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Developmental Biology

L'isolamento e coltura di cellule primarie dell'epicardio ricavate da campioni di cuore umano adulto e fetale

doi: 10.3791/57370 Published: April 24, 2018

Summary

L'epicardio svolge un ruolo cruciale nello sviluppo e nella riparazione del cuore fornendo le cellule e fattori di crescita per la parete del miocardio. Qui, descriviamo un metodo alle cellule dell'epicardio primarie umane di cultura che consente lo studio e il confronto delle loro caratteristiche inerenti allo sviluppo e adulti.

Abstract

L'epicardio, uno strato di cellule epiteliali che copre il miocardio, ha un ruolo essenziale durante sviluppo cardiaco e la risposta di riparazione del cuore dopo lesione ischemica. Quando attivato, le cellule dell'epicardio subiscono un processo noto come epiteliale di transizione mesenchimale (EMT) per fornire le cellule del miocardio. Inoltre, l'epicardio contribuisce via la secrezione di fattori paracrini essenziale. Per apprezzare appieno il potenziale rigenerativo dell'epicardio, è necessario un modello di cellula umana. Qui abbiamo delineare un modello di coltura cellulare romanzo per derivare cellule derivate dell'epicardio primarie (EPDCs) da tessuto cardiaco umano adulto e fetale. Per isolare EPDCs, l'epicardio è dissecato dall'esterno dell'esemplare cuore e trasformato in una sospensione unicellulare. Successivamente, EPDCs sono placcati e coltivate in medium EPDC contenente l'inibitore della 5-chinasi ALK SB431542 per mantenere il loro fenotipo epiteliale. EMT è indotta dalla stimolazione con TGFβ. Questo metodo consente, per la prima volta, lo studio del processo di EMT dell'epicardio umano in un ambiente controllato e agevola guadagnando più comprensione nel secretoma di EPDCs che può aiutare la rigenerazione del cuore. Inoltre, questo approccio uniforme consente un confronto diretto del comportamento umano adulto e fetale dell'epicardio.

Introduction

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L'epicardio, uno strato epiteliale unicellulare che buste il cuore, è di vitale importanza per lo sviluppo cardiaco e riparazione (rivisto in Smits et al. 1). inerente allo sviluppo, l'epicardio nasce dall'organo proepicardial, una piccola struttura situata alla base del cuore in via di sviluppo. Intorno giorno dello sviluppo E9.5 in mouse e post-concezione 4 settimane in umani, cellule iniziano a migrare da questa struttura di cavolfiore e coprire il miocardio in via di sviluppo2. Una volta che si forma uno strato di singola cellula epiteliale, una parte delle cellule dell'epicardio subisce epiteliale di transizione mesenchimale (EMT). Durante EMT, le cellule perdono le loro caratteristiche epiteliali, quali adesioni cellula-cellula e ottenere un fenotipo mesenchimale che dà loro la capacità di migrare nel miocardio in via di sviluppo. Le cellule derivate dell'epicardio formate (EPDCs) possono differenziarsi in diversi tipi di cellule cardiache tra cui fibroblasti, cellule muscolari lisce e potenzialmente cardiomiociti e cellule endoteliali3, anche se la differenziazione di questi ultimi due cellulari resti di popolazioni oggetto di dibattito (rivisto in Smits et al. 4). Inoltre, l'epicardio fornisce segnali paracrini istruttivo al miocardio a regolare la crescita e la vascolarizzazione5,6,7,8. Diversi studi hanno dimostrato che alterata formazione dell'epicardio conduce ai difetti inerenti allo sviluppo in muscolo cardiaco9,10, sistema vascolare11e conduzione sistema12, sottolineando l'essenziale contributo dell'epicardio per la formazione del cuore.

Anche se nel cuore adulto epicardio è presente come uno strato dormiente, esso diventa riattivato su ischemia13. Alberino-ferita di riattivazione dell'epicardio ricapitola molti dei processi descritti per sviluppo cardiaco, tra cui proliferazione ed EMT14, seppur meno efficientemente. È interessante notare che, sebbene l'esatto meccanismo completamente non è capito, il contributo dell'epicardio di riparazione può essere migliorato dal trattamento con, per esempio, Thymosin β415 o modifica mRNA di VEGF-A16, con conseguente migliorato cardiaco funzione dopo infarto miocardico. L'epicardio è quindi considerato un'interessante fonte di cellule per migliorare la riparazione endogena del cuore ferito.

