Summary
Epicardium spelar en avgörande roll i utvecklingen och reparation av hjärtat genom att tillhandahålla celler och tillväxtfaktorer i hjärtinfarkt väggen. Här, beskriver vi en metod för att odla mänskliga primära epikardiell celler som möjliggör studie och jämförelse av deras utvecklings- och vuxen egenskaper.
Abstract
Epicardium, en epitelial cell lager som täcker myokardiet, har en viktig roll under hjärt utveckling, samt i reparation svaret av hjärtat efter ischemisk skada. När aktiverad, genomgå epikardiell celler en process som kallas epitelial mesenkymala övergång (EMT) att tillhandahålla celler att regenerera myokardiet. Dessutom bidrar epicardium via utsöndring av väsentliga parakrin faktorer. För att fullt uppskatta epicardium regenerativ potential, krävs en mänsklig cell modell. Här beskriver vi en roman cell kultur modell för att härleda primära epikardiell härledda celler (EPDCs) från mänskliga vuxen och fostrets hjärtvävnad. För att isolera EPDCs, är epicardium dissekeras från utsidan av hjärtat preparatet och bearbetas till en enda cellsuspension. EPDCs är nästa, Pläter och odlade i EPDC medium som innehåller det ALK 5-tyrosinkinashämmare SB431542 att upprätthålla deras epitelial fenotyp. EMT induceras genom stimulering med TGFβ. Denna metod möjliggör, för första gången, studiet av processen för mänskliga epikardiell EMT i en kontrollerad miljö, och underlättar att få mer insikt i secretome av EPDCs som kan hjälpa hjärtat regenerering. Dessutom tillåter denna enhetliga strategi för direkt jämförelse av vuxen och fostrets epikardiell människauppförande.
Introduction
Epicardium, en encellig epiteliala lagret att kuvert hjärta, är av avgörande betydelse för hjärt utveckling och reparation (recenserade i Smits o.a. 1). utvecklingsmässigt, epicardium uppstår från det proepicardial orgeln, en liten struktur som ligger vid basen av det framkallande hjärtat. Runt utvecklande dag E9.5 mus, och 4 veckor efter befruktningen i mänskliga börjar celler migrera från denna blomkål struktur och täcka den framkallande myokardiet2. När ett enda epitelial cell-lager bildas, genomgår en del av epikardiell cellerna epitelial mesenkymala övergång (EMT). Under EMT, celler förlorar sin epitelial egenskaper, såsom cell cell sammanväxningar, och få en mesenkymala fenotyp som ger dem möjlighet att migrera till utveckla myokardiet. De bildade epikardiell härledda cellerna (EPDCs) kan differentieras till flera hjärt celltyper inklusive fibroblaster, glatta muskelceller, och potentiellt hjärtmuskelceller och endotelceller3, även om differentiering av de senare två cell populationer är fortfarande föremål för debatt (recenserade i Smits o.a. 4). epicardium ger dessutom lärorikt parakrin signaler till hjärtmuskeln att reglera dess tillväxt och vaskularisering5,6,7,8. Flera studier har visat att nedsatt epikardiell bildandet leder till defekter i hjärtmuskeln9,10, vaskulatur11och överledning system12, betonar grundläggande bidrag till epicardium till bildandet av hjärtat.
Även i vuxen hjärtat epicardium är närvarande som ett vilande lager, blir det reaktiveras vid ischemi13. Epikardiell reaktivering efter skada recapitulates flera av processerna som beskrivs för hjärt utveckling, inklusive spridning och EMT14, om än mindre effektivt. Intressant, även om den exakta mekanismen inte är helt klarlagt, epikardiell bidrag att reparera kan förbättras genom behandling med, t.ex., Thymosin β415 eller ändras VEGF-A mRNA16, vilket resulterar i förbättras hjärt funktion efter hjärtinfarkt. Epicardium anses därför en intressant cell källa att öka endogena reparation av skadade hjärtat.
