Summary
De Epicard speelt een cruciale rol in de ontwikkeling en het herstel van het hart door het verstrekken van cellen en de groei factoren op de myocardiale wand. Hier beschrijven we een methode om cultuur menselijke primaire epicardial cellen, die het mogelijk de studie en vergelijking van de kenmerken van hun ontwikkelings- en volwassen maakt.
Abstract
De Epicard, een epitheliale cellaag die betrekking hebben op het myocardium, heeft een essentiële rol tijdens de ontwikkeling van de cardiale, alsmede in het antwoord van de reparatie van het hart na ischemische schade. Wanneer geactiveerd, ondergaan epicardial cellen een proces dat bekend staat als epitheliale mesenchymale overgang (EMT) om cellen aan de regeneratie myocard. Bovendien draagt de Epicard via secretie van essentiële paracrine factoren. Om ten volle waarderen de regeneratieve potentieel van de Epicard, is een menselijke cel model vereist. Hier duidelijk naar voren komt een nieuwe cel cultuur model voor het primaire epicardial afgeleide cellen (EPDCs) ontlenen menselijke volwassen en foetale cardiale weefsel. Isoleren EPDCs, is de Epicard ontleed aan de buitenkant van het hart model en verwerkt tot een enkele celsuspensie. Vervolgens zijn EPDCs verzinkt en gekweekt in EPDC medium met de ALK 5-kinase inhibitor SB431542 om hun epitheliale fenotype. EMT wordt geïnduceerd door stimulatie met TGFβ. Deze methode activeert, voor de eerste keer, de studie van het proces van menselijke epicardial EMT in een gecontroleerde omgeving, en vergemakkelijkt meer inzicht verwerven in de secretome van EPDCs die kan steun hart regeneratie. Bovendien voorziet deze uniforme aanpak in directe vergelijking van menselijke volwassen en foetale epicardial gedrag.
Introduction
De Epicard, een eencellige epitheliale laag dat enveloppen het hart, is van vitaal belang voor de ontwikkeling van de cardiale en reparatie (herzien in Smits et al. 1). ontwikkelingsachterstand, de Epicard vloeit voort uit de proepicardial-orgel, een kleine structuur gelegen aan de voet van het ontwikkelende hart. Rond ontwikkelings dag E9.5 in muis en 4 weken na conceptie in mens beginnen cellen om te migreren van deze structuur van bloemkool en dekken de ontwikkelende myocard-2. Zodra een eencellige epitheliale laag wordt gevormd, ondergaat een deel van de epicardial cellen epitheliale mesenchymale overgang (EMT). Tijdens de EMT, cellen verliezen hun epitheliale kenmerken, zoals de cel verklevingen, en krijgen een mesenchymale fenotype die geeft hen de capaciteit om te migreren naar de ontwikkelingslanden myocard. De gevormde epicardial afgeleide cellen (EPDCs) kunnen onderscheiden in verschillende cardiale celtypen, met inbegrip van de fibroblasten, zachte spiercellen, en potentieel cardiomyocytes en endotheliale cellen3, hoewel de differentiatie van de laatste twee cell bevolking blijft onderhevig aan debat (herzien in Smits et al. 4). bovendien de Epicard biedt leerzame paracrine signalen naar het myocardium te reguleren zijn groei en vascularisatie5,6,7,8. Meerdere studies hebben aangetoond dat verminderde epicardial formatie tot ontwikkelingsstoornissen gebreken in de hartspier9,10, therapieën11en geleiding systeem12 leidt, nadruk op de essentiële bijdrage van de Epicard tot de vorming van het hart.
Hoewel in het volwassen hart de Epicard aanwezig als een slapende laag is, wordt het geactiveerd op ischemie13. Epicardial reactivering na letsel recapituleert verscheidene van de processen beschreven voor cardiale ontwikkeling, met inbegrip van proliferatie en EMT14, zij het minder efficiënt. Interessant, hoewel het exacte mechanisme niet volledig begrepen is, de bijdrage van de epicardial te repareren kan worden verbeterd door behandeling met, bijvoorbeeld, Thymosin β415 of wijziging van VEGF-A mRNA16, wat resulteert in verbeterd cardiale functie na een myocardinfarct. De Epicard wordt derhalve geacht voor een interessante bron van de cel om endogene reparatie van de gewonde hart.
