Summary
L’épicarde joue un rôle crucial dans le développement et la réparation du coeur en fournissant des cellules et facteurs de croissance à la paroi myocardique. Nous décrivons ici une méthode aux cellules humaines d’épicardique principale culture qui permet l’étude et la comparaison de leurs caractéristiques développementales et adultes.
Abstract
L’épicarde, une couche de cellules épithéliales couvrant le myocarde, a un rôle essentiel au cours du développement cardiaque, ainsi que dans la réponse de réparation du coeur après une lésion ischémique. Lorsqu’il est activé, les cellules épicardiques subissent un processus appelé épithéliales de transition mésenchymateuse (EMT) pour assurer les cellules vers le myocarde en régénération. En outre, l’épicarde contribue par l’intermédiaire de la sécrétion de facteurs paracrines essentiel. Pour apprécier pleinement le potentiel de régénération de l’épicarde, un modèle de cellule humaine est nécessaire. Ici, nous présentons un modèle de culture cellulaire roman pour dériver des cellules dérivées épicardiques primaires (EPDCs) de tissu cardiaque adult et du foetus humain. Pour isoler le EPDCs, l’épicarde est disséqué de l’extérieur de l’échantillon de cœur et transformée en une suspension monocellulaire. Ensuite, les EPDCs sont plaqués et cultivées dans un milieu contenant l’inhibiteur de kinase-5 ALK SB431542 pour maintenir leur phénotype épithélial EPDC. EMT est induite par la stimulation avec TGFβ. Cette méthode permet, pour la première fois, l’étude du processus de l’humain EMT épicardique dans un milieu contrôlé et permet de gagner plus de perspicacité dans la sécrétome de EPDCs qui peut aider la régénération cardiaque. Par ailleurs, cette approche uniforme permet une comparaison directe des comportements humains adultes et foetale épicardique.
Introduction
L’épicarde, une couche épithéliale monocellulaires qu’enveloppes le coeur, est d’une importance vitale pour le développement cardiaque et réparation (examinées par Smits et al. 1). développemental, l’épicarde découle de l’orgue de proepicardial, une petite structure située à la base du cœur en voie de développement. Autour du jour du développement E9.5 à la souris et après la conception 4 semaines chez les humains, les cellules commencent à migrer à partir de cette structure de chou-fleur et de couvrir les pays en développement de myocarde2. Une fois qu’une couche unique de cellules épithéliales est formée, une partie des cellules épicardiques subit épithéliales de transition mésenchymateuse (EMT). Au cours de l’EMT, les cellules perdent leurs caractéristiques épithéliales, comme les adhérences cellule-cellule et obtenir un phénotype mésenchymateux qui leur donne la capacité de migrer dans le myocarde en voie de développement. Les cellules formées de dérivée épicardiques (EPDCs) peuvent se différencier en plusieurs types de cellules cardiaques, y compris les fibroblastes, cellules musculaires lisses et potentiellement cardiomyocytes et cellules endothéliales3, bien que la différenciation de ces derniers, deux cellules les populations reste sujette à débat (examinée par Smits et al. 4). en outre, l’épicarde fournit des signaux paracrines instructif sur le myocarde pour réguler sa croissance et la vascularisation5,6,7,8. Plusieurs études ont démontré qu’avec facultés affaiblies formation épicardique conduit à des anomalies du développement dans le muscle cardiaque9,10, système vasculaire11et conduction system12, mettant l’accent sur l’essentiel contribution de l’épicarde à la formation du cœur.
Bien qu’en plein adulte l’épicarde est présent sous une couche dormante, il devient réactivé après ischémie13. Après lésion de réactivation épicardique reprend plusieurs des processus décrits pour le développement cardiaque, y compris la prolifération et EMT14, quoique moins efficacement. Fait intéressant, bien que le mécanisme exact n’est pas entièrement compris, la contribution épicardique de réparer peut être améliorée par un traitement avec, par exemple, thymosine β415 ou modification ARNm de VEGF-A16, résultant en flexibilit cardiaque fonction après infarctus du myocarde. L’épicarde constitue donc une source intéressante de cellulaire pour améliorer la réparation endogène du cœur blessé.
