardium의 기여 금.
성인 심장에는 epicardium 휴면 레이어로 있으면, 비록 그것은 허 혈13시 다시 활성화 된다. Epicardial 다시 활성화 후 상해의 몇몇이 프로세스 심장 개발을 위한 확산 및 응급14, 이기는 하지만 설명 덜 효율적으로. 흥미롭게도, 비록 정확한 메커니즘은 완전히 이해 되지 않습니다, 복구 epicardial 기여와 함께, 예를 들어, Thymosin β415 처리에 의해 향상 시킬 수 있습니다 또는 mRNA VEGF A16, ameliorated 심장에 결과 수정 심근 경색 후 함수입니다. epicardium 따라서 부상된 심장의 내 생 수리를 강화 하는 재미 있는 셀 소스를 여겨진다.
심장 개발의 메커니즘은 덜 효율적인 방식 상해, 동안 자주 지는. Epicardial 활성 검색 확인 하 고 태아 및 성인 epicardium의 전체 용량을 비교할 수 있습니다 우리가 최고입니다. 또한, 치료 관점에서, 동물 실험, 뿐만 아니라 우리 인간의 epicardium의 응답에 관한 지식을 확장 중요 하다. 여기, 우리는 인간 성인 그리고 태아 epicardial 파생된 셀 (EPDCs)는 상피 세포 같은 형태학에 문화를 격리 하 고 구급 대를 유도 하는 방법을 설명 합니다. 이 모델을 우리는 탐구 하 고 성인과 태아 epicardial 셀 동작 비교 목표로 합니다.
이 프로토콜의 주요 장점은 철저 하 게 공부 하지는 인간의 epicardial 물자의 사용 이다. 중요 한 것은, 설명된 절연 및 세포 문화 프로토콜 두 태아 및 성인 자갈 EPDCs, 이러한 두 셀 소스 사이 직접적인 비교를 사용 하면 파생 단일 유니폼 방법의 제공 한다. 또한, 이후는 epicardium 격리 된 위치에 따라, 그것은 셀 실제로 epicardially 파생된17는 보장 된다.
인간의 EPDC 격리 방법을 이전 설립 되었습니다,이 주로 심장 또는 epicardial 조직의 조각 셀 문화 접시18,19에 도금는 파생물 프로토콜에 의존. 이 방법은 그로 인하여 세포는 부분적으로 마이그레이션하려면, 그들의 상피 표현 형을 잃고 그리고 자발적인 응급 수술 하는 경향이 더 위해 특별히 선택 합니다. 현재 프로토콜에서은 epicardium 상피 상태로 유지 하기 위해 고립 된 EPDCs를 허용 하는 단일 셀 솔루션으로 먼저 처리 됩니다. 이 메서드는 따라서 epicardial 응급 연구 단단한 체 외에 모델을 제공 합니다.
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Protocol
인간의 조직 표본으로 모든 실험 라이덴 대학 메디컬 센터의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 고 헬싱키의 선언에. 모든 단계는 캐비닛 셀 문화 흐름에 멸 균 장비와 함께 수행 됩니다.
1입니다. 준비
- Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM 낮은 포도 당) 및 매체 199 (M199) 1:1 비율로 혼합 하 여 EPDC 매체를 준비 합니다. 10% 열 비활성화 소 태아 혈 청 (FBS, 열 56 ° C에서 25 분 비활성화) 추가 100 U/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스 보충. 사전에 EPDC 매체는 37 ° C 물 욕조에 따뜻한.
- 미리 따뜻하게 트립 신 0.25%/EDTA (1:1) 37 ° C 물 목욕에서.
- 젤라틴과 웰 스 코트. 각 우물에 0.1% 젤라틴/PBS를 추가 하 고 37 ° c.에 적어도 15 분 동안 접시를 품 어 필요한 셀 문화 접시에 대 한 지침 표 1에 요약 되어 있습니다. 조심 스럽게 셀을 도금 하기 전에 모든 액체를 제거.
- 재고 솔루션 10 m SB431542 m (SB), 희석 DMSO (주의)를 준비 합니다. -20 ° c.에서 그들을 저장 고 원뿔 바닥 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜브, Eppendorf 관 처럼 50 µ L aliquots 참고 SB aliquots는 한 번만 해빙 될 수 있습니다.