Mechanismen van de cardiale ontwikkeling zijn het vaak gerecapituleerd tijdens letsel, hoewel op een minder efficiënte wijze. Op zoek naar epicardial activators is het primordiaal dat wij kunnen bepalen en vergelijken van de volledige capaciteit van de foetale en volwassen Epicard. Bovendien, van een therapeutisch oogpunt, het is belangrijk dat we naast dierproeven, kennis over de reactie van de menselijke Epicard uitbreiden. Hier beschrijven we een methode om te isoleren en cultuur van de menselijke volwassen en foetale epicardial afgeleide cellen (EPDCs) in een epitheliale-cel-achtige morfologie en voor het opwekken van de EMT. Met dit model willen we verkennen en vergelijken volwassen en foetale epicardial cel gedrag.
Het belangrijkste voordeel van dit protocol is het gebruik van menselijke epicardial materiaal, dat is niet grondig onderzocht. Nog belangrijker is, biedt het beschreven isolatie en cel cultuur-protocol één uniforme methode om beide foetale en volwassen kasseistrook EPDCs, waardoor een directe vergelijking tussen deze twee mobiele bronnen worden afgeleid. Bovendien, aangezien de Epicard geïsoleerd op basis van de locatie is, het is ervoor gezorgd dat de cellen eigenlijk epicardially afgeleide17.
Menselijke EPDC isolatie methoden zijn eerder vastgesteld, afhankelijk deze meestal van uitgroei protocollen waar stukken van cardiale of epicardial weefsel zijn verzinkt op een cel cultuur schotel18,19. Deze aanpak kiest waardoor specifiek voor cellen die gedeeltelijk verliezen hun epitheliale fenotype om te migreren, en die zijn meer vatbaar voor spontane EMT ondergaan. In het huidige protocol, wordt eerst de Epicard verwerkt tot een enkele cel-oplossing waarmee de geïsoleerde EPDCs hun epitheliale toestand te handhaven. Deze methode biedt daarom een solide in vitro model voor het bestuderen van epicardial EMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten met menselijke weefsels exemplaren werden goedgekeurd door de ethische commissie van het Leids Universitair Medisch centrum en voldoet aan de verklaring van Helsinki. Alle stappen worden uitgevoerd met steriel injectiemateriaal in een cel cultuur stroom kabinet.
1. voorbereiding
- Bereid EPDC medium door het mengen van Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM low-glucose) en Medium 199 (M199) in een 1:1 verhouding. Voeg 10% warmte geïnactiveerd foetale runderserum (FBS, warmte geïnactiveerd gedurende 25 minuten op 56 ° C) en aan te vullen met 100 U/mL penicilline en 100 mg/mL streptomycine. Vooraf warm het medium van de EPDC in een waterbad 37 ° C.
- Vooraf warm trypsine 0.25%/EDTA (1:1) in een waterbad 37 ° C.
- Jas putjes met gelatine. 0,1% gelatine/PBS toevoegen aan elk putje en Incubeer de platen gedurende ten minste 15 minuten bij 37 ° C. Richtsnoeren voor de vereiste cel cultuur plaat zijn samengevat in tabel 1. Verwijder voorzichtig alle vloeistof voordat plating cellen.
- Voorbereiden van een stamoplossing van 10 mM SB431542 (SB), verdund in DMSO (voorzichtig). Breng 50 µL aliquots in conische bodem polypropyleen centrifuge buizen, zoals Eppendorf buizen, en bewaar ze bij-20 ° C. Merk op dat de SB aliquots slechts eenmaal kunnen worden ontdooid.
2. ophalen en opslag van volwassen en foetale hart Specimens
- Opslaan van menselijke volwassen auricles direct na verwijdering tijdens de operatie in een tube van 50 mL met 15 mL high-glucose DMEM met 10% FBS, 100 U/mL penicilline en 100 mg/mL streptomycine bij 4 ° C. Monsters zijn over het algemeen 3-5 cm groot en kan worden opgeslagen tot 48u na dissectie.
