Summary
Epicardium spiller en avgjørende rolle i utviklingen og reparasjon av hjertet celler og vekstfaktorer på hjerteinfarkt veggen. Her beskriver vi en metode å kultur menneskelige primære epicardial celler som muliggjør studiet og sammenligning av karakteristikkene utviklingsmessige og voksne.
Abstract
Epicardium, en epitelcellelaget som dekker myokard, har en viktig rolle under hjerte utvikling og reparasjon svar hjertet etter iskemiske skader. Når aktivert, gjennomgå epicardial celler en prosess kjent som epithelial mesenchymal overgang (EMT) å gi cellene regenerating myokard. Videre bidrar epicardium via utskillelsen av viktige paracrine faktorer. For fullt ut regenerativ potensialet i epicardium, kreves det en human celle modell. Her skissere vi en roman celle kultur modell å utlede primære epicardial avledet celler (EPDCs) fra menneskelige voksne og fosterets hjerte vev. For å isolere EPDCs, er epicardium dissekert fra utsiden av hjertet prøven og behandlet i en enkeltcelle suspensjon. Deretter er EPDCs belagt og kultivert i EPDC medium som inneholder den ALK 5-kinase inhibitor SB431542 å opprettholde deres epithelial fenotypen. EMT er indusert ved stimulering med TGFβ. Denne metoden muliggjør, for første gang, studiet av menneskelig epicardial EMT i en kontrollert setting, og Letter å få mer innsikt i secretome av EPDCs som kan hjelpe hjertet gjenfødelse. Videre tillater denne uniform direkte sammenligning av menneskelig voksne og fosterets epicardial atferd.
Introduction
Epicardium, en enkeltcelle epiteliale lag at konvolutter hjertet, er av avgjørende betydning for hjerte utvikling og reparasjon (omtalt i Smits et al. 1). developmentally, epicardium oppstår fra proepicardial orgel, en liten struktur ligger ved foten av utvikle hjerte. Rundt utviklingsmessige dag E9.5 i mus og 4 uker etter unnfangelsen i menneskelig begynner celler å migrere fra denne blomkål strukturen og dekke utvikle myokard2. Når en enkelt epitelcellelaget er dannet, gjennomgår en del av de epicardial cellene epithelial mesenchymal overgang (EMT). Under EMT, cellene mister deres epithelial egenskaper, for eksempel celle-celle adhesjon, og få en mesenchymal fenotypen som gir dem kapasitet til å overføre til utvikle myokard. Dannet epicardial avledet celler (EPDCs) kan skille ut flere cardiac celletyper inkludert fibroblaster, glatt muskelceller, og potensielt cardiomyocytes og endotelceller3, selv om differensiering av sistnevnte to celle bestander fortsatt debatt (omtalt i Smits et al. 4). dessuten epicardium gir lærerikt paracrine signaler til myokard å regulere sin vekst og endometrial blodkar5,6,7,8. Flere studier har vist at svekket epicardial formasjon fører til utviklingsmessige feil i Hjertemuskel9,10, blodkar11og ledning systemet12, understreker vesentlige bidrag av epicardium til dannelse av hjertet.
Selv i voksen hjertet av epicardium finnes som en sovende lag, blir det reaktivert ved iskemi13. Epicardial reaktivering etter skade viser flere av prosessene beskrevet for hjerte utvikling, inkludert spredning og EMT14, om enn mindre effektivt. Interessant, selv om den eksakte mekanismen ikke er fullt ut forstått, epicardial bidrag til å reparere kan forbedres ved behandling med f.eksThymosin β415 eller endret VEGF-A mRNA16, som resulterer i ameliorated hjerte funksjonen etter hjerteinfarkt. Epicardium er derfor betraktes en interessant celle kilde å forbedre endogene reparasjon av skadet hjertet.
