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Biology

Chloropicrin 및 수소 불 화물 유발 각 막 상피 세포 상해에 대 한 높은 처리량 SiRNA 심사

Published: June 16, 2018 doi: 10.3791/57372

Summary

높은 처리량 작은 금지 RNA 검사 화학 각 막 상피 상해의 분자 메커니즘을 더 빠르게 명료를 도울 수 있는 중요 한 도구입니다. 여기, 우리는 개발 및 노출 모델 및 각 막 상피 부상 수소 불 화물 그리고 chloropicrin 유도의 높은 처리량 검열 방법의 유효성 검사 제시.

Abstract

Toxicant 유도 눈 부상 화학 빠르게 상당한 조직 손상을 입힐 잠재력을가지고 있기 때문에 진정한 눈 비상 이다. 아무 특정 치료제가이 부상 치료 존재 toxicant 유발 각 막 부상에 대 한 치료는 일반적으로 지원. 치료 및 노출에 대 한 관심에 치료제를 개발 하는 노력, 그것은이 상해의 분자 및 세포 메커니즘을 이해 하는 것이 중요 수. 있습니다 우리는 높은 처리량 작은 금지 RNA (siRNA) 심사의 활용 화학 각 막 상피 상해의 분자 메커니즘을 더 빠르게 명료를 도울 수 있는 중요 한 도구가 될 수 있습니다 제안 합니다. siRNA는 siRNA에 상 동을가지고 있는 19-25의 뉴클레오티드 긴 mRNA를 저하 하는 통로 입을 post-transcriptional 유전자를 활용 더블 좌초 RNA 분자는. 특정 유전자의 표현의 결과 감소는 toxicant에 세포질 응답에 그 유전자의 기능을 확인 toxicant 노출된 셀에 다음 공부 수 있습니다. 개발 및 체 외에 노출 모델 및 수소 불 화물 (HF) 및 chloropicrin (CP) 유도 눈 부상 (HTS)을 상영 하는 높은 처리량 방법의 유효성 검사는이 문서에 표시 됩니다. 하지만 우리는 이러한 두 가지 유독 선택, 우리의 방법 toxicant 노출 프로토콜에 사소한 수정 다른 유독의 연구에 적용 됩니다. SV40 큰 T 항 원 SV40 HCEC 연구에 대 한 선정 되었다 인간 각 막 상피 세포 선 불후. 세포 생존 능력 및 IL-8 생산 심사 프로토콜에서 끝점으로 선정 됐다. Toxicant 노출의 개발와 관련 된 몇 가지 과제 고 셀 문화 방법 HTS 연구에 대 한 적합 한 표시 됩니다. 이 유독 HTS 모델 설립 화학 눈 부상에 대 한 잠재적인 치료에 대 한 화면을 상해의 메커니즘을 이해 하기 더 연구에 대 한 수 있습니다.

Introduction

Toxicant 유도 눈 부상 화학 빠르게 상당한 조직 손상을 입힐 잠재력을가지고 있기 때문에 진정한 눈 비상 이다. 불행 하 게도, 아니 특정 치료제가이 부상 치료 존재에 toxicant 유발 각 막 부상에 대 한 치료 일반적으로 지원만 있습니다. 현재 치료 전략 일반적인 주로 같은 윤활제, 항생제, 국 소 치료 요법을 포함 하 고 cycloplegics 뒤에 소염제 (예를 들어, 스테로이드) 한 번 각 막1 epithelialized 다시 있다 ,2. 최고의 현재 치료 치료 옵션을 사용할에 불구 하 고 장기적인 예 후는 일반적으로 진보적인 각 막 흐려 및 neovascularization2,3가난.

동물 모델 화학 독성을 조사 하 고 상해의 메커니즘을 이해를 전통적으로 사용 되어 왔습니다. 그러나, 동물 연구는 시간이 소모 되 고 비싸다. 노력을 줄이기 위해 동물 실험도 있다. 예를 들어 유럽 연합에 도달 법안 (EC 1907/2006)를 동물 실험을 줄이기 위한 규정 있다. 규정 회사 동물 테스트 및 동물에 제안 된 테스트를 수행 하기 전에 유럽 화학 제품 기관에서 승인을 얻는 피하기 위하여 데이터 공유 요구 사항이 포함 됩니다. 규정에 따라 동물 실험 최후의 수단 이어야 한다. 또한 단계적으로 동물에서 화장품의 테스트 유럽 화장품 규정 (EC 1223/2009)이 있다. 동물 연구를 실시 하는 경우 그들이 3Rs의 원칙에 의해 인도 된다 (구체화, 감소, 및 교체), 더 자비 롭 동물 연구를 수행, 사용, 동물의 수를 감소 및 비 동물 대안을 사용 하 여 프레임 워크를 제공 하는 가능한 경우. 이러한 이유로 독물학 분야는 독성의 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다 하 고 높은 처리량4에서 행 해질 수 있다 생체 외에서 분석을 채택 하고자 결정 했다. 이것은 기능 독극물 접근 어디 유독 전적으로 그들의 화학에 의해 보다는 오히려 그들의 기능에 의해 정의 됩니다. 단계는 또한, 기능 toxicogenomics 추구 특정 유전자 유독5의 효과에서 재생 역할을 이해 하. SiRNA 기술을 응용, 유독에 분자와 세포질 응답에 유전자 기능을 조사 하기 위해 화면 높은 처리량에 수행할 수 있습니다. siRNA는 19-25의 뉴클레오티드 긴 포스트 transcriptional 유전자 입을 통로 모든 포유류 세포6에 활용 하는 두 배 좌초 된 RNA 분자. 이 종합적으로 만들어지고 특정 유전자를 대상으로 설계 된. 셀에 도입 하는 경우는 siRNA 처리 되 고 한 가닥, 가이드 물가 RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC)에 로드 됩니다. siRNA는 mRNA 분자에 상호 보완적인 영역에 RISC 지시 하 고 있는 RISC 저하는 mRNA. 특정 유전자의 표정 감소 결과. 특정 유전자의 표현의 결과 감소는 toxicant에 세포질 응답에 그 유전자의 기능을 확인 toxicant 노출된 셀에 다음 공부 수 있습니다. 이러한 접근은 더욱 CYP1A17,8의 a h R-종속 유도 리 민감성의 메커니즘 이해 하 사용 되었습니다.

화학 테러 위험 평가 (CTRA) 목록 및 독성 산업용 화학 물질 (TIC) 목록 선택 화학 물질의 독성과 테러, 전쟁, 또는 산업 재해 이벤트9중 출시 될 가능성에 따라 항목별로 나 누이고 있다. 우리는 siRNA 높은 처리량 검열 (HTS) toxicogenomic 접근 테러 사건에서 사용의 높은 위험에 확인 된 CTRA 목록 이용과의 연구에 적용 하 고 있다. 화학 생물;에 있는 불리 한 효과 이해 하고자 하는 전통적인 독물학 그러나, 우리는 더 욕망의 치료제 및 치료 접근을 가능 하 게, 개발을 알리는 목적으로 상해의 메커니즘을 이해 하는 분자 치료 개발에 대 한 대상으로 지정할 수 있는 발견. 몇 가지 방법으로이 노력 유사한 높은 처리량 siRNA 심사 및 약 발견 과정10에서 셀 기반 분석의 사용을 고려할 수 있습니다. 주요 차이점은 우리의 접근 방식에 다소 가능성이 크다 toxicant 노출의 치료에 대 한 높은 치료 가치와 단일 대상 될 것 이다 반면 그 약물 발견 일반적으로 치료 발견에 대 한 단 수 목표를 추구 될 것 이다. 우리 예상 어떤 효과적인 치료 패러다임 toxicant 노출에 대 한 높은 치료 가치를 달성 하는 다각적인 접근 방식이 필요로 하 고 toxicogenomic 데이터 극히 효과적인 치료 패러다임을 알릴 수 있습니다.

