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Developmental Biology

El aislamiento y cultivo de células epicárdicas principales derivan de ejemplares de corazón humano adulto y Fetal

doi: 10.3791/57370 Published: April 24, 2018

Summary

El epicardio desempeña un papel crucial en el desarrollo y la reparación del corazón células y factores de crecimiento para la pared miocardio. Aquí, describimos un método para las células epicárdicas primaria humanas cultura que permite el estudio y comparación de sus características de desarrollo y adultos.

Abstract

El epicardio, un capa de células epiteliales que cubre el miocardio, tiene un papel fundamental durante el desarrollo cardíaco, así como en la respuesta de reparación del corazón después de lesión isquémica. Cuando se activa, las células epicárdicas se someten a un proceso conocido como epitelial de transición mesenquimal (EMT) para proporcionar a las células para regenerar miocardio. Además, el epicardio contribuye mediante la secreción de factores paracrinos esencial. Para apreciar el potencial regenerativo del epicardio, se requiere un modelo de célula humana. Aquí esbozamos un modelo de cultura de célula novela para derivar las células derivadas epicárdicas primarias (EPDCs) del tejido cardiaco adulto y fetal humano. Para aislar EPDCs, el epicardio es disecado desde el exterior de la pieza de corazón y transformar en una suspensión unicelular. A continuación, EPDCs son plateados y cultivadas en medio de la CDEP que contiene el inhibidor de la 5-quinasa ALK SB431542 mantener su fenotipo epitelial. EMT es inducida por la estimulación con TGFβ. Este método permite, por primera vez, el estudio del proceso de EMT epicárdico humano en un ambiente controlado y facilita el obtener una visión más clara en el secretoma de EPDCs que puede ayudar a la regeneración del corazón. Además, este enfoque uniforme permite la comparación directa de la conducta humana adulta y fetal epicárdico.

Introduction

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El epicardio, un capa epitelial unicelular que sobres el corazón, es de vital importancia para el desarrollo cardíaco y reparación (revisado en Smits et al. 1). retraso mental, el epicardio deriva el órgano proepicárdicas, una pequeña estructura situada en la base del corazón en desarrollo. Desarrollo día E9.5 en Concepción después de 4 semanas en ser humano y el ratón, las células comienzan a migrar desde esta estructura de coliflor y cubrir el desarrollo del miocardio2. Una vez que se forma una capa única de células epiteliales, una porción de las células epicárdicas sufre epitelial de transición mesenquimal (EMT). Durante la EMT, las células pierden sus características epiteliales, tales como adhesiones célula-célula y obtención un fenotipo mesenquimal que les da la capacidad de migrar en el miocardio en vías de desarrollo. Las células derivadas epicárdicas formadas (EPDCs) pueden distinguir en varios tipos de células cardiacas incluyendo fibroblastos, células musculares lisas y potencialmente cardiomiocitos y células endoteliales3, aunque la diferenciación de estos últimos dos celulares las poblaciones sigue siendo objeto de debate (revisado en Smits et al. 4). Además, el epicardio proporciona señales instructivas paracrina al miocardio para regular su crecimiento y vascularización5,6,7,8. Múltiples estudios han demostrado que formación epicárdica deteriorada conduce a defectos de desarrollo en músculo cardiaco9,10, vasculatura11y conducción sistema12, haciendo hincapié en lo esencial contribución de epicardio a la formación del corazón.

Aunque el epicardio está presente como una capa inactiva en el corazón adulto, se llega a ser reactivado a isquemia13. Después de la lesión epicárdica reactivación recapitulan varios de los procesos describen para el desarrollo cardíaco, incluyendo proliferación y14de la EMT, aunque menos eficientemente. Curiosamente, aunque el mecanismo exacto no se entiende completamente, la contribución epicárdica a reparar se puede mejorar mediante tratamiento con, por ejemplo, timosina β415 o modificado ARNm del VEGF-A16, dando por resultado cardiaco mejoró función después de infarto de miocardio. El epicardio, por tanto, se considera una fuente interesante de celular para mejorar la reparación endógena del corazón lesionado.