Mekanismer av cardiac utvikling er ofte recapitulated under skade, men i en mindre effektiv måte. Søk epicardial aktivator er det viktig at vi kan finne og sammenligne hele kapasiteten på fosterets og voksen epicardium. Videre fra en terapeutisk synspunkt er det viktig at i tillegg til dyreforsøk, vi utvide kunnskap om responsen av den menneskelige epicardium. Her beskriver vi en metode å isolere og kultur menneskelige voksne og fosterets epicardial avledet celler (EPDCs) i en epithelial-cellen som morfologi og å indusere EMT. Med denne modellen, har vi som mål å utforske og sammenligne voksne og fosterets epicardial celle atferd.
Den største fordelen med denne protokollen er bruk av menneskelige epicardial materiale, som ikke har blitt grundig undersøkt. Viktigere, gir beskrevet isolasjon og celle kultur protokollen en enkelt uniform metode til å utlede både fosterets og voksen brolegge EPDCs, aktivere en direkte sammenligning mellom disse to cellen kilder. I tillegg, siden epicardium er isolert basert på beliggenheten, er det sikret at cellene er faktisk epicardially avledede17.
Mens menneskelig EPDC isolasjon metoder har blitt opprettet tidligere, stole disse meste på utvekst protokoller der stykker av hjerte- eller epicardial vev er belagt på en celle kultur parabol18,19. Denne tilnærmingen velger dermed spesielt for celler som delvis mister deres epithelial fenotypen for å overføre, og det er flere liggende å gjennomgå spontan EMT. I gjeldende protokollen behandles først til epicardium i en enkelt celle løsning som kan de isolerte EPDCs å opprettholde sin epithelial tilstand. Denne metoden gir derfor en solid i vitro modell for å studere epicardial EMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter med menneskelige vevsprøver ble godkjent av etikk i Leiden University Medical Center og overholder erklæring i Helsinki. Alle trinnene utføres sterilt utstyr i en celle kultur strøm kabinett.
1. forberedelser
- Klargjør EPDC medium ved å blande Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM lav-glukose) og middels 199 (M199) i en 1:1 ratio. Legge til 10% varme inaktivert fosterets bovin serum (FBS, varme inaktivert for 25 min på 56 ° C) og supplere med 100 U/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin. Forvarm EPDC medium i en 37 ° C vannbad.
- Forvarm Trypsin 0.25%/EDTA (1:1) i et 37 ° C vannbad.
- Coat brønner med gelatin. Legge til 0,1% gelatin/PBS hver brønn og ruge platene i minst 15 min på 37 ° C. Retningslinjer for nødvendige celle kultur plate oppsummeres i tabell 1. Forsiktig fjerne alle væske før plating celler.
- Forberede en lagerløsning 10 mm SB431542 (SB), fortynnet i DMSO (advarsel). Gjøre 50 µL dele i konisk bunnen polypropylen sentrifuge rør, som Eppendorf rør, og lagre dem på 20 ° C. Merk at SB dele kan tines bare én gang.
2. henting og lagring av voksne og fosterets hjerte
- Lagre menneskelige voksne auricles direkte på fjerning under operasjonen i en 50-mL tube med 15 mL høy-glukose DMEM inneholder 10% FBS, 100 U/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin på 4 ° C. Eksempler er vanligvis 3-5 cm i størrelse og kan lagres opptil 48 timer etter disseksjon.
- Lagre fosterets hjerte innhentet fra valgfag abort materiale i EPDC medium på 4 ° C opptil 24 timer etter isolasjon. For denne protokollen, kan du bruke prøver med en gestasjonsalder mellom 12-22 uker. Merk at hele hjerte kan brukes for isolering av epicardium.
3. isolering av Epicardial laget
- I laminær strømning skap, forberede en 100 mm celle-kultur parabol med PBS og plassere en separat dråpe (~ 200 µL) PBS i lokket. Fyll en 15-mL tube med 5 mL forvarmes EPDC medium.
- Stedet vevet i cellekultur parabolen fylt med PBS. Kontroller at vevet er fuktet ofte under prosedyren.
- Bruker en stereomicroscope, fjerne så mye av det epicardial laget fra Vevsprøve som mulig ved peeling det av ved hjelp av pinsett.
