Summary
Epicardium spiller en afgørende rolle i udviklingen og reparation af hjertet ved at give celler og vækstfaktorer Myokardie væg. Her, beskriver vi en metode til at kultur menneskelige primære epikardielle celler, der giver mulighed for undersøgelse og sammenligning af deres udviklingsmæssige og voksen egenskaber.
Abstract
Epicardium, en epitelcelle lag dækker myokardiet, har en væsentlig rolle under hjerte udvikling, samt reparation svar af hjertet efter iskæmisk skade. Når aktiveret, gennemgå epikardielle celler en proces kendt som epitelial mesenchymale overgangen (EMT) at levere celler til regenererende myokardiet. Desuden bidrager epicardium via sekretion af væsentlige paracrine faktorer. For fuldt ud at værdsætte epicardium regenerativ potentiale, er en menneskelig celle model påkrævet. Her skitsere vi en roman celle kultur model for at udlede primære epikardielle afledte celler (EPDCs) fra menneskelige voksen og fostrets hjerte væv. For at isolere EPDCs, er epicardium dissekeret fra ydersiden af hjertet modellen og forarbejdet til en enkelt cellesuspension. Næste, EPDCs er belagte og kulturperler i EPDC medium indeholdende ALK 5-kinase inhibitor SB431542 at opretholde deres epitelial fænotype. EMT er foranlediget ved stimulation med TGFβ. Denne metode giver mulighed for undersøgelse af processen med menneskelige epikardielle EMT i kontrollerede omgivelser, for første gang, og gør det lettere at få mere indsigt i secretome af EPDCs, der kan støtte hjerte regenerering. Desuden, denne ensartede fremgangsmåde giver mulighed for direkte sammenligning af menneskelig voksne og føtale epikardielle adfærd.
Introduction
Epicardium, en enkelt celle epitel lag at konvolutter hjertet, er af vital betydning for udvikling af hjerte og reparation (gennemgik i Smits et al. 1). udviklingshæmmede, epicardium udspringer af proepicardial orglet, en lille struktur placeret i bunden af den udvikle hjerte. Omkring udviklingsmæssige dag E9.5 i mus, og 4 uger efter undfangelse i menneskelige begynde cellerne at migrere fra denne blomkål struktur og dække den udvikle myokardiet2. Når en enkelt epitelcelle lag er dannet, gennemgår en del af de epikardielle celler epitelial mesenchymale overgangen (EMT). Under EMT, celler mister deres epitelial egenskaber, såsom celle-celle sammenvoksninger, og opnå en mesenchymale fænotype, som giver dem evnen til at overflytte til udviklingslandene myokardiet. De dannede epikardielle afledte celler (EPDCs) kan udvikle sig til flere hjerte celletyper, herunder fibroblaster, glatte muskelceller, og potentielt cardiomyocytes og endotelceller3, selv om differentiering af sidstnævnte to celle befolkningsgrupper er stadig genstand for debat (gennemgik i Smits et al. 4). Derudover epicardium giver lærerigt paracrine signaler at myokardiet at regulere dens vækst og vascularization5,6,7,8. Flere undersøgelser har vist, at nedsat epikardielle dannelse fører til udviklingsmæssige mangler i hjertemuskulaturen9,10, vaskulatur11og varmeledning system12, understreger væsentlige bidrag af epicardium til dannelsen af hjertet.
Selv om voksen midt i epicardium er til stede som en sovende lag, bliver det genaktiveret ved iskæmi13. Epikardielle reaktivering efter skade sammenfatter flere af processerne beskrevet for kardiale udvikling, herunder spredning og EMT14, omend mindre effektivt. Interessant, selv om de nøjagtige mekanisme ikke er fuldt forstået, de epikardielle bidrag til at reparere kan forbedres ved behandling med fxThymosin β415 eller ændret VEGF-A mRNA16, hvilket resulterer i afhjælpes hjerte funktionen efter myokardieinfarkt. Epicardium er derfor en interessant celle kilden øge endogen reparation af de sårede hjerte.