Meccanismi di sviluppo cardiaco sono spesso ricapitolate durante la lesione, anche se in modo meno efficiente. In cerca di attivatori dell'epicardio, è fondamentale che possiamo determinare e confrontare l'intera capacità dell'epicardio feto ed adulto. Inoltre, da un punto di vista terapeutico, è importante che, oltre a esperimenti sugli animali, estendiamo conoscenza per quanto riguarda la risposta dell'epicardio umano. Qui, descriviamo un metodo per isolare e adulte e fetale dell'epicardio derivate cellule umane (EPDCs) in una morfologia epiteliale-cell-like della coltura e di indurre EMT. Con questo modello, ci proponiamo di esplorare e confrontare il comportamento delle cellule dell'epicardio adulto e fetale.

Il vantaggio principale di questo protocollo è l'utilizzo di materiale umano dell'epicardio, che non è stato studiato accuratamente. D'importanza, il protocollo di coltura delle cellule e isolamento descritto fornisce un singolo metodo uniforme per derivare entrambi EPDCs di cobble fetali ed adulti, consentendo un confronto diretto tra queste fonti di due cellule. Inoltre, poiché l'epicardio è isolato basato sulla sua posizione, è accertato che le cellule sono in realtà epicardially derivata17.

Mentre metodi di isolamento EPDC umani sono state stabilite in precedenza, queste si basano principalmente su protocolli di conseguenza dove pezzi di tessuto cardiaco o dell'epicardio sono piastrate su un cellulare cultura piatto18,19. Questo approccio quindi seleziona specificamente per le cellule che perdere parzialmente il loro fenotipo epiteliale al fine di migrare, e che sono più inclini a subire EMT spontanea. Nel protocollo attuale, l'epicardio è prima trasformato in una soluzione di singola cellula che permette il EPDCs isolato per preservarne lo stato epiteliale. Questo metodo fornisce quindi un modello solido in vitro per lo studio dell'epicardio EMT.

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Protocol

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Tutti gli esperimenti con campioni di tessuto umano sono stati approvati dal comitato etico del Leiden University Medical Center e conforme alla dichiarazione di Helsinki. Tutti i passaggi sono eseguiti con attrezzature sterili in un flusso di cultura cellulare mobile.

1. preparati

  1. Preparare il supporto di EPDC mescolando di Dulbecco esente modificato Eagle (DMEM basso-glucosio) e Medium 199 (M199) in un rapporto 1:1. Aggiungere inattivato con calore 10% siero bovino fetale (FBS, calore inattivati per 25 min a 56 ° C) e completare con 100 U/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina. Pre-riscaldare il mezzo EPDC in bagnomaria a 37 ° C.
  2. Preriscaldare la tripsina 0.25%/EDTA (1:1) a bagnomaria a 37 ° C.
  3. Pozzi di cappotto con gelatina. Aggiungere 0,1% gelatina/PBS in ciascun pozzetto e incubare le piastre per almeno 15 min a 37 ° C. Linee guida per la piastra di coltura cellulare richiesto sono riassunti nella tabella 1. Rimuovere con attenzione tutto il liquido prima di placcatura di cellule.
  4. Preparare una soluzione stock di 10 mM SB431542 (SB), diluita in DMSO (attenzione). Rendere le aliquote di 50 µ l in provette in polipropilene fondo conico, come provette Eppendorf e conservarli a-20 ° C. Si noti che le aliquote SB possono essere scongelate solo una volta.

2. recupero e conservazione degli esemplari adulti e fetale cuore

  1. Memorizzare i auricles umano adulto direttamente alla rimozione durante l'intervento chirurgico in un tubo da 50 mL con 15 mL alto-glucosio DMEM contenente 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e streptomicina 100 mg/mL a 4 ° C. I campioni sono generalmente 3-5 cm nel formato e possono essere memorizzati fino a 48 h dopo la dissezione.
  2. Conservare il cuore fetale ottenuto da materiale di aborto elettivo in mezzo EPDC a 4 ° C fino a 24 h dopo l'isolamento. Per questo protocollo, è possibile utilizzare campioni con un'età gestazionale tra 12-22 settimane. Notare che tutto il cuore può essere utilizzato per l'isolamento dell'epicardio.