Mécanismes du développement cardiaque sont souvent récapitulés lors de blessures, quoique de manière moins efficace. En quête d’activateurs épicardiques, il est primordial que nous pouvons déterminer et comparer la capacité totale de l’épicarde foetale et adulte. En outre, d’un point de vue thérapeutique, il est important que, en plus de l’expérimentation animale, nous étendons connaissance relativement à la réponse de l’épicarde humaine. Nous décrivons ici une méthode pour isoler et adultes et foetales épicardiques dérivées des cellules humaines (EPDCs) dans une morphologie épithéliale-cellule-comme la culture et d’induire des EMT. Avec ce modèle, notre objectif est d’explorer et de comparer le comportement cellulaire épicardique adultes et du foetus.
Le principal avantage de ce protocole est l’utilisation de matériel épicardique humain, qui n’a pas été soigneusement étudiée. Ce qui est important, le protocole de culture décrit isolement et cellule fournit une seule méthode uniforme pour calculer les deux galets foetale et adultes EPDCs, permettant une comparaison directe entre les sources de ces deux cellules. En outre, étant donné que l’épicarde est isolée en fonction de son emplacement, il est assuré que les cellules sont en fait que dérivée17.
Tandis que des méthodes d’isolement EPDC humaines ont été établis précédemment, ces dépendent principalement de protocoles excroissance où des morceaux de tissu cardiaque ou épicardique sont plaqués sur une cellule culture plat18,19. Cette approche sélectionne ainsi spécifiquement pour les cellules qui perdent partiellement leur phénotype épithélial afin de migrer, et qui sont plus susceptibles de subir une EMT spontanée. Dans le protocole actuel, l’épicarde est d’abord transformé en une solution de cellule unique qui permet à l’EPDCs isolés maintenir leur état épithélial. Cette méthode fournit donc un modèle solide en vitro afin d’étudier les EMT épicardique.
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Protocol
Toutes les expériences avec des échantillons de tissus humains ont été approuvées par le Comité d’éthique de la Leiden University Medical Center et est conforme à la déclaration d’Helsinki. Toutes les mesures sont effectuées avec du matériel stérile dans un flux de culture cellulaire du cabinet.
1. les préparatifs
- Préparer EPDC milieu en mélangeant de Dulbecco mis à jour le milieu Eagle (DMEM basse-glucose) et milieu 199 (M199) dans un rapport 1:1. Ajouter 10 % chaleur inactivé sérum fœtal (SVF, chaleur inactivé pendant 25 min à 56 ° C) et compléter à 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 100 mg/mL. Réchauffez le milieu EPDC dans un bain-marie à 37 ° C.
- Réchauffez la trypsine 0.25%/EDTA (1:1) dans un bain-marie à 37 ° C.
- Recouvrir les puits avec de la gélatine. Ajouter 0,1 % de gélatine/PBS dans chaque puits et incuber les boîtes pendant au moins 15 min à 37 ° C. Lignes directrices pour la plaque de culture cellulaire requis sont résumées dans le tableau 1. Retirez soigneusement tous les fluides avant ensemencement des cellules.
- Préparer une solution de 10 mM SB431542 (SB), diluée dans le DMSO (CAUTION). Faire 50 µL d’extraits dans des tubes à centrifuger en polypropylène fond conique, comme des tubes Eppendorf et les stocker à-20 ° C. Notez que les parties aliquotes SB peuvent être décongelés qu’une seule fois.
2. récupération et stockage des spécimens adultes et foetal coeur
- Stocker des oreillettes adultes humains directement après le retrait au cours de la chirurgie dans un tube de 50 mL à 15 mL haute-glucose DMEM contenant 10 % FBS, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 100 mg/mL à 4 ° C. Les échantillons sont généralement 3-5 cm de taille et peut être conservés jusqu'à 48 h après dissection.
