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Biology

High Throughput Screening SiRNA per lesione delle cellule epiteliali cloropicrina e Cornea indotta da acido fluoridrico

Published: June 16, 2018 doi: 10.3791/57372
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1US Army Medical Research Institute of Chemical Defense

Summary

Screening RNA inibitorio piccolo su vasta scala è uno strumento importante che potrebbe contribuire a delucidare più rapidamente i meccanismi molecolari di lesioni epiteliali cornea chimica. Qui, presentiamo lo sviluppo e la convalida dei modelli di esposizione e dei metodi per lo screening di elevato throughput di indotta da acido fluoridrico e cloropicrina lesioni epiteliali cornea.

Abstract

Lesione oculare indotta da tossico è una vera emergenza oculare perché prodotti chimici hanno il potenziale per rapidamente infliggere danni ai tessuti significativi. Trattamenti per lesione corneale indotta da tossico sono generalmente solidale come nessun terapeutica specifica esiste per il trattamento di queste lesioni. Negli sforzi per sviluppare trattamenti e terapie di cura per l'esposizione, può essere importante capire i meccanismi cellulari e molecolari di queste lesioni. Proponiamo che l'utilizzo di screening inibitorio piccoli RNA (siRNA) su vasta scala può essere uno strumento importante che potrebbe contribuire a delucidare più rapidamente i meccanismi molecolari di lesioni epiteliali cornea chimica. siRNA sono doppio incagliati molecole RNA che sono 19-25 nucleotidi lunghi e utilizzano il percorso per degradare mRNA il silenziamento genico post-trascrizionale che hanno omologia al siRNA. La conseguente riduzione dell'espressione del gene specifico può essere studiata quindi nelle cellule esposte tossico per accertare la funzione di quel gene nella risposta cellulare alla sostanza tossica. Lo sviluppo e la validazione di modelli di esposizione in vitro e metodiche per l'alto throughput screening (HTS) di fluoruro di idrogeno (HF) e cloropicrina-(CP) indotto ferita oculare sono presentati in questo articolo. Sebbene abbiamo scelto queste due sostanze tossiche, i nostri metodi sono applicabili allo studio di altre sostanze tossiche con lievi modifiche al protocollo esposizione tossico. Il grande T antigene SV40 immortalato linea di cellule epiteliali corneali umane CHE SV40-HCEC è stato selezionato per lo studio. La vitalità cellulare e la produzione di IL-8 sono stati selezionati come endpoint nel protocollo di screening. Diverse sfide associate con lo sviluppo dell'esposizione tossico e metodi di coltura cellulare adatti per studi HTS sono presentati. La creazione di modelli HTS per queste sostanze tossiche consente ulteriori studi per capire meglio il meccanismo della ferita e alla schermata per potenziali terapie per ferita oculare chimica.

Introduction

Lesione oculare indotta da tossico è una vera emergenza oculare perché prodotti chimici hanno il potenziale per rapidamente infliggere danni ai tessuti significativi. Purtroppo, trattamenti per lesione corneale indotta da tossico sono generalmente solidale solo come terapie specifiche non esistono per trattare queste lesioni. L'attuale strategia di trattamento è aspecifica e comprende principalmente trattamenti topici terapeutici come lubrificanti, antibiotici, e cycloplegics seguita da antinfiammatori (ad es., steroidi) una volta la cornea ha re-epithelialized1 ,2. Nonostante il migliore trattamento terapeutico opzioni correnti disponibili, prognosi a lungo termine è generalmente scarsa a causa di appannamento corneale progressiva e neovascolarizzazione2,3.

Modelli animali sono stati utilizzati tradizionalmente per tossicità chimica di studiare e comprendere i meccanismi della ferita. Tuttavia, gli studi sugli animali sono lunghe e costose. Ci sono anche gli sforzi per ridurre la sperimentazione animale. Ad esempio, la normativa REACH (CE 1907/2006) dell'Unione europea ha disposizioni destinate a ridurre la sperimentazione. Le disposizioni sono un requisito che aziende condividono dati al fine di evitare la sperimentazione animale e ottenere l'approvazione dall'Agenzia chimica europea prima di eseguire i test proposti sugli animali. Ai sensi delle disposizioni del regolamento REACH, sperimentazione animale dovrebbe essere l'ultima risorsa. C'è anche il regolamento Cosmetici europeo (CE 1223/2009) che gradualmente la sperimentazione dei cosmetici negli animali. Quando vengono effettuati studi sull'animale, sono guidati dai principi di 3R (raffinatezza, riduzione e sostituzione), che forniscono un quadro per eseguire ricerca animale più umana, riducendo il numero di animali utilizzati e l'utilizzo delle alternative non animali ove possibile. Per questi motivi, il campo della tossicologia ha cercato di adottare saggi in vitro che possono fornire la comprensione nei meccanismi molecolari di tossicità e possono essere fatto in maggiore velocità di trasmissione4. Si tratta di un approccio funzionale tossicologia cui sostanze tossiche sono definite dalla loro funzione, piuttosto che esclusivamente da loro chimica. Compiuto un passo in avanti, funzionale toxicogenomics cercano di capire il ruolo che specifici geni svolgono negli effetti di sostanze tossiche5. Con l'applicazione della tecnologia siRNA, schermi per studiare la funzione del gene nelle risposte molecolari e cellulari alle sostanze tossiche possono essere fatto in alto throughput. siRNA sono molecole di RNA incagliati doppi che sono 19-25 nucleotidi lunghi che sfruttano la presente in tutte le cellule di mammiferi6via post silenziamento trascrizionale del gene. Questi sono sinteticamente fatto e progettati per indirizzare un gene specifico. Quando introdotti in una cella, viene elaborato il siRNA e un filo, il filo guida, viene caricato il complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC). Gli siRNA dirige il RISC ad una regione complementare in una molecola di mRNA, e il RISC degrada il mRNA. Questo comporta la riduzione dell'espressione del gene specifico. La conseguente riduzione dell'espressione del gene specifico può essere studiata quindi nelle cellule esposte tossico per accertare la funzione di quel gene nella risposta cellulare alla sostanza tossica. Tale approccio è stato utilizzato per capire meglio i meccanismi di suscettibilità di ricina e l'induzione di AHR-dipendente di CYP1A17,8.

L'elenco di valutazione di rischio del terrorismo chimico (CTRA) e gli elenchi di prodotti chimici industriali tossici (TIC) sono riportati in dettaglio selezionare prodotti chimici basati sulla loro tossicità e il potenziale per essere rilasciato nel corso di un terrorista, guerra o incidente industriale evento9. Stiamo applicando un throughput elevato di siRNA (HTS) toxicogenomic metodo per lo studio delle sostanze tossiche di elenco CTRA, che sono stati identificati per essere ad alto rischio di uso in un atto terroristico della selezione. Tossicologia tradizionale cerca di comprendere gli effetti avversi che hanno sostanze chimiche sugli organismi viventi; Tuttavia, abbiamo un ulteriore desiderio di comprendere i meccanismi della ferita allo scopo di informare lo sviluppo di terapeutica e approcci terapeutici e possibilmente, per scoprire le molecole che possono essere mirate per lo sviluppo terapeutico. Questo sforzo in un certo senso può essere considerato analogo all'uso di screening su vasta scala siRNA e saggi di cellulare basato nella droga scoperta processo10. Una differenza principale sarebbe che l'individuazione della droga tipicamente cerca una destinazione singolare per la scoperta terapeutica, considerando che il nostro approccio è alquanto improbabile che ci sarebbe una destinazione singolare con alto valore terapeutico per il trattamento dell'esposizione tossico. Prevediamo che qualsiasi paradigma di trattamento efficace per l'esposizione tossico richiederebbe un approccio multi-angolare per raggiungere alto valore terapeutico, e toxicogenomic dati vitale possono informare un paradigma di trattamento efficace.