3. isolamento dello strato dell'epicardio

  1. Nel flusso laminare, preparare un piatto di coltura cellulare di 100 mm con PBS e posizionare una goccia separata (~ 200 µ l) di PBS nel coperchio. Riempire una provetta da 15 mL con 5 mL di terreno pre-riscaldato di EPDC.
  2. Posizionare il tessuto in coltura cellulare piatto pieno di PBS. Assicurarsi che il tessuto è inumidito frequentemente durante la procedura.
  3. Utilizzando un microscopio stereoscopico, rimuovere tanto dello strato dell'epicardio dal campione di tessuto possibile staccando di usando il forcipe.
    Nota: L'epicardio può essere riconosciuto come uno strato molto sottile, trasparente aderito strettamente all'esterno del cuore (Figura 1A). Se si tenta di evitare la contaminazione con tessuto adiposo epicardico e vasi sanguigni poiché questo ostacolerà l'isolamento.
  4. Raccogliere i pezzi di tessuto dell'epicardio nella goccia di PBS sul coperchio.
  5. Tagliare il tessuto dell'epicardio in piccoli pezzi (0,5 mm3) usando un bisturi (Figura 1B), oppure usando le punte taglienti di piccola pinzetta. Si noti che i pezzi devono essere in grado di passare un P1, puntale 000 (punto 3.6).
  6. Aggiungere 1 mL di tripsina al tessuto dell'epicardio e raccogliere i pezzi e la tripsina con una P1, 000 puntale. Trasferire il tessuto in una provetta conica per centrifuga da 1,5 mL (Figura 1).
  7. Incubare la provetta nel bagnomaria a 37 ° C per 10 minuti, agitando a ~ 60 giri/min.
  8. Rimuovere il tubo dal bagno di acqua e pulire la parte esterna del tubo con etanolo al 70%.
  9. Consentire al tessuto di depositarsi sul fondo del tubo (Figura 1) e trasferire con cautela il supernatante contenente cellule dell'epicardio nella provetta di 15 mL contenente 5 mL di terreno di EPDC per inattivare la tripsina.
  10. Ricostituire il tessuto restante nella provetta conica per centrifuga con tripsina 1 mL e Miscelare pipettando delicatamente su e giù.
  11. Ripetere il passaggio 3,7 a 3.10 due volte. Nella fase finale, dopo un totale di 30 min di incubazione di tripsina, trasferire il surnatante e il tessuto restante dell'epicardio nella provetta contenente il mezzo EPDC.
  12. Quando tutte le celle sono raccolti in media EPDC, delicatamente passare la sospensione attraverso una siringa da 10 mL con un ago di calibro 19 in una provetta da 15 mL nuova meccanicamente dissociare le cellule (Figura 1E).
    Nota: Assicurarsi di omogeneizzare la sospensione pipettando su e giù prima di passare la soluzione attraverso l'ago per evitare che l'ago sempre ostruito.
  13. Per dissociare ulteriormente le cellule, ripetere il passaggio 3.12 con un ago da 21 gauge.
  14. Posizionare un colino di cella da 100 µm in cima a un tubo da 50 mL e trasferire il supporto che contiene le cellule dell'epicardio sul filtro utilizzando una pipetta di 10 mL per rimuovere tutti i restanti gruppi (Figura 1F).
  15. Lavare il filtro per raccogliere le cellule residue di pipettare 5 mL di terreno di EPDC sul filtro.
  16. Dispensare la sospensione cellulare dal tubo da 50 mL in una provetta da 15 mL. Poiché cellule depositano sul fondo della provetta, agitare delicatamente la soluzione prima di pipettaggio.
    Nota: Mentre questo passaggio non è necessario, un tubo più piccolo aiuta la visualizzazione del pellet dopo la centrifugazione.
  17. Centrifugare a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente (Figura 1).
  18. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare (Figura 1 H) nel volume richiesto di mezzo EPDC (tabella 1).
    Nota: Per EPDCs fetale, direttamente usare EPDC mezzo contenente 10 µM dell'inibitore della chinasi ALK5 (EPDC + SB). Le cellule adulte possono essere placcate senza SB durante il primo passaggio.
  19. Piastra di sospensione cellulare su piastre di coltura la gelatina rivestito (Figura 1I). Le dimensioni del pozzo dipende dalle dimensioni del campione del tessuto dell'epicardio (tabella 1). Nota che il confluency di bassa indurrà l'avvenimento di EMT.
  20. Posizionare le cellule nell'incubatore per almeno 48 h a 37 ° C, 5% CO2 per permettere alle cellule di fissare la piastra di coltura.