Mekanismer för hjärt utveckling är ofta återgetts under skada, men i ett mindre effektivt sätt. På jakt efter epikardiell aktivatorer är det avgörande att vi kan avgöra och jämföra den fetala och vuxen epicardium hela kapacitet. Dessutom från en terapeutisk synvinkel är det viktigt att, förutom djurförsök, vi utvidga kunskap om den mänskliga epicardium svar. Här, beskriver vi en metod att isolera och kultur mänskliga vuxen och fostrets epikardiell härledda celler (EPDCs) i en epitelial cell-morfologi och inducera EMT. Med denna modell vill vi utforska och jämför vuxen och fostrets epikardiell cell beteende.
Den största fördelen med detta protokoll är användningen av mänskliga epikardiell material, som inte har undersökts grundligt. Allt erbjuder beskrivs isolering och cell kultur protokollet en enda enhetlig metod för att härleda både fetal och vuxen cobble EPDCs, möjliggör en direkt jämförelse mellan dessa två cell källor. Dessutom, eftersom epicardium är isolerade baserat på dess plats, är det säkerställt att cellerna är faktiskt epicardially härledda17.
Medan mänskliga EPDC isoleringsmetoder har fastställts tidigare, åberopa dessa mestadels utväxt protokoll där bitar av hjärt- eller epikardiell vävnad är pläterade på en cell kultur skålen18,19. Denna metod väljer därmed specifikt för celler som delvis förlora sin epitelial fenotyp för att migrera, och som är mer benägna att genomgå spontan EMT. I det nuvarande protokollet bearbetas epicardium först till en enda cell lösning som tillåter de isolerade EPDCs att upprätthålla deras epitelial tillstånd. Denna metod ger därför en solid in vitro- modell för att studera epikardiell EMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment med mänsklig vävnad exemplaren godkändes av den etiska kommittén för Leiden University Medical Center och överensstämmer med Helsingforsdeklarationen. Alla åtgärder utförs med steril utrustning i ett flöde cell kultur skåp.
1. förberedelser
- Förbered EPDC medium genom att blanda Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM låg-glukos) och Medium 199 (M199) i förhållandet 1:1. Lägga till 10% värme inaktiverat fetalt bovint serum (FBS, värme inaktiverat för 25 min vid 56 ° C) och komplettera med 100 U/mL penicillin och 100 mg/mL streptomycin. Pre varma EPDC mediet i 37 ° C vattenbad.
- Pre värma Trypsin 0.25%/EDTA (1:1) i 37 ° C vattenbad.
- Coat brunnar med gelatin. Tillsätt 0,1% gelatin/PBS till varje brunn och inkubera plattorna under minst 15 minuter vid 37 ° C. Riktlinjer för krävs cell kultur plattan sammanfattas i tabell 1. Ta försiktigt bort alla vätska före plätering celler.
- Förbereda en stamlösning av 10 mM SB431542 (SB), utspädd i DMSO (försiktighet). Gör 50 µL portioner i konisk botten polypropylen centrifugrör, som Eppendorf-rör, och lagra dem vid-20 ° C. Observera att SB alikvoter kan tinas upp endast en gång.
2. hämtning och lagring av vuxen och fostrets hjärta exemplar
- Lagra mänskliga vuxen auricles direkt efter borttagning under operation i en 50 mL tub med 15 mL hög-glukos DMEM innehållande 10% FBS, 100 U/mL penicillin och 100 mg/mL streptomycin vid 4 ° C. Prover är i allmänhet 3-5 cm i storlek och kan lagras upp till 48 h efter dissektion.
- Lagra fostrets hjärtan erhålls från elektiv abort material i EPDC medium vid 4 ° C upp till 24 h efter isolering. För detta protokoll, använda prover med en gestationsålder mellan 12-22 veckor. Observera att hela hjärtat kan användas för isolering av epicardium.
3. isolering av lagrets epikardiell
- I laminärt flöde skåp, förbereda en 100 mm cell-kultur maträtt med PBS och placera en separat droplet (~ 200 µL) PBS i locket. Fyll en 15 mL tub med 5 mL före värmde EPDC medium.
- Plats vävnaden i cellkultur skålen fylld med PBS. Se till att vävnaden är fuktade ofta under förfarandet.
- Använder ett stereomikroskop, avlägsna så mycket av epikardiell lagret från vävnadsprov som möjligt genom att dra det bort med pincett.