- Opslaan van foetale hart verkregen electieve abortus materiaal in EPDC medium bij 4 ° C tot 24 h na isolatie. Voor dit protocol, door monsters te gebruiken met een zwangerschapsduur tussen 12-22 weken. Merk op dat het hele hart kan worden gebruikt voor isolatie van de Epicard.
3. isolatie van de Epicardial laag
- In de laminaire flow kabinet, bereiden een 100-mm-celkweek schotel met PBS en plaats een aparte droplet (~ 200 µL) van PBS in het deksel. Vul een buis 15 mL met 5 mL voorverwarmde EPDC medium.
- Plaats het weefsel in de cultuur van de cel schotel gevuld met PBS. Zorg ervoor dat het weefsel wordt bevochtigd vaak tijdens de procedure.
- Met behulp van een stereomicroscoop, Verwijder zo veel van de epicardial laag uit het weefsel monster mogelijk door peeling het uitschakelen met behulp van de verlostang.
Opmerking: De Epicard kan worden herkend als een zeer dunne, transparante laag strak aan de buitenkant van het hart (figuur 1A vastgehouden). Probeer te voorkomen dat besmetting met epicardial adipeus weefsel en bloedvaten aangezien dit het isolement belemmeren zal. - Het verzamelen van stukken van epicardial weefsel in de druppel van PBS op de deksel.
- Snijd het epicardial weefsel in kleine stukjes (0,5 mm3) met behulp van een scalpel (figuur 1B), of het gebruik van de scherpe toppen van kleine pincet. Merk op dat de stukken moeten kunnen passeren een P1, 000 Pipetteer tip (stap 3.6).
- Voeg 1 mL trypsine aan het epicardial weefsel en het verzamelen van de stukken en trypsine met een P1, 000 Pipetteer tip. Breng het weefsel in een 1.5-mL conische centrifugebuis (Figuur 1 c).
- Incubeer de buis in een waterbad 37 ° C gedurende 10 minuten, terwijl het schudden bij een ~ 60 rpm.
- De buis te verwijderen uit het waterbad en reinig de buitenkant van de buis met 70% ethanol.
- Het toestaan van het weefsel te zinken naar de bodem van de buis (Figuur 1 d) zorgvuldig het supernatant met epicardial cellen die de 15 mL tube met 5 mL EPDC medium om de inactivering van de trypsine.
- Aanvullen van het resterende weefsel in de conische centrifugebuis met 1 mL trypsine en meng door zachtjes op en neer pipetteren.
- Herhaal stap 3,7 tot en met 3.10 twee keer. Bij de laatste stap, na een totaal van 30 min van trypsine incubatie, overdracht van zowel het supernatant en het resterende epicardial weefsel in de buis met EPDC medium.
- Wanneer alle cellen zijn verzameld in EPDC medium, voorzichtig passeren de opschorting een 10 mL spuit met een 19-gauge naald in een nieuwe 15 mL-buis aan de cellen (figuur 1E) mechanisch te distantiëren.
Opmerking: Zorg ervoor dat de schorsing Meng door pipetteren op en neer voordat dit wordt doorgegeven van de oplossing door de naald om te voorkomen dat de naald steeds belemmerd. - Als u wilt verder distantiëren van de cellen, herhaalt u stap 3.12 met een naald 21-gauge.
- Plaats een 100-µm cel zeef boven op een buis van 50 mL en breng het medium met de epicardial cellen op de zeef met behulp van een pipet 10 mL voor het verwijderen van alle resterende klontjes (figuur 1F).
- Wassen van de zeef voor het verzamelen van de resterende cellen door pipetteren 5 mL EPDC medium naar de zeef.
- Pipetteer de celsuspensie uit de buis 50 mL in een buis 15 mL. Aangezien cellen naar de bodem van de buis zinken, schud de oplossing voorzichtig voordat pipetteren.
Opmerking: Hoewel deze stap niet nodig is, helpt een kleinere buis visualisatie van de pellet na het centrifugeren. - Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (figuur 1G).