벤치탑 자동화 실험실 제약 또는 생명 공학 산업 밖에 서 높은 처리량 방법론을 제공합니다. 우리 연구소에서 생체 외에서 연구 역사적으로 낮은 처리량11,,1213전통적인 분석 되었습니다. 지난 몇 년 동안, 우리의 실험실 벤치탑 높은 처리량 siRNA 심사를 수행 하기 위해 로봇의 사용에 전환 했다. 여기, 우리가 현재 눈 셀 모델의 세련미와 체 외에서 의 개발 수소 불 화물 (HF)와 chloropicrin (CP) 높은 처리량 siRNA 심사 적합에 대 한 노출 방법. 우리의 목표는 이러한 유독 응답에 세포질 상해를 조절 하는 분자를 식별 하는. 우리는 선택 하는 siRNA 도서관의 목표는 G 단백질 결합 된 수용 체, 단백질 kinases, 프로 테아 제, 가수분해, 이온 채널, 그리고 다른 잠재적으로 druggable 대상 포함 됩니다. HF와 CP 선정 됐다 연구에 대 한 상호 CTRA 목록 에이전트 산업 사고의 ToxNet 보고서를 통해 증기 노출9,14눈 상해의 가장 중대 한 모험을 선물 하는 그를 찾을 수 있습니다. WWI15에 최 루 가스 CP (Cl3CNO2화학식, CAS 번호 76-06-2) 원래 사용 했다. 현재16nematicide, 살 균 제, 살충제는 농업 fumigant 및 기능으로 사용 됩니다. 수소 불 화물 (HF)는 정유 및 화학 fluorination 유기 화합물17의 알을 포함 하 여 프로세스에서 사용 됩니다. HF (화학식 HF, CAS 번호 62778-11-4)는 가스 이지만 수성 형태로 소산 (HFA, CAS 번호 7664-39-3). 따라서, 우리가 우리의 셀 HFA를 사용 하 여 선출 노출 모델. SV40 큰 T 항 원 SV40 HCEC 연구에 대 한 선정 되었다 인간 각 막 상피 세포 선 불후. 세포질 상해에 관련 된 목표 세포 죽음과 선 동적인 응답에 반영 해야 하기 때문에 세포 생존 능력 및 염증 성 마커 IL-8 끝점으로 선정 됐다. 특히, 대상 toxicant 노출에서 보호 역할을 한다면, 세포 죽음 또는 염증 성 cytokine 생산 증가 한다 때 대상 식 siRNA에 의해 저해. 반대로 부정적인 역할을 하는 대상에 대 한 사실 것입니다. 또한, 만성 염증 후 노출, 및 세포 죽음 통로 있는 내정간섭에 임상 결과2,18이 향상 시킬 수 있습니다 각 막 병 리에 역할을 나타납니다.

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Protocol

1. 세포 문화 유지 보수

  1. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)과 DMEM F-12에서 90% 습도에서 셀 라인 SV40-HCEC 성장 1 %L-글루타민, 10 µ g/L 표 피 성장 인자 (EGF), 그리고 5 mg/L 인슐린.
  2. 셀 라인 (시드 밀도)에 따라 3 ~ 4 일 마다 그 confluency는 결코 문화 유지 관리 중 80%를 초과 하도록 통로.
  3. 플라스 크를 사용 하 여 분리 솔루션 (모든 150 c m2 플라스 크에 대 한 14 mL 해결책)와 부 화 37 ° C에서 8 분 더 이상으로 보다에서 세포를 분리 합니다.
  4. 세포 배양의 동등한 양으로 분리 솔루션을 무력화 하 고 160 x g에 7 분 동안 원심 분리 하 여 50 mL 원뿔 튜브에 세포를 작은.
  5. 다시 중간 마다 150 c m2 플라스 크 (20 mL)에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
  6. 자동된 휴대용 셀 카운터와 씨앗 80 %confluency 초과 하지 않고 3 ~ 4 일 동안 성장할 수 있도록 하는 밀도에 새로운 플라스 크에 세포를 계산 합니다.

2. 플레이트 세포 실험에 대 한

  1. 검사는 confluency를 위해 위상 대비 가벼운 현미경에 의해 SV40-HCECs의 플라스 크는 일반 셀 상태를 평가 하 고 80% 보다 작습니다.
  2. 분리, 펠 렛, resuspend, 그리고 SV40-HCECs 1.3 1.6 셀 문화 유지 관리의 단계에서 설명한 대로 플라스 크에서 계산. 0.5 µ g/mL 날린 (HCORT 매체)를 포함 하는 SV40 HCEC 매체를 사용 하 여 셀을 resuspend.
  3. 일회용 중간 병에 미리 데워 진된 HCORT 매체에서 17,857 셀/mL에서 SV40-HCECs의 현 탁 액을 준비 합니다.
    1. 접시를 시드할 수 수에 대 한 충분 한 양의 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
    2. 14 x 96 잘 접시 모든 siRNA 도서관 접시 공부에 대 한 셀의 최소 씨앗
  4. 병을 균등 하 게 셀을 중단, 자동된 액체 처리기의 궤도 통 둥지에 저수지로 충분 한 양의 세포 현 탁 액을 부 어 저장 셀 도금 동안 접시를 온난화 37 ° C에 세포 현 탁 액을 포함 하는 병의 소용돌이 프로세스입니다.
  5. 자동된 액체 처리기를 사용 하 여 당 96 잘 접시의 매체의 70 µ L에서 잘 (5000 셀/cm2) 당 1000 세포의 밀도에 접시에 셀을 추가. 50 µ L/s를 사용 하 여 모든 단계 pipetting 속도.
    1. 100 rpm에서 시드 프로세스 동안 끊임없이 궤도 셰이 커를 실행 합니다.
    2. 3 세포 현 탁 액 (140 µ L 믹스 볼륨) 번 믹스 자동된 액체 처리기를 사용 하 여.
    3. 세포 현 탁 액의 140 µ L 발음 하 고 두 셀 문화 접시의 각 음에 70 µ L을 분배.
    4. 2.5.3-2.5.4 단계를 반복 하 여 모든 플레이트 셀 시드 있다.
    5. 시드 프로세스 중 필요에 따라 셀 서 스 펜 션 저수지를 리필.
  6. 번호판을 시드 후 자동된 액체 처리기에서 그들을 제거 하 고 세포 문화 인큐베이터에 그들을 전송 하기 전에 그들을 실 온에서 30 분 동안 품 어.
  7. 평가의 각 격판덮개에 대 한 모든 잘 셀 밀도 셀 문화 인큐베이터에 15%와 22% 합칠 사이 하지 않은 인테리어 웰 스는 연구에서 어떤 접시를 제외 하 고는 자동된 이미징 시스템을 사용 하 여 다음 아침.

3. transfect 세포 siRNA와

  1. 미리 접시 당 80 siRNA 목표를 포함 하도록 구성 하는 공급 업체에서 siRNA 도서관 번호판을 취득 ( 그림 4참조), 열 1 및 12 비어.
  2. 제조업체의 지침19에 따라 siRNA의 각 잘 2 pmol / µ L의 최종 농도에 siRNA 버퍼와 siRNA 도서관 플레이트 reconstitute
  3. SiRNA의 4 pmol/잘와 0.3 µ L/잘 transfection 시 약의 시드 후 셀 24 h transfect. Transfection 시 약 제조업체의 프로토콜에 따라 모든 단계를 수행 (플레이트 레이아웃 그림 4 참조)20.
    1. 모든 자동된 액체 처리기를 사용 하 여 transfections를 수행 하 고 사용 하는 25 µ L/s pipetting 속도 대 한 모든 단계. 페는 우물만을 해결 하기 위해 미리 구성 된 팁 상자를 사용 합니다.
    2. 6 복제 격판덮개의 세트 transfect 라이브러리 접시의 절반 이라고 "탑 플레이트 설정" top 사용 (siRNA, n 당 복제 6 = 6).
    3. 하단의 transfect 6 복제 격판덮개의 다른 세트를 라이브러리 접시의 절반 이라고 "하단 플레이트 설정"을 사용 하 여 (siRNA, n 당 복제 6 = 6).
    4. "풀 플레이트 세트" 라는 용어를 사용 하 여 라이브러리 siRNA와 페 12 셀 접시를 설명 하기 위해.
    5. 모든 가기 후 부정적인 풀 siRNA와 풀 플레이트 세트에 모든 접시의 우물 B2 B6 transfect와 하단 플레이트 세트 도서관 siRNA와 페 되어 있다.
    6. 또한 transfect 라이브러리 siRNA에는 영향을 받지 않는 고 부정적인 풀 siRNA와 노출 되지 않은 컨트롤 (상단 플레이트 세트)와 하단 플레이트 세트 한 될 것입니다 또 다른 2 개의 격판덮개의 우물 B2 B6.
  4. 부드러운 모든 시간을 도청 하 여 모든 transfection 믹스 추가한 후 4 시간 및 혼합 셀 문화 인큐베이터에서 모든 셀 접시를 품 어.
  5. 미리 데워 진된 HCORT 매체와 두 번 판 모든 우물을 세척 하는 자동화 된 액체 처리기를 사용 하 여 희석 PBS에서 1:5. 50 µ L/s를 사용 하 여 모든 단계 pipetting 속도.
    1. 각 우물에서 100 µ L를 발음 하 고 폐기물 저수지로 그를 버리고.
    2. 각 잘 100 µ L/잘 추가 미리 데워 진된 HCORT 매체 희석 1: 5에 PBS에 번호판의 수에 대 한 충분 한 양의 다른 저수지에 포함 된.
    3. 각 접시 3.5.1-3.5.2 단계를 반복 합니다.
      1. 필요에 따라 폐기물 저수지를 비어 있습니다.
      2. 리필 HCORT 매체와 저수지 1:5 필요에 따라 PBS에 희석.
    4. 각 우물에서 100 µ L를 발음 하 고 폐기물 공기 통으로 그를 버리고.
  6. 100 µ L/잘 미리 데워 진 HCORT 매체, 격판덮개의 수에 대 한 매체의 충분 한 볼륨에 다른 저수지에 포함 된 접시의 모든 우물 refeed
    1. 필요에 따라 매체와 저수지를 리필.
  7. 모든 격판덮개의 우물 c 2-c 6를 사용 하 여 컨트롤 비 페.
  8. B7-B11 우물과 C7-C11 toxicant 노출 약물 및 차량 컨트롤로 사용할 비 페 모든 접시의 유지.