Obs: Epicardium kan kännas som en mycket tunn, transparent lager följs tätt på utsidan av hjärtat (figur 1A). Försök att undvika kontaminering med epikardiell adipose vävnad och blodkärl eftersom detta kommer att hämma isolering. - Samla bitar av epikardiell vävnad i droplet-programmet PBS på locket.
- Skär epikardiell vävnaden i små bitar (0,5 mm3) med hjälp av en skalpell (figur 1B), eller vassa tips av liten pincett. Observera att bitarna ska kunna passera en P1, 000 Pipettera tip (steg 3.6).
- Tillsätt 1 mL av trypsin epikardiell vävnaden och samla bitar och trypsin med en P1, 000 Pipettera tip. Överföra vävnaden i ett 1,5 mL koniskt centrifugrör (figur 1 c).
- Inkubera röret i ett vattenbad på 37 ° C i 10 min, under omskakning vid ~ 60 rpm.
- Ta bort röret från vattenbadet och rengör utsidan av röret med 70% etanol.
- Låt vävnaden som sjunker till botten av röret (figur 1 d) och noggrant överför supernatanten innehållande epikardiell celler till 15 mL röret som innehåller 5 mL EPDC medium för att inaktivera trypsin.
- Fylla på den återstående vävnaden i det koniskt centrifugröret med 1 mL trypsin och blanda genom pipettering försiktigt upp och ner.
- Upprepa steg 3,7 till 3.10 två gånger. Det sista steget, efter totalt 30 min av trypsin inkubation, överföra både supernatanten och återstående epikardiell vävnaden in i röret som innehåller EPDC medium.
- När alla celler samlas i EPDC medium, försiktigt passera suspensionen en 10 mL spruta med 19 gauge nål in i en ny 15 mL tub att mekaniskt separera celler (figur 1E).
Obs: Se till att homogenisera suspensionen genom pipettering upp och ner innan de passerar lösningen genom nålen att förhindra att nålen få blockerat. - För att ytterligare separera celler, upprepa steg 3.12 med en 21-gauge nål.
- Placera en 100 µm cell SIL ovanpå en 50 mL tub och överföra det medium som innehåller epikardiell celler på silen med 10 mL pipett att ta bort alla återstående klumpar (figur 1F).
- Tvätta silen för att samla kvarstående celler genom pipettering 5 mL EPDC medium på Silen.
- Pipettera cellsuspensionen från 50 mL röret in i en 15 mL tub. Eftersom cellerna sjunker till botten av röret, skaka lösningen försiktigt före pipettering.
Obs: Detta steg är inte nödvändigt, en mindre tub hjälpmedel visualisering av pelleten efter centrifugering. - Centrifugera vid 200 x g under 5 minuter i rumstemperatur (figur 1 g).
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten (figur 1 H) i volymen som krävs av EPDC medium (tabell 1).
Obs: För fostrets EPDCs, direkt använda EPDC medium innehållande 10 µM av den ALK5 tyrosinkinashämmare (EPDC + SB). Vuxna celler kan beläggas utan SB under första passagen. - Tallrik cellsuspension på gelatin överdragna kultur plattor (figur 1I). Brunn storlek beror på storleken på den epikardiell vävnadsprov (tabell 1). Observera att låga konfluens kommer inducera förekomsten av EMT.
- Placera cellerna i inkubatorn för i minst 48 timmar vid 37 ° C, 5% CO2 att låta cellerna att bifoga till kultur plattan.
4. kultur av EPDCs
- Fylla på EPDC + SB medium minst var tredje dag.
- Inspektera cellerna minst vart 3 dagar använda mikroskopet. När cellerna når konfluens, passage dvsnär kultur plattan är helt täckt med celler, cellerna i förhållandet 1:2 yta. Observera att nå konfluens kan ta ~ 5-10 dagar.
- Sug ut medlet med en Pipettera eller aspiration system, t.ex., en glas Pipettera.
- Tvätta cellerna noggrant genom att lägga till PBS till cellerna. Försiktigt snurra plattan och aspirera PBS.
- Lägg till trypsin till plattan. Försiktigt rotera plattan för att täcka alla celler med trypsin och inkubera plattan för 1 min vid 37 ° C.