Mekanismer af cardiac udvikling er ofte sammenfattet under skade, dog i en mindre effektiv måde. På jagt efter epikardielle aktivatorer er det altafgørende, at vi kan bestemme og sammenligne den fulde kapacitet af den føtale og voksne epicardium. Derudover fra et terapeutisk synspunkt er det vigtigt, at ud over dyreforsøg, vi udvide viden om reaktion af den menneskelige epicardium. Her, beskriver vi en metode til at isolere og kultur menneskelige voksen og fostrets epikardielle afledte celler (EPDCs) i en epitel-celle-lignende morfologi og fremkalde EMT. Med denne model, vi sigter mod at undersøge og sammenligne voksne og føtale epikardielle celle adfærd.
Den største fordel ved denne protokol er brug af menneskelige epikardielle materiale, som ikke er blevet grundigt undersøgt. Vigtigere, giver beskrevet isolation og celle kultur protokollen en enkelt ensartet metode til at udlede begge føtale og voksne cobble EPDCs, gør det muligt for en direkte sammenligning mellem disse to celle kilder. Derudover da epicardium er isoleret baseret på dens placering, er det sikret, at cellerne er faktisk epicardially afledte17.
Mens menneskelige EPDC isolation metoder har oprettet tidligere, regne disse for det meste udvækst protokoller hvor stykker af hjerte- eller epikardielle væv er belagt på en celle kultur parabol18,19. Denne tilgang markerer dermed specielt til celler der delvist mister deres epitelial fænotype for at migrere, og der er mere tilbøjelige til at gennemgå spontan EMT. I den nuværende protokol behandles epicardium først i en enkelt celle løsning, som giver mulighed for de isolerede EPDCs til at opretholde deres epitelial tilstand. Denne metode giver derfor et solidt in vitro- model for at studere epikardielle EMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter med humant væv individer blev godkendt af den etiske komité i Leiden University Medical Center og er i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen. Alle trin er udført med sterilt udstyr i en celle kultur flow kabinet.
1. præparater
- Forberede EPDC medium ved at blande Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM low-glucose) og Medium 199 (M199) i forholdet 1:1. Tilføje 10% varme inaktiveret føtal bovint serum (FBS, varme inaktiveres i 25 min ved 56 ° C) og supplere med 100 U/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin. Pre varm EPDC medium i et 37 ° C vandbad.
- Pre varm Trypsin 0.25%/EDTA (1:1) i et 37 ° C vandbad.
- Frakke brønde med gelatine. Tilføje 0,1% gelatine/PBS til hver brønd og Inkuber plader i mindst 15 min. ved 37 ° C. Retningslinjer for den nødvendige celle kultur plade er sammenfattet i tabel 1. Fjern forsigtigt alle væske før plating celler.
- Forberede en stamopløsning af 10 mM SB431542 (SB), fortyndet i DMSO (forsigtighed). Gøre 50 µL delprøver i konisk bund polypropylen centrifugeglas, ligesom Eppendorf-rør, og gemme dem på-20 ° C. Bemærk at SB delprøver kan optøs kun én gang.
2. hentning og opbevaring af voksne og føtale hjerte enheder
- Gemme menneskelige voksen bladflige direkte efter udtagning under operation i en 50 mL tube med 15 mL høj-glucose DMEM indeholdende 10% FBS, 100 U/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin ved 4 ° C. Prøverne er generelt 3-5 cm i størrelse og kan lagres op til 48 timer efter dissektion.
- Gemme fostrets hjerte fremstillet af elektiv abort materiale i EPDC medium ved 4 ° C op til 24 timer efter isolation. For denne protokol, skal du bruge prøver med en gestationsalder mellem 12-22 uger. Bemærk, at hele hjertet kan anvendes til isolering af epicardium.
3. isolering af de epikardielle lag
- I laminar flow kabinet, forberede en 100-mm cellekultur parabol med PBS og placere et separat slipværktøj (~ 200 µL) af PBS i låget. Fyld en 15 mL tube med 5 mL pre varmede EPDC medium.
- Sted væv i cellekultur fad fyldt med PBS. Sørg for, at vævet er fugtet ofte under proceduren.
- Ved hjælp af et stereomikroskop, fjerne så meget af det epikardielle lag fra vævsprøve som muligt ved at skrælle det ud ved hjælp af pincet.