- Stocker les coeurs foetaux issus de matériel de l’avortement électif dans EPDC milieu à 4 ° C jusqu'à 24h après l’isolement. Pour ce protocole, utilisez des échantillons à un âge gestationnel entre 12-22 semaines. Notez que le coeur entier peut être utilisé pour l’isolement de l’épicarde.
3. isolement de la couche épicardique
- Dans le flux laminaire, préparer un plat de 100 mm-culture de cellules avec du PBS et placez une goutte de séparé (~ 200 µL) de PBS dans le couvercle. Remplir un tube de 15 mL avec support EPDC préchauffé 5 mL.
- Placer le tissu dans le plat de culture cellulaire rempli avec du PBS. Assurez-vous que le tissu est imbibé fréquemment au cours de la procédure.
- À l’aide d’un stéréomicroscope, enlevez autant de la couche épicardique de l’échantillon de tissu possible en elle décolle avec une pincette.
Remarque : L’épicarde peut être reconnu comme une très mince couche transparente adhéré étroitement à l’extérieur du cœur (Figure 1 a). Essayez d’éviter une contamination par le tissu adipeux épicardique et les vaisseaux sanguins puisque cela entravera l’isolement. - Rassembler les morceaux de tissu épicardique dans la goutte de PBS sur le couvercle.
- Couper le tissu épicardique en petits morceaux (0. 5 mm3) à l’aide d’un scalpel (Figure 1 b), ou le bout pointu des petites pinces. Notez que les pièces soient en mesure de passer une P1, 000 embout de la pipette (étape 3.6).
- Ajouter 1 mL de la trypsine dans le tissu épicardique et collecter les pièces et la trypsine avec une P1, 000 embout de la pipette. Transvaser le tissu dans un tube à centrifuger conique de 1,5 mL (Figure 1).
- Incuber le tube dans un bain-marie à 37 ° C pendant 10 min, en agitant à ~ 60 tr/min.
- Retirer le tube de l’eau du bain et nettoyer l’extérieur du tube avec l’éthanol à 70 %.
- Laisser le tissu à couler au fond du tube (Figure 1) et transvaser avec soin le surnageant contenant les cellules épicardiques dans le tube de 15 mL contenant 5 mL de milieu de EPDC pour inactiver la trypsine.
- Reconstituer le tissu restant dans le tube à centrifuger conique avec la trypsine 1 mL et mélanger doucement pipetage de haut en bas.
- Répétez l’étape 3.7 à 3.10 deux fois. À l’étape finale, après un total de 30 min d’incubation de la trypsine, transfert tant le surnageant et le tissu épicardique restant dans le tube contenant le milieu EPDC.
- Lorsque toutes les cellules sont collectées dans un milieu EPDC, doucement passer la suspension par une seringue de 10 mL avec une aiguille de calibre 19 dans un nouveau tube de 15 mL de dissocier mécaniquement les cellules (Figure 1E).
Remarque : Assurez-vous d’homogénéiser la suspension par pipetage de haut en bas avant de passer la solution à travers l’aiguille afin d’empêcher l’aiguille s’obstruée. - Pour davantage de dissocier les cellules, répétez l’étape 3.12 avec une aiguille de calibre 21.
- Placez une passoire de cellule de 100 µm au sommet d’un tube de 50 mL et transférer le support contenant les cellules épicardiques sur la crépine à l’aide d’une pipette de 10 mL pour enlever toutes les touffes restants (Figure 1F).
- Laver le filtre pour recueillir des cellules résiduelles en pipettant également, 5 mL de milieu de EPDC sur la crépine.
- Pipette de la suspension cellulaire du tube de 50 mL dans un tube de 15 mL. Étant donné que les cellules se déposent au fond du tube, secouez légèrement la solution avant de pipetage.