Automazione del laboratorio porta metodologia throughput elevato ai laboratori fuori le industrie farmaceutiche o biotecnologiche. Gli studi in vitro al nostro Istituto sono state storicamente le analisi tradizionali che sono di bassa velocità effettiva11,12,13. Negli ultimi anni, il nostro laboratorio ha eseguito la transizione per l'utilizzo della robotica da banco per eseguire screening su vasta scala siRNA. Qui, presentiamo la raffinatezza dei modelli cellulari oculare e lo sviluppo in vitro di metodi di esposizione per acido fluoridrico (HF) e cloropicrina (CP) adatto per screening su vasta scala siRNA. Il nostro obiettivo è quello di identificare molecole che regolano la lesione cellulare in risposta a queste sostanze tossiche. Gli obiettivi della biblioteca siRNA che abbiamo selezionato sono recettori accoppiati a proteine G, proteinchinasi, proteasi, fosfatasi, canali ionici e altri potenzialmente bersagli. HF e CP sono stati selezionati per lo studio incrociando CTRA elenco agenti con i rapporti ToxNet degli incidenti industriali per trovare quelli che presentano il maggior rischio di lesioni oculari tramite vapore esposizione9,14. CP (formula chimica Cl3CNO2, numero CAS 76-06-2) è stato originariamente utilizzato come un gas lacrimogeni in WWI15. Attualmente è stato utilizzato come un fumigante agricolo e funzioni come un insetticida, fungicida e nematocida16. Acido fluoridrico (HF) è utilizzato nei processi tra cui di alchilazione in raffinerie di petrolio e fluorurazione elettrochimica di composti organici17. HF (formula chimica HF, numero CAS 62778-11-4) è un gas, ma nella sua forma acquosa è l'acido fluoridrico (HFA, CAS 7664-39-3 di numero). Pertanto, abbiamo scelto di utilizzare HFA nella nostra cella in modelli di esposizione. Il grande T antigene SV40 immortalato linea di cellule epiteliali corneali umane CHE SV40-HCEC è stato selezionato per lo studio. La vitalità cellulare e il marcatore infiammatorio IL-8 sono stati selezionati come endpoint perché gli obiettivi che sono coinvolti nella lesione cellulare dovrebbero riflettersi nella morte delle cellule e la risposta infiammatoria. In particolare, se una destinazione dovesse svolgere un ruolo protettivo nell'esposizione tossico, morte delle cellule e/o la produzione di citochine infiammatorie dovrebbe aumentare quando l'espressione di destinazione è inibita da siRNA. Il contrario sarebbe vero per gli obiettivi che giocano un ruolo negativo. Inoltre, l'infiammazione cronica sembra svolgere un ruolo nella patologia della cornea dopo l'esposizione e l'intervento nelle vie di morte delle cellule può migliorare il risultato clinico2,18.

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Protocol

1. cella cultura manutenzione

  1. Crescere la linea cellulare SV40-HCEC a 37 ° C, 5% CO2e 90% di umidità in DMEM F-12 con 15% siero bovino fetale (FBS), 1% L-Glutammina, 10 µ g/L fattore di crescita (EGF) e di 5 mg/L insulina.
  2. Passaggio della linea cellulare ogni 3-4 giorni (a seconda della densità di semina) per garantire che confluency mai supera l'80% durante la manutenzione di cultura.
  3. Staccare le cellule da boccette utilizzando una soluzione di distacco (14 mL di soluzione per ogni boccetta di2 cm 150) e l'incubazione a 37 ° C per non più di 8 min.
  4. Neutralizzare la soluzione di distacco con un uguale volume di terreno di coltura cellulare e agglomerare le cellule in provette coniche da 50 mL mediante centrifugazione per 7 min a 160 x g.
  5. Risospendere il pellet cellulare in mezzo (20 mL per ogni boccetta di2 150 cm).
  6. Contare le celle con un contatore di cellule palmare automatizzati e semi in nuove boccette con una densità che consentirà loro di crescere per 3 o 4 giorni senza superare 80% confluency.

2. piastra cellule per la sperimentazione

  1. Verifica boccette di SV40-HCECs da microscopia chiara di contrasto di fase per garantire tale confluenza è minore di 80% e per valutare la salute generale delle cellule.
  2. Scollegare, a pellet, risospendere e contare SV40-HCECs da boccette come descritto ai punti da 1.3 a 1.6 di mantenimento di coltura delle cellule. Usare mezzo di SV40-HCEC contenenti idrocortisone 0,5 µ g/mL (media HCORT) per risospendere le cellule.
  3. In una bottiglia di media USA e getta, preparare una sospensione di SV40-HCECs a 17.857 cellule/mL nel mezzo di HCORT pre-riscaldato.
    1. Preparare un volume sufficiente di sospensione cellulare per il numero di piastre per essere seminato.
    2. Semi di un minimo di 14 x 96 pozzetti con cellule per ogni piatto di biblioteca di siRNA essere studiato.
  4. Agitare il flacone per sospendere le cellule uniformemente, versare un sufficiente volume della sospensione cellulare in un serbatoio sul nido agitatore orbitale di un gestore di liquido automatizzato e conservare il flacone contenente la sospensione cellulare su un 37 ° C piastra di riscaldamento durante la placcatura di cella processo.
  5. Utilizzare il gestore di liquido automatizzato per aggiungere celle a piastre ad una densità di 1000 cellule per pozzetto (5000 cellule/cm2) in 70 µ l di terreno per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Utilizzare un 50 µ l/s velocità di pipettaggio per tutti i passaggi.
    1. Eseguire l'agitatore orbitale a 100 rpm costantemente durante il processo di seeding.
    2. Mescolare la sospensione cellulare tre volte (140 µ l di miscela) utilizzando il gestore di liquido automatizzato.
    3. 140 µ l della sospensione delle cellule di aspirare e dispensare 70 µ l in ogni pozzetto di due piastre per colture cellulari.
    4. Ripetere i passaggi 2.5.3 e 2.5.4 per tutte le piastre hanno seminate con le cellule.
    5. Riempire il serbatoio di sospensioni di cellule come necessario durante il processo di seeding.
  6. Dopo le piastre hanno seminate, rimuoverli dal gestore liquido automatizzato e li Incubare 30 min a temperatura ambiente prima di trasferirli in un'incubatrice di cultura cellulare.
  7. Valutare la densità delle cellule di ogni pozzo per ogni piatto la mattina seguente, utilizzando un sistema automatizzato di imaging che è ospitato in un'incubatrice di coltura cellulare ed esclude eventuali piastre dallo studio che hanno pozzi interni che non sono tra 15% e 22% confluenti.

3. transfect cellule con siRNA

  1. Acquisire piastre libreria siRNA dal fornitore pre-configurato per contenere 80 siRNA obiettivi per piastra (vedere Figura 4), con colonne 1 e 12 lasciato vuoto.
  2. Ricostituire la piastra di biblioteca di siRNA con siRNA buffer per una concentrazione finale di 2 pmol / µ l per ogni pozzetto di siRNA secondo istruzioni19 del produttore.
  3. Transfect le cellule 24 h dopo la semina con 4 pmol/pozzetto di siRNA e 0,3 µ l/pozzetto di reagente di transfezione. Eseguire tutti i passaggi secondo il protocollo del produttore del reagente di transfezione (Vedi Figura 4 per il layout di piastra)20.
    1. Eseguire tutte le transfezioni utilizzando un gestore di liquido automatizzato e utilizzare un 25 µ l/s di velocità di pipettaggio per tutti i passaggi. Utilizzare scatole di tip pre-configurato per affrontare solo i pozzi che saranno trasfettati.
    2. Utilizzare la parte superiore metà della piastra biblioteca a transfect una serie di sei piatti replicare indicata come il "Top Plate Set" (sei repliche per siRNA, n = 6).
    3. Utilizzare il fondo metà della piastra biblioteca a transfect un diverso insieme di sei piatti replicare indicata come il "piatto fondo Set" (sei repliche per siRNA, n = 6).
    4. Utilizzare il termine "Full Plate Set" per descrivere il 12 piastre di cellule che sono state trasfettate con siRNA biblioteca.
    5. Transfect pozzi B2-B6 di tutte le piastre nel Set completo di piastra con piscina negativo siRNA dopo tutti i set di piastra superiore e inferiore sono stati trasfettati con siRNA biblioteca.
    6. Anche transfect pozzi B2-B6 di un altro due piastre, che non ricevono biblioteca siRNA e serviranno come comandi non esposti (uno per il set piastra superiore) e uno per il set di piastra di fondo, con piscina negativo siRNA.
  4. Incubare tutte le placche delle celle in un'incubatrice di coltura cellulare per 4 ore dopo aver aggiunto tutte le miscele di transfezione e mix di gentle toccando ogni ora.
  5. Utilizzare un gestore automatico liquido per lavare tutti i pozzetti delle piastre due volte con il mezzo di HCORT pre-riscaldato diluito 1:5 in PBS. Utilizzare un 50 µ l/s velocità di pipettaggio per tutti i passaggi.
    1. 100 µ l di ciascun pozzetto di aspirare e scartare che in un serbatoio dei rifiuti.
    2. Aggiungere ad ogni ben 100 µ l/pozzetto preriscaldata medio HCORT diluito 1:5 in tampone PBS che è contenuta in un serbatoio diverso a un volume sufficiente di per il numero di piatti.
    3. Ripetere i passaggi 3.5.1 e 3.5.2 per ogni piatto.
      1. Svuotare il serbatoio dei rifiuti secondo le necessità.
      2. Ricarica il serbatoio con il mezzo di HCORT diluito 1:5 in PBS come necessario.
    4. 100 µ l di ciascun pozzetto di aspirare e scartare che nel serbatoio dei rifiuti.
  6. Refeed tutti i pozzetti della piastra con 100 µ l/pozzetto pre-riscaldato HCORT terreno, che è contenuta in un serbatoio diverso a un volume sufficiente di mezzo per il numero di piatti.
    1. Riempire il serbatoio con medie come necessario.
  7. Utilizzare pozzetti C2-C6 di tutte le piastre come controlli non trasfettate.
  8. Tenere pozzi B7-B11 e C7-C11 di tutte le piastre non trasfettate per essere utilizzati come controlli droga e veicolo per esposizione tossico.