Merk: Epicardium kan gjenkjennes som en svært tynn, gjennomsiktig lag strengt overholdt utsiden av hjertet (figur 1A). Prøve å unngå forurensning med epicardial fettvev og blodkar siden dette vil hemme isolasjon. - Samle epicardial vev i slippverktøyet for PBS på lokket.
- Skjær epicardial vevet i små biter (0,5 mm3) bruker en skalpell (figur 1B), eller bruker skarp tips av liten tang. Merk at brikkene bør kunne passere en P1, 000 Pipetter tips (trinn 3.6).
- Legg 1 mL av trypsin til epicardial vev og samle stykker og trypsin med en P1, 000 Pipetter tips. Overføre vev til en 1.5-mL konisk sentrifuge tube (figur 1 c).
- Inkuber røret i et 37 ° C vannbad for 10 min, mens risting ~ 60 RPM.
- Fjerne røret i vannbad og rengjøre utsiden av røret med 70% etanol.
- Kan vev synke å bunnen av røret (figur 1 d) og nøye overføre nedbryting som inneholder epicardial cellene til 15-mL røret som inneholder 5 mL EPDC medium for å deaktivere trypsin.
- Fylle den gjenværende vev i røret konisk sentrifuge med 1 mL trypsin og blande av pipettering forsiktig opp og ned.
- Gjenta trinn 3.7 til 3.10 to ganger. Når det siste trinnet, etter totalt 30 min med trypsin inkubering, overføre både nedbryting og gjenværende epicardial vevet inn i røret som inneholder EPDC medium.
- Når alle celler er samlet i EPDC medium, forsiktig passere suspensjon 10-mL sprøyte med en 19-gauge nål i en ny 15-mL tube å mekanisk dissociate cellene (figur 1E).
Merk: Pass på å homogenize suspensjon av pipettering opp og ned før løsningen gjennom nålen å hindre nålen bli hindret. - For å ytterligere distansere cellene, gjentar du trinn 3.12 med en 21-gauge nål.
- Plasser en 100 µm celle sil over en 50-mL tube og overføre mediet som inneholder de epicardial cellene på silen med en 10-mL pipette fjerne alle resterende klumper (figur 1F).
- Vask silen å samle gjenværende celler av pipettering 5 mL EPDC medium på silen.
- Pipetter celle suspensjon fra 50-mL røret til en 15-mL tube. Siden celler synke å bunnen av røret, riste løsningen forsiktig før pipettering.
Merk: Dette trinnet er ikke nødvendig, en mindre rør hjelpemidler visualisering av pellet etter sentrifugering. - Sentrifuge 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur (figur 1G).
- Fjern nedbryting og resuspend celle pellet (figur 1 H) i et bestemt volum av EPDC medium (tabell 1).
Merk: For føtal EPDCs, bruke direkte EPDC medium som inneholder 10 µM av den ALK5 kinase inhibitor (EPDC + SB). Voksen celler kan være belagt uten SB under første passering. - Plate celle suspensjon på gelatin belagt kultur plater (figur 1I). Størrelsen på brønnen avhenger av størrelsen på den epicardial Vevsprøve (tabell 1). Merk at lav confluency vil indusere forekomsten av EMT.
- Plasser cellene i inkubator for minst 48 timer på 37 ° C, 5% CO2 til at cellene å knytte til kultur plate.
4. kulturen i EPDCs
- Fylle EPDC + SB mediet minst hver tredje dag.
- Inspisere cellene minst hver tredje dag av mikroskopet. Når cellene kommer confluency, passasje dvsnår kultur plate er fullstendig dekket med celler, cellene i 1:2 overflaten forholdet. Merk at nå confluency ta ~ 5-10 dager.
- Sug opp mediet bruker en Pipetter eller en aspirasjon system med f.ekset glass pipetter.
- Vask cellene nøye ved å legge til PBS cellene. Forsiktig swirl platen og Sug opp PBS.
- Legge til trypsin til platen. Forsiktig rotere platen for å dekke alle celler med trypsin og ruge platen i 1 min på 37 ° C.