2. 검색 및 성인 및 태아 심장 표본 저장
- 수술 시 제거 시 직접 인간 성인 auricles 15 mL 50 mL 튜브에 저장 10 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 4 ° c.에 100 mg/mL 스 포함 된 높은 포도 당 DMEM 샘플은 일반적으로 3-5 cm 크기에서 및 최대 저장 될 수 있다 해 부 후 48 h.
- 격리 후 24 h까지 4 ° C에서 EPDC 매체에서 선택 낙태 자료에서 얻은 태아 마음을 저장 합니다. 이 프로토콜에 대 한 샘플을 사용 하 여 12 월 22 일 주 사이 임신 나이. 참고 전체 심 혼은 epicardium의 격리에 대 한 사용할 수 있습니다.
3입니다. 절연 Epicardial 계층의
- 층 류 캐비닛에 PBS 가진 100 m m 세포-배양 접시를 준비 하 고 뚜껑에 PBS의 별도 작은 물방울 (~ 200 µ L)를 배치 합니다. 5 mL 미리 데워 진된 EPDC 매체에 15 mL 튜브를 채우십시오.
- 장소 세포 배양 접시에 조직 PBS 가득합니다. 조직 절차 동안 자주 습 하 게 다는 것을 확인 하십시오.
- 집게를 사용 하 여 그것을 벗 하 여 가능한 조직 샘플에서 epicardial 계층의 제거는 stereomicroscope를 사용 하 여.
참고:로 매우 얇고, 투명 한 레이어는 밀접 하 게 심장 (그림 1A)의 바깥쪽에 준수는 epicardium은 인식할 수 있습니다. 이 격리를 방해 합니다 때문 epicardial 지방 조직 및 혈관으로 오염을 방지 하려고 합니다. - 뚜껑에 PBS의 물방울에 epicardial 조직의 조각을 수집 합니다.
- (그림 1B), 메스를 사용 하 여 또는 작은 집게의 날카로운 팁을 사용 하 여 작은 조각 (0.5 m m3)으로 epicardial 조직을 잘라. 조각을 P1, 전달할 수 있어야 합니다 참고 000 피펫으로 팁 (단계 3.6).
- 1 mL의 트립 신 epicardial 조직에 추가 하 고 조각 및 p1, 000 피펫으로 팁 트립 신 수집. 조직 1.5 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 (그림 1C)로 전송 합니다.
- ~ 60 rpm에서 떨고 있는 동안 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 튜브를 품 어.
- 물 탕에서 튜브를 제거 하 고 70% 에탄올 튜브의 외부를 청소.
- (그림 1D) 관의 바닥에 침 몰 하 고 신중 하 게 상쾌한 비활성화는 트립 신을 5 mL EPDC 매체를 포함 하는 15 mL 튜브에 epicardial 셀을 포함 하는 조직을 허용.
- 1 mL의 트립 신와 원뿔 원심 분리기 튜브에 남아 있는 조직을 보충 하 고 부드럽게 위아래로 pipetting으로 혼합.
- 3.7 3.10 단계를 두 번 반복 합니다. 마지막 단계에서 트립 신 보육의 30 분의 총 후 전송는 상쾌한 고 나머지 epicardial 조직 EPDC 매체를 포함 하는 관으로.
- 모든 세포는 EPDC 매체에 수집 되는 경우 부드럽게 통과 정지 10 mL 주사기 19-게이지 바늘으로 세포 (그림 1E) 기계적으로 해리를 새로운 15 mL 튜브에.
참고: 방해 지 고 바늘을 방지 하기 위해 바늘을 통해 솔루션을 전달 하기 전에 아래로 pipetting으로 현 탁 액을 균질 있는지 확인 합니다. - 더 세포 분열, 21-게이지 바늘 3.12 단계를 반복 합니다.
- 100 µ m 셀 거르는 50 mL 튜브 위에 놓고 10 mL 피 펫을 사용 하 여 모든 나머지 덩어리 (그림 1 층)을 제거 하는 여과기에 epicardial 셀을 포함 하는 매체를 전송 합니다.