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel (Figuur 1 H) in de vereiste hoeveelheid EPDC medium (tabel 1).
Opmerking: Voor foetale EPDCs, direct EPDC medium met 10 µM van het ALK5 kinase inhibitor van de omwenteling (EPDC + SB) gebruiken. Volwassen cellen kunnen verguld worden zonder SB tijdens de eerste passage. - Plaat van de celsuspensie op de gelatine gecoat cultuur platen (figuur 1I). De grootte van de put is afhankelijk van de grootte van de steekproef van epicardial weefsel (tabel 1). Merk op dat een lage confluentie het vóórkomen van EMT zal veroorzaken.
- De cellen in de incubator voor ten minste 48 uur bij 37 ° C, 5% CO2 om de cellen te hechten aan de cultuur plaat plaatsen.
4. cultuur van EPDCs
- Vullen het EPDC + SB medium minstens om de 3 dagen.
- Inspecteer de cellen minstens om de 3 dagen met behulp van de Microscoop. Wanneer de cellen bereiken confluentie, passage dat wil zeggen, wanneer de cultuur plaat is volledig bedekt met cellen, de cellen in een oppervlakte verhouding van 1:2. Confluentie bereiken kunt ~ 5-10 dagen duren.
- Het medium met een pipet of een aspiratie systeem, bijvoorbeeldeen glazen pipet gecombineerd.
- De cellen zorgvuldig wassen door PBS toe te voegen aan de cellen. Zachtjes swirl van de plaat en de PBS gecombineerd.
- Trypsine toevoegen aan de plaat. Zachtjes draaien de plaat om te dekken alle cellen met trypsine en Incubeer de plaat voor 1 min bij 37 ° C.
Opmerking: Gebruik als weinig trypsine mogelijk (indicatie: 200 µL per putje van een 6 goed plaat) - Tik op de plaat om mechanisch loskoppelen van de cellen vanaf de onderkant van de plaat. Gebruik de Microscoop visueel controleren als cellen hebben losgemaakt. Als dat niet het geval is, wordt de cel cultuur plaat Incubeer gedurende een minuut extra.
- De vereiste hoeveelheid EPDC + SB medium aan de cellen toevoegen, resuspendeer door pipetteren op en neer en de celsuspensie overbrengen in een nieuwe gelatine gecoat cultuur plaat.
Opmerking: In het algemeen, cellen kunnen worden bewaard in een geplaveide morfologie tot passage 8.
5. de inductie van EMT in EPDCs
- Om te induceren EMT, de cellen met trypsine en de overdracht de cellen die moeten nieuwe gelatine gecoat putten in een verhouding 1:2 oppervlakte in EPDC + SB medium, als omschreven in 4, en incubeer gedurende ten minste 24 uur bij 37 ° C, 5% CO2te distantiëren.
- Selectievakje is als confluency 50-70% en als EPDCs een geplaveide morfologie hebben.
Opmerking: Confluentie heeft invloed op het vermogen van EPDCs om het ondergaan van de EMT. - Het medium van de cellen gecombineerd en wassen van de cellen zorgvuldig met PBS (zie stap 4.2.1 - 4.2.2).
- Stimuleren van de cellen met 1 ng/mL TGFβ3 in EPDC medium en plaats ze in een incubator bij 37 ° C, 5% CO2 voor 5 dagen. Merk op dat tijdens de stimulatie, het medium van de EPDC met TGFβ3 niet hoeft te worden aangevuld.
- De cellen dagelijks controleren. Na 5 dagen, worden cellen die onderging EMT herkend door een spindel-vormig morfologie (figuur 2A).
- Cultuur spindel-vormig EPDCs volgens de methode beschreven in 4 zonder toevoeging van SB of TGFβ aan het EPDC medium. Merk op dat in het algemeen, spindel-vormig EPDCs kan worden gekweekt tot passage 20.