4. la cultura di EPDCs

  1. Ricostituire il mezzo EPDC + SB almeno ogni 3 giorni.
  2. Ispezionare le cellule almeno ogni 3 giorni con il microscopio. Quando le cellule raggiungono confluency, vale a dire, quando la piastra di coltura è completamente ricoperta di cellule, le cellule in un rapporto di superficie di 1:2 del passaggio. Si noti che arrivano fino a confluenza può prendere ~ 5-10 giorni.
    1. Aspirare il mezzo utilizzando una pipetta o un sistema di aspirazione con, per esempio, una pipetta di vetro.
    2. Lavare accuratamente le cellule aggiungendo PBS alle cellule. Delicatamente la piastra di turbinio e aspirare il PBS.
    3. Aggiungere tripsina alla piastra. Ruotare delicatamente la piastra per coprire tutte le cellule con tripsina e incubare la piastra per 1 min a 37 ° C.
      Nota: Utilizzare come tripsina piccolo come possibile (indicazione: 200 µ l di un 6 piastra bene)
    4. Toccare la piastra per scollegare meccanicamente le cellule dalla parte inferiore della piastra. Utilizzare il microscopio per controllare visivamente se cellule staccato. In caso contrario, incubare la piastra di coltura cellulare per un minuto in più.
    5. Aggiungere il volume richiesto di mezzo EPDC + SB alle cellule, risospendere pipettando su e giù e trasferire la sospensione cellulare per una nuova piastra di coltura di gelatina rivestito.
      Nota: In generale, le cellule possono essere mantenute in una morfologia di ciottoli fino al passaggio 8.

5. l'induzione di EMT in EPDCs

  1. Per indurre EMT, dissociare le cellule con tripsina e trasferimento alle cellule di nuova gelatina rivestito pozzi in un rapporto di superficie di 1:2 in mezzo EPDC + SB, come descritto in 4 e incubare per almeno 24 h a 37 ° C, 5% CO2.
  2. Verificare se confluenza è 50-70% e se EPDCs hanno una morfologia di ciottoli.
    Nota: Confluency riguarda la capacità di EPDCs di subire EMT.
  3. Aspirare il mezzo dalle cellule e lavare le cellule con attenzione con PBS (Vedi punto 4.2.1 - 4.2.2).
  4. Stimolare le cellule con 1 ng/mL TGFβ3 in mezzo EPDC e metterli in un incubatore a 37 ° C, 5% CO2 per 5 giorni. Si noti che durante la stimolazione, il supporto di EPDC contenente TGFβ3 non deve essere rifornito.
  5. Monitorare quotidianamente le cellule. Dopo 5 giorni, le cellule che hanno subito la EMT sono riconosciute da una morfologia fusiforme (Figura 2A).
  6. Cultura EPDCs fusiformi secondo il metodo designate in 4 senza aggiunta di SB o TGFβ al medium EPDC. Si noti che in generale, EPDCs fusiformi possono essere coltivate fino a passaggio 20.
  7. Convalidare l'avvenimento di EMT con macchiatura immunofluorescente usando gli anticorpi contro i marcatori mesenchymal αSMA o il Vimentin o da falloidina per rilevare la formazione di fibre di stress di F-actina (Figura 2B), o mediante qRT-PCR per geni correlati all'EMT ( ad esempio, WT1, Periostina, Col1A1, αSMA, N-caderina, MMP3, lumaca, lumaca) (Figura 2 e tabella 2).