- 5 mL EPDC 매체는 여과기에 pipetting 여 잔여 세포를 수집 여과기를 세척.
- 피펫으로 세포 현 탁 액 15 mL 튜브에 50 mL 튜브에서. 이후 셀 튜브의 바닥에 침 몰, pipetting 전에 솔루션 부드럽게 흔들어.
참고:이 단계는 필요 하지, 하는 동안 작은 튜브 원심 분리 후 펠 릿의 시각화를 에이즈. - 실내 온도 (그림 1G)에 5 분 동안 200 x g에서 원심.
- 상쾌한을 제거 하 고 필요한 양의 EPDC 매체 (표 1)에 셀 펠 릿 (그림 1 H) resuspend.
참고: 태아 EPDCs 직접 ALK5 키 니 아 제 억제 물 (EPDC + SB)의 10 µ M를 포함 하는 EPDC 매체를 사용 합니다. 성인 세포 첫 대목 중 SB 없이 도금 될 수 있다. - 세포 현 탁 액에 젤라틴 코팅 배양 배지 (그림 1I) 접시 우물의 크기는 epicardial 조직 샘플 (표 1)의 크기에 따라 달라 집니다. 참고 낮은 confluency 응급의 발생을 유발 한다.
- 37 ° c, 5% CO2 문화 접시에 연결할 셀 수 있도록 적어도 48 h에 대 한 인큐베이터에 셀을 놓습니다.
4입니다. EPDCs의 문화
- EPDC + SB 매체 매 3 일 보충.
- 적어도 3 일 마다 현미경을 사용 하 여 셀을 검사 합니다. 셀 도달 하면 confluency, 즉, 문화 접시 셀으로 완전히 덮여 때, 통로 표면 비율 1: 2에에서 셀. Note confluency 도달 ~ 5-10 일을 걸릴 수 있습니다.
- 매체와 함께, 예를 들면, 유리 피펫으로 피펫으로 또는 포부 시스템을 사용 하 여 발음
- 세포를 PBS를 추가 하 여 셀을 신중 하 게 씻어. 부드럽게 접시 소용돌이 PBS 발음.
- 접시에 트립 신을 추가 합니다. 부드럽게 회전 하는 트립 신으로 모든 세포를 커버 하 고 37 ° c.에 1 분 동안 접시를 품 어 접시
참고: 사용 가능한 작은 트립 신으로 (표시: 6의 당 200 µ L 잘 플레이트) - 접시 접시의 아래쪽에서 세포를 기계적으로 분리를 누릅니다. 현미경을 사용 하 여 시각적으로 세포 분리가 확인. 그렇지 않으면, 추가 분에 대 한 셀 문화 접시를 품 어.
- 셀에 EPDC + SB 매체의 필요한 볼륨을 추가 하 고 아래로, pipetting으로 resuspend 새로운 젤라틴 코팅 문화 접시에 세포 현 탁 액을 전송.
참고: 일반적으로, 세포 수에 보관 통과 8까지 조약돌 형태학.
5입니다. EPDCs 구급 대의 유도
- 세계로 유도 하 trypsin 및 전송 새로운 젤라틴을 셀 4에 설명 된 대로 EPDC + SB 매체에서 표면 비율 1:2 웰 스를 코팅 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 적어도 24 h에 대 한 품 어 세포 분열.
- 확인 경우 confluency은 50-70% 그리고 EPDCs 조약돌 형태학입니다.
참고: Confluency 응급을 EPDCs의 능력을 영향을 줍니다. - 세포에서 매체를 발음 하 고 신중 하 게 PBS와 세포 세척 (단계 4.2.1-참조 4.2.2).
- 1 ng/mL TGFβ3 EPDC 매체에와 세포를 자극 하 고 37 ° c, 5% CO2 5 일 동안 인큐베이터에 넣어. 참고는 자극, 동안 포함 하는 TGFβ3 EPDC 매체 필요가 없습니다 보충 되어야 합니다.
- 셀을 매일 모니터링 합니다. 5 일 후 응급 수술 하는 셀은 스핀 들 모양의 형태 (그림 2A)에 의해 인식 됩니다.