4. refeed le cellule il seguente giorno

  1. Utilizzare un gestore di liquido automatizzato per refeed tutti i pozzetti delle piastre. Utilizzare un 50 µ l/s velocità di pipettaggio per tutti i passaggi.
    1. 100 µ l di ciascun pozzetto di aspirare e scartare che in un serbatoio dei rifiuti.
    2. Ogni pila bene con 100 µ l/pozzetto preriscaldata mezzo HCORT che è contenuta in un serbatoio diverso e ha un volume sufficiente di mezzo per il numero di piastre per essere refed.
    3. Ripetere i passaggi 4.1.1 e 4.1.2 come bisogno di refeed tutte le placche delle celle.
      1. Svuotare il serbatoio dei rifiuti secondo le necessità.
      2. Riempire il serbatoio con medie come necessario.

5. controllo positivo aggiunta

  1. Due giorni dopo trasfezione e due ore prima dell'esposizione, preparare una soluzione di 62,5 µM del cardamonin di controllo positivo in mezzo HCORT per essere utilizzata per esposizioni HFA e aggiungere alla riga B di un serbatoio di diluizione 8-riga.
    1. Per l'esposizione di CP, preparare e utilizzare una soluzione di 25 µM di SKF 86002.
    2. Preparare un volume di controllo positivo e sufficiente per il numero di piastre per essere testato.
  2. Preparare una soluzione di 0,625% di DMSO in mezzo HCORT (controllo del veicolo) e aggiungere alla riga C del serbatoio stesso.
    1. Per l'esposizione di CP, preparare e utilizzare una soluzione di 0,5% di DMSO.
    2. Preparare un volume di controllo del veicolo sufficiente per il numero di piastre per essere testato.
  3. Utilizzare il gestore di liquido automatizzato per aggiungere i controlli positivo e veicolo ai pozzi B7-B11 e C7-C11 di ciascuna piastra di cella e utilizzare un 50 µ l/s pipettaggio velocità per tutti i passaggi. Utilizzare scatole di tip pre-configurato per affrontare solo i pozzi che riceveranno i controlli positivo e veicolo.
    1. Rimuovere 10 µ l di terreno da pozzi B7-B11 e C7-C11 di ciascuna piastra di cella e gettarlo in righe G e H del serbatoio 8-riga diluizione.
    2. Trasferire 10 µ l dei controlli positivi e veicolo di quei pozzi e mescolare 3 volte.
  4. Riporre queste piastre di cella nell'incubatore.
  5. Ripetere i passaggi 5.3 a 5.4 fino a quando tutte le piastre di cellulari hanno ricevuto positivi ed i comandi del veicolo.

6. HF esposizione delle cellule coltivate

Attenzione: HFA è acutamente tossici e corrosivi.

  1. Eseguire tutte le operazioni di esposizione a sostanze chimiche in una cappa chimica indossando guanti in nitrile doppio, un camice da laboratorio, maniche di protezione in polietilene monouso e occhiali di sicurezza.
    1. Acquisire HFA come soluzione di 48%.
    2. Diluire HFA all'1% con acqua ultrapura e memorizzare in aliquote da 5 mL a 10 mL fiale di polietilene parete spessa per migliorare la sicurezza.
    3. Decontaminare i puntali per pipette e bacini che sono venuti in contatto con HFA e qualsiasi residuo liquido HFA con gluconato di calcio 2,5% prima dello smaltimento nel flusso di rifiuti pericolosi.
  2. Per ogni piatto di library di siRNA sotto inchiesta, preparare una soluzione di media del HFA 0.0036% aggiungendo µ l 288 del 1% HFA a 80 mL di mezzo HCORT pre-riscaldato in un flacone da 150 mL.
    1. Agitare la bottiglia e incubare l'HFA diluito in un incubatore a 37 ° C nella cappa chimica per 10 min.
  3. Mescolare la soluzione media HFA ancora agitando il flacone e aggiungere la soluzione di medie HFA in un serbatoio di reagente su una piastra scaldavivande.
  4. Eseguire l'esposizione con due tecnici lavorano in tandem.
    1. Sono il tecnico sulla destra aspirato 100 µ l da ciascuno dei pozzetti di una piastra di cella utilizzando una pipetta a 12 canali interni e quindi passare la piastra al tecnico sulla sinistra.
    2. Sono il tecnico sulla sinistra aggiungere 100 µ l di soluzione media HFA.
    3. Ripetere i passaggi 6.4.1 e 6.4.2 per tutte le piastre di cellula che sono esposti a tossico.
    4. Anche ripetere passaggi 6.4.1 e 6.4.2 per piastre di controllo non esposti, utilizzando freschi HCORT mezzo invece la soluzione media HFA.
  5. Posizionare le piastre nell'incubatore cappuccio chimico del vapore per 20 minuti e poi tornare per l'incubatrice della coltura cellulare.
  6. Ripetere il passaggio di aggiunta di controllo positivo (passi 5.1-5.5) come precedentemente indicato una volta che tutti i piatti sono stati esposti e ritornò l'incubatrice della coltura cellulare.

7. CP esposizione delle cellule coltivate

Attenzione: CP è acutamente tossica e irritante.