Obs: Använder som lite trypsin som möjligt (indikation: 200 µL per brunn en 6 väl plåt) - Knacka plattan för att mekaniskt lossa cellerna från botten av plattan. Använda mikroskopet visuellt kontrollera om celler har lossnat. Om så inte är fallet, inkubera cell kultur plattan i en extra minut.
- Lägga till volymen som krävs av EPDC + SB medium i cellerna, Omsuspendera genom pipettering upp och ner och överföra cellsuspensionen till en ny gelatin överdragna kultur plattan.
Obs: I allmänhet celler kan hållas i en kullersten morfologi upp till passagen 8.
5. induktion av EMT i EPDCs
- För att inducera EMT, dissociera cellerna med trypsin och överföring celler till nya gelatin överdragna brunnar i förhållandet 1:2 yta i EPDC + SB medium, enligt 4 och inkubera i minst 24 timmar vid 37 ° C, 5% CO2.
- Kontrollera är om confluency 50-70% och om EPDCs har en kullersten morfologi.
Obs: Konfluens påverkar EPDCs förmåga att genomgå EMT. - Aspirera på medellång från cellerna och tvätta cellerna noggrant med PBS (se steg 4.2.1 - 4.2.2).
- Stimulera celler med 1 ng/mL TGFβ3 i EPDC medium och placera dem i en inkubator vid 37 ° C, 5% CO2 i 5 dagar. Observera att vid stimulering EPDC mediet som innehåller TGFβ3 inte behöver fyllas på.
- Övervaka cellerna dagligen. Efter 5 dagar känns celler som genomgick EMT av en spolformad morfologi (figur 2A).
- Kultur spolformad EPDCs enligt den metod som beskrivs i 4 utan tillsats av SB eller TGFβ till EPDC medium. Observera att i allmänhet, spolformad EPDCs kan vara odlade upp till passage 20.
- Validera förekomsten av EMT med Immunofluorescerande färgning med antikroppar mot mesenkymala markörer αSMA eller Vimentin eller genom phalloidin för att upptäcka bildandet av F-aktin stress fibrer (figur 2B) eller använda qRT-PCR för EMT-relaterade gener ( e.g., WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Cadherin, MMP3, snigel, Slug) (figur 2 c och tabell 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här beskriver vi ett enkelt protokoll för att isolera EPDCs från mänskliga vuxen och fostrets hjärtvävnad (figur 1). Detta protokoll utnyttjar det lättåtkomliga läget av epicardium på utsidan av hjärtat (figur 1A). Färgning av hjärtat hjärtörat efter dissektion visar att den WT1 + epicardium tas bort medan den underliggande subepicardial extracellulär matrix och hjärtinfarkt vävnad förblir intakt (figur 1J). Omfattande karakterisering genomförts tidigare, visar att EPDCs snabb epikardiell markörer, t.ex., ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 och avsaknaden uttryck för andra hjärtat boförälder celltyper, t.ex., PECAM1, ISL1, CD34 och TNNT2. 17
Både vuxen (figur 1 K) och foster (figur 1 L) EPDCs odlade i närvaro av ALK5 kinase inhibitor SB431542 Visa en kullersten morfologi. Dock beroende på givare och kultur, kan fostrets EPDCs genomgå EMT trots närvaron av SB. Detta kan resultera i spolformad celler inom befolkningen av kullersten celler (se pilar i figur 1 L). Tänk dock på att isoleringen av kullersten-formade celler från fostervävnad är inte alltid möjligt, och kan resultera i härledningen av mestadels spolformad celler. Eftersom dessa celler växer snabbare, kommer de snabbt växa över andra celltyper.