Mecanismos del desarrollo cardíaco a menudo son recapitulados durante la lesión, aunque de manera menos eficiente. En busca de activadores epicárdicos, es de suma importancia que podemos determinar y comparar la capacidad total de epicardio fetal y adulto. Por otra parte, desde un punto de vista terapéutico, es importante que, además de los experimentos con animales, ampliamos conocimientos sobre la respuesta del epicardio humana. Aquí, describimos un método para aislar y adulto y fetales epicárdicas derivado las células humanas (EPDCs) en una morfología epitelial-célula-como de la cultura y para inducir la EMT. Con este modelo, nuestro objetivo es explorar y comparar el comportamiento adulto y fetal la célula epicárdico.

La principal ventaja de este protocolo es el uso de material epicárdico humano, que no ha sido bien estudiado. Lo importante, el protocolo de cultivo aislamiento y celular descrito proporciona un método uniforme para derivar ambos EPDCs adoquín fetal y adulto, lo que permite una comparación directa entre estas fuentes de dos células. Además, desde el epicardio está aislado basado en su ubicación, se asegura que las células son realmente epicardially derivada17.

Mientras que previamente se han establecido métodos de aislamiento de DAPC humanos, estos en su mayoría dependen de protocolos de derivación donde se platean pedazos de tejido cardiaco o epicárdico en una célula cultura plato18,19. Este enfoque lo selecciona específicamente por células que pierden parcialmente su fenotipo epitelial para migrar, y que son más propensos a experimentar la EMT espontánea. En el protocolo actual, el epicardio se transforma primero en una solución única célula que permite el EPDCs aislados mantener su estado epitelial. Este método por lo tanto proporciona un modelo sólido en vitro para estudiar la EMT epicárdico.

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Protocol

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Todos los experimentos con muestras de tejido humano fueron aprobados por el Comité de ética de la Leiden University Medical Center y se ajusta a la declaración de Helsinki. Todas las medidas se realizan con equipo estéril en un flujo de la cultura de célula gabinete.

1. preparaciones

  1. Preparar medio de DAPC mezcla de Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM low-glucosa) y medio 199 (M199) en una proporción 1:1. Agregar 10% calor inactiva el suero bovino fetal (FBS, calor inactivada durante 25 minutos a 56 ° C) y completar con 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 mg/mL. Caliente previamente el medio de DAPC en un baño de agua de 37 ° C.
  2. Caliente previamente la tripsina 0.25%/EDTA (1:1) en un baño de agua de 37 ° C.
  3. Pozos de la capa con la gelatina. Añadir 0.1% gelatina/PBS a cada pocillo e incubar las placas durante al menos 15 min a 37 ° C. Directrices para la placa de cultivo celular requiere se resumen en la tabla 1. Retire con cuidado todo el líquido antes de las células de la galjanoplastia.
  4. Preparar una solución stock de 10 mM SB431542 (SB), diluida en DMSO (PRECAUCIÓN). 50 alícuotas de μL en tubos de centrífuga de polipropileno de fondo cónico, como tubos de Eppendorf y almacenar a-20 ° C. Nota que alícuotas SB pueden ser descongelados una sola vez.

2. recuperación y almacenamiento de las muestras del corazón Fetal y adulto

  1. Tienda humanas aurículas adultos directamente en la remoción durante la cirugía en un tubo de 50 mL con 15 mL alta glucosa DMEM con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 mg/mL a 4 ° C. Las muestras son generalmente 3-5 cm de tamaño y se pueden almacenar hasta 48 h después de la disección.
  2. Guarde el corazón fetal obtenidos de material de aborto en medio de la CDEP a 4 ° C hasta 24 horas después de aislamiento. De este protocolo, utilizar muestras con una edad gestacional entre las semanas 12-22. Tenga en cuenta que el corazón entero se puede utilizar para el aislamiento del epicardio.