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Representative Results

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Qui, descriviamo un protocollo semplice per isolare EPDCs da tessuto cardiaco umano adulto e fetale (Figura 1). Questo protocollo sfrutta la posizione facilmente raggiungibile dell'epicardio sulla parte esterna del cuore (Figura 1A). Macchiatura del auricle cuore dopo dissezione dimostra che l'epicardio WT1 + viene rimosso mentre il sottostante subepicardial matrice extracellulare e tessuto miocardico rimangono intatti (Figura 1J). Ampia caratterizzazione è stata eseguita prima, dimostrando che EPDCs esprimono marcatori dell'epicardio, ad es., ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 e la mancanza di espressione di altri tipi di cellule del cuore-residente, ad esempio, PECAM1, ISL1, CD34 e TNNT2. 17

Adulti (Figura 1 K) e fetale (Figura 1 L) EPDCs coltivate in presenza di spettacolo di ALK5 chinasi inibitore SB431542 una morfologia di ciottoli. Tuttavia, a seconda delle condizioni dei donatori e la cultura, EPDCs fetale può subire EMT nonostante la presenza di SB. Questo può causare cellule fusiformi all'interno della popolazione delle cellule di ciottoli (vedi frecce nella Figura 1 L). Si prega di essere consapevole che l'isolamento di cellule a forma di ciottoli da tessuto fetale non è sempre fattibile e può provocare la derivazione di cellule per lo più fusiformi. Poiché queste cellule crescono più velocemente, essi saranno rapidamente invadere altri tipi delle cellule.

EMT può essere indotta incubando con TGFβ320 per 5 giorni in cellule sia in adulte e fetali, come dimostrato da una transizione trasparente morfologica a cellule fusiformi (Figura 2A). Come ha dimostrato con il controllo non trattato ("vuoto"), EPDCs fetale subirà EMT spontanea alla rimozione della SB, mentre EPDCs adulto solo subirà EMT dopo stimolazione con TGFβ3. Per convalidare EMT, EPDCs immunostained con l'actina alfa-liscia del muscolo (αSMA), un indicatore mesenchymal (Figura 2B). Inoltre, EMT è stata confermata in adulto EPDCs mediante qRT-PCR visualizzando del marcatore dell'epicardio WT1 sottoregolazione del marker mesenchimale POSTN, αSMA, collagene 1A1, MMP3 e N-caderina (Figura 2). Completi esperimenti riguardanti EMT dell'epicardio adulto e fetale sono stati pubblicati prima di17.

Tessuto Tipo di bene Zona di crescita delle cellule (cm2) Volume di terreno (mL) Aggiunta di SB
Fetale 24 1.9 0,5 Direttamente
Adulto piccola (< 4 cm) 12 3.8 1 Dopo 1st passaggio
Adulto grande 6 9.6 2 Dopo 1st passaggio
(> 4 cm)

Tabella 1: linee guida per la selezione la piastra di coltura di cella appropriata. La dimensione ben necessaria dipende dalla quantità di cellule dell'epicardio isolate. Queste linee guida utilizzabile come una regola empirica per selezionare la piastra di coltura di cella appropriata.

Gene Sequenza
WT1 avanti CAG CTT GAA TGC ATG ACC TG
WT1 Reverse TAT TCT GTA TTG GGC TCC GC
N-caderina avanti CAG ACC GAC CCA AAC AGC AAC
N-caderina Reverse GCA GCA ACA GTA AGG ACA AAC ATC
POSTN avanti GGA GGC AAA CAG CTC AGA GT
POSTN inversa GGC TGA GGA AGG TGC TAA AG
SMA in avanti CCG GGA GAA AAT GAC TCA AA
SMA Reverse GAA GGA ATA GCC ACG CTC AG
MMP3 avanti TGG ATG CCG GATTO ATG AAG
MMP3 Reverse CAG AAA TGG CTG CAT CGA
COL1A1 avanti CCA GAA GAA CTG GTA GATTO CAG CA
COL1A1 Reverse CGC GATTO ATTO CGA AAT GGG AAT
GAPDH avanti AGC CAC ATC GCT CAG ACA C
GAPDH Reverse GCC CAA TAC GAC CAA ATC C
B2M avanti ACA CTG AAT TCA CCC CCA CT
B2M Reverse GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC T

Tabella 2: sequenze Primer utilizzate per la convalida della EMT in EPDCs. Sequenze dei primer forward e reverse usato qRT-PCR per determinare che l'espressione di EMT diversi geni in adulto EPDCs correlati.