Bemærk: Epicardium kan anerkendes som en meget tynd, gennemsigtig lag stramt overholdt på ydersiden af hjertet (figur 1A). Prøv at undgå forurening med epikardielle fedtvæv og blodkar, da dette vil hæmme isolation. - Indsamle stykker af epikardielle væv i denne droplet PBS på låget.
- Skær det epikardielle væv i små stykker (0,5 mm3) ved hjælp af en skalpel (figur 1B), eller ved hjælp af de skarpe tips af lille pincet. Bemærk, at stykker bør være i stand til at passere en P1, 000 afpipetteres tip (trin 3.6).
- Tilsættes 1 mL trypsin på epikardielle væv og indsamler stykker og trypsin med en P1, 000 afpipetteres tip. Overføre vævet ind i en 1,5 mL konisk centrifugeglas (figur 1 c).
- Inkuber rør i et 37 ° C vandbad i 10 min, mens ryste på ~ 60 rpm.
- Fjerne røret fra vandbadet, og rengør ydersiden af røret med 70% ethanol.
- Tillad væv til at synke til bunden af røret (figur 1 d) og omhyggeligt overføre supernatanten epikardielle celler til 15 mL tube der indeholder 5 mL EPDC medium til at inaktivere trypsin.
- Genopbygge de resterende væv i konisk centrifugeglasset med 1 mL trypsin, og bland forsigtigt når der afpipetteres op og ned.
- Gentag trin 3.7 til 3.10 to gange. På det sidste skridt, efter 30 min trypsin inkubation, alt overføre både supernatanten og de resterende epikardielle væv ind i røret, der indeholder EPDC medium.
- Når alle celler er indsamlet i EPDC medium, forsigtigt passere suspension gennem en 10-mL sprøjte med en 19-gauge kanyle ind i en ny 15 mL rør til mekanisk adskille celler (figur 1E).
Bemærk: Sørg for at homogenisere suspensionen af pipettering op og ned inden de passerer løsningen gennem nålen at forhindre nålen at få blokeret. - For at yderligere adskille cellerne, skal du gentage trin 3.12 med en 21-gauge kanyle.
- Placer en 100 µm celle si på toppen af en 50 mL tube og overføre det medium, der indeholder de epikardielle celler på sien ved hjælp af en 10-mL pipette til at fjerne alle resterende klumper (figur 1F).
- Vask si til at indsamle tilbageværende celler når der afpipetteres 5 mL EPDC medium på sien.
- Med pipette overfoeres cellesuspension fra 50 mL rør ind i en 15 mL rør. Da celler synker til bunden af røret, ryst løsningen forsigtigt før pipettering.
Bemærk: Dette trin er ikke nødvendig, en mindre rør aids visualisering af toerstoffet efter centrifugering. - Der centrifugeres ved 200 x g i 5 min. ved stuetemperatur (figur 1 g).
- Fjern supernatanten og resuspenderes celle (figur 1 H) i den krævede mængde af EPDC medium (tabel 1).
Bemærk: For føtal EPDCs, direkte bruge EPDC medium indeholdende 10 µM af ALK5 kinase inhibitor (EPDC + SB). Voksne celler kan være forgyldt uden SB under den første passage. - Plade cellesuspension på gelatine belagt kultur plader (figur 1I). Størrelsen af brønden afhænger af størrelsen af den epikardielle vævsprøve (tabel 1). Bemærk at lave confluency vil fremkalde forekomsten af EMT.
- Placer cellerne i rugemaskinen i mindst 48 timer ved 37 ° C, 5% CO2 at tillade celler at tillægge kultur plade.
4. kultur af EPDCs
- Genopbygge EPDC + SB medium mindst hver 3 dage.
- Inspicere cellerne mindst hver 3 dage ved hjælp af mikroskopet. Når cellerne kommer til confluency, passage dvs., når kultur plade er fuldt dækket med celler, celler i forholdet 1:2 overflade. Bemærk at nå confluency kan tage ~ 5-10 dage.
- Opsug medium ved hjælp af en pipette eller en aspiration system med fxet glas pipette.
- Cellerne vaskes omhyggeligt ved at tilføje PBS til cellerne. Forsigtigt swirl pladen og Opsug PBS.
- Tilføje trypsin til pladen. Forsigtigt rotere pladen for at dække alle celler med trypsin og inkuberes plade i 1 minut ved 37 ° C.