3. aislamiento de la capa epicárdica

  1. En el gabinete de flujo laminar, preparar un plato de cultivo celular de 100 mm con PBS y coloque una gota de separado (~ 200 μL) de PBS en la tapa. Llene un tubo de 15 mL con medio de DAPC precalentado 5 mL.
  2. Coloque el tejido en el plato de cultivo de células con PBS. Asegúrese de que el tejido se humedece frecuentemente durante el procedimiento.
  3. Mediante un estereomicroscopio, quitar tanto de la capa epicárdica de la muestra de tejido como sea posible por pelar apagado con unas pinzas.
    Nota: El epicardio puede reconocerse como una capa muy fina, transparente firmemente adherido al exterior del corazón (figura 1A). Trate de evitar la contaminación con tejido adiposo epicárdico y los vasos sanguíneos ya que esto obstaculizará el aislamiento.
  4. Recoge piezas de tejido epicárdico en la gota de PBS en la tapa.
  5. Cortar el tejido epicárdico en trozos pequeños (0.5 mm3) usando un bisturí (figura 1B), o usando las afiladas puntas de pinzas pequeñas. Tenga en cuenta que las piezas puedan pasar un P1, 000 punta de la pipeta (paso 3.6).
  6. Añadir 1 mL de tripsina en el tejido epicárdico y recoger los pedazos y tripsina con un P1, 000 punta de la pipeta. Transferir el tejido en un tubo de centrífuga cónico de 1,5 mL (figura 1).
  7. Incubar el tubo en un baño de agua de 37 ° C durante 10 min, agitando a ~ 60 rpm.
  8. Retire el tubo del baño y limpie el exterior del tubo con etanol al 70%.
  9. Permitir que el tejido se hunden hasta el fondo del tubo (figura 1) y transferir cuidadosamente el sobrenadante que contiene las células epicárdicas al tubo de 15 mL que contiene 5 mL medio de DAPC para inactivar la tripsina.
  10. Reponer el tejido restante en el tubo de centrífuga cónico con tripsina 1 mL y mezclar pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
  11. Repita el paso 3.7 a 3.10 dos veces. En la etapa final, después de un total de 30 min de incubación de la tripsina, transferir el sobrenadante y el restante tejido epicárdico en el tubo que contiene medio de DAPC.
  12. Cuando todas las células se recogen en medio de la CDEP, suavemente pasar la suspensión a través de una jeringa de 10 mL con una aguja de calibre 19 a un nuevo tubo de 15 mL a disociar mecánicamente las células (Figura 1E).
    Nota: Asegúrese de homogeneizar la suspensión mediante pipeteo arriba y abajo antes de pasar la solución a través de la aguja para evitar que la aguja que obstruye.
  13. Para más disociar las células, repita el paso 3.12 con una aguja de calibre 21.
  14. Coloque un colador celular de 100 μm en la parte superior un tubo de 50 mL y transferir el medio que contiene las células epicárdicas en el filtro con una pipeta de 10 mL para eliminar los grupos restantes (Figura 1F).
  15. Lave el filtro para recoger células residuales mediante pipeteo medio de DAPC 5 mL en el colador.
  16. Pipetear la suspensión de la célula del tubo 50 mL en un tubo de 15 mL. Puesto que las células se hunden hasta el fondo del tubo, agite suavemente la solución antes de pipetear.
    Nota: Aunque este paso no es necesario, un tubo más pequeño ayuda a la visualización de la pelotilla después de la centrifugación.
  17. Centrifugue a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente (figura 1).
  18. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células (figura 1 H) en el volumen requerido de medio CDEP (tabla 1).
    Nota: Para EPDCs fetales, utilizar directamente medio DAPC conteniendo 10 μm ALK5 kinase del inhibidor de la (DAPC + SB). Las células adultas se pueden platear sin SB durante el primer paso.
  19. Placa de la suspensión de células en las placas recubierta de gelatina (figura 1I). El tamaño del pozo depende del tamaño de la muestra de tejido epicárdico (tabla 1). Nota que confluencia baja induce la ocurrencia de la EMT.
  20. Colocar las células en la incubadora durante al menos 48 h a 37 ° C, 5% CO2 para permitir que las células fijar a la placa de cultivo.

4. cultura de EPDCs

  1. Reponer el medio DAPC + SB al menos cada 3 días.
  2. Inspeccione las celdas por lo menos cada 3 días con el microscopio. Cuando las células alcanzan confluencia, es decir, cuando la placa de cultivo se cubre totalmente con las células, las células en una proporción de 1:2 superficie del paso. Tenga en cuenta que llegar a confluencia puede tomar ~ 5-10 días.
    1. Aspire el medio con una pipeta o un sistema de aspiración, por ejemplo, una pipeta de vidrio.
    2. Lave cuidadosamente las células mediante la adición de PBS a las células. Suavemente la placa del remolino y aspirar el PBS.
    3. Añadir tripsina a la placa. Gire suavemente la placa para cubrir todas las celdas con tripsina e Incube la placa durante 1 min a 37 ° C.
      Nota: Utilizar como tripsina poco como sea posible (indicación: 200 μL por pozo de 6 bien la placa)
    4. Toque en la placa para separar mecánicamente las células de la parte inferior de la placa. Utilizar el microscopio para comprobar visualmente si las células han separado. Si no, incubar la placa de cultivo celular por un minuto.
    5. Añadir el volumen necesario de medio DAPC + SB a las células, suspender mediante pipeteo arriba y abajo y transferir la suspensión a una placa de cultivo gelatina cubierta nueva.
      Nota: en general, las células pueden tener una morfología de adoquines hasta el paso 8.