EMT kan induceras av inkubation med TGFβ320 i 5 dagar i både vuxen och fostrets celler, vilket framgår av en tydlig morfologiska övergång till spolformad celler (figur 2A). Som visat med obehandlad kontroll (”tom”), kommer att fostrets EPDCs genomgå spontan EMT vid borttagning av SB, medan vuxna EPDCs kommer endast att genomgå EMT vid stimulering med TGFβ3. För att validera EMT, var EPDCs immunostained med alpha-smooth muscle aktin (αSMA), en mesenkymala markör (figur 2B). Dessutom bekräftades EMT i vuxen EPDCs använder qRT-PCR visar nedreglering av epikardiell markören WT1 och uppreglering av mesenkymala markörer POSTN, αSMA, kollagen 1A1, MMP3 och N-Cadherin (figur 2 c). Omfattande experiment angående vuxna och fostrets epikardiell EMT publiceras före17.
| Vävnad | Väl typ | Cell tillväxtområde (cm2) | Volym av medium (mL) | Tillägg av SB |
| Fostrets | 24 | 1.9 | 0,5 | Direkt |
| Vuxen små (< 4 cm) | 12 | 3.8 | 1 | Efter 1st passage |
| Vuxen stor | 6 | 9,6 | 2 | Efter 1st passage |
| (> 4 cm) |
Tabell 1: riktlinje för att markera den cell lämpliga kultur plattan. Den krävs väl storleken beror på mängden epikardiell celler isolerade. Dessa riktlinjer kan användas som en tumregel för att Markera cell lämplig kultur plattan.
| Gene | Sekvens |
| WT1 framåt | CAG CTT GAA TGC ATG ACC TG |
| WT1 omvänd | TAT TCT GTA TTG GGC TCC GC |
| N-Cadherin framåt | CAG ACC GAC CCA AAC AGC AAC |
| N-Cadherin omvänd | GCA GCA ACA GTA AGG ACA AAC ATC |
| POSTN framåt | GGA GGC AAA CAG CTC AGA GT |
| POSTN omvänd | GGC TGA GGA AGG TGC TAA AG |
| SMA framåt | CCG GGA GAA AAT GAC TCA AA |
| SMA omvänd | GAA GGA ATA GCC ACG CTC AG |
| MMP3 fram | TGG ATG CCG KATT ATG AAG |
| MMP3 bakåt | CAG AAA TGG CTG KATT CGA |
| COL1A1 framåt | CCA GAA GAA CTG GTA KATT CAG CA |
| COL1A1 omvänd | CGC KATT ACT CGA AAT GGG AAT |
| GAPDH framåt | AGC CAC ATC GCT CAG ACA C |
| GAPDH omvänd | GCC CAA TAC GAC CAA ATC C |
| B2M framåt | ACA CTG AAT TCA CCC CCA CT |
| B2M omvänd | GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC T |
Tabell 2: Primer sekvenser används för validering av EMT i EPDCs. Sekvenser av framåt och bakåt primers används för qRT-PCR för att fastställa ett uttryck för flera EMT relaterade gener i vuxen EPDCs.
Figur 1 : Isolering av epikardiell härrör celler (EPDCs). (A) Depicted är en vuxen hjärtörat bort från det mänskliga hjärtat med ett tunt yttre membranös lager, den epicardium, som tas bort. Den svarta pilen pekar på epicardium. (B-jag) Visuell representation av metoden isolering av EPDCs. Den svarta pilen pekar på cellpelleten. (J) Immunofluorescerande färgning av en hjärta hjärtörat med och utan dissektion av epicardium. Skalstapeln: 50 µm. (K) representativa bilder av två olika vuxen EPDC isoleringar odlade med SB. (L) representativa bilder av två olika fostrets EPDC isoleringar odlade med SB. svarta pilar indikerar mesenkymala-liknande celler i fostrets EPDC kultur. Skalstapeln: 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Validering av EMT i mänskliga vuxen och fostrets epikardiell härrör celler (EPDCs). Vuxen och fostrets EPDCs var odlade med SB, inte behandlas (tom) eller stimuleras med TGFβ3 i 5 dagar. (A) representativa ljusa fält bilder. Skalstapeln: 200 µm. (B) immunfärgning för DAPI och αSMA. Skalstapeln: 100 µm. (C) mRNA nivåer av EMT-relaterade gener, bestäms i vuxen EPDCs med qRT-PCR. Uppmätta värden var normaliserade till GAPDH och B2M uttryck. Värden är avbildade som medelvärdet + SD 2 ^-ΔΔct (n = 2). Förkortningar: WT1:Wilms' tumör 1, MMP3: Matrix metalloproteinas 3, POSTN:Periostin, αSMA: alpha Smooth Muscle aktin, Col1A1:Collagen 1A1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll att isolera och kultur primära epikardiell celler härrör från mänskliga vuxen och fostrets hjärtan. Omfattande karakterisering av dessa celler har funnits tidigare publicerade17. Vi har visat att båda celltyper kan upprätthållas som kullersten-liknande epitelceller när odlade med den ALK5 tyrosinkinashämmare SB431542. EMT är en integrerad del av epikardiell aktivering i vivo under både utveckling och efter skada svar. EMT kan studeras med denna metod genom tillsats av TGFβ. Allt observerade vi tidigare att fostrets EPDCs snabbt genomgå spontan EMT när SB tas bort, medan vuxna EPDCs endast genomgå EMT vid stimulering17. Studera dessa processer i fostrets EPDCs får stöd i att förstå hur man optimalt aktivera den vuxna epicardium efter skada.