Merk: Bruk som liten trypsin som mulig (indikasjon: 200 µL per brønn en 6 vel plate) - Trykk plate å mekanisk koble cellene fra bunnen av platen. Bruk mikroskopet visuelt kontrollere hvis cellene har frittliggende. Hvis ikke, ruge celle kultur plate for en ekstra minutt.
- Legge til et bestemt volum av EPDC + SB medium til cellene, resuspend av pipettering opp og ned og overføre celle suspensjon til en ny gelatin belagt kultur plate.
Merk: vanligvis cellene kan holdes i en brosteinsbelagt morfologi til passering 8.
5. induksjon av EMT i EPDCs
- For å indusere EMT, distansere cellene med trypsin og overføre de til nye gelatin belagt brønner i 1:2 overflaten forholdet i EPDC + SB medium, som beskrevet i 4 og ruge for minst 24 timer på 37 ° C, 5% CO2.
- Sjekk er hvis confluency 50-70%, og hvis EPDCs har en brosteinsbelagt morfologi.
Merk: Confluency påvirker muligheten for EPDCs å gjennomgå EMT. - Sug opp mediet cellene og vaske cellene med PBS (se trinn 4.2.1 - 4.2.2).
- Stimulere cellene med 1 ng/mL TGFβ3 EPDC medium og plassere dem i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 i 5 dager. Merk at under stimulering, EPDC mediet som inneholder TGFβ3 ikke har etterfylles.
- Overvåke cellene daglig. Etter 5 dager gjenkjennes celler som gjennomgikk EMT av en spindel-formet morfologi (figur 2A).
- Kultur spindel-formet EPDCs etter metoden beskrevet i 4 uten tilsetning av SB eller TGFβ til EPDC medium. Merk at generelt spindel-formet EPDCs kan kultivert til passering 20.
- Validere forekomsten av EMT med immunofluorescent flekker bruker antistoffer mot mesenchymal markører αSMA eller Vimentin eller phalloidin for å oppdage dannelsen av F-utgangen stress fiber (figur 2B), eller bruke qRT PCR for EMT-relaterte gener ( f.eks, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Cadherin, MMP3, brevpost, Slug) (figur 2C og tabell 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her skissere vi en enkel protokoll for å isolere EPDCs fra menneskelige voksne og fosterets hjerte vev (figur 1). Denne protokollen drar nytte av lett tilgjengelig plassering i epicardium på utsiden av hjertet (figur 1A). Farging av hjertet auricle etter disseksjon viser at WT1 + epicardium fjernes mens den underliggende subepicardial ekstracellulær matrix og hjerteinfarkt vev forblir intakt (figur 1J). Omfattende karakteristikk er utført før, viser at EPDCs uttrykke epicardial markører, f.eks, ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 og manglende uttrykk for andre hjerte-resident celletyper, f.eks, PECAM1, ISL1, CD34 og TNNT2. 17
Både voksne (figur 1 K) og fosterets (figur 1 L) EPDCs kultivert i nærvær av ALK5 kinase inhibitor SB431542 viser en brosteinsbelagt morfologi. Imidlertid avhengig av giver og kultur forholdene, kan føtal EPDCs gjennomgå EMT tross av tilstedeværelsen av SB. Dette kan medføre spindel-formet celler i befolkningen brosteinsbelagte celler (se pilene i figur 1 L). Vær oppmerksom på at isolering av brostein-formet celler fra fosterets vev er ikke alltid mulig, og kan medføre avledning av hovedsakelig spindel-formet celler. Siden disse cellene vokse raskere, vil de raskt overgrow andre celletyper.
EMT kan indusert ved rugende med TGFβ320 i 5 dager i både voksne og fosterets celler, som demonstrert av en klar morfologiske overgang til spindel-formet celler (figur 2A). Som vist med ubehandlet control ("tomt"), vil føtal EPDCs gjennomgå spontan EMT på fjerning av SB, mens voksen EPDCs vil bare gjennomgå EMT ved stimulering med TGFβ3. For å validere EMT, var EPDCs immunostained med alpha-glatt muskel utgangen (αSMA), en mesenchymal markør (figur 2B). Videre ble EMT bekreftet i voksen EPDCs qRT PCR viser downregulation på epicardial står WT1 og oppregulering av mesenchymal markører POSTN, αSMA, Collagen 1A1, MMP3 og N-Cadherin (figur 2C). Omfattende eksperimenter angående voksne og fosterets epicardial EMT publiseres før17.