Bemærk: Brug som lille trypsin som muligt (indikation: 200 µL pr. brønd af et 6 godt plade) - Tryk på pladen for at mekanisk frigøre celler fra bunden af pladen. Anvende mikroskopet til visuelt kontrollere hvis celler er skilt. Hvis ikke, inkuberes celle kultur pladen i et minut ekstra.
- Tilføje den nødvendige mængde af EPDC + SB medium til cellerne, resuspend af pipettering op og ned, og overføre cellesuspension til en ny gelatine belagt kultur plade.
Bemærk: generelt celler kan holdes i en cobblestone morfologi op til passage 8.
5. induktion af EMT i EPDCs
- For at fremkalde EMT, adskille celler med trypsin og overførsel celler til nye gelatine coatede brønde i forholdet 1:2 overflade i EPDC + SB medium, som beskrevet i 4, og der inkuberes i mindst 24 timer ved 37 ° C, 5% CO2.
- Check er hvis confluency 50-70%, og hvis EPDCs har en cobblestone morfologi.
Bemærk: Confluency påvirker EPDCs evne til at gennemgå en EMT. - Opsug medium fra cellerne, og cellerne vaskes omhyggeligt med PBS (Se trin 4.2.1 - 4.2.2).
- Stimulere cellerne med 1 ng/mL TGFβ3 i EPDC medium og placere dem i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 i 5 dage. Bemærk, at under stimulation, EPDC medium indeholdende TGFβ3 ikke har skal genopfyldes.
- Overvåge cellerne dagligt. Efter 5 dage, er celler, der undergik EMT anerkendt ved en spindel-formet morfologi (figur 2A).
- Kultur spindel-formet EPDCs ifølge metoden beskrevet i 4 uden tilsætning af SB eller TGFβ til EPDC medium. Bemærk, at i almindelighed, spindel-formede EPDCs kan være kulturperler op til passage 20.
- Validere forekomst af EMT med immunfluorescent farvning af antistoffer mod mesenchymale markører αSMA eller Vimentin eller ved phalloidin til påvisning af dannelsen af F-actin stress fibre (figur 2B), eller ved hjælp af qRT-PCR for EMT-relaterede gener ( f.eks., WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Cadherin, MMP3, sneglen, Slug) (figur 2 c og tabel 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her, skitsere vi en enkel protokol for at isolere EPDCs fra menneskelige voksen og fostrets hjerte væv (figur 1). Denne protokol udnytter epicardium lettilgængelig placering på ydersiden af hjertet (figur 1A). Farvning af hjertet øret efter dissektion viser, at WT1 + epicardium fjernes, mens den underliggende subepicardial ekstracellulære matrix og Myokardie væv forbliver intakt (figur 1J). Omfattende karakterisering er udført før, viser, at EPDCs express epikardielle markører, fx, ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 og manglende udtryk for andre hjerte-resident celletyper, f.eks., PECAM1, ISL1, CD34 og TNNT2. 17
Både voksen (figur 1 K) og fostrets (figur 1 L) EPDCs kulturperler i overværelse af ALK5 kinase inhibitor SB431542 Vis en cobblestone morfologi. Imidlertid afhængigt af donor og kultur, kan føtal EPDCs underkastes EMT trods tilstedeværelsen af SB. Dette kan resultere i spindel-formet celler inden for befolkningen i brostensbelagte celler (Se pile i figur 1 L). Vær opmærksom på at isoleringen af brosten-formet celler fra fostervæv er ikke altid gennemførlig, og kan resultere i afledning af det meste spindel-formet celler. Da disse celler vokse hurtigere, vil de hurtigt vokse hen over andre celletyper.