4. refeed 셀 다음 날

  1. Refeed 판 모든 우물을 자동된 액체 처리기를 사용 합니다. 50 µ L/s를 사용 하 여 모든 단계 pipetting 속도.
    1. 각 우물에서 100 µ L를 발음 하 고 폐기물 저수지로 그를 버리고.
    2. 잘 100 µ L/잘 미리 데워 진된 HCORT 매체와는 다른 저수지에 포함 되어 있으며 매체 수 놓입니다에 번호판의 수에 대 한 충분 한 양의 각 refeed.
    3. 4.1.1와 4.1.2 refeed 모든 셀 접시를 필요에 따라 단계를 반복 합니다.
      1. 필요에 따라 폐기물 저수지를 비어 있습니다.
      2. 필요에 따라 매체와 저수지를 리필.

5. 긍정적인 컨트롤 추가

  1. Transfection 후 2 일, 2 시간 노출, 전 HFA 노출에 사용할 수를 하 고 8 행 희석 저수지의 행 B HCORT 매체에서 긍정적인 제어 cardamonin의 62.5 µ M 솔루션을 준비 합니다.
    1. CP 노출에 대 한 준비 하 고 SKF 86002의 25 µ M 솔루션을 사용 합니다.
    2. 긍정적인 통제 테스트할 번호판의 수에 대 한 충분 한 볼륨을 준비 합니다.
  2. HCORT 매체 (차량 통제)에 DMSO의 0.625% 솔루션을 준비 하 고 같은 저수지의 행 C에 추가.
    1. CP 노출에 대 한 준비 하 고 DMSO의 0.5% 솔루션을 사용 합니다.
    2. 차량 제어 테스트할 번호판의 수에 대 한 충분 한 볼륨을 준비 합니다.
  3. 모든 단계에 대 한 자동된 액체 처리기 우물 B7-B11 및 각 셀 플레이트의 C7-C11 긍정 및 차량 컨트롤을 추가 하 고 50 µ L/s pipetting 사용을 빠르게 사용 합니다. 미리 구성 된 팁 상자를 사용 하 여 해결만 우물 양수와 차량 제어를 받게 됩니다.
    1. B7-B11 및 C7-C11 각 셀 격판덮개의 우물에서 매체의 10 µ L을 제거 하 고 행 G와 H의 8 행 희석 저수지에 버리고.
    2. 그 우물을 긍정 및 차량 제어의 10 µ L를 전송 하 고 3 번을 혼합.
  4. 인큐베이터에이 셀 접시를 반환 합니다.
  5. 단계 5.3에 5.4 모든 셀 접시 양수 받은 때까지 및 차량 제어를 반복 합니다.

6. HF 노출 배양된 세포의

주의: HFA 이다 부식성 그리고 유독한 심하게입니다.

  1. 더블 니트 릴 장갑, 실험실 코트, 일회용 폴 리 에틸렌 소매 프로텍터와 안전 안경을 착용 하는 화학 증기 두건에서 모든 화학 노출 작업을 수행 합니다.
    1. 48% 솔루션으로 HFA를 취득 합니다.
    2. HFA 초순와 1%로 희석 하 고 안전을 개선 하기 위해 10 mL 두꺼운 벽 폴 리 에틸렌 튜브에 5 mL aliquots에 저장 합니다.
    3. 피 펫 팁 및 HFA와 유해 폐기물 스트림의 처리 전에 2.5% 칼슘 글 루 콘 산으로 남은 모든 액체 HFA 접촉 온 저수지 오염을.
  2. 조사 각 siRNA 도서관 접시 준비 0.0036 %HFA 중간 솔루션 1%의 288 µ L을 추가 하 여 HFA 80 ml 150 mL 병에 미리 데워 진된 HCORT 매체의.
    1. 병의 소용돌이 10 분 동안 화학 증기 두건에서 37 ° C 배양 기에서 희석 HFA를 품 어.
  3. 병 소용돌이 의해 다시 HFA 중간 솔루션을 혼합 하 고 따뜻한 접시에 시 약 저수지에 HFA 중간 솔루션을 추가 합니다.
  4. 탠덤에서 일 두 기술자 노출을 수행 합니다.
    1. 12 채널 pipettor를 사용 하 여 셀 판의 내부 우물의 각에서 오른쪽 aspirate 100 µ L에 기술자를 있고 왼쪽 접시 기술자에 전달.
    2. 왼쪽에 기술자 HFA 중간 솔루션의 당 100 µ L를 추가 했습니다.
    3. Toxicant에 노출 되는 모든 셀 접시 6.4.1-6.4.2 단계를 반복 합니다.
    4. 또한 노출 되지 않은 컨트롤 격판덮개, HFA 중간 솔루션 대신 신선한 HCORT 매체를 활용 하 여 6.4.1-6.4.2 단계를 반복 합니다.
  5. 20 분에 대 한 화학 연기 후드 인큐베이터에 접시를 놓고 셀 문화 인큐베이터에 그들을 반환 합니다.
  6. 일단 모든 접시는 노출 하 고 셀 문화 인큐베이터에 반환을 표시 이전 긍정적인 제어 추가 단계 (단계 5.1-5.5)를 반복 합니다.

7. CP 노출 배양된 세포의

주의: CP 심하게 독성과 자극입니다.

  1. 더블 니트 릴 장갑, 실험실 코트, 일회용 폴 리 에틸렌 소매 프로텍터와 안전 안경을 착용 하는 화학 증기 두건에서 모든 화학 노출 작업을 수행 합니다.
    1. CP를 획득 합니다.
    2. 5 %DMSO CP를 희석 하 고 안전을 개선 하기 위해 10 mL 섬광 튜브에 10 mL aliquots에 저장 합니다.
    3. 피 펫 팁 및 CP와 어떤 남은 액체 CP 유해 폐기물 스트림의 처리 전에 2.5% 나트륨 중 아 황산 염과의 접촉으로 온 저수지 오염을.
  2. 미리 데워 진된 HCORT 매체 노출 펜/Strep 번호판의 수에 대 한 미리 데워 공영 x 1의 충분 한 볼륨을 준비 합니다.
  3. 각 탑 플레이트 설정 또는 하단 플레이트 세트에 대 한 추가 5%의 8.04 µ L 미리 데워 진 HCORT 매체와 0.0008%의 최종 CP 농도 대 한 잘 섞어 약 50 mL 수를 DMSO에 CP. 튜브를 단단히 뚜껑 하 고 1 시간에 대 한 화학 증기 두건에서 37 ° C 배양 기에서 솔루션을 품 어.
    1. 각 탑 플레이트 설정 노출 하 고 CP는 매체의 50 mL 약 수에 추가 된 후 toxicant 정확 하 게 1 h 수신 하단 플레이트 설정 매체의 50 mL aliquots에 CP의 추가 시간.
  4. 셀 문화 인큐베이터에서 상단 플레이트 설정 하 고 1 노출 되지 않은 컨트롤 플레이트를 제거 하 고 화학 증기 두건 잠복기의 끝의 가까이에서 그들을 배치.
  5. 튜브를 거꾸로 하 여 CP 솔루션을 믹스와 다음 가만히 따르다 그것 시 저수지에 1 시간 잠복기의 끝에.
  6. 탠덤에서 일 두 기술자 노출을 수행 합니다.
    1. 12 채널 pipettor를 사용 하 여 셀 판의 내부 우물의 각에서 오른쪽 aspirate 100 µ L에 기술자를 있고 왼쪽 접시 기술자에 전달.
    2. 왼쪽에 기술자 CP 중간 솔루션의 당 100 µ L를 추가 했습니다.
    3. Toxicant에 게시 하도록 설정 하는 상단 플레이트의 모든 세포 격판덮개 7.6.1-7.6.2 단계를 반복 합니다.
    4. 또한 CP 중간 솔루션 대신 신선한 HCORT 매체를 활용 하 여 노출 되지 않은 컨트롤 번호판에 대 한 단계 7.6.1 7.6.2를 반복 합니다.
  7. 10 분 동안 화학 증기 두건에서 37 ° C 배양 기에서 접시를 놓습니다.
  8. PBS와 HCORT 매체 1의 충분 한 볼륨 추가 펜/Strep 시 저수지 잠복기가 10 분의 끝의 가까이 x.
  9. 12 채널 pipettor를 사용 하 여 셀 격판덮개에서 CP 솔루션을 제거 하 고 PBS의 당 100 µ L 잠복기가 10 분의 끝에 그것을 바꿉니다.
  10. 바로 세포 격판덮개에서 PBS를 제거 하 고 HCORT 매체 1의 당 100 µ L 펜/Strep x.
  11. 또한 노출 되지 않은 컨트롤 번호판에 대 한 단계 7.9 7.10를 반복 합니다.
  12. 표준 셀 문화 인큐베이터에 셀 접시를 반환 합니다.
  13. 하단 플레이트 설정 단계 7.3 7.12 반복 합니다.
  14. 앞에서 설명한 모든 플레이트 노출 되 고 셀 문화 인큐베이터에 반환 후 긍정적인 제어 추가 단계 (단계 5.1-5.5)를 반복 합니다.