| Vev | Godt type | Celle vekst i området (cm2) | Volumet av medium (mL) | Tillegg av SB |
| Fosterets | 24 | 1.9 | 0,5 | Direkte |
| Voksen liten (< 4 cm) | 12 | 3.8 | 1 | Etter 1st passasje |
| Voksen store | 6 | 9.6 | 2 | Etter 1st passasje |
| (> 4 cm) |
Tabell 1: retningslinjer for valg av riktig celle kultur plate. Vel størrelse, avhenger av hvor mye epicardial celler isolert. Disse retningslinjene kan brukes som en tommelfingerregel for å velge riktig celle kultur plate.
| Gene | Sekvens |
| WT1 fremover | CAG CTT GAA TGC ATG ACC VS |
| WT1 omvendt | TAT TCT GTA TTG GGC TCC GC |
| N-Cadherin fremover | CAG ACC GAC CCA AAC AGC AAC |
| N-Cadherin omvendt | GCA GCA ACA GTA AGG ACA AAC ATC |
| POSTN fremover | GGA GGC AAA CAG CTC AGA GT |
| POSTN omvendt | GGC TGA GGA AGG TGC TAA AG |
| SMA fremover | CCG GGA GAA AAT GAC TCA AA |
| SMA omvendt | GAA GGA ATA GCC ACG CTC AG |
| MMP3 fremover | TGG ATG CCG KATTEN ATG AAG |
| MMP3 omvendt | CAG AAA TGG CTG KATTEN CGA |
| COL1A1 fremover | CCA GAA GAA CTG GTA KATTEN CAG CA |
| COL1A1 omvendt | CGC KATTEN ACT CGA AAT GGG AAT |
| GAPDH fremover | AGC CAC ATC GCT CAG ACA C |
| GAPDH omvendt | GCC CAA TAC GAC CAA ATC C |
| B2M fremover | ACA CTG AAT TCA CCC CCA CT |
| B2M omvendt | GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC T |
Tabell 2: Primer sekvenser brukes til validering av EMT i EPDCs. Sekvenser av forover og bakover grunning gjelder qRT PCR bestemme uttrykk for flere EMT relatert gener i voksen EPDCs.
Figur 1 : Isolering av Epicardial avledet celler (EPDCs). (A) Depicted er en voksen auricle fjernet fra det menneskelige hjertet ytre membranous løsmasse, epicardium, som er fjernet. Den svarte pilen peker på epicardium. (B-jeg) Visuell representering av isolasjon metoden for EPDCs. Den svarte pilen peker til celle pellets. (J) Immunofluorescent farging av et hjerte auricle med og uten Disseksjon av epicardium. Skala bar: 50 µm. (K) representant bilder av to forskjellige voksen EPDC isolasjoner kultivert med SB. (L) representant bilder av to forskjellige føtal EPDC isolasjoner kultivert med SB. Black piler angir mesenchymal som celler i fosterets EPDC kultur. Skala bar: 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Validering av EMT i menneskelige voksne og fosterets Epicardial avledet celler (EPDCs). Voksne og fosterets EPDCs ble kultivert med SB, ikke behandlet (tom) eller stimulert med TGFβ3 5 dager. (A) representant lyse feltet bilder. Skala bar: 200 µm. (B) Immunostaining for DAPI og αSMA. Skala bar: 100 µm. (C) mRNA nivåer av EMT-relaterte gener i voksen EPDCs bruker qRT PCR. Målte verdier var normalisert til GAPDH og B2M. Verdier er avbildet som betyr + SD 2 ^-ΔΔct (n = 2). Forkortelser: WT1:Wilms' svulst 1, MMP3: matrise Metalloproteinase 3, POSTN:Periostin, αSMA: alpha glatt muskel begrepsordbok, Col1A1:Collagen 1A1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en detaljert protokollen å isolere og kultur primære epicardial celler avledet fra menneskelige voksne og fosterets hjerte. Omfattende karakteristikk av disse cellene har vært publisert tidligere17. Vi har vist at begge celletyper kan opprettholdes som brosteinsbelagte-lignende epitelceller når kultivert med den ALK5 kinase inhibitor SB431542. EMT er en integrert del av epicardial aktivisering i vivo under både utvikling og etter skade responsen. EMT kan studeres ved hjelp av denne metoden ved tillegg av TGFβ. Viktigere, observert vi tidligere at fosterets EPDCs raskt gjennomgå spontan EMT når SB er fjernet, mens voksen EPDCs bare gjennomgå EMT ved stimulering17. Studere disse prosessene i fosterets EPDCs kan hjelpe i å forstå hvordan optimalt aktivere den voksne epicardium etter skade.