  1. Eseguire tutte le operazioni di esposizione a sostanze chimiche in una cappa chimica indossando guanti in nitrile doppio, un camice da laboratorio, maniche di protezione in polietilene monouso e occhiali di sicurezza.
    1. Acquisire CP.
    2. Diluire il CP al 5% in DMSO e memorizzare in aliquote di 10 mL a 10 mL fiale di scintillazione per migliorare la sicurezza.
    3. Decontaminare i puntali per pipette e bacini che sono venuti in contatto con CP e qualsiasi residuo liquido CP con bisolfito di sodio 2,5% prima dello smaltimento nel flusso di rifiuti pericolosi.
  2. Preparare un volume sufficiente di pre-riscaldato mezzo HCORT contenente 1 x Pen/Strep e PBS preriscaldata per il numero di piastre di essere esposti.
  3. Per ogni set Top Plate Set o piastra inferiore, aggiungere 8.04 µ l del 5% CP in DMSO ad un'aliquota di 50 mL di pre-riscaldato HCORT medio e mescolare bene per una concentrazione finale di CP di 0,0008%. Richiudere ermeticamente il tubo e incubare la soluzione in un incubatore a 37 ° C nella cappa chimica per 1 h.
    1. Ora l'aggiunta di CP per le aliquote di 50 mL di mezzo in modo che ciascuno esposti Top Plate Set e Bottom Plate Set riceve tossico esattamente 1 h dopo CP è stato aggiunto per l'aliquota di 50 mL di mezzo.
  4. Togliere un Top Plate Set e 1 controllo non esposto l'incubatrice della coltura cellulare e metterli nella cappa chimica verso la fine del periodo d'incubazione.
  5. Miscelare la soluzione CP capovolgendo la provetta e decantare quindi ad un serbatoio di reagente alla fine del periodo di incubazione di 1 h.
  6. Eseguire l'esposizione con due tecnici lavorano in tandem.
    1. Sono il tecnico sulla destra aspirato 100 µ l da ciascuno dei pozzetti di una piastra di cella utilizzando una pipetta a 12 canali interni e quindi passare la piastra al tecnico sulla sinistra.
    2. Sono il tecnico sulla sinistra aggiungere 100 µ l di soluzione media CP.
    3. Ripetere i passaggi 7.6.1 e 7.6.2 per tutte le piastre di cella del Top Plate Set di essere esposti alla sostanza tossica.
    4. Anche ripetere passaggi 7.6.1 e 7.6.2 per piastre di controllo non esposti, utilizzando freschi HCORT mezzo invece la soluzione media CP.
  7. Posizionare le piastre in un incubatore a 37 ° C nella cappa chimica per 10 min.
  8. Aggiungere un volume sufficiente di PBS e HCORT mezzo contenente 1 x Pen/Strep a serbatoi di reagente vicino alla fine del periodo di incubazione di 10 min.
  9. Rimuovere la soluzione di CP da piastre di cella utilizzando una pipetta a 12 canali e sostituirlo con 100 µ l di PBS alla fine del periodo di incubazione di 10 min.
  10. Immediatamente rimuovere il PBS placche in cella e sostituirlo con 100 µ l di terreno di HCORT contenente 1 x Pen/Strep.
  11. Anche ripetere passaggi 7.9 e 7.10 per le piastre di controllo non esposti.
  12. Restituire le piastre di cella per un'incubatrice di cultura cellulare standard.
  13. Ripetere i passaggi da 7,3 a 7.12 per il Bottom Plate Set.
  14. Ripetere il passaggio di aggiunta del controllo positivo (passi 5.1-5.5) come precedentemente descritto una volta che tutti i piatti sono stati esposti e ritornò l'incubatrice della coltura cellulare.

8. raccolta e analisi di attuabilità delle cellule del campione

  1. Ventiquattro ore dopo l'esposizione, preparare una soluzione di substrato MTT di 0,5 mg/mL in PBS contenente 10 g/L glucosio e riscaldare a 37 ° C21. Preparare 10 mL di substrato per ogni piatto deve essere analizzato.
  2. Per il numero di piastre deve essere analizzato, è necessario aggiungere un volume sufficiente di soluzione di substrato MTT ad un serbatoio su un gestore di liquido automatizzato.
  3. Utilizzare il gestore di liquido automatizzato per raccogliere il campione e aggiungere substrato MTT utilizzando un 50 µ l/s pipettaggio velocità per tutti i passaggi. Preconfigurare scatole di tip per risolvere solo quei pozzi deve essere analizzato.
    1. Mezzo di aspirato 95 µ l of da interni 60 pozzetti della piastra e deposito 42,5 µ l in ciascuna delle due piastre 384 pozzetti deposito.
    2. Immediatamente aggiungere 100 µ l di soluzione substrato MTT per le piastre di cella e li Incubare a 37 ° C in un'incubatrice di coltura cellulare per 1,5 h.
    3. Riempire il serbatoio con la soluzione di substrato MTT come necessario.
  4. Incubare le piastre di cella a 37 ° C in un'incubatrice di coltura cellulare per 1 h.
  5. Sigillare le piastre 384 pozzetti deposito e conservarli a-80 ° C per la successiva analisi.
  6. Ripetere i passaggi da 8,3 a 8,5 per tutti i set di piastra superiore e inferiore e i controlli associati non esposti.
    1. Riutilizzare i suggerimenti tra repliche se lo si desidera, ma lavarli quando si aggiunge la soluzione di substrato MTT e commutazione tra piastra quando imposta.
  7. Dopo l'incubazione di 1h, aggiungere un volume sufficiente di DMSO per un serbatoio su un gestore di liquido automatizzato.
  8. Utilizzare il gestore di liquido automatizzato per aggiungere DMSO e utilizzare un 50 µ l/s pipettaggio velocità per tutti i passaggi.
    1. 100 µ l da ciascuno dei pozzetti delle piastre cella interni di aspirare e scartare la soluzione di substrato MTT in un serbatoio dei rifiuti.
      1. Svuotare il serbatoio dei rifiuti secondo le necessità.
    2. Sovrapposizione di ciascun pozzetto con 100 µ l DMSO.
      1. Riempire il serbatoio di DMSO come necessario.
  9. Agitare le piastre su un agitatore per piastre per 3 min.
  10. Misurare l'assorbanza a 570 e 690 nm utilizzando uno spettrofotometro di piastra.
  11. Sottrarre lo sfondo e l'attuabilità delle cellule % viene calcolato dividendo i valori di assorbanza esposti dai controlli non esposti. Utilizzare il controllo di siRNA media piscina negativo non esposti per calcolare % vitalità cellulare per tutte le destinazioni.

9. IL misura-8 concentrazione nei surnatanti della cultura delle cellule

  1. Misura la concentrazione di IL-8 nei surnatanti di cultura cellulare utilizzando un no lavare test basati su tallone secondo istruzioni22 del produttore. Creare un layout di piastra di dosaggio per ospitare i campioni e la curva standard.
  2. Rimuovere le piastre 384 pozzetti deposito dal congelatore-80 ° C, scongelare a temperatura ambiente e centrifugare brevemente le piastre per raccogliere il campione nel fondo dei pozzetti.
  3. Per il numero di piastre di analisi da eseguire, è necessario effettuare un volume sufficiente di perline acceptor anti-IL-8 e anticorpo biotinilato anti-IL-8 nel tampone incluso nel kit. Utilizzare il rapporto di 50 µ l di perline acceptor anti-IL8 e 50 µ l di anticorpo anti-IL8 biotinilato a 9,9 mL di tampone del saggio.
    1. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere la miscela di tallone/anticorpo ad una piastra di stoccaggio nero 384 pozzetti.
      1. Aggiungere acceptor tallone/anticorpo ai pozzetti destinati all'uso per i campioni e la curva standard in base al layout di piastra di dosaggio.
      2. Aggiungere un volume sufficiente per pozzetto per il numero di piastre di analisi da eseguire.
  4. Ricostituire IL-8 standard a 1000 pg/mL utilizzando il mezzo di coltura cellulare contenente 354 µM NaCl. Rendere un volume sufficiente per il numero di piastre di analisi da eseguire.
  5. Fare otto diluizioni seriali della curva standard.
  6. Aggiungere la curva standard in triplice copia relativi pozzetti di una piastra nera 384 pozzetti deposito in base al layout di piastra di dosaggio. Aggiungere un volume sufficiente per pozzetto per il numero di piastre di analisi da eseguire.
    1. Allo stesso modo, aggiungere mezzo di coltura cellulare contenente 354 µM NaCl con nessun IL-8 per la misura di sfondo.
  7. Utilizzare un gestore di liquido automatizzato per eseguire l'analisi. Utilizzare scatole di tip pre-configurato per affrontare solo i pozzetti designati dal layout di piastra di dosaggio. Utilizzare un 50 µ l/s velocità di pipettaggio per tutti i passaggi.
    1. Trasferire 8 µ l della miscela della perla-anticorpo accettore ai pozzetti delle piastre 384 pozzetti poco profonde analisi ben bianco.
      1. Aggiungere solo i pozzi indicati per campioni e la curva standard in base al layout di piastra di dosaggio.
    2. Trasferire 2 µ l della curva standard relativi pozzetti delle piastre dosaggio ben poco profonde in base al layout di piastra di dosaggio.
    3. Preparare una soluzione di NaCl 3,54 M e aggiungere un volume sufficiente per il numero di piastre deve essere analizzato per un bacino poco profondo sul gestore del liquido automatizzato.
    4. Regolare la concentrazione di sale dei campioni in base a quella della curva standard trasferendo 4,5 µ l della soluzione NaCl ai campioni delle piastre di stoccaggio nero 384 pozzetti.
    5. Mescolare i campioni tre volte utilizzando un volume di miscelazione di 30 µ l, e trasferire 2 µ l dei campioni per il bianco poco profondo analisi ben piastre in base al layout di piastra di dosaggio.
      1. Cambiare suggerimenti tra piastre di campione.
    6. Incubare per 1 h al buio a temperatura ambiente.
    7. Per il numero di piastre di analisi da eseguire, è possibile rendere un volume sufficiente di perline acceptor nel tampone. Utilizzare il rapporto di 200 µ l di perline acceptor secondaria a 12,3 mL di tampone del saggio.
    8. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere perline secondarie ad una piastra di stoccaggio nero 384 pozzetti.
      1. Aggiungere perline secondarie ai pozzetti destinati all'uso per i campioni e la curva standard in base al layout di piastra di dosaggio.
      2. Aggiungere un volume sufficiente per pozzetto per il numero di piastre di analisi da eseguire.
    9. Utilizzando il gestore di liquido automatizzato, trasferire 10 µ l delle perline secondarie ai pozzetti delle piastre bianco dosaggio ben poco profonde 384 pozzetti.
      1. Aggiungere solo i pozzi che ha ricevuto i campioni e la curva standard secondo lo schema di dosaggio piastra e lavare le punte tra ogni piatto.
    10. Incubare per un'altra ora al buio a temperatura ambiente.
  8. Sigillare il dosaggio piastre con chiaro guarnizioni piastra ed eseguire la scansione utilizzando un lettore di piastra compatibile con l'analisi. Utilizzare 0,2 mm di distanza tra piastra e rivelatore, 180 ms tempo di eccitazione e 550 ms tempo di misura per l'analisi.
  9. Importare i dati grezzi dai dosaggi di IL-8 in un foglio di calcolo.
  10. Utilizzare automatizzata curva raccordo per la curva standard dei saggi IL-8 e quindi convertire i dati grezzi in pg/mL per ogni campione.