Remarque : Cette étape n’est pas nécessaire, un tube plus petit sida visualisation du culot après centrifugation. - Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à température ambiante (Figure 1).
- Retirez le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire (Figure 1 H) dans le volume requis de EPDC support (tableau 1).
Remarque : Pour EPDCs fœtales, utilisez directement moyen EPDC contenant 10 µM de l’inhibiteur de kinase de ALK5 (EPDC + SB). Les cellules adultes peuvent être plaqués sans SB lors du premier passage. - Plaque de la suspension cellulaire sur les plaques de culture de gélatine enduit (Figure 1I). La taille du puits dépend de la taille de l’échantillon de tissu épicardique (tableau 1). Notez que confluence basse va entraîner l’apparition de l’EMT.
- Placer les cellules dans un incubateur pendant au moins 48 h à 37 ° C, 5 % de CO2 pour permettre les cellules fixer sur la plaque de culture.
4. culture de EPDCs
- Reconstituer le milieu EPDC + SB au moins tous les 3 jours.
- Inspecter les cellules au moins tous les 3 jours à l’aide du microscope. Lorsque les cellules atteignent la confluence, c'est-à-direlorsque la plaque de culture est entièrement recouverte de cellules, le passage des cellules dans un rapport de 1:2 de surface. Notez que pour atteindre confluence peut prendre environ 5 à 10 jours.
- Aspirez le milieu à l’aide d’une pipette ou un système d’aspiration avec, par exemple, une pipette de verre.
- Laver soigneusement les cellules en ajoutant des PBS aux cellules. Doucement agiter la plaque et aspirer le PBS.
- Ajouter la trypsine à la plaque. Tourner délicatement la plaque pour couvrir toutes les cellules avec de la trypsine et incuber la plaque pendant 1 min à 37 ° C.
NOTE : Utiliser comme trypsine peu possible (indication : 200 µL / puits d’une 6 bien sur plaque) - Taper la plaque pour détacher mécaniquement les cellules de la partie inférieure de la plaque. Utiliser le microscope pour vérifier visuellement si les cellules ont détaché. Si ce n’est pas le cas, incuber la plaque de culture cellulaire pendant une minute supplémentaire.
- Ajouter le volume requis de EPDC + SB milieu aux cellules, resuspendre par pipetage de haut en bas et transférer la suspension cellulaire à une nouvelle plaque de culture enduit de gélatine.
Remarque : en général, les cellules peuvent être conservés dans une morphologie pavées jusqu'à passage 8.
5. l’induction de l’EMT dans EPDCs
- Pour provoquer l’EMT, dissocier les cellules avec la trypsine et transfert les cellules à la gélatine de nouveaux enduits de puits dans un rapport de 1:2 surface dans un milieu EPDC + SB, comme décrit dans 4 et incuber pendant au moins 24 h à 37 ° C, 5 % de CO2.
- Vérifiez si confluency est 50-70 %, et si EPDCs ont une morphologie de pavés.
Remarque : Confluence affecte l’aptitude des EPDCs EMT. - Aspirer le milieu des cellules et laver les cellules soigneusement avec du PBS (Voir l’étape 4.2.1 - 4.2.2).
- Stimuler les cellules avec 1 ng/mL TGFβ3 dans un milieu EPDC et placez-les dans un incubateur à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 5 jours. Notez que pendant la stimulation, le milieu EPDC contenant du TGFβ3 n’a pas à être réapprovisionné.
- Contrôler les cellules au quotidien. Après 5 jours, les cellules qui ont subi les EMT sont reconnus par une morphologie fusiforme (Figure 2 a).
- La culture fusiformes EPDCs selon la méthode décrite dans 4 sans addition de SB ou TGFβ au milieu EPDC. Notez qu’en général, EPDCs fusiformes peuvent être cultivées jusqu'à passage 20.