8. 샘플 수집 및 세포 생존 능력 분석 실험

  1. 노출 후 24 시간 포도 당 10 g/L를 포함 하는 PBS에 0.5 mg/mL MTT 기판의 솔루션을 준비 하 고 37 ° C21에 따뜻한. 각 접시 수 분석에 대 한 기판의 10 mL를 준비 합니다.
  2. 접시에 분석 될 수에 대 한 자동된 액체 처리기에 저수지에 MTT 기판 솔루션의 충분 한 볼륨을 추가 합니다.
  3. 모든 단계에 대 한 샘플을 수집 하 여 MTT 기판 50 µ L/s pipetting을 사용 하 여 추가 자동된 액체 처리기 속도 사용 합니다. 팁 상자 수 분석을 그 우물만을 해결 하기 위해 미리 구성 합니다.
    1. 셀 플레이트, 그리고 두 384-잘 스토리지 접시의 각 보증금 42.5 µ L의 내부 60 우물에서 aspirate 95 µ L의 중간.
    2. 즉시 셀 번호판 MTT 기판 솔루션의 당 100 µ L을 추가 하 고 1.5 h에 대 한 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 그들을 품 어.
    3. MTT 기판 솔루션 필요에 따라 저수지를 리필.
  4. 1 시간에 대 한 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 셀 접시를 품 어.
  5. 384-잘 저장 번호판 봉인 하 고 후속 분석을 위해-80 ° C에서 그들을 저장 합니다.
  6. 모든 상단 및 하단 플레이트 세트와 연결 된 노출 되지 않은 컨트롤에 대 한 8.3에서 8.5 단계를 반복 합니다.
    1. 원하는, 하지만 MTT 기판 솔루션 및 집합 플레이트 사이 전환할 때 추가 하는 때 그들을 세척 하는 경우 복제 사이의 팁을 다시 사용 합니다.
  7. 1 h 부 화 후 자동된 액체 처리기에 저수지에 DMSO의 충분 한 볼륨을 추가 합니다.
  8. 모든 단계에 DMSO를 추가 하 여 50 µ L/s pipetting 사용 자동된 액체 처리기 속도 사용 합니다.
    1. 각 셀 접시의 내부 우물에서 100 µ L를 발음 하 고 폐기물 저수지로 MTT 기판 솔루션을 삭제.
      1. 필요에 따라 폐기물 저수지를 비어 있습니다.
    2. 각 잘 100 µ L DMSO 오버레이 합니다.
      1. 필요에 따라 DMSO 저수지를 리필.
  9. 3 분 판 통에 판을 흔들어.
  10. 플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 570, 690 nm에서 흡 광도 측정 한다.
  11. 배경 빼기 고 노출 되지 않은 컨트롤에 의해 노출 된 흡 광도 값을 나누어 % 세포 생존 능력을 계산. 평균 unexposed 부정적인 풀 siRNA 제어를 사용 하 여 모든 대상에 대 한 % 세포 생존 능력 계산 하.

9. 측정 IL-8 셀 문화 Supernatants 농도

  1. 측정에는 no를 사용 하 여 셀 문화 supernatants IL-8의 농도 구슬 기반 분석 결과 제조업체의 지침22에 따라 씻어. 분석 결과 플레이트 레이아웃을 샘플 및 표준 곡선을 만듭니다.
  2. -80 ° C 냉동 고에서 384-잘 저장 플레이트를 제거 하 고 실 온에서 녹여 간단히 원심 판 우물의 아래에 샘플을 수집 하.
  3. 실행 분석 결과 접시의 수에 대 한 분석 결과 버퍼는 키트에 포함 된 안티-IL-8 수락자 구슬 및 biotinylated 안티-IL-8 항 체의 충분 한 볼륨을 확인 합니다. 안티 IL8 수락자 구슬의 50 µ L 및 biotinylated 안티-IL8 항 체 분석 결과 버퍼의 9.9 ml의 50 µ L의 비율을 사용 합니다.
    1. 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 검은 384-잘 저장 판에 구슬/항 체의 혼합물을 추가 합니다.
      1. 샘플 및 시험 접시 레이아웃에 따라 표준 곡선에 대 한 사용 하기 위해 지정 하는 웰 스에 수락자 구슬/항 체를 추가 합니다.
      2. 잘 실행 되도록 분석 결과 접시의 수에 대 한 당 충분 한 볼륨을 추가 합니다.
  4. IL-8 1000 pg/mL 354 µ M를 포함 하는 셀 문화 매체를 사용 하 여 표준 reconstitute NaCl. 실행 분석 결과 접시의 수에 대 한 충분 한 볼륨을 확인 합니다.
  5. 표준 곡선의 8 개의 이중 직렬 희석을 확인 합니다.
  6. 분석 결과 플레이트 레이아웃에 따라 검은 384-잘 저장 판의 적절 한 우물을 3 중에 표준 곡선을 추가 합니다. 잘 실행 되도록 분석 결과 접시의 수에 대 한 당 충분 한 볼륨을 추가 합니다.
    1. 마찬가지로, 354 µ M를 포함 하는 셀 문화 매체를 추가 NaCl 배경 측정에 대 한 아무 IL-8.
  7. 분석 결과 수행 하는 자동화 된 액체 처리기를 사용 합니다. 분석 결과 플레이트 레이아웃 지정 우물만을 해결 하기 위해 미리 구성 된 팁 상자를 사용 합니다. 50 µ L/s를 사용 하 여 모든 단계 pipetting 속도.
    1. 흰색 384-잘 얕은 잘 분석 결과 격판덮개의 우물에 수락자 구슬-항 체 혼합물의 8 µ L를 전송.
      1. 샘플 및 시험 접시 레이아웃에 따라 표준 곡선에 대 한 지정 된 우물에만 추가 합니다.
    2. 분석 결과 플레이트 레이아웃에 따라 얕은 잘 분석 결과 접시의 적절 한 우물에 표준 곡선의 2 µ L를 전송.
    3. 3.54 M NaCl 솔루션을 준비 하 고 자동된 액체 처리기에 얕은 저수지에 분석에 번호판의 수에 대 한 충분 한 볼륨을 추가 합니다.
    4. 4.5 µ L NaCl 해결책의 검은 384-잘 저장 판에 샘플을 전송 하 여 표준 곡선의 일치 하는 샘플의 소금 농도 조정 합니다.
    5. 세 번 사용 하 여 혼합 볼륨 30 µ L의 샘플을 혼합 하 고 얕은 흰색 샘플의 전송 2 µ L 잘 분석 결과 분석 결과 플레이트 레이아웃에 따라 접시.
      1. 도움말 샘플 번호판 사이 변경 합니다.
    6. 실 온에서 어둠 속에서 1 시간에 품 어.
    7. 실행 분석 결과 접시의 수에 대 한 분석 결과 버퍼에서 수락자 구슬의 충분 한 볼륨을 확인 합니다. 분석 결과 버퍼의 12.3 ml 보조 수락자 구슬의 200 µ L의 비율을 사용 합니다.
    8. 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 보조 구슬 검은 384-잘 저장 판 추가.
      1. 샘플 및 시험 접시 레이아웃에 따라 표준 곡선에 대 한 사용 하기 위해 지정 하는 웰 스에 보조 비즈를 추가 합니다.
      2. 잘 실행 되도록 분석 결과 접시의 수에 대 한 당 충분 한 볼륨을 추가 합니다.
    9. 자동된 액체 처리기를 사용 하 여 보조 구슬의 10 µ L 흰색 384-잘 얕은 잘 분석 결과 접시의 웰 스 전송.
      1. 샘플 및 시험 접시 레이아웃에 따라 표준 곡선을 받은 우물에만 추가 하 고 각 격판덮개 사이 팁 세척.
    10. 실 온에서 어둠 속에서 다른 시간에 품 어.
  8. 접시 열판을 명확 하 고 분석 결과와 호환 플레이트 리더를 사용 하 여 스캔 분석 결과 봉인. 플레이트 및 검출기, 180 여기 시간, 및 550 측정 시간 사이의 0.2 m m 거리를 사용 하 여 검색에 대 한.
  9. 스프레드시트에 IL-8 분석 실험에서 원시 데이터를 가져옵니다.
  10. 자동화 곡선 IL-8 분석의 표준 곡선 맞춤을 사용 하 고 pg/ml 각 샘플에 대 한 원시 데이터를 변환.

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Representative Results

노출 방법 개발

우리는 세련 하 고 HTS 연구에 사용 하기 위해 인간 각 막 상피 세포 선 SV40-HCEC의 적합성을 평가. SV40 HCEC SV 40 큰 T 항 원을 사용 하 여 불멸 하 게 했다 고 Dhanajay Pal23에서 선물 했다. 간결 하 게, 여기 제시 노출 방법론 개발에 탐구 하는 너무 많은 변수가 있었고 그래서, 우리가 생각 하는 연구 결과의 일부 샘플 더 광범위 하 게 적용 될 수 있습니다만 여러 이용과 제공 됩니다.