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Representative Results

Sviluppo del metodo di esposizione

Abbiamo raffinato ed abbiamo valutato l'idoneità della linea cellulare epiteliale corneale umana SV40-HCEC per uso negli studi HTS. SV40-HCEC furono immortalati utilizzando il grande T antigene di SV-40 e sono stati un regalo da Dhanajay Pal23. C'erano troppe variabili Esplorate nello sviluppo di metodologia di esposizione per presentare brevemente nel presente documento, e così, solo alcuni esempi dei risultati che riteniamo potrebbero essere più ampiamente applicabile a più sostanze tossiche sono presentati.

Esposizione tossico di Spike o cambio medio

Inizialmente abbiamo cercato di esporre le cellule chiodando 5 µ l di un lavoro di concentrazione del tossico diluito in acqua, soluzione salina o medie in 95 µ l di terreno già presente in tutti i pozzetti delle cellule in una piastra a 96 pozzetti per ottenere la concentrazione finale desiderata esposizione. SV40-HCEC erano esposti utilizzando questo picco esporre/refeed metodologia a 1 X LD50 di HFA per 24 h (1 X LD50 = 0,02% HFA da questo metodo quando il picco HFA è stato diluito in mezzo), e pozzi sono stati diventeranno con fresco medio 10 min più tardi. Dopo 24 h, le cellule erano sovrapposti con substrato MTT come descritto sopra per l'analisi di attuabilità delle cellule. Immagini sono state catturate da fotomicroscopia prima della solubilizzazione dei cristalli di formazano con DMSO. Approfondimento dei pozzi ha mostrato che un elevato grado di morte cellulare è stato localizzato in uno spot, e questo è malgrado il fatto che la piastra è stata agitata per 15 s immediatamente dopo il picco è stato aggiunto per l'intera piastra (Figura 1a). Questo fenomeno è stato osservato quando il picco è stato aggiunto in fondo il bene o quando aggiunto al menisco. Un'immagine di ingrandimento superiore di questa zona usando spettacoli di contrasto di fase che le cellule sono ancora presenti nella zona senza macchia di MTT (Figura 1b). Abbiamo provato anche un cambio medio esporre/refeed metodologia dove il medium è stato rimosso dai pozzi, sostituiti con terreno di coltura cellulare contenente la 1 X LD50 di HFA (1 X LD50 = 0.035% HFA da questo metodo) e pozzi sono stati diventeranno con fresco medio 10 min più tardi. Dopo 24 h, le cellule erano sovrapposti con substrato MTT come descritto sopra. Questo metodo ottiene un'apparentemente più anche risposta delle cellule morte delle cellule all'interno di ciascun pozzetto (Figura 1C e 1D). Comandi non esposti sono forniti per riferimento e non mostrano nessun zone localizzate della morte delle cellule (Figura 1e e 1f). Per le esposizioni di CP, il metodo di spike non ha provocato un grande grado di morte cellulare localizzato in un punto all'interno di ciascun pozzo; Tuttavia, la risposta di morte delle cellule era più coerenza da una ripetizione al successivo utilizzando il metodo di esposizione media exchange (dati non mostrati).

Figure 1
Figura 1 : Morte indotta da spike e metodi di esposizione medio scambio cellulare. Tutte le immagini sono state catturate 1,5 h dopo aggiunta del substrato MTT. Pannello (a) è un'immagine del campo luminoso di SV40-HCEC esposti a spike HFA esporre/refeed metodologia. Pannello (b) è un ingrandimento superiore del pozzo stesso nel pannello (a) utilizzo di contrasto di fase. Pannello (c) è un'immagine del campo luminoso di SV40-HCEC esposti dal cambio medio esporre/refeed metodologia. Pannello (d) è un ingrandimento superiore del pozzo stesso nel pannello (c) utilizzo di contrasto di fase. Pannelli (e) e (f) sono da un campo non ben esposto, luminoso e ingrandimento maggiore contrasto di fase, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tossico stabilità in mezzo

È stato osservato che una volta diluita in mezzo, la citotossicità apparente di HF e CP cambia e poi si stabilizza. HFA è stato diluito in mezzo al 0.0036% e lasciata incubare a 37 ° C per 1-60 min prima di esporre SV40-HCECs, come descritto in precedenza. Per HFA, la citotossicità aumenta entro i primi 5 min che HFA è diluita in mezzo ed è quindi stabile per almeno un'ora (Figura 2a). Un modo ANOVA seguita da Test di confronto più di Dunnett ha mostrato quella vitalità cellulare % a tutti i punti di tempo erano significativamente differenti dal punto di tempo di 1 min. Non c'erano differenze significative tra il 2,5 a 60 min tempo punti. CP è organico e prima è diluito al 5% in DMSO. Era quindi diluito in mezzo a 0,0008% e lasciata incubare a 37 ° C per 5-120 min prima di esporre SV40-HCECs, come descritto in precedenza. Una volta diluita in mezzo, la citotossicità di CP diminuisce oltre 60 min e poi si stabilizza per almeno il prossimo h (Figura 2b). Un modo ANOVA seguita da Test di confronto più di Dunnett ha mostrato quella vitalità cellulare % a tutti i punti di tempo erano significativamente differenti dal punto di tempo di 5 min. Non c'erano differenze significative fra il min 60 a 120 punti di tempo.

Figure 2
Figura 2 : Perdita tossico di citotossicità in diluizioni medie. I dati sono espressi come media delle redditività percentuale ± SD (n = 6). Pannello (a) Mostra la stabilità di citotossicità HFA 0.0036% quando diluito in mezzo e incubati a temperatura ambiente per 1-60 min prima di esporre SV40-HCECs, come descritto in precedenza. Pannello (b) Mostra la stabilità di citotossicità di CP 0,0008% quando diluito in mezzo e lasciata per incubare a 37 ° C per 5-120 min prima di esporre SV40-HCECs, come descritto in precedenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Esporre/Refeed o esporre solo