5. inducción de la EMT en EPDCs

  1. Para inducir la EMT, disociar las células con tripsina y transferencia de las células a la nueva gelatina cubierto de pozos en una proporción de superficie de 1:2 en medio de la CDEP + SB, como se describe en 4 e incuban durante al menos 24 h a 37 ° C, 5% CO2.
  2. Compruebe si confluency es 50-70% y si EPDCs tienen una morfología de adoquines.
    Nota: Confluencia afecta la capacidad de EPDCs a EMT.
  3. Aspirar el medio de las células y lavar las células con PBS (vea el paso 4.2.1 - 4.2.2).
  4. Estimular las células con 1 ng/mL TGFβ3 en medio DAPC y colocarlos en una incubadora a 37 ° C, 5% CO2 durante 5 días. Tenga en cuenta que durante la estimulación, el medio de DAPC con TGFβ3 no tiene que ser reemplazados.
  5. Monitorear diariamente las células. Después de 5 días, las células que experimentaron la EMT son reconocidas por una morfología en forma de huso (figura 2A).
  6. Cultura en forma de huso EPDCs según el método descrito en 4 sin adición de SB o TGFβ al medio de DAPC. Tenga en cuenta que en general, fusiformes EPDCs puede cultivarse hasta el paso 20.
  7. Validar la ocurrencia de la EMT con la tinción de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos contra la vimentina marcadores mesenquimales αSMA o phalloidin para detectar la formación de fibras de estrés de F-actina (figura 2B), o uso de qRT-PCR para genes relacionados con la EMT ( por ejemplo,, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Caderina, MMP3, Snail, Slug) (figura 2 y tabla 2).

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Representative Results

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Aquí, describimos un protocolo sencillo para aislar EPDCs de tejido humano adulto y fetal cardiaco (figura 1). Este protocolo aprovecha la ubicación fácilmente accesible del epicardio en la parte exterior del corazón (figura 1A). La coloración de la aurícula del corazón después de disección demuestra que el WT1 + epicardio se retira mientras que la subyacente subepicárdico matriz extracelular y tejido miocárdico permanecen intactos (Figura 1J). Amplia caracterización se ha realizado antes, demostrando que EPDCs expresan marcadores epicárdicos, p. ej., ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 y falta la expresión de otros tipos de la célula reside en el corazón, por ejemplo, PECAM1, ISL1, CD34 y TNNT2. 17

Adulto (figura 1 K) y fetal (figura 1 L) EPDCs cultivan en presencia de show de ALK5 kinase inhibidor SB431542 una morfología de adoquines. Sin embargo, dependiendo de las condiciones del donante y de la cultura, EPDCs fetales pueden someterse a EMT a pesar de la presencia de SB. Esto puede resultar en células spindle-shaped dentro de la población de células de adoquines (ver flechas en la figura 1 L). Tenga en cuenta que el aislamiento de células con forma de guijarro de tejido fetal no siempre es factible y puede resultar en la derivación de células spindle-shaped sobre todo. Puesto que estas células crecen más rápido, ellos rápidamente cubran otros tipos celulares.

EMT puede ser inducida por incubación con TGFβ320 por 5 días en células de adulto y fetales, como lo demuestra una transición clara morfológica de células fusiformes (figura 2A). Como se demuestra con el control sin tratar ("vacío"), EPDCs fetales se someterá a EMT espontánea sobre retiro de SB, mientras que EPDCs adultos experimentarán sólo EMT sobre el estímulo con TGFβ3. Para validar el EMT, EPDCs immunostained con la actinia alfa-lisa del músculo (αSMA), un marcador mesenquimal (figura 2B). Además, EMT fue confirmada en adultos EPDCs mediante qRT-PCR muestra downregulation del marcador epicárdico WT1 y upregulation de marcadores mesenquimales POSTN, αSMA, colágeno 1A1, MMP3 y N-Cadherin (figura 2). Globales experimentos sobre EMT epicárdico adulto y fetal se publican antes de17.