- Het vóórkomen van EMT met immunefluorescentie kleuring valideren met behulp van antilichamen tegen de mesenchymale markeringen αSMA of Vimentin of door phalloidin de vorming van F-actine stress vezels (figuur 2B), of met behulp van qRT-PCR voor EMT-gerelateerde genen ( bijvoorbeeld, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-cadherine, MMP3, slak, Slug) (2C van de figuur en tabel 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We schetsen hier, een eenvoudig protocol om EPDCs isoleren van menselijke volwassen en foetale cardiale weefsel (Figuur 1). Dit protocol maakt gebruik van de gemakkelijk toegankelijke locatie van de Epicard aan de buitenkant van het hart (figuur 1A). Kleuring van de oorschelp hart na dissectie toont aan dat de WT1 + Epicard wordt verwijderd terwijl de onderliggende subepicardial extracellulaire matrix en myocard weefsel intact (figuur 1J blijven). Uitgebreide karakterisering is uitgevoerd vóór, aan te tonen dat EPDCs express epicardial markeringen, bijvoorbeeld, ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 en gebrek aan expressie van andere hart-ingezeten celtypes, bijvoorbeeld, PECAM1, ISL1, CD34 en TNNT2. 17
Zowel volwassene (Figuur 1 K) en foetale (Figuur 1 L) EPDCs gekweekt in aanwezigheid van ALK5 kinase inhibitor SB431542 Toon een geplaveide morfologie. Afhankelijk van de donor en cultuur voorwaarden, kunnen foetale EPDCs echter EMT ondanks de aanwezigheid van SB ondergaan. Dit kan resulteren in spindel-vormig cellen binnen de bevolking van geplaveide cellen (Zie pijlen in Figuur 1 L). Wees u ervan bewust dat het isolement van de kasseien-vormige cellen uit foetaal weefsel niet altijd haalbaar is en in de afleiding van cellen meestal spindel-vormig resulteren kan. Aangezien deze cellen sneller groeien, zullen zij andere celtypes snel overwoekeren.
EMT kan worden opgewekt door aan het broeden met TGFβ320 voor 5 dagen in zowel volwassen en foetale cellen, zoals blijkt uit een duidelijke morfologische overgang naar spindel-vormig cellen (figuur 2A). Zoals aangetoond met de onbehandelde controleren ("leeg"), zal foetale EPDCs ondergaan spontane EMT na verwijdering van SB, terwijl volwassen EPDCs zal slechts EMT ondergaan na stimulatie met TGFβ3. Als u wilt valideren EMT, waren EPDCs immunostained met alpha-gladde spier actine (αSMA), een mesenchymale marker (figuur 2B). Bovendien, EMT werd bevestigd in volwassen EPDCs met qRT-PCR weergegeven: Downregulatie van het epicardial markering WT1 en opregulatie van de mesenchymale markeringen, POSTN, αSMA, collageen 1A1, MMP3 en N-cadherine (figuur 2C). Uitgebreide experimenten met betrekking tot volwassen en foetale epicardial EMT zijn bekendgemaakt vóór17.
| Weefsel | Goed type | Cel groeigebied (cm2) | Volume medium (mL) | Toevoeging van SB |
| Foetale | 24 | 1.9 | 0,5 | Direct |
| Kleine volwassene (< 4 cm) | 12 | 3.8 | 1 | Na 1st passage |
| Volwassene grote | 6 | 9.6 | 2 | Na 1st passage |
| (> 4 cm) |
Tabel 1: Richtsnoer voor het selecteren van de juiste cel cultuur plaat. De vereiste goed grootte is afhankelijk van de hoeveelheid epicardial cellen geïsoleerd. Deze richtsnoeren kunnen worden gebruikt als een vuistregel om te selecteren van de juiste cel cultuur plaat.