Un altro fattore studiato in metodologia dell'esposizione era se: A) aggiungere tossico per 10 min, lavare, refeed, togliere la cappa chimica, piastre e incubare per 24 h in un'incubatrice di coltura cellulare standard (metodo di esporre/refeed); o B) aggiungere tossico, lasciarlo acceso, rimuovere le piastre dalla cappa chimica e incubare per 24 h in un'incubatrice di coltura cellulare standard (esporre unico metodo). La sicurezza è un fattore importante come non può essere consentito di rimuovere le piastre di celle che contengono tossico diluito dalla cappa chimica perché la sostanza tossica sarà off-gas ed esporre il personale. Una considerazione correlata è il numero di piastre per essere esposto in un dato momento poiché le piastre più ci sono, ci sarà un maggiore volume fuori-fornire di gas. Nostri metodi HTS, esponiamo 48 x 96 pozzetti in un giorno determinato studio. Abbiamo messo piastre per colture cellulari esposte in un sacchetto sigillato e quindi utilizzati tubi rivelatore gas colorimetrico per valutare CP e HF fuori-fornire di gas dalle piastre esposte. Abbiamo trovato che esponendo 48 tavole a 1 x LD50 di HFA non ha provocato alcun rilevabile HF fuori-fornire di gas (dati non mostrati). Per le esposizioni di CP, abbiamo scoperto che c'era abbastanza CP fuori-fornire di gas da 48 tavole esposte a 1 x LD50 per presentare almeno qualche preoccupazione per la sicurezza (dati non mostrati). Esporre/refeed ed esporre solo i metodi sono stati valutati per le esposizioni HFA. SV40-HCEC cellule sono state esposte a HFA e attuabilità è stata valutata dall'analisi di MTT 24 h dopo l'esposizione. Dose risposta iterazioni sono state effettuate in giorni diversi. Rispetto al metodo esporre/refeed (Figura 3a), abbiamo trovato che l'unico metodo di esporre prodotti più coerente risultati di dosaggio attuabilità delle cellule (Figura 3b). Pertanto, questo metodo è stato selezionato come parte della metodologia d'esposizione finale. Per CP, eventuali differenze nella consistenza dei risultati del test vitalità cellulare tra le due metodologie di esposizione differenti non potrebbero essere valutate poiché preoccupazioni per la sicurezza ha precluso la rimozione delle piastre di CP esposti dalla cappa chimica per 24 ore di incubazione in una incubatrice di coltura cellulare standard.

Figure 3
Figura 3 : Coerenza di esposizione con esporre/refeed ed esporre solo metodi. I dati sono espressi come media delle redditività percentuale ± SD (n = 6). (a) HFA era diluito in mezzo, incubato a temperatura ambiente per 10 min e poi utilizzato per esporre le cellule dal metodo esporre/refeed. (b) HFA era diluito in mezzo, incubato a temperatura ambiente per 10 min e poi utilizzato per esporre SV40-HCEC dall'unico metodo di esporre. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Affinamento del modello di cella

Medi costituenti

Abbiamo rispettato le condizioni di coltura stabilite dagli investigatori originari per il passaggio e la manutenzione di queste linee cellulari; Tuttavia, li abbiamo modificato per le celle di sperimentazione. Il terreno di coltura cellulare prescritto dagli investigatori originari per le celle di SV40-HCEC non include l'idrocortisone, ma abbiamo utilizzato un basso livello di idrocortisone (0,5 µ g/mL) durante gli studi di esposizione per sopprimere il picco occasionale nella produzione di citochina visto in ingenuo SV40-HCEC (dati non mostrati) che alterate analisi dei dati da una ripetizione alla successiva durante gli studi di perfezionamento.

Stabilità fenotipica

Durante i nostri studi di perfezionamento del modello delle cellule, abbiamo trovato che il SV40-HCEC cominciano a hanno fatto diminuire la produzione di citochina in risposta all'esposizione tossico a partire intorno numero di passaggio 60 (dati non mostrati). Per questo motivo, abbiamo mantenuto cryostocks delle cellule di passaggio basso, eseguito tutti gli studi che usando le cellule sotto numero di passaggio 60 e monitorato la produzione di citochine durante il processo di screening.

Layout di piastra

Un'importante fonte di variabilità sperimentale negli studi di throughput elevato è effetti di bordo delle piastre multi-pozzetto. Abbiamo scoperto che non erano coerenti con le risposte di citochina delle cellule nei pozzi di bordo, o equivalente a, pozzi interni in entrambi HFA e CP studia (dati non mostrati). Mediano polacco dei dati, un esercizio statistico utilizzato per ridurre al minimo gli effetti del bordo su un set di dati, non sufficientemente viene risolto il problema (dati non mostrati). Pertanto, nessuna cella piastra pozzetti di bordo sono stati utilizzati per sperimentazione o controlli (Figura 4).

Figure 4
Figura 4 : Biblioteca e piastra di cella layout. Le aree ombreggiate grigia nel Layout della piastra biblioteca rappresentano pozzetti contenenti siRNA. I pozzetti bianchi siano vuoti. 40 obiettivi da righe A-D della piastra libreria sono utilizzati in "Top Plate Set", e le 40 destinazioni da righe E-H della piastra biblioteca vengono utilizzate in "Bottom Plate Set". Wells B2-B6 sono utilizzati per i controlli negativi piscina siRNA. Pozzetti C2-C6 sono non-transfettate. Wells B7-B11 sono utilizzati per cardamonin o farmaci di controllo positivo 86002 SKF come descritto, e pozzi C7-C11 sono utilizzati per il controllo di veicoli di DMSO. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In Vitro modello convalida per HTS

Abbiamo usato Z' analisi per determinare l'idoneità di SV40-HCEC per uso negli studi HTS come questo test statistico è utilizzato per determinare la qualità di dosaggio per HTS24dei fattori. Per HF Z' fattore di analisi, le cellule sono state seminate ad 1,25 x 103 cellule/pozzetto, trasfettate con siRNA piscina negativo (come descritto sopra) 24 h dopo la semina ed esposta a 48 ore dopo la trasfezione di 0.0036% HFA (1 x LD50), n = 3. Per CP Z' fattore di analisi, le cellule sono state seminate e transfettate come descritto sopra ed esposti 48 ore dopo la trasfezione di 0,0008% CP (1 x LD50), n = 5. Un n maggiore è stato utilizzato per gli studi di CP a causa della maggiore variabilità in questo modello di esposizione. Z' fattore è stato calcolato per IL-8 espressione dati da cellule non esposti vs esposti e piscina negativo siRNA transfettate non impressionate vs esposti cellule per le esposizioni di CP e HFA. Abbiamo anche analizzato non transfettati per determinare se c'era un effetto sulla qualità di dosaggio a causa di trasfezione con siRNA. Molte iterazioni di studi di convalida sono state eseguite durante la raffinazione condizioni di esposizione e cultura nel tentativo di massimizzare la Z' fattore risultati. SV40-HCEC ha superato la convalida e la maggior parte delle iterazioni avevano Z' fattore valori maggiori di 0.50 per HF esposizioni (tabella 1) e CP esposizioni (tabella 2). Ogni replica in queste tabelle è stato dalle cellule placcate in giorni diversi.

Gruppi di esposizione Z'-analisi dei fattori
Rep. n. 1 Rep. n. 2 Rep. n. 3
Controllo negativo HF-esposti vs controllo negativo non esposto 0,68 0,5 0,56
HF-esposti vs ingenuo 0.4 0,68 0,56

Tabella 1: SV40-HCEC HFA esposizione Z' fattore di analisi del-8

Gruppi di esposizione Z'-analisi dei fattori
Rep. n. 1 Rep. n. 2 Rep. n. 3
Controllo negativo CP-esposti vs controllo negativo non esposto 0.6 0.18 0.46
CP-esposti vs ingenuo 0,42 0,29 0,42

Tabella 2: SV40-HCEC CP esposizione Z' fattore di analisi del-8

SiRNA primario di Screening risultati di celle di feriti HFA

Gli studi di ottimizzazione di transfezione sono stati effettuati prima dello screening, e siRNA targeting ciclofilina b è stato usato per questi studi. Un test di rilevamento in situ RNA è stato utilizzato per misurare i livelli di mRNA di ciclofilina b, e un alto contenuto analyzer è stato utilizzato per quantificare i risultati. Abbiamo raggiunto vicino a 90% atterramento della ciclofilina b e in genere non più di 5-10% perdita di cellule con 4 pmol di siRNA per pozzetto e reagente di transfezione di µ l/pozzetto 0,3 (dati non mostrati). Una maggiore quantità di siRNA effettivamente provocato atterramento di più povera della ciclofilina b (dati non mostrati). Sono stati raggiunti livelli simili di atterramento con 1,2 pmol/pozzetto di siRNA e reagente di transfezione µ l/pozzetto di 0,09, ma abbiamo scelto di utilizzare 4 pmol per pozzetto per affrontare tutti gli obiettivi che potrebbero richiedere una maggiore quantità di siRNA per raggiungere efficace atterramento. Cinetica di atterramento di destinazione inoltre sono stati valutati, ed è stato osservato che atterramento di destinazione era massima dalla post-transfezione due giorni (dati non mostrati). Destinazione coerenza atterramento su tutta la piastra era anche convalidati (dati non mostrati). I farmaci anti-infiammatori cardamonin e SKF 86002 sono utilizzati come controlli positivi per l'inibizione della produzione di citochina per esposizione HFA e CP, rispettivamente. Questi sono stati selezionati da testing di una varietà di composti con proprietà antinfiammatorie conosciute nelle cellule esposte. La dose utilizzata in studi di screening è stata selezionata da studi di ottimizzazione di dose risposta.