스파이크 또는 매체 교환에 의해 toxicant 노출

우리는 처음 최종 원하는 노출 농도 달성 하기 위해 96 잘 접시에 셀의 각 음에 이미 존재 하는 매체의 95 µ L로 물, 염 분, 또는 매체에 희석 toxicant의 작업 농도의 사용률이 5 µ L로 세포를 노출 하고자 했다. SV40-HCEC이이 스파이크 노출/refeed 1 X LD50 HFA 24 h에 대 한 방법론을 사용 하 여 노출 됐다 (1 X LD50 = 0.02 %HFA 스파이크는 중간에 희석 하는 경우이 메서드에서 HFA), 그리고 웰 스 했다 놓입니다 신선한 중간 10 분으로 나중. 24 시간 후 셀은 세포 생존 능력 분석 결과 대 한 위에 설명 된 대로 MTT 기판으로 중첩 됩니다. 이미지는 photomicroscopy 이전 DMSO와 formazan 결정의 가용 화에 의해 체포 했다. 우물의 가까운 검사 보여 세포 죽음의 큰 정도 한 자리에서 지역화 된 접시 15 동요 되었다 사실에도 불구 하 고 이것이 s 스파이크 후 즉시 전체 판 (그림 1a)에 추가 되었습니다. 이 현상은 스파이크는 잘 또는 때 추가 초승달 모양에의 하단에 추가할 때 관찰 되었다. 세포 단계 대조 표시를 사용 하 여이 분야의 더 높은 확대 이미지는 여전히 MTT (그림 1b)에 의해 흠 없는 지역에 존재. 우리는 또한 폭 로/refeed 방법론 중간 세포 배양 1 X LD50 HFA의 포함 된 바뀝니다 우물에서 제거 되었다 중간 exchange 테스트 (1 X LD50 = 0.035%가 메서드에서 HFA)와 웰 스 했다 놓입니다 신선한 중간 10 분으로 나중. 24 시간 후 셀은 위에서 설명한 대로 MTT 기판으로 중첩 됩니다. 이 메서드는 분명히 더 많은 심지어 세포 죽음 반응 각 잘 (그림 1c 및 1d) 내의 셀의 달성. 노출 되지 않은 컨트롤 참조에 대 한 제공 하 고 (그림 1e , 1f) 세포 죽음의 아무 지역화 된 영역을 표시. 각 잘; 내에서 한 자리를 지역화 하는 세포 죽음의 큰 학위 CP 노출에 대 한 스파이크 메서드를 사용 하면 발생 하지 않았다 그러나, 세포 죽음 반응 다음 반복에서 더 일관 되었다 중간 exchange 노출 방법 (데이터 표시 되지 않음)를 사용 하 여.

Figure 1
그림 1 : 죽음 스파이크와 중간 교환 노출 방법에 의해 유도 된 세포. 모든 이미지는 MTT 기판의 추가 후 캡처한 1.5 h를 했다. (A) 패널 SV40-HCEC HFA 스파이크 노출/refeed 방법론에 노출의 밝은 필드 이미지입니다. 패널 (b)는 (a) 패널에 동일한 잘 더 높은 확대 단계 대조를 사용 하 여. 패널 (c) SV40-HCEC 노출/refeed 방법론 중간 exchange에 의해 노출 되는 밝은 필드 이미지 이다. 패널 (d) 단계 대조를 사용 하 여 같은 잘 패널 (c)에서 더 높은 확대 이다. 패널 (e)와 (f)은 잘 노출 되지 않은, 밝은 분야 및 단계 대비 더 높은 확대, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

중간에 toxicant 안정성

중간에 희석, 일단 HF와 CP의 명백한 세포 독성이 변경 및 다음 안정화는 관찰 되었다. HFA 매체 0.0036%에 희석 되었고 위에서 설명한 SV40-HCECs를 노출 하기 전에 1-60 분 동안 37 ° C에서 품 어 수 있습니다. HFA, HFA 매체에 희석 하 고 다음 안정에 대 한 적어도 한 시간 (그림 2a)은 첫 번째 5 분 이내에 세포 독성 증가 합니다. 한 가지 방법은 ANOVA Dunnett의 여러 비교 테스트에 의해 따라 나타났다 그 % 세포 생존 능력 전혀 시간 포인트 1 분 시간 포인트에서 크게 달랐다. 시간 포인트 2.5 ~ 60 분 사이 상당한 차이가 있었다. CP 유기 이며 5 %DMSO 희석 처음 이다. 그것은 다음 0.0008% 중간에 희석 하 고 위에서 설명한 대로 SV40-HCECs를 노출 하기 전에 5-120 분 동안 37 ° C에서 품 어 수 있습니다. 일단 중간에 희석, CP의 세포 독성 60 분 이상 감소 하 고 적어도 다음 h (그림 2b)에 대 한 다음 안정 시킨다. 한 가지 방법은 ANOVA Dunnett의 여러 비교 테스트에 의해 따라 나타났다 그 % 세포 생존 능력 전혀 시간 포인트 5 분 시간 포인트에서 크게 달랐다. 시간 포인트 60 ~ 120 분 사이 상당한 차이가 있었다.

Figure 2
그림 2 : 중간 희석 세포 독성의 toxicant 손실. 데이터는 % 생존 ± SD의 평균으로 표현 (n = 6). 패널 (a) 매체에 희석 하 고 위에서 설명한 대로 SV40-HCECs를 노출 하기 전에 1-60 분 동안 실 온에서 incubated 0.0036 %HFA 세포 독성의 안정성을 보여줍니다. 패널 (b) 매체에 희석 하 고 위에서 설명한 대로 SV40-HCECs를 노출 하기 전에 5-120 분 동안 37 ° C에서 품 어 수 0.0008 %CP 세포 독성의 안정성을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

노출/Refeed 또는 노출만

또 다른 요인은 노출 방법론에서 조사 했다 여부: A) 대 10 분, 세척, 화학 증기 두건에서 번호판을 제거 refeed, toxicant를 추가 하 고 표준 셀 문화 인큐베이터 (노출/refeed 방법);에서 24 h를 품 어 또는 B) toxicant 추가에 두고, 화학 증기 두건에서 접시를 제거 하 고 표준 셀 문화 인큐베이터 (폭로 유일한 방법)에서 24 h를 품 어. 안전은 플레이트는 toxicant-가스 되며 직원을 노출 하기 때문에 화학 증기 두건에서 희석된 toxicant를 포함 하는 셀의 제거를 허용 하지 않을 수 있습니다으로 한 중요 한 요소 이다. 관련된 고려 접시는 더 많은 접시부터 주어진된 시간에 노출 될 수, 거기는 더 큰 볼륨을-가스 있을 것입니다. 우리의 HTS 방법에 우리는 주어진된 연구 하루에 48 x 96 잘 접시를 노출. 우리는 봉인된 된 봉투에 노출 된 세포 배양 배지를 배치 하 고 CP와 HF 오프-가스 노출된 플레이트에서 평가 하기 위해 색도계 가스 탐지기 튜브를 사용. 우리는 HFA의 LD50 x 1로 48 플레이트 노출 어떤 감지 HF 오프-가스 (데이터 표시 되지 않음)에 초래 하지 않았다 발견. CP 노출에 대 한 우리는 충분 한 CP 오프-가스 48 판 LD50 적어도 약간 안전 관심사 (데이터 표시 되지 않음)을 제시 하 x 1에 노출에서 있었다는 것을 발견. 노출/refeed와 노출 메서드만 HFA 노출에 대 한 평가 했다. SV40 HCEC 셀 HFA에 노출 됐다 고 생존 노출 후 MTT 분석 결과 24 h에 의해 평가 되었다. 복용량 응답 반복 다른 일에 수행 되었다. 노출/refeed 메서드 (그림 3a)에 비해, 우리는 폭로 유일한 방법 더 일관 된 세포 생존 능력 분석 결과 (그림 3b) 생산 발견. 따라서,이 메서드는 마지막 노출 방법론의 일환으로 선정 됐다. CP에 대 한 두 개의 서로 다른 노출 방법론 사이 세포 생존 능력 분석 실험 결과의 일관성에 차이 계산 될 수 없음을 안전 우려 배제에 24 시간 보육에 대 한 화학 증기 두건에서 CP 노출 번호판을 제거 이후는 표준 셀 문화 인큐베이터입니다.