- 문화 스핀 들-모양 EPDCs EPDC 매체에 SB 또는 TGFβ의 추가 없이 4에서 설명 하는 방법. 일반적으로, 스핀 들-모양 EPDCs는 통로 20까지 양식 수 있습니다.
- Immunofluorescent 얼룩과 응급 발생 확인 F-말라 스트레스 섬유 (그림 2B)의 형성을 검출 하기 위하여 엽 마커 αSMA 또는 Vimentin 또는 phalloidin에 의해 항 체를 사용 하 여 또는 qRT-PCR를 사용 하 여 응급 관련 유전자 ( 에 대 한 예를 들어, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Cadherin, MMP3, 달팽이, 민 달팽이) (그림 2C 와 표 2).
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Representative Results
여기, 우리는 인간 성인 그리고 태아 심장 조직 (그림 1)에서 EPDCs를 분리 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 (그림 1A) 심장의 외부에는 epicardium의 쉽게 접근할 수 있는 위치를 활용합니다. 해 부 WT1 + epicardium 기본 subepicardial 기질 및 심근 조직 손상 (그림 1J) 유지 하는 동안 제거 됩니다 보여 줍니다 후 심장 auricle의 얼룩. 광범위 한 특성 EPDCs 익스프레스 epicardial 마커, 예를 들어, 다른 심장 상주 세포 유형, 예를 들면, PECAM1, ISL1, CD34, 및 TNNT2의 ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 및 부족 식 시연 전에 수행 되었습니다. 17
성인 (그림 1 K)와 태아 (그림 1 L) EPDCs 조약돌 형태학 ALK5 kinase 억제제 SB431542 표시의 존재 양식. 그러나, 기증자와 문화 조건에 따라 태아 EPDCs 받을 수 응급 SB의 존재에도 불구 하 고. 이 조약돌 셀 (참조 그림 1 L에에서 화살표)의 인구 내의 스핀 들 모양의 셀에 발생할 수 있습니다. 태아 조직에서 조약돌 모양의 세포의 고립은 항상, 그리고 주로 스핀 들 모양의 셀의 파생 될 수 있습니다 유의 하십시오. 이 세포는 빨리 성장, 이후 그들은 신속 하 게 다른 세포 유형을 자라 다.
명확한 형태 전환 스핀 들 모양의 셀 (그림 2A)에 의해 증명으로 응급 성인 그리고 태아 세포에 5 일 동안 TGFβ320 잠복기에 의해 유도 될 수 있다. 치료 컨트롤 ("Empty")와 같이, 태아 EPDCs 성인 EPDCs TGFβ3와 자극에만 구급 대를 받게 될 것 이다 동안 SB의 제거에 따라 자발적인 구급 대를 받게 된다. 응급의 유효성을 검사 하려면 EPDCs immunostained 알파-부드러운 근육 걸 (αSMA), 엽 표식 (그림 2B)와 함께 했다. 또한, 응급 epicardial 마커의 WT1 qRT-PCR 보여주는 downregulation 엽 마커 POSTN, αSMA, 콜라겐 1A1, MMP3, 및 N-Cadherin (그림 2C)의 upregulation를 사용 하 여 성인 EPDCs에서 확인 됐다. 성인 및 태아 epicardial 응급에 관한 포괄적인 실험17전에 게시 됩니다.
| 조직 | 잘 입력 | 세포 성장 지역 (cm2) | 매체 (mL)의 볼륨 | SB의 추가 |
| 태아 | 24 | 1.9 | 0.5 | 직접 |
| 성인 작은 (< 4cm) | 12 | 3.8 | 1 | 1세인트 통과 후 |
| 큰 성인 | 6 | 9.6 | 2 | 1세인트 통과 후 |
| (> 4 cm) |
표 1: 적절 한 세포 배양 접시를 선택 하기 위한 지침. 필요한 잘 크기 절연 epicardial 셀의 크기에 따라 달라 집니다. 이러한 지침을 적절 한 셀 문화 접시를 선택 엄지손가락의 규칙으로 사용할 수 있습니다.