Tejido Tipo de bien Zona de crecimiento celular (cm2) Volumen de medio (mL) Además de SB
Fetal 24 1.9 0.5 Directamente
Adulto pequeño (< 4 cm) 12 3.8 1 Después de 1 paso dest
Adulto grande 6 9.6 2 Después de 1 paso dest
(> 4 cm)

Tabla 1: Guía para la selección de la placa de cultivo celular adecuado. El tamaño bien requerido depende de la cantidad de las células epicárdicas aislado. Estas directrices pueden utilizarse como una regla para seleccionar la placa de cultivo celular adecuado.

Gene Secuencia de
WT1 adelante CAG CTT GAA TGC ATG CAC TG
Inversa de WT1 TAT TCT GTA TTG GGC TCC GC
N-cadherina hacia adelante CAG CAC GAC CCA AAC AAC DE AGC
Inversa de N-cadherina ACG ACA ACG GTA AGG ACA AAC ATC
POSTN adelante GGA GGC CAG AAA CTC AGA GT
POSTN inversa GGC TGA GGA AGG TGC TAA AG
Avance de SMA CCG GGA GAA AAT GAC TCA AA
SMA Reverse GAA GGA ATA GCC ACG CTC AG
MMP3 adelante TGG CCG DE ATG ATG CAT AAG
MMP3 inversa CAG AAA TGG CTG CGA DE GATO
COL1A1 adelante CCA GAA GAA CTG GTA GATO CAG CA
COL1A1 inversa CGC CAT LEY CGA AAT GGG AAT
GAPDH adelante AGC CAC ATC GCT CAG ACA C
GAPDH inversa CCG CAA TAC GAC CAA ATC C
B2m adelante ACA CTG AAT TCA CCA CCC CT
Inversa de B2m GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC T

Tabla 2: secuencias de la cartilla utilizadas para validación de la EMT en EPDCs. Secuencias de primers adelante y atrás utilizadas para qRT-PCR para determinar la expresión de la EMT varias relacionadas con genes en EPDCs adultos.

Figure 1
Figura 1 : Aislamiento del epicardio deriva de las células (EPDCs). (A) aquí presentados es una aurícula adultos extraído el corazón humano con una delgada capa membranosa externa, el epicardio, que se quita. La flecha negra señala el epicardio. (B-I) Representación visual del método de aislamiento de EPDCs. La flecha negra señala el sedimento celulares. (J) coloración inmunofluorescente de una aurícula del corazón con o sin disección del epicardio. Barra de escala: 50 μm. (K) con cuadros representativos de dos diferentes aislamientos de DAPC adultos con cuadros representativos de SB (L) de dos diferentes aislamientos de DAPC fetales con flechas SB negro indican las células mesenquimales como fetal Cultura de DAPC. Barra de escala: 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Validación de EMT en adulto y fetal epicárdico derivados de células humanas (EPDCs). Adulto y fetales EPDCs fueron cultivados con SB, no tratado (vacía) o estimularon con TGFβ3 durante 5 días. Fotos de representante de campo brillante (A). Barra de escala: 200 μm. (B) Immunostaining para DAPI y αSMA. Barra de escala: 100 μm. (C) niveles mRNA de genes relacionados con la EMT, en adultos EPDCs mediante qRT-PCR. Valores medidos se normalizaron a la expresión de la GAPDH y B2M. Los valores se representan como media + 2 SD ^-ΔΔct (n = 2). Las abreviaturas: Tumor de WT1:Wilms 1, MMP3: matriz metaloproteinasa 3, POSTN:Periostin, αSMA: alfa actina de músculo liso, Col1A1:Collagen 1A1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Aquí describimos un protocolo detallado para aislar y la cultura primarias epicárdicas células derivadas de los corazones humanos adultos y fetales. Amplia caracterización de estas células ha sido previamente publicado17. Hemos demostrado que se pueden mantener ambos tipos de células como las células epiteliales de adoquines-como cuando se cultivan con el inhibidor de la cinasa del ALK5 SB431542. EMT es una parte integral de activación epicárdica en vivo durante el desarrollo y la respuesta posterior a la lesión. EMT se puede estudiar con este método por adición de TGFβ. Lo importante, anteriormente observamos que EPDCs fetales rápidamente sometido a EMT espontánea cuando SB se retira, mientras EPDCs adulto sólo se someten a EMT sobre estimulación17. Estudio de estos procesos en EPDCs fetales puede ayudar a entender cómo activar óptimamente el epicardio adultos después del daño.