Figure 1
Figura 1 : Isolamento dell'epicardio derivate cellule (EPDCs). (A) Depicted è un adulto auricle rimosso dal cuore dell'uomo con un sottile strato membranoso esterno, l'epicardio, che viene rimosso. La freccia nera indica l'epicardio. (B-io) Rappresentazione visiva del metodo isolamento di EPDCs. La freccia nera indica il pellet cellulare. (J) macchiatura immunofluorescente un auricle di cuore con e senza dissezione dell'epicardio. Barra della scala: 50 µm. (K) immagini rappresentative di due isolamenti di EPDC adulti diversi coltivate con immagini rappresentative di SB. (L) di due differenti isolamenti fetali di EPDC coltivati con SB. Black arrows indicano mesenchymal-come le cellule in fetale Cultura EPDC. Barra della scala: 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Convalida della EMT in adulto e fetale dell'epicardio derivate cellule umane (EPDCs). EPDCs adulto e fetale sono stati coltivati con SB, non trattati (vuoto) o stimolate con TGFβ3 per 5 giorni. Immagini di rappresentativo del campo luminoso (A). Barra della scala: 200 µm. (B) Immunostaining per DAPI e αSMA. Barra della scala: 100 µm. (C) livelli di mRNA di geni correlati EMT, determinati in adulto EPDCs mediante qRT-PCR. I valori misurati sono stati normalizzati al GAPDH e B2M espressione. I valori sono rappresentati come media + SD 2 ^-ΔΔct (n = 2). Abbreviazioni: Tumore degli WT1:Wilms 1, MMP3: Matrix Metalloproteinase 3, POSTN:Periostin, αSMA: alfa actina del muscolo liscio, Col1A1:Collagen 1A1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Qui descriviamo un protocollo dettagliato per isolare e cultura primaria dell'epicardio cellule derivata da cuori umani adulti e fetali. Ampia caratterizzazione di queste cellule è stato precedentemente pubblicato il17. Abbiamo dimostrato che entrambi i tipi cellulari possono essere mantenuti come cellule epiteliali di ciottoli-come una volta coltivate con l'inibitore della chinasi di ALK5 SB431542. EMT è parte integrante di attivazione dell'epicardio in vivo durante sia lo sviluppo e la risposta post-infortunio. EMT possono essere studiati utilizzando questo metodo di aggiunta del TGFβ. D'importanza, abbiamo osservato precedentemente che fetale EPDCs subire rapidamente EMT spontanea quando SB è rimosso, mentre EPDCs adulto subiscono solo EMT su stimolazione17. Lo studio di questi processi in EPDCs fetale può essere di aiuto nella comprensione di come attivare in modo ottimale l'epicardio adulto dopo danni.

Il metodo proposto si basa su materiale paziente, che si ottiene durante la chirurgia. Pertanto, si possono prevedere diverse variazioni nello stato del materiale isolato, che sono causa di variabilità o la velocità alla quale il materiale è raccolto in sala operatoria. Questa variazione può spiegare le differenze nella procedura: 1) come facilmente epicardio può essere sezionata dal miocardio, 2) l'aderenza delle cellule isolate alla piastra, 3) la capacità di prevenire o subire EMT e la velocità di proliferazione 4). In generale, un isolamento rapido è preferibile per la sopravvivenza delle cellule. Il principale punto critico si staccava l'epicardio dal miocardio. Se l'epicardio è fortemente aderisce al tessuto sottostante, un 15 min e pre-trattamento del tessuto cardiaco con tripsina può contribuire a rimuovere più facilmente l'epicardio. Inoltre, l'efficacia del trattamento della tripsina dipende da diversi fattori, tra cui l'attività della tripsina e la composizione del tessuto. Pertanto, se si osserva una bassa resa, il tempo di incubazione con tripsina può essere regolato. Inoltre, se nessun pellet cellulare è visibile dopo la rotazione verso il basso, la soluzione potrebbe non sono stato completamente dissociata prima di eseguire attraverso il filtro. Mescolando la soluzione prima di passare la soluzione tramite la siringa o utilizzando un extra, la siringa più piccola potrebbe essere utile per dissociare le cellule. La dimensione del bene per semina EPDCs dovrebbe essere considerata attentamente per attivare le cellule per preservarne lo stato epiteliale. La tabella 1 fornisce un'indicazione, ma uno può deviare da questa linea guida quando, ad esempio, può essere utilizzata solo una piccola parte del cuore fetale e placcatura in un ben più piccolo è più conveniente.