- Valider la présence de l’EMT avec immunofluorescence à l’aide d’anticorps contre les marqueurs mésenchymateux αSMA ou la vimentine ou par la phalloïdine pour détecter la formation de fibres de stress d’actine F (Figure 2 b), ou qRT-PCR pour les gènes liés à l’EMT ( par exemple, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-cadhérine, MMP3, escargot, limace) (Figure 2 et tableau 2).
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Representative Results
Ici, nous exposons un protocole simple pour isoler EPDCs des adult et du foetus humain tissu cardiaque (Figure 1). Ce protocole tire parti de l’emplacement facilement accessible de l’épicarde à l’extérieur du cœur (Figure 1 a). Coloration de l’oreillette cardiaque après que dissection montre que l’épicarde WT1 + est supprimé tandis que le sous-épicardique sous-jacente de la matrice extracellulaire et le tissu myocardique restent intactes (Figure 1J). Caractérisation approfondie a été effectuée avant, démontrant que les EPDCs expriment des marqueurs épicardiques, par exemple, expression ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 et l’absence d’autres types de cellules de coeur-résident, par exemple, PECAM1, ISL1, CD34 et TNNT2. 17
Adultes (Figure 1 K) et fœtale (Figure 1D) EPDCs cultivées en présence de voir la SB431542 d’inhibiteur de kinase ALK5 une morphologie pavées. Toutefois, selon les conditions des bailleurs de fonds et de la culture, EPDCs foetales peuvent subir une EMT malgré la présence de SB. Cela peut entraîner dans les cellules fusiformes au sein de la population de cellules pavées (voir les flèches dans la Figure 1 L). S’il vous plaît être conscient que l’isolement de cellules en forme de pavé de tissu fœtal n’est pas toujours possible et peut entraîner la dérivation de pour la plupart des cellules fusiformes. Étant donné que ces cellules se développent plus rapidement, ils seront rapidement proliférer des autres types de cellules.
EMT peut être induite en incubant avec TGFβ320 pendant 5 jours dans les cellules adultes et du foetus, comme en témoigne une transition claire morphologique à cellules fusiformes (Figure 2 a). Comme l’a démontré avec le témoin non traité (« vide »), EPDCs foetales fera l’objet d’EMT spontanée lors du retrait du SB, tandis que les adultes EPDCs subira seulement EMT lors de la stimulation avec TGFβ3. Pour valider les EMT, EPDCs ont été immunomarquées avec l’actine musculaire lisse alpha (αSMA), un marqueur mésenchymateux (Figure 2 b). En outre, EMT a été confirmée dans EPDCs adultes utilisant qRT-PCR montrant une diminution du marqueur épicardique WT1 et stimulation de l’expression des marqueurs mésenchymateux POSTN, αSMA, collagène 1 a 1, MMP3 et N-cadhérine (Figure 2). Expériences complètes au sujet de l’EMT épicardique adulte et du foetus sont publiés avant le17.
| Tissu | Type de bien | Zone de croissance cellulaire (cm2) | Volume de liquide (mL) | Ajout de SB |
| Fœtale | 24 | 1,9 | 0,5 | Directement |
| Adulte petite (< 4 cm) | 12 | 3.8 | 1 | Après 1 passagest |
| Adulte grand | 6 | 9.6 | 2 | Après 1 passagest |
| (> 4 cm) |
Tableau 1 : lignes directrices pour la sélection de la plaque de culture cellulaire appropriée. La taille bien choisie dépend de la quantité de cellules épicardiques isolée. Ces lignes directrices peuvent servir comme une règle de base pour sélectionner la plaque de culture cellulaire approprié.