El método presentado se basa en material del paciente, que se obtiene durante la cirugía. Por lo tanto, puede esperarse algunas variaciones en el estado del material aislado, que son debido a la variabilidad del paciente o la velocidad a la que el material se recoge en el quirófano. Esta variación puede explicar las diferencias en el procedimiento: 1) cómo fácilmente el epicardio puede ser disecado del miocardio, 2) adherencia de células aisladas a la placa, 3) la capacidad de prevenir o someterse a la EMT y la velocidad de proliferación 4). En general, un aislamiento rápido es preferible para la supervivencia de la célula. El principal punto crítico está pelando el epicardio del miocardio. Si el epicardio está fuertemente adherido al tejido subyacente, puede ayudar un tratamiento previo de 15 minutos del tejido cardiaco con tripsina para eliminar más fácilmente el epicardio. Además, la eficacia del tratamiento de tripsina depende de varios factores, incluyendo la actividad de la tripsina y la composición del tejido. Por lo tanto, si se observa un bajo rendimiento, puede ajustarse el tiempo de incubación con tripsina. Además, si no hay precipitado de células es visible después de girar hacia abajo, la solución podría no han sido completamente disociada antes de ejecutar a través del filtro. Mezclar la solución antes de pasar la solución de la jeringa o usar un suplemento, jeringa más pequeña podría ser útil para disociar las células. El tamaño bien para sembrar EPDCs debe considerarse cuidadosamente para mantener su estado epitelial de las células. La tabla 1 da una indicación, pero uno puede desviarse de esta pauta cuando, por ejemplo, puede utilizar sólo una pequeña parte del corazón fetal y siembra en un menor bien es más conveniente.

Pues las células fetales se EMT inmediatamente sin SB17, EPDCs fetales siempre deben ser plateados con SB. Sin embargo, EPDCs adultos tienden a mantener su morfología epitelial y por lo tanto pueden ser sin SB durante las primeras 48 h del primer paso para promover la adhesión de la célula. Después del primer paso, EPDCs adulto y fetales se cultivan continuamente con SB para evitar EMT espontánea. Además, la densidad celular baja es un disparador importante para EMT. EPDCs por lo tanto no se deben cultivar por debajo de 50% de confluencia. Por otro lado, si se desea EMT, asegúrese de que EPDCs se siembran no demasiado densamente y permanecer por debajo de la confluencia de 70%. Aunque este protocolo utiliza TGFβ3, estimulación con TGFβ1 y -2 puede inducir EMT en EPDCs así (observaciones inéditas).

En el presente Protocolo, las células se dividen directamente sin girar hacia abajo, ya que observamos una menor supervivencia de la célula cuando se usa la centrífuga. Por lo tanto, es vital utilizar volúmenes bajos de la tripsina para su desactivación cuando se agrega el medio que contenga suero.

Después de ~ 6-8 pasajes, EPDCs con una morfología epitelial o bien dejará de crecer o en EMT espontáneamente. Por lo tanto, para los experimentos, utilizamos el adoquín EPDCs entre el paso 3 y paso 6. En cambio, EPDCs con una morfología mesenquimal son menos vulnerables y pueden ser cultivadas hasta el paso 20. En experimentos, sin embargo, nosotros nunca hemos utilizado del huso EPDCs después del paso 10 delth .

Desde el epicardio está situado en la parte exterior del corazón y es fácil de separar del tejido subyacente, la autenticidad de las células es evidente, y la posibilidad de contaminación significativa es baja. Aunque el tejido adiposo o los vasos sanguíneos a veces se pega a la capa epicárdica aislada, la mayoría de las células no pasará el filtro durante el aislamiento y de lo contrario no puede sobrevivir en cultivo celular de DAPC. Además, como se mencionó anteriormente, utilizando material humano proporciona un modelo único para investigar el comportamiento de células humanas epicárdica. Se sabe que, por ejemplo, el tejido adiposo epicárdico es diferente entre especies, haciendo hincapié en la necesidad de modelos de células humanas epicárdico21.

Cabe señalar que las aurículas del corazón se obtuvieron durante la cirugía en el corazón enfermo, y por lo tanto las diferencias en la enfermedad, medicación usada, edad y sexo del donante pueden influir en la reproducibilidad de los experimentos. Por lo tanto deben realizar experimentos en varios aislamientos para obtener resultados válidos y permitir establecer conclusiones sólidas. Además, dependiendo de la pregunta de investigación, se podría elegir específicamente a sólo utilizar epicardio de pacientes con enfermedad isquémica o no isquémica enfermedad valvular, que espera que se comporten diferentemente.