Den presenterade metoden bygger på patientmaterial, som erhålls under operation. Därför kan man förvänta sig flera varianter av materialet isolerad, som är antingen på grund av patientens variabilitet eller hastigheten där materialet samlas i operativa theater. Denna variation kan förklara skillnader i förfarandet: 1) hur enkelt epicardium kan vara dissekeras från myokardiet, 2) anslutning av isolerade celler till plattan, 3) förmåga att förhindra eller genomgå EMT, och 4) spridning hastighet. En snabb isolering är i allmänhet att föredra för cellöverlevnad. Den viktigaste kritiska punkten är peeling epicardium från hjärtmuskeln. Om epicardium följs starkt underliggande vävnad, kan en 15-min förbehandling av hjärtats vävnad med trypsin hjälpa att ta bort epicardium lättare. Dessutom beror effekten av trypsin behandling på flera faktorer, inklusive aktiviteten trypsin och sammansättningen av vävnaden. Därför, om en låg avkastning observeras, inkubationstiden med trypsin kan justeras. Dessutom, om ingen cellpelleten syns efter spinning ner kanske lösningen inte har varit helt separerade innan du kör genom filtret. Blanda lösningen innan du passerar lösningen genom sprutan eller använder en extra, kan mindre sprutan vara användbart att separera celler. Väl storleken för sådd EPDCs bör noga övervägas att aktivera cellerna för att upprätthålla deras epitelial tillstånd. Tabell 1 ger en indikation, men man kan avvika från denna riktlinje när exempelvis endast en liten del av fostrets hjärta kan användas och plätering i ett mindre väl är bekvämare.
Eftersom fostrets celler kommer att genomgå EMT omedelbart utan SB17, bör fostrets EPDCs alltid vara klädd med SB. Men vuxna EPDCs tenderar att behålla deras epitelial morfologi och därför kan beläggas utan SB under de första 48 h på första passagen, att främja efterlevnad av cellen. Efter första passagen odlas både vuxna och fostrets EPDCs kontinuerligt med SB att förhindra spontana EMT. Dessutom är låg cell densiteten en viktig utlösande faktor för EMT. EPDCs bör därför aldrig vara odlade under 50% konfluens. Däremot, om EMT önskas, se till att EPDCs inte är seedade alltför tätt, och hålla sig under 70% konfluens. Om detta protokoll använder tredjeparts TGFβ3, kan stimulering med TGFβ1 och -2 inducera EMT i EPDCs samt (opublicerade observationer).
I detta protokoll delas celler direkt utan att snurra ner, eftersom vi observerar en lägre cellöverlevnad när du använder centrifugen. Därför är det viktigt att använda låga volymer av trypsin för att säkerställa dess avaktivering när serum innehållande medium läggs.
Efter ~ 6-8 passager, EPDCs med en epitelial morfologi slutar antingen växa eller kommer att genomgå EMT spontant. Därför, för experiment, använder vi snickra EPDCs mellan passage 3 och passage 6. Däremot EPDCs med en mesenkymala morfologi är mindre sårbara och kan vara odlade upp till passage 20. I experiment, men vi har aldrig använt spindel EPDCs efter 10th passagen.