| Gène | Séquence |
| WT1 avant | ACG CTT GAA TGC ATG ACC TG |
| WT1 inverse | TAT TCT GTA TTG GGC STC GC |
| N-cadhérine avant | CAG ACC GAC CCA AAC AGC AAC |
| Revers de la N-cadhérine | GCA GCA ACA GTA AGG ACA AAC ATC |
| POSTN avant | GGA GGC AAA CAG CCT AGA GT |
| POSTN inverse | GGC TGA GGA AGG TGC TAA AG |
| Avant de SMA | GCC GGA GAA AAT GAC TCA AA |
| SMA inverse | GAA GGA ATA GCC NOC CCT AG |
| MMP3 avant | TGG ATG GCC ATG CAT AAG |
| MMP3 inverse | ACG AAA TGG CTG CAT CGA |
| COL1A1 avant | CCA GAA GAA CTG GTA CAT CAG CA |
| COL1A1 inverse | CCG CAT LOI CGA AAT AAT DE GGG |
| GAPDH avant | AGC CAC ATC CAG GCT ACA C |
| GAPDH inverse | GCC CAA TAC GAC CAA ATC C |
| B2M avec impatience | ACA CTG AAT TCA CCC CCA CT |
| B2M inverse | GCT TAC ATG TCT CGA STC CAC T |
Tableau 2 : séquences d’amorces utilisées pour la validation de l’EMT dans EPDCs. Séquences des amorces et inverses utilisés pour qRT-PCR pour déterminer que l’expression de l’EMT plusieurs des gènes chez les adultes EPDCs.
Figure 1 : Isolement des épicardique dérivées des cellules (EPDCs). (A) s est un pavillon adult retiré du cœur humain d’une fine couche extérieure membraneux, l’épicarde, qui est supprimé. La flèche noire pointe vers l’épicarde. (B-j’ai) Représentation visuelle de la méthode d’isolement de EPDCs. La flèche noire pointe vers le culot cellulaire. (J) par immunofluorescence souillant d’une auricule cardiaque avec et sans la dissection de l’épicarde. Barre d’échelle : 50 µm. (K) photos représentatives de deux isolements EPDC adultes différentes cultivées avec des images représentatives SB. (L) de deux isolements EPDC foetales différentes cultivées avec des flèches Black SB. indiquer cellules mésenchymateuses dans foetale Culture EPDC. Echelle : 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Validation de l’EMT dans les cellules d’origine humaine adulte et foetale épicardique (EPDCs). EPDCs adultes et fœtales ont été cultivées avec SB, ne pas traitée (vide) ou stimulent avec TGFβ3 pendant 5 jours. Photos de champ lumineux représentant (A). Echelle : 200 µm. (B) Immunostaining DAPI et αSMA. Echelle : 100 µm. (C) l’ARNm des gènes liés à l’EMT, déterminés dans les EPDCs adultes par qRT-PCR. Valeurs mesurées ont été normalisées à l’expression GAPDH et B2M. Les valeurs sont dépeints comme moyenne + SD 2 ^-ΔΔct (n = 2). Abréviations : Tumeur de WT1:Wilms 1, MMP3 : Matrix Metalloproteinase 3, POSTN:Periostin, αSMA : alpha actine Muscle lisse, Col1A1:Collagen 1 a 1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous décrivons ici un protocole détaillé d’isoler et de la culture des cellules primaires épicardiques dérivés de coeurs adultes et du foetus humains. Une caractérisation de ces cellules a été précédemment publié17. Nous avons montré que les deux types de cellules peuvent être maintenues tant que les cellules épithéliales de pavées comme lorsqu’il est cultivé avec l’inhibiteur de kinase de ALK5 SB431542. EMT est partie intégrante du épicardique activation in vivo au cours de développement et de la réponse après l’accident. EMT peut être étudié à l’aide de cette méthode par addition de TGFβ. Ce qui est important, nous avons observé précédemment que EPDCs foetales subissent rapidement EMT spontanée lorsque SB est supprimé, tandis que les EPDCs adultes subissent seulement EMT sur stimulation17. Étudier ces processus en EPDCs foetales peut aider à comprendre comment mieux activer l’épicarde adulte après avarie.