Figure 3
그림 3 : 노출/refeed 노출 일관성만 메서드를 노출 하는 고. 데이터는 % 생존 ± SD의 평균으로 표현 (n = 6). (a) HFA 매체에 희석, 10 분 동안 실 온에서 incubated 이었고 노출/refeed 방법으로 세포를 노출 하는 데 사용. (b) HFA 매체에 희석, 10 분 동안 실 온에서 incubated 이었고 노출 유일한 방법에 의해 SV40-HCEC를 노출 하는 데 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

셀 모델 구체화

중간 성분

우리는 통로 및 이러한 셀 라인;의 유지 보수에 대 한 원래 조사자에 의해 설립 된 문화 조건에 준수 그러나, 우리는 셀 실험에 대 한 그들을 수정. SV40 HCEC 세포에 대 한 원래 조사자에 의해 세포 배양 매체 날린, 포함 되지 않습니다 하지만 우리 cytokine 생산에 가끔 스파이크를 억제 하기 위해 노출 연구 기간 동안 날린 (0.5 µ g/mL)의 저수준을 활용 순진한 SV40-HCEC (데이터 표시 되지 않음)에 부정적인 영향을 받는 하나의 반복에서 다음에 데이터 분석 상세 연구 중.

Phenotypic 안정성

우리의 셀 모델 수정 연구 중 우리 발견 SV40-HCEC toxicant 노출 시작 통로 번호 60 (데이터 표시 되지 않음) 응답에서 cytokine 생산 감소 하기 시작. 이러한 이유로, 우리는 낮은 통로 세포의 cryostocks를 유지 통로 번호 60, 셀을 사용 하 여 모든 연구를 실행 하 고 심사 과정에서 cytokine 생산 모니터링.

플레이트 레이아웃

높은 처리량 연구에 있는 실험적인 가변성의 중요 한 원천이 다 잘 접시의 가장자리 효과입니다. 우리는 모두 인테리어 웰 스에 동등한 HFA와 CP 연구 (데이터 표시 되지 않음) 또는 지 웰 스에 세포의 사이토카인 응답 했다 일치, 발견. 데이터를 데이터 집합에 가장자리 영향을 최소화 하는 데 사용 되는 통계 운동의 메디아 폴란드어 (데이터 표시 되지 않음) 문제를 충분히 해결 되지 않았습니다. 따라서, 아무 셀 접시 가장자리 웰 스 실험 또는 컨트롤 (그림 4) 사용 되었다.

Figure 4
그림 4 : 라이브러리와 셀 접시 레이아웃. 라이브러리 플레이트 레이아웃에서에서 회색 영역은 siRNA를 포함 하는 우물을 나타냅니다. 화이트 웰 스 비어 있습니다. 라이브러리 판의 행 A-D 40 목표는 상단 플레이트 "설정", 사용 되 고 라이브러리 판의 행 E-H 40 대상 "하단 플레이트 설정"에 사용 됩니다. 웰 스 B2 B6 부정적인 풀 siRNA 컨트롤에 사용 됩니다. 웰 스 C2-C6는 비 페. 웰 스 B7-B11 cardamonin 또는 설명, SKF 86002 긍정적인 통제 약물에 대 한 사용 되 고 우물 C7-C11 DMSO 차량 제어에 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

HTS에 대 한 체 외 모델 유효성 검사

Z 사용 '이 통계 테스트 HTS24에 대 한 분석 결과 품질을 결정 하는 데 사용은 HTS 연구에 사용 하기 위해 SV40-HCEC의 적합성을 결정 하기 위해 분석 요소. HF Z에 대 한 ' 요소 분석, 셀은 103 셀/음, (위에서 설명한) 대로 부정적인 풀 siRNA와 페 x 1.25 시드 시드, 후 24 h 그리고 0.0036 %transfection 후 노출된 48 h HFA (LD50x 1), n = 3. CP Z에 대 한 ' 분석, 요소 셀 시드 했다 하 고 위에서 설명한 대로 페 0.0008 %transfection 후 48 h 노출 CP (LD50x 1), n = 5. 큰 n이 노출 모델에서 큰 변화 때문에 CP 연구를 위해 사용 되었다. Z' 요소 IL-8 식 데이터 노출 되지 않은 노출 셀 및 부정적인 풀 siRNA 페 unexposed 노출 셀 CP 및 HFA 노출에 대 한 계산 했다. 우리는 또한 거기 때문에 siRNA transfection 분석 결과 품질에 영향을 결정 하 비 페 셀을 분석 했다. 유효성 검사 연구의 많은 반복 노출 및 문화 조건 Z를 극대화 하기 위해에서 정제 하는 동안 수행한 ' 결과 요소. SV40-HCEC 유효성 검사를 통과 하 고 대부분 반복 했다 Z' 0.50 HF 노출 (표 1) 및 CP 노출 (표 2)에 대 한 보다 큰 값을 요소. 이 테이블에 있는 각 복제 세포 다른 일에 도금에서 했다.

노출 그룹 Z'-요소 분석
의원은 # 1 의원 # 2 공화국 # 3
HF 노출 부정적인 제어 Unexposed 부정적인 제어 대 0.68 0.5 0.56
순진한 대 HF 노출 0.4 0.68 0.56

표 1: SV40 HCEC HFA 노출 Z' IL-8의 분석 요소

노출 그룹 Z'-요소 분석
의원은 # 1 의원 # 2 공화국 # 3
노출 되지 않은 부정적인 제어 대 CP 노출 부정적인 제어 0.6 0.18 0.46
순진한 대 CP 노출 0.42 0.29 0.42

표 2: SV40 HCEC CP 노출 Z' IL-8의 분석 요소

기본 siRNA 심사 결과의 HFA 부상 셀

Transfection 최적화 연구 심사 전에 수행한 그리고 cyclophilin b를 대상으로 siRNA는 이러한 연구에 대 한 사용 되었다. 그리고 제자리에 RNA 검출 분석 결과 cyclophilin b mRNA 수준 측정 하 사용 높은 콘텐츠 분석기 결과 계량 하는 데 사용 되었다. 우리는 cyclophilin b의 최저와 일반적으로 siRNA/잘 및 0.3 µ L/잘 transfection 시 약 (데이터 표시 되지 않음)의 4 pmol와 5-10% 셀 손실 보다는 더 이상 90% 가까이 달성. SiRNA의 높은 금액은 실제로 가난한 cyclophilin b 최저 (데이터 표시 되지 않음)에서 결과. 최저의 siRNA와 0.09 µ L/잘 transfection 시 약 1.2 pmol/잘 달성 했다 하지만 우리가 해결할 수 있는 큰 금액을 필요로 효과적인 최저를 달성 하는 siRNA의 어떤 표적 든 지 잘 당 4 pmol 사용 선출. 대상 최저 속도 또한 평가 되었다, 그리고 이틀 후 transfection (데이터 표시 되지 않음) 하 여 그 대상 최저는 최대한 관찰 되었다. 접시에 걸쳐 대상 최저의 일관성 검증된 (데이터 표시 되지 않음)도 했다. 항 염증 제 약 cardamonin 및 SKF 86002 각각 사용 됩니다 긍정적인 컨트롤로 HFA와 CP 노출에 대 한 cytokine 생산의 억제에 대 한. 이러한 노출된 셀에 다양 한 화합물으로 알려진된 항 염증 성 속성을 테스트 하 여 선정 됐다. 연구 심사에 활용 하는 복용량은 복용량 응답 최적화 연구에 의해 선정 되었다.

우리가 활용 전략 스크리닝 높은 처리량 siRNA 업계 표준 이며, 세 가지 주요 단계가 포함 됩니다: 1) 1 차 심사, 2) 라이브러리 deconvolution, 및 3) 대상 유효성 검사. 1 차 심사에서 각 대상의 표현 형 다른 siRNA 시퀀스의 혼합물을 이용 하 여 각 유전자를 대상으로 한 시 약으로 평가 됩니다. 목표는 다음 라이브러리 deconvolution을 다운 선택. 이 단계에서는 1 차 심사에서 각 유전자를 대상으로 풀링된 다른 siRNA 시퀀스의 각 별도로 테스트 됩니다. 목표 대상 유효성 검사 대상 형 약물, 표현 형 복원, 또는 다른 공급 업체에서 siRNA 확인에 다른 다운 선택 받 다. 우리의 기본 화면에 대 한 우리 경제 이유를 위한 게놈 넓은 스크린 보다는 오히려 집중된 하위 게놈 스크린 수행 선출. Microarray 데이터 HF 및 CP 부상 마우스 각 고 독창성 통로 분석 (IPA) 우리의 대상 라이브러리 기본 화면 (원고 준비에서)에 대 한 집중 하는 데 사용 했다. 간단히, 마우스 각 증기 컵 비슷한 앞에서 설명한 방법25를 사용 하 여 toxicant 증기에 노출 되었다. 노출된 각 막 버튼과 컨트롤 포인트 게시물 노출 하는 다양 한 시간에 수확 했다. RNA는 고립, 그리고 RNA의 양과 품질 모니터링. 모든 microarray 실험 제조 업체의 프로토콜26에 따르면 수행 했다. 원시 신호 강도 정규화 하 고 주성분 분석 (PCA) 데이터에 있는 가변성의 중요 한 소스를 확인 하 여 분석 했다. 유전자 순위 통계적 의미에 의해 지시 했다입니다. 데이터 채굴 되었고 유전자 목록이 미리 구성 된 siRNA 도서관에 비해. 이 유전자 목록에서 우리는 3120 대상 심사에 대 한 선택. SiRNA 도서관 SV40 HCEC 셀 (기본 화면에 대 한 HTS 프로토콜의 흐름 차트 그림 5 참조)에서 상영 되었다. 끝점 평가 MTT 분석 결과 의해 아니 세척 구슬 기반 분석 결과 및 세포 생존 능력으로 세포 배양 매체에서 IL-8 레벨을 포함. 세포는 약 1 LD50x 0.0036%HFA, 앞에서 설명한에 노출 되었다. 세포 생존 능력은 MTT 분석 결과 24 시간 노출 후에 평가 됩니다. 엄격 하 게 표준화 된 평균 차이 (SSMD)27을 사용 하 여 각 접시에 대 한 노출된 제외 풀 평균을 기준으로 통계적 의미에 대 한 분석은 세포 생존 능력에 각 siRNA 풀의 영향을. SSMD 및 세포 생존 능력 배-변경의 듀얼-손전등 줄거리는 그림 6에 표시 됩니다. 히트 선택 임계값 세포 죽음을 악화 또는 세포 생존 능력을 개선 하는 대상에 대 한 선택 했다 SSMD ≤-1.28 SSMD ≥ 1.28, 각각.