| 유전자 | 시퀀스 |
| WT1 앞으로 | CAG CTT GAA TGC ATG ACC 안내 |
| WT1 역 | 문신 TCT GTA TTG GGC TCC GC |
| N-Cadherin 앞으로 | CAG ACC GAC CCA AAC AGC AAC |
| N-Cadherin 역 | GCA GCA ACA GTA AGG ACA AAC ATC |
| POSTN 앞으로 | GGA GGC AAA CAG CTC AGA GT |
| POSTN 역 | GGC TGA GGA AGG TGC TAA AG |
| SMA 앞으로 | CCG GGA GAA AAT GAC TCA AA |
| SMA 역 | GAA GGA ATA GCC ACG CTC AG |
| MMP3 앞으로 | TGG ATG CCG 고양이 ATG 아 그 |
| MMP3 역 | CAG AAA TGG CTG 고양이 CGA |
| COL1A1 앞으로 | CCA GAA GAA CTG GTA 고양이 CAG CA |
| COL1A1 역 | CGC 고양이 법 CGA AAT GGG AAT |
| GAPDH 앞으로 | AGC CAC ATC GCT CAG ACA C |
| GAPDH 역 | GCC CAA 전술 GAC CAA ATC C |
| B2M 앞으로 | ACA CTG AAT TCA CCC CCA CT |
| B2M 역 | GCT 전술 ATG TCT CGA TCC CAC T |
표 2: EPDCs에 응급의 유효성 검사에 사용 하는 뇌관 시퀀스. QRT-PCR를 위해 여러 세계로 표현 관련 성인 EPDCs에 유전자 확인 하는 데 사용 하는 정방향 및 역방향 뇌관의 시퀀스입니다.
그림 1 : 절연 Epicardial 파생 셀 (EPDCs). (A) Depicted 얇은 외부 막 층으로, 제거 epicardium 인간의 마음에서 제거 하는 성인 auricle입니다. 검은색 화살표는 epicardium를 가리킵니다. (B-난) EPDCs의 격리 방법의 시각적 표현입니다. 검은색 화살표 셀 펠 릿을 가리킵니다. (J) Immunofluorescent는 epicardium의 절 개 없이 심장 auricle의 얼룩. 눈금 막대: 50 µ m. (K) 대표 사진은 두 개의 다른 성인 EPDC 격리 하고있다 (L) 대표 사진 두 다른 태아 EPDC 격리 하고있다 검은 화살표와 경작의 경작의 태아에 엽 같은 셀 표시 EPDC 문화입니다. 눈금 막대: 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 인간 성인 그리고 태아 Epicardial 파생 셀 (EPDCs)에 응급의 유효성 검사. 성인 및 태아 EPDCs SB, 치료 하지 (비어 있음)와 교양 또는 5 일 동안 TGFβ3와 자극. (A) 대표 밝은 필드 사진. 눈금 막대: 200 µ m. (B) DAPI 및 αSMA Immunostaining. 눈금 막대: 100 µ m. (C) mRNA 수준의 응급 관련 유전자, 성인 EPDCs qRT-PCR를 사용 하 여 결정. 측정된 값 GAPDH 및 B2M 식 정규화 되었다. 값 의미 + SD 2로 묘사 된다 ^-ΔΔct (n = 2). 약어: WT1:Wilms' 종양 1, MMP3: 매트릭스 Metalloproteinase 3, POSTN:Periostin, αSMA: 알파 Col1A1:Collagen 1A1 부드러운 근육 걸. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기 우리는 상세한 프로토콜을 및 문화 기본 epicardial 세포 인간 성인 그리고 태아 심 혼에서 파생 된 설명 합니다. 이러한 세포의 광범위 한 특성은 이전에 게시17이었다. 우리는 두 세포 유형 상피 조약돌 모양의 셀 때 ALK5 키 니 아 제 억제 물 SB431542와 교양으로 유지할 수 있습니다 나타났습니다. 응급 개발 및 후 부상 응답 epicardial 활성화에 vivo에서 의 중요 한 부분 이다. 응급 수 공부 될이 메서드를 사용 하 여 TGFβ의 추가 의하여. 중요 한 것은, 이전 관찰 SB 제거 성인 EPDCs는만 자극17시 응급 수술 하는 동안 태아 EPDCs 빠르게 자발적인 응급을 받아야 합니다. 태아 EPDCs에서이 과정을 공부 하 고 최적의 성인 epicardium 손상 후 활성화 하는 방법을 이해에 도움이 수 있습니다.