La méthode présentée s’appuie sur le matériel de patient, qui est obtenu au cours de la chirurgie. Par conséquent, on peut s’attendre plusieurs variations dans l’état du matériel isolé, qui sont soit en raison de la variabilité de patient ou de la vitesse à laquelle le matériau est recueilli dans le théâtre d’opération. Cette variation peut expliquer les différences dans la procédure : 1) la facilité avec laquelle l’épicarde peut être disséqué par le myocarde, 2) adhérence de cellules isolées à la plaque de 3) la capacité de prévenir ou de subir une EMT et la vitesse de prolifération 4). En général, un isolement rapide est préférable pour la survie des cellules. Le principal point critique s’écaille l’épicarde par le myocarde. Si les tissus sous-jacents est fortement respecté l’épicarde, un 15 min avant le traitement du tissu cardiaque avec la trypsine peut aider à enlever l’épicarde plus facilement. En outre, l’efficacité du traitement trypsine dépend de plusieurs facteurs, dont l’activité de la trypsine et la composition du tissu. Par conséquent, si on observe un faible rendement, le temps d’incubation avec de la trypsine est réglable. En outre, si aucun culot cellulaire n’est visible après rotation vers le bas, la solution ne pourrait pas avoir été complètement dissociée avant d’exécuter à travers le filtre. Mélanger la solution avant traversant la solution de la seringue ou à l’aide d’un supplément, plus petite seringue pourrait être utile de dissocier les cellules. La taille bien pour l’amorçage EPDCs considérer soigneusement pour activer les cellules maintenir leur état épithélial. Le tableau 1 donne une indication, mais on peut s’écarter de cette ligne directrice lorsque, par exemple, seulement une petite partie du rythme cardiaque fœtal peut être utilisée et bordé dans un bien plus petit est plus pratique.
Puisque les cellules fœtales fera l’objet d’EMT immédiatement sans SB17, EPDCs foetales doivent toujours être plaqués avec SB. Cependant, EPDCs adultes ont tendance à maintenir leur morphologie épithéliale et peuvent donc être plaqués sans SB pendant les premières 48 h du premier passage, pour promouvoir l’adhésion cellulaire. Après le premier passage, EPDCs les deux adultes et foetales sont continuellement cultivées avec SB pour empêcher les EMT spontanée. En outre, la densité cellulaire faible est un déclencheur important pour EMT. EPDCs ne doivent donc jamais être cultivées au-dessous de 50 % de confluence. En revanche, si vous souhaitez EMT, assurez-vous que EPDCs ne sont pas trop densément semés et restent en dessous de 70 % de confluence. Bien que ce protocole utilise TGFβ3, stimulation avec TGFβ1 et -2 peut induire des EMT dans EPDCs ainsi (observations non publiées).
Dans ce protocole, les cellules sont réparties directement sans les filer vers le bas, puisque nous observons une survie inférieure de la cellule lors de l’utilisation de la centrifugeuse. Il est donc urgent d’exploiter les faibles volumes de trypsine pour assurer sa désactivation lorsque le milieu contenant de sérum est ajouté.
Après environ 6-8 passages, EPDCs avec une morphologie épithéliale seront arrête soit en croissance ou fera l’objet d’EMT spontanément. Par conséquent, pour des expériences, nous utilisons galets EPDCs entre passage 3 et 6 d’adoption. En revanche, EPDCs avec une morphologie mésenchymateuse sont moins vulnérables et peuvent être cultivés jusqu'à passage 20. Dans les expériences, cependant, nous avons jamais utilisé de broche EPDCs après le passage deth 10.
Puisque l’épicarde est situé à l’extérieur du cœur et est facile à séparer des tissus sous-jacents, l’authenticité des cellules est évidente, et les risques de contamination importante sont faible. Bien que le tissu adipeux ou vaisseaux sanguins parfois coller à la couche épicardique isolée, la majorité de ces cellules ne passera pas le filtre lors de l’isolation et dans le cas contraire, ne peuvent pas survivre dans une culture cellulaire EPDC. En outre, comme mentionné précédemment, à l’aide de matériel humain fournit un modèle unique pour étudier le comportement humain cellule épicardique. On sait que, par exemple, le tissu adipeux épicardique est différent entre les espèces, mettant l’accent sur la nécessité de cellules épicardique humaines modèles21.