Gli siRNA elevato throughput screening strategia abbiamo utilizzato è standard di settore e prevede tre passaggi principali: screening 1) primario, deconvoluzione libreria 2) e 3) destinazione convalida. Nello screening primario, il fenotipo di ogni destinazione viene valutato utilizzando una miscela di sequenze di siRNA differenti come singolo reagente per ogni gene di destinazione. Gli obiettivi sono quindi giù-selezionati di deconvoluzione di biblioteca. In questo passaggio, ciascuna delle sequenze di siRNA differenti che sono in pool per ogni gene in screening primario di destinazione sono stati sottoposti separatamente. Obiettivi sottoposti a selezione a un altro in convalida di destinazione in cui il fenotipo di destinazione è confermato con droghe, restauro di fenotipo, e/o siRNA da un altro fornitore. Per il nostro schermo primario, noi abbiamo scelto di eseguire uno schermo sub-genomica concentrato piuttosto che uno schermo ampio genoma per ragioni di economia. I dati di microarray di HF e CP ferito le cornee del mouse e ingegno Pathway Analysis (IPA) sono stati utilizzati per concentrare la nostra libreria di destinazione per la schermata principale (manoscritti in preparazione). Brevemente, le cornee del mouse sono stati esposti a vapori tossico utilizzando una tazza vapore simile a metodi precedentemente descritti25. Cornea esposta pulsanti e controlli sono state raccolte al tempo vari punti dopo l'esposizione. RNA è stato isolato, e la qualità e la quantità di RNA monitorati. Tutti gli esperimenti di microarray sono stati eseguiti secondo protocollo26 del produttore. Intensità del segnale grezzo sono state normalizzate e analizzate dall'analisi delle componenti principali (PCA) per determinare le fonti significative di variabilità dei dati. Geni erano rank ordinato di significatività statistica. I dati sono stati estratti e rispetto agli elenchi di gene di librerie di siRNA preconfigurati. Da questi elenchi di gene, abbiamo selezionato 3120 target per lo screening. La biblioteca di siRNA è stata proiettata in cellule di SV40-HCEC (vedere la Figura 5 per un diagramma di flusso del protocollo HTS per la schermata principale). Le valutazioni dell'endpoint includevano livelli di IL-8 nel mezzo di coltura cellulare di analisi basata a perlina no-lavaggio e attuabilità delle cellule dall'analisi di MTT. Le cellule sono state esposte al 0.0036%HFA, come descritto in precedenza, che è di circa 1 x LD50. La vitalità cellulare è stata valutata dall'analisi di MTT 24 h dopo l'esposizione. L'effetto di ogni pool di siRNA sulla vitalità cellulare è stata analizzata la significatività statistica rispetto alla media della piscina negativi esposti per ogni piastra utilizzando rigorosamente standardizzato differenza media (SSMD)27. Un complotto di dual-torcia di SSMD e cellula attuabilità piega-cambiamento è illustrato nella Figura 6. Le soglie di selezione hit scelte per gli obiettivi che ha esacerbato la morte delle cellule o migliorata di attuabilità delle cellule erano SSMD ≤-1.28 e SSMD ≥ 1.28, rispettivamente.

Figure 5
Figura 5 : Diagramma di flusso di protocollo primario schermo HTS. Questo schema illustra i passi fondamentali che vengono eseguiti ogni giorno per il protocollo HTS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : Dual-torcia trama del siRNA effetto sulle cellule di SV40-HCEC Cell Viability of HFA-Exposed. Risultati mostrati per ogni destinazione sono la media dei sei repliche (n = 6). Dati di attuabilità delle cellule sono espresse come una piega-modifica riguardante il siRNA di controllo esposte piscina negativo e significatività statistica è stata analizzata da SSMD. Gli obiettivi che aveva un SSMD ≤-1.28 o ≥ 1,28 sono stati selezionati come colpi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'effetto di ogni pool di siRNA sulla produzione di IL-8 indotta da HFA è stato analizzato per significatività statistica rispetto alla media della piscina negativi esposti per ogni piatto. IL-8 nel surnatante della cultura delle cellule era valutato analisi 24 h dopo l'esposizione. Un complotto di dual-torcia della piega-modifica SSMD e IL-8 è illustrato nella Figura 7. Le soglie di selezione hit scelte per gli obiettivi che ridotta produzione di IL-8 erano una diminuzione di 40% e ≤ SSMD -1,0. Le soglie di selezione hit scelte per gli obiettivi che ha aumentato la produzione di IL-8 erano un aumento quintuplo e SSMD > 1,28.

Figure 7
Figura 7 : Dual-torcia trama del siRNA effetto sulla produzione di IL-8 dalle cellule di SV40-HCEC HFA-Exposed. Risultati mostrati sono la media dei sei repliche (n = 6). Dati a livello di espressione del-8 sono espresse come una piega-modifica riguardante il siRNA piscina negativi esposti e significatività statistica è stata analizzata da SSMD. Colpi sono stati definiti come obiettivi che aveva un 40% diminuiscono nei livelli di IL-8 e SSMD ≤ -1,0 o un aumento quintuplo nei livelli di IL-8 e SSMD > 1,28. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Qui descriviamo i nostri metodi e risultati sullo sviluppo di una cellula epiteliale di cornea elevato throughput screening modello per lo studio delle lesioni HF e CP. Inoltre presentiamo i risultati dalla schermata principale siRNA per lesioni HF. C'erano molte sfide per lo sviluppo di modelli HTS per lo studio delle lesioni TIC. Metodi che potremmo trovare nella letteratura relazionata allo studio di HF, HFA o CP in modelli di coltura cellulare erano di poco aiuto. Maggior parte dei studi in vitro sullo ione fluoruro coinvolgono cellule orali e utilizzate il fluoruro di sodio e non HF o HFA (per alcuni esempi, vedere28,29). Alcuni metodologia sull'esposizione in vitro di cellule epiteliali bronchiali al CP è stata pubblicata da Pesonen et al. 30. in definitiva, abbiamo non trovato nessun metodi specifici in letteratura relazionata allo studio HTS di HF, HFA o CP, e la maggior parte delle sfide e variabili relazionate allo studio di queste sostanze tossiche in sviluppo HTS richiesto. Particolare attenzione è stata dedicata a raggiungere l'elevato grado di coerenza di esposizione attraverso il tempo e numerose piastre di screening necessari per uno studio HTS successo.