Figure 5
그림 5 : 기본 화면 HTS 프로토콜 흐름 차트. 이 순서도 HTS 프로토콜에 대 한 매일 수행 되는 필수적인 단계를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 : SiRNA Cell Viability of HFA-Exposed SV40 HCEC 세포에 영향의 듀얼-손전등 줄거리. 각 대상에 대해 표시 된 결과 6 복제의 평균 (n = 6). 세포 생존 데이터 노출된 부정적인 풀 컨트롤 siRNA 상대적인 배 변경으로 표현 되 고 통계적 의미는 SSMD에 의해 분석 되었다. -1.28 SSMD ≤ 또는 ≥ 1.28 했던 목표는 명 중으로 선정 됐다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

HFA 유도 IL-8 생산에 각 siRNA 풀의 효과 각 접시에 대 한 노출된 제외 풀 평균을 기준으로 통계적 의미에 대 한 분석 했다. IL-8 세포 배양 표면에 뜨는 노출 후 평가 분석 결과 24 h를 했다. SSMD 및 IL-8 배 변경의 듀얼-손전등 줄거리는 그림 7에 표시 됩니다. IL-8 생산 감소 하는 대상에 대 한 선택 히트 선택 임계값 SSMD ≤-1.0 40% 감소 했다. IL-8 생산을 증가 하는 대상 했다 배 증가 및 SSMD을 선택 했다 선택 임계값 > 1.28.

Figure 7
그림 7 : HFA-Exposed SV40 HCEC 세포에 의해 일-8 생산에 siRNA 효과의 듀얼-손전등 줄거리. 표시 된 결과 6 복제의 평균 (n = 6). IL-8 식 수준 데이터 노출된 부정적인 풀 siRNA 상대적인 배 변경으로 표현 되 고 통계적 의미는 SSMD에 의해 분석 되었다. 조회 수 IL-8 레벨 및 SSMD ≤-1.0, IL-8 레벨에 SSMD 배 증가 감소 목표는 40%로 정의 된 > 1.28. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

본 모델의 HF와 CP 부상 연구에 대 한 심사는 높은 처리량 각 막 상피 세포의 개발에 우리의 방법 및 결과 설명 우리. 우리는 또한 HF 부상에 대 한 기본 siRNA 화면에서 결과 제시. TIC 상해 연구를 위한 HTS 모델의 개발에 많은 도전을 했다. 우리가 셀 문화 모델에 HF, HFA 또는 CP의 연구와 관련 된 문학에서 찾을 수 있는 방법은 작은 도움의 이었다. 불 소 이온에 대부분 생체 외에서 연구 구강 세포를 포함 하 고 (대 한 몇 가지 예제 참조28,29) 나트륨 불 화물와 HF 또는 HFA를 활용. 체 외에 노출에 기관지 상피 세포의 CP 일부 방법론 Pesonen 그 외 여러분 에 의해 게시 되었습니다. 30. 궁극적으로, 우리 도전과 변수가이 유독 필요한 HTS 개발에서 연구에 관련 된의 대다수와 HF, HFA 또는 CP, HTS 연구에 관련 된 문학에서 아무 특정 방법을 찾아냈다. 시간 및 성공적인 HTS 연구에 필요한 수많은 심사 플레이트 노출 일관성의 고차를 달성 하는 데 특별 한 주의 지불 했다.

한 가지 유형의 발생 도전 toxicant의 세포 배양 시스템에 응용 프로그램에 관련 되었다. 일부 이용과 함께 반응 또는 수성 해결책에서 불안정입니다. 유독 우리 연구에 대 한 선택 하지 이러한 불안정성 문제를 가진 것으로 간주 됩니다. CP의 photohydrolysis 조사는 농업 연구 물에 CP의 0.001 M 솔루션 31.1 h 1100 럭 스 크 세 논 빛 소스 (흐린된 날의 햇빛 강도)에 10 일, 12 시간 하루31당에 대 한 노출의 반감기 했다 보여주었다. 때 솔루션 어둠 속에 저장 된 동일한 10 일 동안 아무 측정 가수분해가 있었습니다. HFA의 양성자 및 불 소 이온은 명확 하 게 물에 안정. 그러나 있다,, toxicant 희석 세포 배양에 관한 추가 안정성 고려 사항. 우리는 그 때 어느 정도 세포 독성의 초기 변화는 유독 다음 시간의 짧은 기간에 후 안정화 세포 배양 매체에 희석 먼저 했다 발견. 우리는 이것이 toxicant 바인딩 또는 매체에서 성분 complexing 믿습니다. 셀 중간에는 칼슘, 마그네슘, 단백질, 불 소 이온32,33와 상호 작용을 한다고 알려져 있습니다 포함 되어 있습니다. CP는 생물 thiols와 산화 반응을 하 알려져 있지만 그것은 또한 DNA, 단백질, 및 다른 nucleophiles34,35를 바인딩할 수 있습니다. 일단 이러한 반응 및 상호 작용을 완료 했거나 평형에 도달, 사용 가능한 toxicant의 양을 안정화 하 고 따라서 명백한 세포 독성 안정 시킨다. 우리는 처음 작업 희석의 중간 성분 toxicant 상호 작용을 피하기 위해 노출에 대 한 사용 하는 작업 주식에 대 한 이용과의 염 분 및 물 희석의 사용을 탐험. 식 염 수를 사용 하 여 또한 HFA 부상 노출 매체 교환에 의해 수행에 대 한의 산 성 구성 요소를 유지 것입니다. 우리 발견 물과 식 염 수 희석에 유독 하 셀 죽음 응답 중간 교환 (데이터 표시 되지 않음) 세포 배양 매체 희석을 사용 하는 방법 보다 더 많은 변수를 했다. HFA와 스파이크 노출 방법에 관한 다양성 셀룰러 대상 사용 가능한 불 소 이온에 대 한 중간 성분 경쟁에 잘 선도에 분산 하는 스파이크에 불일치 될 수 있습니다. 중간 교류 HFA 식 염 수 희석 하 여 HFA 노출에 변화에 대 한 이유를 완전히 명확 하지 않다. 어떤 경우에, HFA에 대 한 식 염 수 희석을 사용 하 여 노출 방법 포기 하 고 CP에 대 한 탐험 하지. 중간에 우리의 HFA 희석의 독성 아마 밀접 하 게 셀 중간 우리의 HFA 희석에 무료 양성자 버퍼링 때문에 나트륨 불 소를 사용 하 여 연구를 모방 합니다.