EMT kan være fremkaldt ved inkubering med TGFβ320 i 5 dage i både voksne og føtale celler, som det fremgår af en klar morfologiske overgang til spindel-formet celler (figur 2A). Som påvist med ubehandlet kontrol ("Tom"), vil føtal EPDCs gennemgå spontan EMT efter udtagning af SB, mens voksne EPDCs vil kun gennemgå EMT ved stimulation med TGFβ3. For at validere EMT, blev EPDCs immunostained med alpha-glat muskel aktin (αSMA), en mesenchymale markør (figur 2B). Derudover blev EMT bekræftet i voksen EPDCs ved hjælp af qRT-PCR viser downregulation af den epikardielle markør WT1 og opregulering af mesenchymale markører POSTN, αSMA, kollagen 1A1, MMP3 og N-Cadherin (figur 2 c). Omfattende forsøg vedrørende voksne og føtale epikardielle EMT offentliggøres inden17.
| Væv | Godt skrive | Celle vækstområde (cm2) | Volumen af medium (mL) | Tilsætning af SB |
| Føtal | 24 | 1.9 | 0,5 | Direkte |
| Voksen lille (< 4 cm) | 12 | 3.8 | 1 | Efter 1st passage |
| Voksen store | 6 | 9.6 | 2 | Efter 1st passage |
| (> 4 cm) |
Tabel 1: retningslinje for at vælge den relevante celle kultur plade. Det krævede godt størrelse afhænger af mængden af epikardielle celler isoleret. Disse retningslinjer kan bruges som en tommelfingerregel for at vælge den relevante celle kultur plade.
| Gen | Sekvens |
| WT1 frem | CAG CTT GAA TGC ATG ACC TG |
| WT1 omvendt | TAT TCT GTA TTG GGC TCC GC |
| N-Cadherin frem | CAG ACC GAC CCA AAC AGC AAC |
| N-Cadherin omvendt | GCA GCA ACA GTA AGG ACA AAC ATC |
| POSTN frem | GGA GGC AAA CAG CTC AGA GT |
| POSTN omvendt | GGC TGA GGA AGG TGC TAA AG |
| SMA frem | CCG GGA GAA AAT GAC TCA AA |
| SMA Reverse | GAA GGA ATA GCC ACG CTC AG |
| MMP3 frem | TGG ATG CCG KAT ATG AAG |
| MMP3 omvendt | CAG AAA TGG CTG KAT CGA |
| COL1A1 frem | CCA GAA GAA CTG GTA KAT CAG CA |
| COL1A1 omvendt | CGC KAT ACT CGA AAT GGG AAT |
| GAPDH frem | AGC CAC ATC GCT CAG ACA C |
| GAPDH Reverse | GCC CAA TAC GAC CAA ATC C |
| B2M frem | ACA CTG AAT TCA CCC CCA CT |
| B2M Reverse | GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC T |
Tabel 2: Primer sekvenser bruges til validering af EMT i EPDCs. Sekvenser af forward og reverse primere bruges til qRT-PCR til at bestemme udtryk for flere EMT relaterede gener i voksen EPDCs.
Figur 1 : Isolation af epikardielle afledte celler (EPDCs). (A) Depicted er en voksen øret fjernes fra det menneskelige hjerte med en tynd ydre hindeagtige lag, epicardium, som er fjernet. Den sorte pil peger på epicardium. (B-jeg) Visuel repræsentation af metoden isolation af EPDCs. Den sorte pil peger på celle pellet. (J) immunfluorescent farvning af et hjerte øret med og uden dissektion af epicardium. Skalalinjen: 50 µm. (K) repræsentative billeder af to forskellige voksen EPDC isolering kulturperler med vejledende (L) repræsentative billeder af to forskellige føtal EPDC isolering kulturperler med vejledende sorte pile angiver mesenchymale-lignende celler i fostrets EPDC kultur. Skalalinjen: 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Validering af EMT i voksne og føtale epikardielle afledt menneskeceller (EPDCs). Voksne og føtale EPDCs var kulturperler med SB, ikke behandles (tomme) eller stimuleret med TGFβ3 i 5 dage. (A) repræsentative lysfelt billeder. Skalalinjen: 200 µm. (B) immunfarvning for DAPI og αSMA. Skalalinjen: 100 µm. (C) mRNA niveauer af EMT-relaterede gener, bestemmes i voksen EPDCs ved hjælp af qRT-PCR. Målte værdier var normaliseret til GAPDH og B2M udtryk. Værdierne er afbildet som middelværdi + SD 2 ^-ΔΔct (n = 2). Forkortelser: WT1:Wilms' tumor 1, MMP3: Matrix Metalloproteinase 3, POSTN:Periostin, αSMA: alpha glat muskel aktin, Col1A1:Collagen 1A1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en detaljeret protokol til at isolere og kultur primære epikardielle celler stammer fra menneskelige voksne og føtale hjerter. Omfattende karakterisering af disse celler har været tidligere udgivet17. Vi har vist, at begge celletyper kan opretholdes som brostensbelagte-lignende epitelceller når kulturperler med ALK5 kinase inhibitor SB431542. EMT er en integreret del af epikardielle aktivering i vivo under både udvikling og efter skade svar. EMT kan studeres ved hjælp af denne metode ved tilsætning af TGFβ. Vigtigere, observeret vi tidligere, at fostrets EPDCs hurtigt gennemgå spontan EMT når SB er fjernet, mens voksne EPDCs kun underkastes EMT ved stimulation17. At studere disse processer i fostrets EPDCs kan støtte i at forstå hvordan man optimalt aktivere de voksne epicardium efter skader.