Eftersom epicardium ligger på utsidan av hjärtat och är lätt att separera från underliggande vävnad, äktheten av cellerna är uppenbar, och chansen att betydande förorening är låg. Även om fettvävnad eller blodkärl ibland hålla sig till det isolera epikardiell lagret, majoriteten av dessa celler inte kommer att passera silen under isoleringen, och annars inte kan överleva i EPDC cellodling. Dessutom som tidigare nämnts ger använder humant material en unik modell för att undersöka människors epikardiell cell beteende. Det är känt att exempelvis epikardiell fettvävnad är olika mellan arter, betonar nödvändigheten av mänsklig epikardiell cell modeller21.
Det bör noteras att de hjärtat auricles erhölls under operation på sjuka hjärtan, och skillnaderna i sjukdom, används medicinering, ålder och kön av givaren kan därför påverka reproducerbarheten av experimenten. Experiment bör därför utföras på flera isoleringar att erhålla giltiga resultat och låta fasta slutsatser kan dras. Dessutom beroende på forskningsfrågan, kunde man välja att bara använda epicardium från patienter med ischemisk sjukdom eller patienter med icke-ischemisk klaffsjukdom, vilka förväntas bete sig annorlunda.
Det har föreslagits att förmaksflimmer epicardium kan ha tydliga kännetecken från ventrikeln epicardium2, därmed ifrågasätter om epicardium härrör från förmaksflimmer hjärtat hjärtörat ger en giltig modell för epikardiell beteende. I detta sammanhang är det viktigt att påpeka att vi inte kunde hitta skillnader mellan fostrets förmaks- och härrör EPDCs (opublicerade data). Dock skulle använda epicardium från mänskliga vuxen kammare vara den ultimata cell källan för att verifiera detta. Ändå samlar stora exemplar av mänskliga vuxen ventriklarna EPDC isolering är mycket invasiva för patienten, och är därför för närvarande inte möjligt i detta sjukhus.
Vi observerade att SB inte är alltid tillräckliga för att förhindra EMT, främst i fostrets EPDCs. När fostrets EPDCs genomgå EMT i närvaro av SB, utesluter vi dem från experiment. Som en följd är celler som används för experiment utvalda för sin förmåga att upprätthålla en epitelial fenotyp som svar på SB. Vi hypotes att fostrets celler kan redan vara över en viss tröskel i färd med att EMT, och att hämning med SB är inte kunna stoppa detta.
Denna epikardiell cell modell har flera tillämpningar, eftersom både utvecklingsländerna och de vuxna epicardium kan undersökas. I vårt labb fokuserar vi på förbättring av epikardiell regenerativ svar efter hjärt skador. Vuxen EPDCs kan användas för att testa substanser som inducerar EMT, som syftar till att hitta en potentiell terapeutisk ameliorated regenerativ svar av epicardium. Dessutom är det möjligt att mäta faktorer utsöndras av EPDCs att förstå den parakrin signalering till (åter) genererar myokardiet. Dessutom eftersom vi observerade att fostrets EPDCs är mer benägna att genomgå EMT spontant jämfört med vuxna EPDCs, undersöker vi skillnaderna mellan de fetala och vuxen EPDCs. Att bestämma den underliggande mekanismen vid ökad fetal aktivering kan ge en cue för att förbättra epikardiell aktivering i vuxen hjärtat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO) (VENI 016.146.079) och en LUMC forskning gemenskap både till AMS och LUMC Bontius Stichting (MJG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
References
- Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
- Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).
- Zhou, B., Ma, Q., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
- Smits, A., Riley, P. Epicardium-Derived Heart Repair. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).
- Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor. Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).
- Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).
- Lavine, K. J., Yu, K., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).
- Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).
- Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).
- Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns. Circulation Research. 96 (5), (2005).
- Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).
- van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PloS one. 7 (9), e44692 (2012).
- Zhou, B., Honor, L. B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Smart, N., Bollini, S., et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury. Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).
- Zangi, L., Lui, K. O., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).
- Clunie-O'Connor, C., Smits, A. M., et al. The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).
- Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).
- Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1. Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).
- Chechi, K., Richard, D. Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue. International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).