Se ha sugerido que atrial epicardio puede tener distintas características del ventrículo epicardio2, lo preguntan si epicardio deriva de la aurícula del corazón aurícula proporciona un modelo válido para comportamiento epicárdico. En este contexto, es importante señalar que no encontramos diferencias entre fetal atriales y ventriculares derivan EPDCs (datos no publicados). Sin embargo, usando el epicardio del ventrículo adulto humano sería la fuente de la última celda para comprobar esto. Sin embargo, toma de muestras grandes de ventrículos humanos adultos para aislamiento de DAPC es altamente invasiva para el paciente y por lo tanto actualmente no es factible en este hospital.

Observamos que la SB no es siempre suficiente para evitar que la EMT, principalmente en EPDCs fetales. Cuando EPDCs fetos someterse a EMT en presencia de SB, nos excluirlas de los experimentos. Como consecuencia, las células utilizadas para los experimentos se seleccionan por su capacidad para mantener un fenotipo epitelial en respuesta a SB. Presumimos que las células fetales pueden ser ya más allá de un cierto umbral en el proceso de EMT, y que la inhibición con SB no es capaz de detener esto.

Este modelo de celular epicárdico tiene varias aplicaciones, ya que los países en desarrollo y adultos epicardio pueden ser investigados. En nuestro laboratorio, nos centramos en la mejora de la respuesta regenerativa epicárdica después de daño cardíaco. EPDCs adultos pueden utilizarse para probar compuestos que inducen la EMT, con el objetivo de encontrar una droga terapéutica potencial para una respuesta regenerativa ameliorated del epicardio. Además, es posible medir factores secretados por EPDCs a comprender la paracrina de señalización para la (re) generar miocardio. Además, puesto que observamos que EPDCs fetales son más propensos a experimentar la EMT espontáneamente en comparación con adultos EPDCs, investigamos las diferencias entre las EPDCs fetales y adulto. Determinar el mecanismo subyacente de más activación fetal podría proporcionar una clave para mejorar la activación epicárdica en el corazón adulto.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación es apoyada por la organización de países bajos para la investigación científica (NWO) (VENI 016.146.079) y una beca de investigación LUMC a AMS y Stichting LUMC de Bontius (MJG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX Gibco 21885-025
Medium 199  Gibco 31150-022
Fetal Bovine Serum  Gibco 10270-106
Trypsin 0.25% Invitrogen 25200-056
Penicillin G sodium salt Roth HP48
Streptomycin sulphate Roth HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas Serva 37289
EDTA Sigma E4884
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890
Culture plates 6 well Greiner bio-one 657160
Culture plates 12 well Corning 3512
Culture plates 24 well Greiner bio-one 662160
SB 431542 Tocris 1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Merck 102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips Corning 4809
10-ml pipet Greiner bio-one 607180
5-ml pipet Greiner bio-one 606180
Cell culture dish 100/20 mm Greiner bio-one 664160
PBS Gibco 10010056 Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL Eppendorf 0030120086
15-ml centrifuge tubes Greiner bio-one 188271
50-ml centrifuge tubes Greiner bio-one 227261
10 mL Syringe Becton Dickinson 305959
Needles 19 Gauge Becton Dickinson 301700
Needles 21 Gauge Becton Dickinson 304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm Greiner bio-one 542000
TGFβ3  R&D systems 243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle Sigma A2547 
Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Invitrogen A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen A12379
Equipment
Name Company Catalog Number Comments
Pipet P1,000 Gilson F123602
Pipet controller Integra 155 015
Stereomicroscope Leica M80
Inverted Light Microscope Olympus CK2
Centrifuge Eppendorf 5702
Waterbath GFL 1083

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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El aislamiento y cultivo de células epicárdicas principales derivan de ejemplares de corazón humano adulto y Fetal
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Dronkers, E., Moerkamp, A. T., van Herwaarden, T., Goumans, M. J., Smits, A. M. The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens. J. Vis. Exp. (134), e57370, doi:10.3791/57370 (2018).More

Dronkers, E., Moerkamp, A. T., van Herwaarden, T., Goumans, M. J., Smits, A. M. The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens. J. Vis. Exp. (134), e57370, doi:10.3791/57370 (2018).

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