제시 방법은 수술 하는 동안 얻은 환자 자료에 의존 합니다. 따라서, 한 중 환자 다양성 또는 자료 운영 극장에서 수집 하는 속도, 절연 재료의 상태에 몇 가지 유사 콘텐츠를 기대할 수 있습니다. 이 변화 절차의 차이 설명할 수 있습니다: 1) 얼마나 쉽게는 epicardium 심근에서 해 부 될 수 있다, 접시, 3) 능력을 방지 하거나 응급, 그리고 4) 확산 속도 받을 준수 2) 고립 된 세포의. 일반적으로, 빠른 격리 세포 생존을 위해 바람직합니다. 중요 한 요점은 심근에서 epicardium 필 링입니다. epicardium 기본 조직을 강하게 준수는, 트립 신으로 심장 조직의 15 분 전처리는 epicardium 보다 쉽게 제거 하 도울 수 있다. 또한, 트립 신 치료의 효능 trypsin 활동과 조직의 구성 등 여러 가지 요인에 따라 달라 집니다. 따라서, 낮은 수익률, 관찰 하는 경우 보육 시간 트립 신을 조정할 수 있습니다. 또한, 아무 셀 펠 릿 아래로 회전 후 보이는 경우에, 솔루션 수도 하지가 되어 완전히 해리 했다 필터를 통해 실행 하기 전에. 주사기를 통해 솔루션을 전달 하거나 추가로 사용 하기 전에 솔루션을 혼합, 작은 주사기 셀을 분리 유용 수 있습니다. EPDCs 시드를 위한 잘 크기는 상피 상태로 유지 하기 위해 셀 수 있도록 신중 하 게 고려해 야 합니다. 표 1 는 표시를 제공 하지만 한 때, 예를 들어 태아 심장의 단지 작은 부분을 사용할 수 있습니다 작은 잘에 도금 보다 편리 하 게이 지침에서 일탈 할 수 있다.
태아 세포는 SB17없이 구급 대를 즉시 받게 될 것 이다, 이후 태아 EPDCs SB와 도금 항상 한다. 그러나, 성인 EPDCs 그들의 상피 형태를 유지 하는 경향이 하 고 따라서 셀 준수를 촉진 하는 첫 대목의 첫 번째 48 h 동안 SB 없이 도금 될 수 있다. 첫 대목, 후 성인 그리고 태아 EPDCs 지속적으로 자발적인 구급 대를 방지 하기 위해 SB와 교양. 또한, 낮은 세포 밀도 응급에 대 한 중요 한 방 아 쇠입니다. EPDCs 한다 따라서 결코 될 교양 50 %confluency 아래. 다른 한편으로, 세계로, 필요한 경우 EPDCs 너무 밀도가 시드되지 않습니다 70 %confluency 아래 숙박 있는지 확인 합니다. 하지만이 프로토콜 사용 TGFβ3, TGFβ1 및-2 자극 뿐만 EPDCs (관찰 되지 않은)에 응급을 유도할 수 있다.
이 프로토콜에서 셀이 때문에 우리는 원심 분리기를 사용 하는 경우 더 낮은 세포 생존을 관찰, 회전 하지 않고 직접 분할 됩니다. 따라서, trypsin의 낮은 볼륨을 사용 하 여 혈 청 포함 매체 추가 될 때 그것의 비활성화를 위해 생명 이다.