Presentert metoden er avhengig av pasienten materiale, som oppnås under operasjonen. Derfor kan man forvente flere varianter i delstaten materialet isolert, som er enten på grunn av tålmodig variasjon eller hastigheten som materialet er samlet i operasjonssalen. Denne varianten kan forklare forskjeller i prosedyren: 1) hvor lett epicardium kan være dissekert fra myokard, 2) etterlevelse av isolerte celler av platen, 3) muligheten til å forhindre eller gjennomgå EMT og 4) spredning hastighet. Generelt, anbefales en rask isolasjon for cellen overlevelse. Kritisk Hovedpoenget er peeling epicardium fra myokard. Hvis epicardium er sterkt overholdt underliggende vev, hjelpe en 15 minutters behandling av hjerte vev med trypsin for å fjerne epicardium lettere. Videre er effekten av trypsin behandling avhenger av flere faktorer, inkludert trypsin aktiviteten og sammensetningen av vev. Derfor, hvis en lav avkastning er observert, inkubasjon tiden med trypsin kan justeres. I tillegg, hvis ingen celle pellet vises etter spinne ned, kan løsningen ikke har vært helt atskilt før du kjører gjennom filteret. Miksing løsningen før løsningen passerer sprøyten eller bruke en ekstra, kan mindre sprøyte være nyttig å distansere cellene. Vel størrelsen seeding EPDCs bør vurderes nøye slik at cellene å opprettholde sin epithelial tilstand. Tabell 1 gir en indikasjon, men en kan avvike fra denne retningslinjen når, for eksempel bare en liten del av fosterets hjerte kan brukes og overflate i et mindre godt er mer praktisk.
Siden fosterets celler gjennomgå EMT umiddelbart uten SB17, bør føtal EPDCs alltid være belagt med SB. Men voksne EPDCs tendens til å opprettholde deres epithelial morfologi og derfor kan være belagt uten SB under første 48 h i første passering, å fremme overholdelse av cellen. Etter første passering, er både voksne og fosterets EPDCs kontinuerlig kultivert med SB å hindre spontan EMT. I tillegg er lav celle tetthet en viktig utløser for EMT. EPDCs bør derfor aldri kultivert under 50% confluency. På den annen side, hvis EMT, sørg for at EPDCs ikke er rangert for tett, og bo under 70% confluency. Men denne protokollen utnytter TGFβ3, kan stimulering med TGFβ1 og -2 indusere EMT i EPDCs samt (observasjoner upublisert).
I denne protokollen deles tabellceller direkte uten å spinne ned, siden vi observerer en lavere celle overlevelse ved sentrifuge. Derfor er det viktig å bruke lave volumer av trypsin for å sikre dens deaktivering når serum som inneholder mediet.
Etter ~ 6-8 passasjer, EPDCs med en epithelial morfologi stopper enten vokser eller gjennomgå EMT spontant. Derfor for eksperimenter, bruker vi brolegge EPDCs mellom passering 3 og passasjen 6. Derimot EPDCs med en mesenchymal morfologi, er mindre sårbare og kan være kulturperler til passering 20. Eksperimenter, men vi har aldri brukt vri EPDCs etter 10th passering.