| Gen | Volgorde |
| WT1 vooruit | CAG CTT GAA TGC ATG ACC GS |
| WT1 Reverse | TAT TCT GTA TTG GGC TCC GC |
| N-cadherine vooruit | CAG ACC GAC CCA AAC AGC AAC |
| N-cadherine Reverse | GCA GCA ACA GTA AGG ACA AAC ATC |
| POSTN vooruit | GGA GGC AAA CAG CTC AGA GT |
| POSTN Reverse | GGC TGA GGA AGG TGC TAA AG |
| SMA Forward | CCG GGA GAA AAT GAC TCA AA |
| SMA Reverse | GAA GGA ATA GCC ACG CTC AG |
| MMP3 vooruit | TGG ATG CCG KAT ATG AAG |
| MMP3 Reverse | CAG AAA TGG CTG KAT CGA |
| COL1A1 vooruit | CCA GAA GAA CTG GTA KAT CAG CA |
| COL1A1 Reverse | CGC KAT ACT CGA AAT GGG AAT |
| GAPDH vooruit | AGC CAC ATC GCT CAG ACA C |
| GAPDH Reverse | GCC CAA TAC GAC CAA ATC C |
| B2M vooruit | ACA CTG AAT TCA CCC CCA CT |
| B2M Reverse | GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC T |
Tabel 2: Primer sequenties gebruikt voor de validatie van de EMT in EPDCs. Sequenties van voorwaartse en omgekeerde inleidingen voor qRT-PCR gebruikt om dat de uitdrukking van verschillende EMT gerelateerde genen in volwassen EPDCs.
Figuur 1 : Isolatie van Epicardial afgeleide cellen (EPDCs). (A) Depicted is een volwassen oorschelp verwijderd uit het menselijk hart met een dunne membraanachtig buitenlaag, de Epicard, die wordt verwijderd. De zwarte pijl wijst naar de Epicard. (B-ik) Visuele voorstelling van de methode van de isolatie van de EPDCs. De zwarte pijl wijst naar de cel-pellet. (J) immunefluorescentie kleuring van de oorschelp van een hart met en zonder dissectie van de Epicard. Schaal bar: 50 µm. (K) representatieve foto's van twee verschillende volwassen EPDC isolatie gekweekt met SB. (L) representatieve foto's van twee verschillende foetale EPDC isolatie gekweekt met SB. zwarte pijlen geven aan mesenchymale-achtige cellen in foetale EPDC cultuur. Schaal bar: 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Validatie van EMT in menselijke volwassen en foetale Epicardial afgeleide cellen (EPDCs). Volwassen en foetale EPDCs werden gekweekt met SB, niet behandeld (leeg) of gestimuleerd met TGFβ3 voor 5 dagen. (A) representatieve helder veld foto's. Schaal bar: 200 µm. (B) immunokleuring voor DAPI en αSMA. Schaal bar: 100 µm. (C) mRNA niveaus van EMT-gerelateerde genen, bepaald in volwassen EPDCs qRT-PCR gebruikt. Gemeten waarden zijn genormaliseerd naar GAPDH en B2M expressie. Waarden worden afgeschilderd als mean + SD 2 ^-ΔΔct (n = 2). Afkortingen: WT1:Wilms' tumor 1, MMP3: Matrix Metalloproteinase 3, POSTN:Periostin, αSMA: alpha Smooth Muscle actine, Col1A1:Collagen 1A1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol te isoleren en cultuur primaire epicardial cellen afgeleid van menselijke volwassen en foetale hart. Uitgebreide karakterisering van deze cellen geweest eerder gepubliceerde17. We hebben aangetoond dat beide celtypes kunnen worden gehandhaafd als epitheliale cellen van de kasseien-achtige wanneer gekweekt met het ALK5 kinase inhibitor SB431542. EMT is een integraal onderdeel van het epicardial activatie in vivo tijdens zowel de ontwikkeling als de reactie na verwonding. EMT kan worden bestudeerd met behulp van deze methode door toevoeging van TGFβ. Nog belangrijker is, vastgesteld we hebben eerder dat foetale EPDCs snel spontane EMT ondergaan bij SB wordt verwijderd, terwijl volwassen EPDCs ondergaan slechts EMT op stimulatie17. Het bestuderen van deze processen in de foetale EPDCs kan steun bij het begrijpen van de volwassen Epicard optimaal te activeren na beschadiging.