Metoden præsenteres afhængig patient materiale, som er opnået under operationen. Derfor kan man forvente flere variationer i tilstanden af det materiale, isoleret, som er enten på grund af patient variabilitet eller hastighed, materialet er indsamlet i teatret drift. Denne variation kan forklare forskelle i fremgangsmåde: 1) hvor let epicardium kan blive dissekeret fra myokardiet, 2) overholdelse af isolerede celler til pladen, 3) muligheden for at forebygge eller gennemgå EMT, og 4) spredning hastighed. En hurtig isolation er generelt at foretrække frem for celle overlevelse. Det vigtigste kritiske punkt er peeling epicardium fra myokardiet. Hvis epicardium er stærkt levet op til det underliggende væv, kan en 15-min forbehandling af hjertets væv med trypsin bidrage til at fjerne epicardium lettere. Desuden, effekten af trypsin behandling afhænger af flere faktorer, herunder trypsin aktivitet og sammensætning af væv. Derfor, hvis et lavt udbytte er observeret, kan inkubationstiden med trypsin justeret. Desuden, hvis ingen celle pellet er synlig efter spinning ned, løsningen måske ikke har været helt dissocieres før du kører gennem filteret. Blandingsopløsning før løsningen på gennemrejse i sprøjten eller ved hjælp af en ekstra, kunne mindre sprøjten være nyttigt at adskille cellerne. Godt størrelsen for såning EPDCs bør overvejes nøje at aktivere celler til at opretholde deres epitelial tilstand. Tabel 1 giver en indikation, men man kan afvige fra denne retningslinje, når for eksempel kun en lille del af fosterets hjerte kan bruges og plating i en mindre godt er mere bekvemt.
Da føtale celler vil gennemgå EMT straks uden SB17, bør føtal EPDCs altid være belagt med SB. Men voksne EPDCs tendens til at opretholde deres epitelial morfologi og derfor kan være forgyldt uden SB under de første 48 timer af den første passage, at fremme overholdelse af celle. Efter den første passage, er både voksne og føtale EPDCs løbende kulturperler med SB at forhindre spontan EMT. Derudover er lav celle tæthed en vigtig udløser til EMT. EPDCs bør derfor aldrig blive kulturperler under 50% confluency. På den anden side hvis EMT ønskes, Sørg for at EPDCs udsås ikke alt for tæt, og forblive under 70% confluency. Selv om denne protokol udnytter TGFβ3, kan stimulation med TGFβ1 og -2 fremkalde EMT i EPDCs samt (observationer upubliceret).
I denne protokol deles celler direkte uden spinning ned, da vi observerer en lavere celle overlevelse, når ved hjælp af en centrifuge. Derfor er det vigtigt at bruge små mængder af trypsin for at sikre dens deaktivering når serum indeholdende medium er tilføjet.
Efter ~ 6-8 passager, EPDCs med en epitelial morfologi vil enten stoppe voksende eller vil gennemgå EMT spontant. Derfor, for eksperimenter, vi bruger flikke EPDCs mellem passage 3 og passage 6. Derimod EPDCs med en mesenchymale morfologi er mindre sårbare og kan være kulturperler op til passage 20. I eksperimenter, men vi har aldrig brugt spindel EPDCs efter 10th passage.