Poiché le cellule fetali subirà EMT immediatamente senza SB17, EPDCs fetale dovrebbe sempre essere placcato con SB. Tuttavia, EPDCs adulti tendono a mantenere la loro morfologia epiteliale e pertanto può essere placcato senza SB durante le prime 48 h del primo passaggio, per promuovere l'adesione delle cellule. Dopo il primo passaggio, EPDCs sia in adulti e fetali sono coltivate continuamente con SB in modo da prevenire EMT spontanea. Inoltre, la densità bassa delle cellule è un importante trigger per EMT. EPDCs mai dovrebbe pertanto essere coltivate sotto confluency di 50%. D'altra parte, se è desiderato il EMT, assicurarsi di che EPDCs non sono seminati troppo densamente e rimanere di sotto confluency di 70%. Anche se questo protocollo utilizza TGFβ3, stimolazione con TGFβ1 e -2 può indurre EMT in EPDCs pure (osservazioni non pubblicate).

In questo protocollo, le celle sono divisi direttamente senza spinning verso il basso, dal momento che osserviamo una sopravvivenza inferiore di cella quando si utilizza la centrifuga. Di conseguenza, è fondamentale utilizzare bassi volumi di tripsina per assicurare la sua disattivazione quando contenente il mezzo di siero viene aggiunto.

Dopo i passaggi di ~ 6-8, EPDCs con una morfologia epiteliale o smetterà di crescere o subirà EMT spontaneamente. Pertanto, per esperimenti, utilizziamo ciottolo EPDCs tra passaggio 3 e passaggio 6. Al contrario, EPDCs con una morfologia mesenchimale sono meno vulnerabili e possono essere coltivate fino a passaggio 20. Negli esperimenti, tuttavia, non abbiamo mai utilizzato mandrino EPDCs dopo il passaggio 10 dith .

Poiché l'epicardio si trova di fuori del cuore ed è facile da separare dal tessuto sottostante, l'autenticità delle cellule è evidente, e la possibilità di contaminazione significativa è bassa. Anche se il tessuto adiposo o vasi sanguigni a volte attaccare al livello dell'epicardio isolato, la maggior parte di quelle cellule non passerà il filtro durante l'isolamento e altrimenti non può sopravvivere in coltura cellulare EPDC. Inoltre, come accennato prima, utilizzando materiale umano fornisce un modello unico per studiare il comportamento umano delle cellule dell'epicardio. È noto che, per esempio, il tessuto adiposo epicardico è diverso tra specie, sottolineando la necessità della cellula umana dell'epicardio modelli21.

Dovrebbe essere notato che le orecchiette del cuore sono stati ottenuti durante la chirurgia su cuori malati, e di conseguenza le differenze nella malattia, farmaco utilizzato, età e sesso del donatore possono influenzare la riproducibilità degli esperimenti. Dovrebbe pertanto essere esperimenti su isolamenti diversi per ottenere risultati validi e consentire di trarre conclusioni solide. Inoltre, a seconda della domanda di ricerca, si poteva scegliere specificamente di utilizzare solo epicardio da pazienti con malattia ischemica o pazienti con la malattia valvular non-ischemica, che sono tenuti a comportarsi in modo diverso.