De onderhavige methode berust op de patiënt materiaal, die is verkregen tijdens de operatie. Daarom kan men verschillende varianten in de staat van het materiaal geïsoleerd, die hetzij als gevolg van de variabiliteit van de patiënt of de snelheid waarmee het materiaal wordt verzameld in de operationele theater verwachten. Deze variatie kan verklaren verschillen in de procedure: 1) hoe gemakkelijk de Epicard van het myocardium kan worden ontleed, 2) hechting van geïsoleerde cellen aan de plaat, 3) de mogelijkheid om te voorkomen of het ondergaan van de EMT, en 4) proliferatie snelheid. In het algemeen is een snelle isolatie beter voor de overleving van de cel. Het belangrijkste punt van kritiek is de Epicard van het myocardium peeling. Als de Epicard sterk het onderliggende weefsel wordt nageleefd, kan een 15-min voorbehandeling van de cardiale weefsel met trypsine helpen om de Epicard gemakkelijker verwijderen. De doeltreffendheid van de behandeling van de trypsine is bovendien afhankelijk van verschillende factoren, waaronder de trypsine-activiteit en de samenstelling van het weefsel. Daarom, indien een lage opbrengst wordt waargenomen, de incubatietijd met trypsine kan worden aangepast. Bovendien, als geen cel pellet zichtbaar na spinnen neer is, misschien de oplossing niet hebben zijn volledig los voordat u uitvoert door het filter. Mengen de oplossing voordat de oplossing passeren de spuit of het gebruik van een extra, kan kleinere spuit nuttig zijn voor de cellen van elkaar gescheiden. De grootte van het goed voor het zaaien van EPDCs moet zorgvuldig worden overwogen om ervoor te zorgen dat de cellen hun epitheliale toestand te handhaven. Tabel 1 geeft een indicatie, maar men kan afwijken van deze richtlijn wanneer, bijvoorbeeld, slechts een klein deel van foetale hart kan worden gebruikt en beplating in een kleinere goed is handiger.
Aangezien foetale cellen zal ondergaan EMT onmiddellijk zonder SB17, moeten foetale EPDCs altijd worden bekleed met SB. Echter volwassen EPDCs hebben de neiging om hun epitheliale morfologie en daarom zonder SB kunnen worden verguld gedurende de eerste 48 uur van de eerste passage, ter bevordering van de naleving van de cel. Na de eerste passage, worden zowel de volwassen als de foetale EPDCs continu gekweekt met SB ter voorkoming van spontane EMT. Daarnaast, is lage celdichtheid een belangrijke trigger voor EMT. EPDCs moet daarom nooit onder 50% confluentie worden gekweekt. Aan de andere kant, als EMT gewenst is, zorg ervoor dat EPDCs niet te dicht opeen is geplaatst, en onder de 70% confluentie blijven. Hoewel dit protocol maakt gebruik van TGFβ3, kan stimulatie met TGFβ1 en -2 induceren EMT in EPDCs ook (niet-gepubliceerde opmerkingen).
In dit protocol worden cellen gesplitst rechtstreeks zonder spinnen, aangezien we een lagere overleving van de cel Volg bij het gebruik van de centrifuge. Daarom is het van vitaal belang voor het gebruik van lage volumes van trypsine om haar deactiveren wanneer serum met medium wordt toegevoegd.
Na ~ 6-8 gangen, EPDCs met een epitheliale morfologie ofwel zullen stoppen met groeien of EMT spontaan zal ondergaan. Daarom, voor experimenten, gebruiken we EPDCs tussen passage 3 en passage 6 flansen. Daarentegen is EPDCs met een mesenchymale morfologie zijn minder kwetsbaar en kunnen worden gekweekt tot passage 20. In experimenten, echter hebben wij nooit gebruikt spindel EPDCs na de 10th passage.
Aangezien de Epicard bevindt zich op de buitenkant van het hart en gemakkelijk is te scheiden van de onderliggende weefsel, de authenticiteit van de cellen is duidelijk, en de kans op significante besmetting is laag. Hoewel adipeus weefsel of bloedvaten soms stok aan de geïsoleerde epicardial laag, de meerderheid van deze cellen niet passeert de zeef tijdens het isolement, en anders niet kan overleven in de cultuur van de cel van de EPDC. Bovendien, zoals eerder vermeld, met behulp van menselijk materiaal biedt een uniek model voor het onderzoek naar menselijke epicardial cel gedrag. Het is bekend dat, bijvoorbeeld, epicardial adipeus weefsel tussen soorten verschilt, nadruk op de noodzaak van menselijke epicardial cel modellen21.