~ 6-8 구절, 후 상피 형태와 EPDCs 성장 중지 하거나 또는 자발적으로 구급 대를 받게 될 것 이다. 따라서, 실험을 위해 우리 사용 EPDCs 통로 3 사이의 통로 6 선. 대조적으로, 엽 형태와 EPDCs 덜 취약 하 고 통로 20까지 경작 될 수 있다. 그러나 실험에서, 우리가 사용한 적이 없는 10번째 통과 후 EPDCs 스핀 들.
epicardium 심장의 외부에 있기 때문에 기본 조직에서 분리 하기 쉽습니다, 셀의 신뢰성은 분명 하다, 그리고 중요 한 오염 가능성이 낮습니다. 지방 조직 또는 혈관 때로는 격리 epicardial 계층에 충실, 비록 대부분 그 세포의 고립 동안에 여과기를 통과 하지 않습니다 하 고 그렇지 않으면 EPDC 세포 배양에서 살아남을 수 없다. 또한, 전에 설명 했 듯이, 인간의 재료를 사용 하 여 모델을 제공 합니다 독특한 인간의 epicardial 셀 동작. 를 조사 하 예를 들어, epicardial 지방 조직은 인간의 epicardial 셀 모델21의 필요성을 강조 하는 종 사이 다른 알려져 있습니다.
그것은 심장 auricles 병에 걸리는 마음에 수술 하는 동안 가져온 및 질병, 약물 사용된, 나이, 그리고 기증자의 성별 차이 실험의 재현성 영향을 미칠 수 있으므로 유의 하십시오. 실험은 유효한 결과 얻을 하 고 확실 한 결론을 그릴 수 있도록 몇 가지 격리에 따라서 수행 되어야 한다. 또한, 연구 문제에 따라 하나의 다르게 동작할 것으로 예상 된다 비-허 혈 성 판 막 병 질환 epicardium 허 혈 성 질병을 가진 환자 또는 환자에서 사용 하도록 특별히 선택할 수 있었다.
그것은, epicardial 동작에 대 한 유효한 모델을 제공 함으로써 epicardium 심 방 심장 auricle에서 파생 하는 경우 질문 심 epicardium 심 epicardium2에서 독특한 특성을 있을 수 있습니다 제안 되었습니다. 이런이 맥락에서는 찾을 수 없습니다 차이점 태아 심 방 및 심 실 파생 된 EPDCs (되지 않은 데이터)는 것을 중요 하다. 그러나, 인간의 성인 심 실에서 epicardium를 사용 하 여이 확인 하는 궁극적인 셀 소스 것. 아직, EPDC 절연에 대 한 인간의 성인 심의 큰 견본 수집 매우 환자에 대 한 침략 적 이며 따라서 현재 가능 하지 않습니다이 병원에서.
우리는 SB 항상 태아 EPDCs에 주로 응급을 방지 하기 위해 충분 하지는 않다는 것을 관찰 했다. 때 태아 EPDCs 응급 SB의 존재를 받 다, 우리는 실험에서 그들을 제외 합니다. 결과적으로, 세포 실험에 사용 되는 SB에 상피 표현 형을 유지 하는 그들의 기능에 대 한 선택 됩니다. 우리 가설 태아 세포 응급, 과정에서 특정 임계값을 넘어 이미 수 그리고 SB와 그 억제는 이것을 막을 수 없습니다.
이 epicardial 셀 모델 개발 및 성인 epicardium 조사 수 때문에 여러 응용 프로그램, 있다. 우리 실험실에서 우리는 심장 손상 후 epicardial 재생 응답의 개선에 집중 한다. 성인 EPDCs는 epicardium의 ameliorated 재생 대응에 대 한 잠재적인 치료 약물을 찾을 것을 목표로 하는 구급 대를 유발 하는 화합물을 테스트를 사용할 수 있습니다. 또한, paracrine 신호는 (다시)를 이해 하는 EPDCs에 의해 은닉 하는 요소를 측정 하는 심근을 생성. 또한, 태아 EPDCs는 자연스럽 게 성인 EPDCs에 비해 응급 수술 하는 경향이 관찰, 이후 우리 태아 및 성인 EPDCs의 차이점을 조사 합니다. 증가 태아 활성화의 기본 메커니즘을 결정 성인 심장 epicardial 활성화를 개선 하기 위해 큐를 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 네덜란드 조직에 대 한 과학적 연구 (NWO) (아래 016.146.079) 및 LUMC 연구 친교 AMS, 및 LUMC Bontius Stichting (MJG) 둘 다에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
References
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