È stato suggerito che epicardio atriale può avere caratteristiche distinte da ventricolo epicardio2, quindi mettere in discussione se epicardio derivato dall'auricola atriale cuore fornisce un modello valido per il comportamento dell'epicardio. In questo contesto, è importante sottolineare che non abbiamo potuto trovare differenze tra fetale atriali e ventricolari derivato EPDCs (dati non pubblicati). Tuttavia, utilizzando epicardio dal ventricolo umano adulto sarebbe la fonte di cellule ultimate per verificarlo. Eppure, raccogliendo esemplari di grandi dimensioni dei ventricoli umani adulti per isolamento EPDC è altamente invasiva per il paziente e pertanto attualmente non è fattibile in questo ospedale.

Abbiamo osservato che SB non è sempre sufficiente ad impedire EMT, principalmente in EPDCs fetale. Quando EPDCs fetale subiscono EMT in presenza di SB, li escludiamo da esperimenti. Di conseguenza, le cellule utilizzati per esperimenti sono selezionate per la loro capacità di mantenere un fenotipo epiteliale in risposta a SB. Supponiamo che le cellule fetali possono essere già oltre una certa soglia in procinto di EMT, e che l'inibizione con SB non è in grado di fermare questo.

Questo modello di cellulare dell'epicardio ha diverse applicazioni, dal momento che lo sviluppo e l'epicardio adulto può essere indagati. Nel nostro laboratorio, ci concentriamo sul miglioramento della risposta rigenerativa dell'epicardio dopo danno cardiaco. EPDCs adulto può essere utilizzato per testare i composti che inducono EMT, con l'obiettivo di trovare una droga potenziale terapeutica per una migliorata risposta rigenerativa dell'epicardio. Inoltre, è possibile misurare fattori secernute da EPDCs a comprendere il paracrine segnalazione per (ri) generare miocardio. Inoltre, poiché abbiamo osservato che EPDCs fetale sono più inclini a subire EMT spontaneamente rispetto al EPDCs adulto, analizziamo le differenze tra la EPDCs fetali ed adulti. Determinazione del meccanismo di attivazione fetale aumentata potrebbe fornire uno spunto per migliorare l'attivazione dell'epicardio nel cuore adulto.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è sostenuta da l'organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) (VENI 016.146.079) e un assegno di ricerca LUMC sia per AMS e Stichting Bontius LUMC (MJG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX Gibco 21885-025
Medium 199  Gibco 31150-022
Fetal Bovine Serum  Gibco 10270-106
Trypsin 0.25% Invitrogen 25200-056
Penicillin G sodium salt Roth HP48
Streptomycin sulphate Roth HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas Serva 37289
EDTA Sigma E4884
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890
Culture plates 6 well Greiner bio-one 657160
Culture plates 12 well Corning 3512
Culture plates 24 well Greiner bio-one 662160
SB 431542 Tocris 1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Merck 102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips Corning 4809
10-ml pipet Greiner bio-one 607180
5-ml pipet Greiner bio-one 606180
Cell culture dish 100/20 mm Greiner bio-one 664160
PBS Gibco 10010056 Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL Eppendorf 0030120086
15-ml centrifuge tubes Greiner bio-one 188271
50-ml centrifuge tubes Greiner bio-one 227261
10 mL Syringe Becton Dickinson 305959
Needles 19 Gauge Becton Dickinson 301700
Needles 21 Gauge Becton Dickinson 304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm Greiner bio-one 542000
TGFβ3  R&D systems 243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle Sigma A2547 
Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Invitrogen A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen A12379
Equipment
Name Company Catalog Number Comments
Pipet P1,000 Gilson F123602
Pipet controller Integra 155 015
Stereomicroscope Leica M80
Inverted Light Microscope Olympus CK2
Centrifuge Eppendorf 5702
Waterbath GFL 1083

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References

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L'isolamento e coltura di cellule primarie dell'epicardio ricavate da campioni di cuore umano adulto e fetale
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Dronkers, E., Moerkamp, A. T., van Herwaarden, T., Goumans, M. J., Smits, A. M. The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens. J. Vis. Exp. (134), e57370, doi:10.3791/57370 (2018).More

Dronkers, E., Moerkamp, A. T., van Herwaarden, T., Goumans, M. J., Smits, A. M. The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens. J. Vis. Exp. (134), e57370, doi:10.3791/57370 (2018).

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