Da epicardium er placeret på ydersiden af hjertet og er nem at adskille fra underliggende væv, ægtheden af cellerne er indlysende, og chancen for betydelig forurening er lav. Selvom fedtvæv eller blodkar tider holde sig til den isolerede epikardielle lag, fleste af disse celler vil ikke passere sien i isolation, og ellers ikke kan overleve i EPDC cellekultur. Desuden, som nævnt før, ved hjælp af humant materiale giver en enestående model for at undersøge menneskelige epikardielle celle adfærd. Det er kendt, at eksempelvis epikardielle fedtvæv er forskellig mellem arter, understreger nødvendigheden af menneskelige epikardielle cell modeller21.
Det skal bemærkes, at hjertet bladflige blev opnået under operationen på syge hjerter, og derfor forskelle i sygdom, anvendt medicin, alder og køn af donor kan påvirke reproducerbarhed af forsøgene. Eksperimenter skal derfor udføres på flere isolering til at opnå gyldige resultater og solide konklusioner der skal drages. Desuden, afhængigt af problemformulering, kunne man vælge specifikt til brug kun epicardium fra patienter med iskæmisk sygdom eller patienter med ikke-iskæmisk utætte hjerteklapper sygdomme, som forventes at opføre sig anderledes.
Det er blevet foreslået at atrieflimren epicardium kan have forskellige karakteristika fra ventrikel epicardium2, dermed sætte spørgsmålstegn ved hvis epicardium afledt af atrieflimren hjerte øret indeholder en gyldig model til epikardielle adfærd. I denne forbindelse er det vigtigt at påpege, at vi ikke kunne finde forskelle mellem fostrets atrielle og ventrikulære afledt EPDCs (ikke-offentliggjorte data). Men ved hjælp af epicardium fra den menneskelige voksne ventrikel ville være den ultimative celle kilde til at verificere dette. Endnu, indsamle store eksemplarer af menneskelige voksen hjertekamrene til EPDC isolation er meget invasiv for patienten, og er derfor i øjeblikket ikke muligt i dette hospital.
Vi observerede, at SB ikke er altid tilstrækkelige til at forhindre EMT, hovedsagelig i fostrets EPDCs. Når føtal EPDCs gennemgå EMT i overværelse af SB, udelukke vi dem fra eksperimenter. Som følge heraf er celler til eksperimenter udvalgt for deres evne til at opretholde en epitelial fænotype som svar på SB. Vi hypotesen, at fosterets celler kan allerede være over en bestemt tærskel i EMT, og denne hæmning med SB er ikke i stand til at stoppe dette.
Denne epikardielle celle model har flere ansøgninger, da både udviklingslandene og de voksne epicardium kan undersøges. I vores laboratorium fokusere vi på forbedring af epikardielle regenerativ respons efter cardiac skader. Voksne EPDCs kan bruges til at teste forbindelser, som inducerer EMT, med henblik på at finde en potentiel terapeutisk stof til en afhjælpes regenerativ svar af epicardium. Det er derudover muligt at måle faktorer udskilles af EPDCs at forstå paracrine signalerer at (gen) skabe myokardiet. Desuden, da vi konstaterede, at fostrets EPDCs er mere tilbøjelige til at gennemgå EMT spontant i forhold til voksne EPDCs, vi undersøge forskellene mellem de føtale og voksne EPDCs. Bestemmelse af den underliggende mekanisme i øget føtal aktivering kunne give en køindikator for at forbedre epikardielle aktivering i voksen hjertet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning er støttet af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO) (VENI 016.146.079) og en LUMC Research fellowship både til AMS og LUMC Bontius Stichting (MJG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
References
- Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
- Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).
- Zhou, B., Ma, Q., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
- Smits, A., Riley, P. Epicardium-Derived Heart Repair. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).
- Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor. Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).
- Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).
- Lavine, K. J., Yu, K., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).
- Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).
- Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).
- Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns. Circulation Research. 96 (5), (2005).
- Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).
- van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PloS one. 7 (9), e44692 (2012).
- Zhou, B., Honor, L. B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Smart, N., Bollini, S., et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury. Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).
- Zangi, L., Lui, K. O., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).
- Clunie-O'Connor, C., Smits, A. M., et al. The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).
- Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).
- Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1. Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).
- Chechi, K., Richard, D. Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue. International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).