Opgemerkt moet worden dat het hart auricles zijn verkregen tijdens de operatie op zieke harten, en daarom de verschillen in ziekte, gebruikte medicatie, leeftijd en geslacht van de donor invloed op de reproduceerbaarheid van de experimenten hebben kunnen. Experimenten moeten dus worden uitgevoerd op verschillende isolatie verkrijgen van geldige resultaten en solide conclusies te worden getrokken. Bovendien, afhankelijk van de onderzoeksvraag, kon men kiezen wil alleen gebruik maken van Epicard van patiënten met ischemische ziekte of patiënten met niet-ischemische valvular ziekte, die verwachting anders gedraagt.
Er is gesuggereerd dat atriale Epicard wellicht verschillende kenmerken van ventrikel Epicard2, een geldig model voorziet daarmee verhoor als Epicard afgeleid van de oorschelp atriale hart met epicardial gedrag. In dit verband is het belangrijk erop te wijzen dat we niet konden vinden verschillen tussen foetale atriale en ventriculaire afgeleid EPDCs (niet-gepubliceerde gegevens). Met behulp van Epicard uit de menselijke volwassen ventrikel zou echter de ultieme mobiele bron om dit te controleren. Nog, verzamelen van grote exemplaren van de menselijke volwassen ventrikels voor EPDC isolatie is zeer invasieve voor de patiënt, en is daarom momenteel niet haalbaar in dit ziekenhuis.
We hebben vastgesteld dat SB niet altijd voldoende is om te voorkomen dat EMT, voornamelijk in de foetale EPDCs. Wanneer foetale EPDCs ondergaan EMT in aanwezigheid van SB, sluiten wij hen uit experimenten. Dientengevolge, worden voor experimenten gebruikte cellen geselecteerd om hun vermogen om het handhaven van een epitheliale fenotype in reactie op SB. We veronderstellen dat foetale cellen reeds boven een bepaalde drempel in het proces van EMT kunnen en dat remming met SB is niet in staat om dit te stoppen.
Dit epicardial cel model kent verschillende toepassingen, aangezien zowel de ontwikkelingslanden als de volwassen Epicard kunnen worden onderzocht. In ons lab, richten we ons op de verbetering van de epicardial regeneratieve reactie na cardiale schade. Volwassen EPDCs kunnen worden gebruikt voor het testen van verbindingen die EMT, gericht op het vinden van een potentiële therapeutische drug voor een ameliorated regeneratieve respons van de Epicard induceren. Daarnaast is het mogelijk om te meten factoren uitgescheiden door EPDCs te begrijpen van de paracrine signalering voor de (her) genereren van myocard. Bovendien, aangezien we waargenomen dat foetale EPDCs meer vatbaar zijn voor het ondergaan van de EMT spontaan in vergelijking met volwassen EPDCs, onderzoeken we de verschillen tussen de foetale en volwassen EPDCs. Bepaling van het onderliggende mechanisme van verhoogde foetale activering kon bieden een cue om activering van het epicardial in de volwassen hart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek wordt ondersteund door de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO) (VENI 016.146.079) en een onderzoek van het LUMC fellowship zowel AMS en LUMC Bontius Stichting (MJG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
References
- Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
- Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).
- Zhou, B., Ma, Q., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
- Smits, A., Riley, P. Epicardium-Derived Heart Repair. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).
- Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor. Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).
- Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).
- Lavine, K. J., Yu, K., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).
- Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).
- Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).
- Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns. Circulation Research. 96 (5), (2005).
- Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).
- van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PloS one. 7 (9), e44692 (2012).
- Zhou, B., Honor, L. B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Smart, N., Bollini, S., et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury. Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).
- Zangi, L., Lui, K. O., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).
- Clunie-O'Connor, C., Smits, A. M., et al. The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).
- Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).
- Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1. Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).
- Chechi, K., Richard, D. Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue. International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).