Il est à noter que les oreillettes du coeur ont été obtenus au cours de la chirurgie sur les coeurs malades et par conséquent les différences dans la maladie, le médicament utilisé, l’âge et le sexe du donneur, peuvent influer sur la reproductibilité des expériences. Expériences doivent donc être effectuées sur plusieurs isolements pour obtenir des résultats valides et permettre de solides conclusions puissent être tirées. En outre, selon la question de recherche, on pourrait choisir plus précisément de n’utiliser qu’épicarde de patients d’une maladie ischémique ou non ischémique maladie valvulaire, qui sont censés se comporter différemment.
Il a été suggéré qu’épicarde auriculaire peut avoir des caractéristiques distinctes du ventricule épicarde2, questionnant ainsi si épicarde dérivée de l’auricule auriculaire cardiaque fournit un modèle valide pour comportement épicardique. Dans ce contexte, il est important de souligner que nous ne pouvions pas trouver de différences entre foetale auriculaires et ventriculaires dérivé EPDCs (données non publiées). Cependant, en utilisant épicarde du ventricule adulte humain serait la source ultime de cellule pour vérifier cela. Pourtant, collecte de gros spécimens humains adultes ventricules pour isolement EPDC est très invasive pour le patient et est donc actuellement pas faisable dans cet hôpital.
Nous avons observé que SB n’est pas toujours suffisant pour empêcher les EMT, principalement en EPDCs foetales. Lorsque EPDCs foetales subissent une EMT en présence de SB, nous exclure d’expériences. En conséquence, les cellules utilisés pour des expériences sont sélectionnées pour leur capacité à maintenir un phénotype épithélial en réponse à SB. Nous émettons l’hypothèse que les cellules foetales peuvent être déjà au-delà d’un certain seuil dans le processus de l’EMT, et que l’inhibition avec SB n’est pas en mesure d’arrêter cela.
Ce modèle de cellule épicardique a plusieurs applications, étant donné que les pays en développement et l’épicarde adulte peuvent être étudiées. Dans notre laboratoire, nous nous concentrons sur l’amélioration de la réponse régénératrice épicardique après altération cardiaque. EPDCs adultes peuvent être utilisés pour tester les composés qui provoquent des EMT, visant à trouver un médicament thérapeutique potentiel pour une meilleure réponse régénératrice de l’épicarde. En outre, il est possible de mesurer les facteurs sécrétés par EPDCs de comprendre le paracrine signalisation à la (re) génération de myocarde. En outre, étant donné que nous avons observé que EPDCs foetales sont plus sujettes à subir une EMT spontanément par rapport aux adultes EPDCs, nous étudions les différences entre les EPDCs foetales et adultes. Déterminer le mécanisme sous-jacent de l’augmentation de l’activation foetale pourrait fournir un repère afin d’améliorer l’activation épicardique dans le cœur d’adulte.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche est financée par l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO) (VENI 016.146.079) et une bourse de recherche de LUMC tant d’AMS et LUMC Bontius Stichting (MJG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
References
- Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
- Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).
- Zhou, B., Ma, Q., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
- Smits, A., Riley, P. Epicardium-Derived Heart Repair. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).
- Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor. Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).
- Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).
- Lavine, K. J., Yu, K., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).
- Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).
- Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).
- Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns. Circulation Research. 96 (5), (2005).
- Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).
- van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PloS one. 7 (9), e44692 (2012).
- Zhou, B., Honor, L. B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Smart, N., Bollini, S., et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury. Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).
- Zangi, L., Lui, K. O., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).
- Clunie-O'Connor, C., Smits, A. M., et al. The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).
- Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).
- Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1. Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).
- Chechi, K., Richard, D. Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue. International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).