Siden epicardium ligger på utsiden av sentrum og er lett å skille fra underliggende vev, ektheten av cellene er tydelig, og betydelig forurensning er lav. Fettvev eller blodårer klebes til isolerte epicardial lag, fleste av disse cellene passere ikke silen under isolasjon og ellers ikke kan overleve i EPDC cellekultur. Videre, som nevnt før, med menneskelige materiale gir en unik modell for å undersøke human epicardial celle oppførsel. Det er kjent at for eksempel epicardial fettvev er forskjellig mellom arter, understreker nødvendigheten av menneskelig epicardial celle modeller21.
Det bør bemerkes at hjertet auricles ble innhentet under operasjonen på syke hjerter, og derfor forskjellene i sykdom, brukte medisiner, alder og kjønn donor kan påvirke reproduserbarhet av eksperimenter. Eksperimenter bør derfor utføres på flere isolasjoner få gyldig resultater og tillate solid konklusjonene som kan trekkes. Videre, avhengig av problemstillingen, kan man velge spesielt å bare bruke epicardium fra pasienter med iskemiske sykdom eller pasienter med ikke-iskemiske Valvulær sykdom, som forventes å oppføre seg annerledes.
Det har blitt foreslått at atrial epicardium kan ha forskjellige egenskaper fra ventrikkel epicardium2, og dermed spørsmål om epicardium avledet fra atrial hjertet auricle gir en gyldig modell for epicardial atferd. I denne sammenheng er det viktig å påpeke at vi ikke kunne finne forskjellene mellom fosterets atrial og ventrikkel avledet EPDCs (upublisert data). Imidlertid ville bruker epicardium fra menneskelige voksne ventrikkel være den ultimate celle kilden til å bekrefte dette. Likevel, samle store prakteksemplarer av menneskelige voksne ventriklene EPDC isolering er svært invasiv for pasienten, og er derfor ikke mulig i denne sykehus.
Vi observerte at SB ikke er alltid tilstrekkelig til å hindre EMT, hovedsakelig i fosterets EPDCs. Når føtal EPDCs gjennomgår EMT i nærvær av SB, utelukke vi dem fra eksperimenter. Som en konsekvens, er celler som brukes til forsøk valgt for sin evne til å opprettholde en epithelial fenotypen svar på SB. Vi hypothesize at fosterets celler kan allerede være utover en viss terskel under EMT, og at hemming med SB greier ikke å stoppe dette.
Denne epicardial celle modell har flere programmer, både utvikling og den voksne epicardium kan undersøkes. I vår lab fokusere vi på forbedring av epicardial regenerativ svaret etter hjertestans skade. Voksen EPDCs kan brukes til å teste forbindelser som induserer EMT, satsing å finne en potensiell terapeutisk medikament for en ameliorated regenerativ reaksjon av epicardium. I tillegg er det mulig å måle faktorer skilles ut av EPDCs å forstå paracrine signalisering til å (re) genererer myokard. Videre, siden vi observert at fosterets EPDCs er flere liggende å gjennomgå EMT spontant sammenlignet med voksen EPDCs, vi undersøke forskjellene mellom fosterets og voksen EPDCs. Bestemme den underliggende mekanismen av økt fosterets aktivisering kunne gi et signal for å forbedre epicardial aktivisering i voksen hjertet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen er støttet av The Netherlands Organisation for vitenskapelig forskning (NWO) (VENI 016.146.079) og en LUMC forskningsstipend både AMS, og LUMC Bontius Stichting (MJG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
References
- Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
- Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).
- Zhou, B., Ma, Q., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
- Smits, A., Riley, P. Epicardium-Derived Heart Repair. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).
- Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor. Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).
- Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).
- Lavine, K. J., Yu, K., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).
- Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).
- Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).
- Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns. Circulation Research. 96 (5), (2005).
- Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).
- van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PloS one. 7 (9), e44692 (2012).
- Zhou, B., Honor, L. B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Smart, N., Bollini, S., et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury. Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).
- Zangi, L., Lui, K. O., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).
- Clunie-O'Connor, C., Smits, A. M., et al. The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).
- Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).
- Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1. Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).
- Chechi, K., Richard, D. Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue. International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).