우리가 발생 하는 다른도 전에 HTS.에 사용 하기 위해 셀 문화 모델의 구체화와 관련 있었다 우리는 그것 셀 실험, 특히 날린과 항생제에 대 한 세포 배양 매체 성분 수정 해야 하는 것을 발견. 우리 순진한 SV40-HCEC에서 본 cytokine 생산에 가끔 스파이크를 억제 하기 위해 노출 연구 기간 동안 날린 (0.5 µ g/mL)의 저수준을 활용. 이 낮은 양의 날린 셀의 toxicant 응답을 부정적인 영향을 주지 않았다 고 일반적으로 흥분 제36,37응답에 경작된 한 세포에 의해 사이토카인 생산을 억제 하는 데 사용 하는 수준 이었다. 왜 순진한 SV40 HCEC 세포는 때때로 초과 cytokines을 생산 하는 정확한 이유는 알려져 있지 않습니다, 하지만 셀은 변함없이 셀 뿌리고 도금 하는 동안 발생 하는 사소한 스트레스에 민감한 가능 합니다. 많은 실험실은 정기적으로 셀 문화 유지 보수 매체, 하지만 몇 가지 항생제에 항생제를 포함, tetracyclines 특히, 각 막 상피 세포38를 포함 하 여 경작된 한 세포에 항 염증 성 효과 전시에 표시 되었습니다. 일반적으로, 우리의 실험실이 잠재적으로 연구를 혼동 수 있습니다 이후 가능 하면 항생제의 사용을 방지 합니다. 우리는 또한 문화에서 우리의 세포의 여러 구절을 통해 phenotypic 드리프트를 조사. 그것은 여러 통로 통해 유전 그리고/또한 phenotypic 드리프트를 불멸 하 게 셀에 대 한 일반적인 아니라면 confluency에 도달 하도록 허용 하거나 특정 환경 스트레스39,40 노출 지 수 단계에서 유지 ,41. 따라서, 그것은 중요 높은 처리량 화면 셀 라인 제대로 유지 하 고 알려진된 phenotypic 응답을 유지 하는 셀 통로 숫자를 사용 하 여 화면을 완료 하는 동안. 다 잘 플레이트 가장자리 효과 종종 다 잘 플레이트의 외부 경계 우물에 성장 셀 같은 응답 하지 않는 또는 실내에 성장 하는 세포로 같은 일관성 있는 우물42현상입니다. 통계 연습, 데이터 세트43에 가장자리 효과 최소화 하기 위해 활용 될 수 있는 중간 폴란드어, 등이 있다. 그러나, 그것은 항상 지 잘, 테스트 및 이동 대상 복제 사이 격판덮개 레이아웃 변화 또는 지 웰 스의 컨트롤은 물류는 특정 대상 또는 컨트롤 가장자리 효과 제거할 수 있는 아무 통계 운동이 있다 실용적인 또는 비용 효과적입니다. 그것은 세포 기반 HTS 분석 실험에 가장자리 우물의 사용을 포함 한다 결정 신중 하 게 우리의 의견 이다. 우리는 컨트롤 및 대상 지 우물에 성장 하는 셀의 사용을 제거 하는 데 필요한 발견.

HF 부상 시험관에 대 한 우리의 HTS 셀 모델 및 노출 방법론 3120 대상의 기본 siRNA 화면 성공적으로 완료 하는 데 사용 되었다. SSMD 히트 선택 컨트롤 및 siRNA27사이의 차이의 크기를 측정 하는 구체적으로 제안 했다 때문에 사용 되었다. 세포 생존 능력에 대 한 우리의 결과 표시 SSMD 및 거의 모든 대상에 대 한 배 변화 사이 듀얼 손전등 음모에 선형 관계를 했다. 이 따라서, SSMD의 단일 기준이이 끝점에 대 한 적중된 선택에 대 한 사용 했습니다. IL-8 데이터 다른 강한 하지만 일치 하지 않는 효과 보여 일부 대상 약한 하지만 일관성 효과 했다에서 다릅니다. 따라서이 끝점에 대 한 적중된 선택 기준에 대 한 배 변화 및 SSMD를 사용 우리. SSMD 값 두 세포 생존 능력에 대 한 적중된 선택 사용 및 IL-8 데이터 차단 1과 1.645 (또는-1와-1.65) 사이의 낮은 거짓 발견 및 비-디스커버리 요금44얻을 있기 때문에 선택 되었다. 세포 생존 능력 및 IL-8 데이터 조회 수 있던 어떤 목표물을 확인 하 고 있었다. 이러한 경우 deconvolution 라이브러리에 포함에 대 한 선호 (향상 된 생존 능력 및 감소 IL-8) 전반적인 건강을 개선 또는 부상 악화의 동일한 방향에서 그들의 효과 발휘 하는 그 대상에 주어졌다 (세포 죽음 증가 하 고 증가 IL-8). 전반적으로, 우리는 세포 생존 능력 및 HF 부상 deconvolution 라이브러리를 IL-8 끝점 사이 250 대상의 전체 선택. 생체 외에서 CP 부상에 대 한 기본 화면 진행 중입니다.

요약 하자면, 노출 및 문화 조건 적합 HF와 CP 눈 상해의 HTS 연구 개발 했습니다. 노출 및 문화 조건에서 여러 변수 세련 되었고 최적화, 그리고 모델 z HTS 연구에 적합 확인 했다 ' 요소 분석. 우리 더 HF 모델에 siRNA 도서관의 기본 화면을 작성 하 여이 모델의 유틸리티를 입증 했다. 많은 부상 및 아니오의 질병 또는 부상 및 거의 모든 실험실에서 질병의 HTS 연구를 용이 하 게 제약 또는 생명 공학 산업, CP와 HF 포함, toxicant 부상에 제한 된 관심 및 벤치탑 로봇의 출현 . 높은 처리량 genomic 데이터 세트 특정 유전자에 부상 또는 질병 보다 효율적으로 초점을 도울 수 있는 재생 하는 역할의 이해에 크게 기여할 수 있다 생체 외에서 또는 vivo에서 학문에 따라.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

면책 조항:이 문서에 표현 들 저자와 군대의 부, 국방부, 또는 미국 정부의 공식 정책 반영 하지 않습니다. 이 연구는 NIH/NIAID 사이의 USAMRICD, 부처간의 합의 의해 지원 되었고 일부 대학원 연구 참여 프로그램에는 미국 육군 의료 연구 연구소의 화학 방어에 약속에 의해 오크에 의해 관리 릿지 연구소 과학 미국 에너지 부와 USAMRMC 사이의 부처간 합의 통해 교육에 대 한.

Acknowledgments

이 연구로는 국립 연구소의 건강 중화 프로그램 부처간 계약 # AOD13015-001 지원 되었다. 우리는 그들의 노력과 전문 비디오 제작에 대 한 스테파니 Froberg 피터 허스트를 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bravo liquid handing platform Agilent or equivalent G5409A
Bravo plate shaker Agilent or equivalent Option 159
Bravo 96LT disposable tip head Agilent or equivalent Option 178 96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 177 96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 179 384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
EnSpire multimode plate reader Perkin Elmer or equivalent 2300-0000 AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit  Perkin Elmer or equivalent AL224F no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates Perkin Elmer or equivalent 6008359
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen or equivalent 13778500 Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium Invitrogen or equivalent 31985070
TrypLE Express Gibco or equivalent 12605010 Cell detachment solution
IncuCyte Zoom Essen Instruments or equivalent ESSEN BIOSCI 4473 Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin Trinity Manufacturing or equivalent N/A Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium Invitrogen or equivalent 11330-057 Contains HEPES
Fetal bovine serum Invitrogen or equivalent 1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade) Invitrogen or equivalent E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 15140122
Hydrocortisone (cell culture grade) Sigma or equivalent H0888-10G
Glucose  (cell culture grade) Sigma or equivalent G7021
PBS  (cell culture grade) Sigma or equivalent P5493
siRNA Dharmacon or equivalent various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide Sigma or equivalent M5655 MTT assay substrate
siRNA buffer Thermo or equivalent B002000
96-well cell culture plates Corning or equivalent CLS3595
T150 cell culture flasks Corning or equivalent CLS430825
BSL-2 cell culture hood Nuaire or equivalent NU-540
300 mL robotic reservoirs Thermo or equivalent 12-565-572 
96 baffled automation reservoirs Thermo or equivalent 1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles Corning or equivalent CLS430282
Microplate heat sealer Thermo or equivalent AB-1443A
Microplate heat sealing foil Thermo or equivalent AB-0475
Cardamonin Tocris or equivalent 2509 Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002  Tocris or equivalent 2008 Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO Sigma or equivalent D8418
48% hydrofluoric acid Sigma or equivalent 339261 Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014382
200 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014391
20 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014392
1000 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17014497
200 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013810
20 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013808
Pipettor tips 1000 μL Rainin or equivalent 17002920
Pipettor tips 200 μL Rainin or equivalent 17014294
Pipettor tips 20 μL Rainin or equivalent 17002928
Chemical fume hood Jamestown Metal Products MHCO_229
384-well sample storage plates Thermo or equivalent 262261
Sodium chloride Sigma or equivalent S6191
50 mL conical tubes Thermo or equivalent 14-959-49A
Serological pipettes 50 mL Corning or equivalent 07-200-576
Serological pipettes 25 mL Corning or equivalent 07-200-575
Serological pipettes 10 mL Corning or equivalent 07-200-574
Serological pipettes 5 mL Corning or equivalent 07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells N/A N/A These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter Millipore or equivalent PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument Affymetrix or equivalent 00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates Affymetrix or equivalent 901257; 901434
Draegger tube HF Draeger or equivalent 8103251
Draegger tube CP Draeger or equivalent 8103421
Draegger pump Draeger or equivalent 6400000
Clear Plate seals Resesarch Products International or Equivalent 202502
Reagent reservoirs VistaLab Technologies or equivalent 3054-1000
Xlfit IDBS or equivalent N/A Excel add-in used for automated curve fitting

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References

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생물학 문제 136 Chloropicrin 수소 불 화물 각 막 상피 세포 각 막 부상 siRNA 높은 처리량 검열
Chloropicrin 및 수소 불 화물 유발 각 막 상피 세포 상해에 대 한 높은 처리량 SiRNA 심사
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Lehman, J. G., Causey, R. D., LaGrasta, C. V., Ruff, A. L. High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury. J. Vis. Exp. (136), e57372, doi:10.3791/57372 (2018).

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