Un tipo di sfida incontrato era imparentato con l'applicazione del tossico a sistemi di coltura cellulare. Alcune sostanze tossiche sono reattivi con o instabile in soluzioni acquose. Le sostanze tossiche che abbiamo selezionato per lo studio non sono considerati come aventi questi problemi di instabilità. Uno studio agricolo indagando photohydrolysis di CP ha mostrato che una soluzione 0.001 M di CP in acqua aveva un tempo di dimezzamento di 31,1 h quando esposto ad una sorgente luminosa del xeno di 1100 lux (intensità di luce del sole di una giornata nuvolosa) per 10 giorni, 12 ore al giorno31. Non c'era nessuna idrolisi misurabili rispetto allo stesso periodo di 10 giorni, quando la soluzione è stata conservata al buio. Lo ione fluoruro e protone di HFA sono chiaramente stabile in acqua. Ci sono, tuttavia, considerazioni di maggiore stabilità per quanto riguarda le diluizioni tossico nel mezzo di coltura cellulare. Abbiamo trovato che c'era un cambiamento iniziale di citotossicità in una certa misura, quando le sostanze tossiche in primo luogo sono stati diluiti in mezzo di coltura cellulare che poi si stabilizza dopo un breve periodo di tempo. Crediamo che questo sia dovuto il legame tossico o complessanti con costituenti nel mezzo. Medium cellulare contiene calcio, magnesio, proteine, ecc che sono noti per interagire con il fluoruro ioni32,33. CP è noto per avere reazioni ossidative con tioli biologici, ma può anche associare il DNA, proteine e altri nucleofili34,35. Una volta che queste reazioni e interazioni hanno completato o raggiunto l'equilibrio, la quantità di sostanza tossica disponibile stabilizza e così si stabilizza la citotossicità apparente. Inizialmente abbiamo esplorato l'uso di soluzione salina e acqua diluizioni di sostanze tossiche per gli stock di lavoro utilizzato per esposizioni per evitare interazioni tossico con medie costituenti in diluizioni di lavoro. L'uso di soluzione salina sarebbe anche preservare la componente acida della ferita HFA per esposizioni eseguite da exchange medie. Abbiamo trovato che le risposte di morte delle cellule alle sostanze tossiche in acqua e soluzione saline diluizioni erano più variabile rispetto al metodo che utilizzate diluizioni di terreno di coltura cellulare con cambio medio (dati non mostrati). Per quanto riguarda il metodo di esposizione di picco con HFA, la variabilità può essere a causa di un'incoerenza nel picco disperdente nel bene a bersagli cellulari in competizione con medie costituenti per lo ione fluoruro disponibili. Le ragioni per la variabilità nelle esposizioni HFA da media exchange con diluizioni saline HFA non sono completamente chiare. In ogni caso, metodi di esposizione utilizzando diluizioni saline per HFA erano abbandonati e non esplorati per CP. La tossicità del nostro diluizioni HFA in mezzo probabilmente strettamente imita gli studi facendo uso di fluoruro di sodio perché medium delle cellule buffer il protone libero nel nostro diluizioni HFA.

Altre sfide che abbiamo incontrato erano legate alla raffinatezza dei modelli di coltura cellulare per l'uso in HTS Ci è sembrato necessario modificare i costituenti di terreno di coltura delle cellule per le celle di sperimentazione, in particolare l'idrocortisone e antibiotici. Abbiamo utilizzato un basso livello di idrocortisone (0,5 µ g/mL) durante gli studi di esposizione per sopprimere il picco occasionale nella produzione di citochina visto in ingenuo SV40-HCEC. Questa bassa quantità di idrocortisone non ha colpito avversamente le risposte delle cellule al tossico ed era di sotto livelli in genere usati per sopprimere la produzione di citochine dalle cellule coltivate in risposta a stimolante36,37. Non si conoscono i motivi esatti perché le cellule naive SV40-HCEC occasionalmente producono citochine in eccesso, ma è possibile che le cellule sono variabilmente sensibile ai fattori di stress minori che si verificano durante la cella di passaggio e di placcatura. Molti laboratori sono ordinariamente antibiotici in mezzo di manutenzione di coltura cellulare, ma alcuni antibiotici, tetracicline, in particolare, sono state indicate per esibire gli effetti anti-infiammatori sulle cellule coltivate tra cui cellule epiteliali corneali38. In generale, il nostro laboratorio evita l'uso di antibiotici quando possibile, poiché questi possono potenzialmente confondere gli studi. Inoltre abbiamo studiato la deriva fenotipica sopra passaggi multipli delle nostre cellule in coltura. È comune per le cellule immortalizzate per subire deriva genetica e/o fenotipica sopra passaggi multipli, se non mantenute nella fase esponenziale, in se di raggiungere confluency, o se esposti a determinati fattori di stress ambientale39,40 ,41. Pertanto, è fondamentale durante un schermo di throughput elevato che le linee cellulari sono adeguatamente mantenute e che lo schermo viene completato utilizzando numeri di passaggio delle cellule che mantengono la risposta fenotipica conosciuta. Effetti di bordo piastra multi-pozzetto è il fenomeno che le cellule coltivate in pozzetti di piastre multi-pozzetto perimetro esterno spesso non rispondono lo stesso o con la stessa consistenza le cellule coltivate in interni pozzi42. Ci sono esercizi di statistici, come il mediano polacco, che possono essere utilizzate per ridurre al minimo gli effetti di bordo su un set di dati43. Tuttavia, non esiste nessun esercizio statistico che può eliminare effetti di bordo su un obiettivo particolare o un controllo, se è sempre testato in un pozzo di bordo e variando il layout di piastra tra replica per spostare gli obiettivi o i controlli al largo di pozzi di bordo non è logisticamente pratico o costo effettivo. È nostra opinione che la decisione di includere l'uso dei pozzi di bordo nelle analisi cell-based di HTS dovrebbe essere fatto con cautela. Ci è sembrato necessario per eliminare l'uso di cellule cresciute in pozzi di bordo per i controlli e gli obiettivi.

La nostra metodologia HTS modello e l'esposizione di cellule per in vitro lesioni HF è stato utilizzato per completare con successo lo schermo primario siRNA di 3120 bersagli. SSMD è stato utilizzato per la selezione ha colpito perché è stato proposto in modo specifico per misurare la grandezza della differenza tra un controllo e un siRNA27. I nostri risultati per attuabilità delle cellule indicano che c'era una relazione lineare nella trama dual-torcia tra SSMD e piega-cambiamento per praticamente tutti gli obiettivi. Per questo motivo, abbiamo usato l'unico criterio di SSMD per colpire selezione per questo endpoint. I dati di IL-8 ha differito da in quanto alcuni obiettivi ha avuto effetti deboli ma costanti, mentre altri hanno mostrato effetti forti ma incoerenti. Di conseguenza, abbiamo usato sia piega-cambiamento e SSMD per i criteri di selezione hit per questo endpoint. I valori SSMD utilizzati per colpire selezione per entrambi la vitalità cellulare e dati di IL-8 sono stati scelti perché tagli tra 1 e 1.645 (o -1 e-1.65) ottenere basso scoperta falsa e non-scoperta tariffe44. C'erano alcuni obiettivi che sono stati successi in dati di IL-8 sia la vitalità cellulare. In questi casi, è stata data la preferenza per l'inclusione nella libreria di deconvoluzione al conseguimento degli obiettivi che ha esercitato i loro effetti nella stessa direzione di migliorare la salute generale (una migliore redditività e in diminuzione di IL-8) o esacerbare la ferita (morte aumentata delle cellule e aumentato IL-8). Nel complesso, abbiamo selezionato un totale di 250 destinazioni tra l'attuabilità delle cellule e gli endpoint di IL-8 per rendere la libreria di deconvoluzione per infortunio di HF. La schermata principale per la ferita in vitro CP è in corso.

In sintesi, abbiamo sviluppato l'esposizione e la cultura condizioni idonee per lo studio HTS della ferita oculare di HF e CP. Diverse variabili in condizioni di esposizione e la cultura sono state raffinate e ottimizzate, e i modelli sono stati convalidati per essere adatto a studi HTS di Z' analisi dei fattori. Abbiamo ulteriormente dimostrato l'utilità di questi modelli completando la schermata principale di una libreria di siRNA nel modello HF. Ci sono molti infortuni e malattie che sono di no o limitato interesse farmaceutico o industria biotech, lesioni tossico di CP e HF incluso e l'avvento della robotica benchtop facilita lo studio HTS di infortuni e malattie in qualsiasi laboratorio . Dati genomici elevato throughput insiemi possono notevolmente contribuire alla comprensione dei ruoli che specifici geni giocano a infortunio o malattia che può aiutare a concentrarsi in modo più efficiente seguono gli studi in vitro o in vivo .

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

DISCLAIMER: le opinioni espresse in questo articolo sono quelle degli autori e non riflettono la politica ufficiale del dipartimento dell'esercito, dipartimento della difesa o il governo degli Stati Uniti. Questa ricerca è stata sostenuta da un accordo tra agenzie tra NIH/NIAID e il USAMRICD e in parte da un appuntamento per il programma di partecipazione di ricerca post-laurea presso esercito medico Research Institute della chimica difesa amministrata dal rovere Istituto di crinale per scienza e formazione attraverso un accordo tra agenzie tra l'US Department of Energy e USAMRMC.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta dalla nazionale istituti di salute contrastare programma Interagency accordo # AOD13015-001. Vorremmo ringraziare Stephanie Froberg e Peter Hurst per l'impegno e la competenza sulla produzione video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bravo liquid handing platform Agilent or equivalent G5409A
Bravo plate shaker Agilent or equivalent Option 159
Bravo 96LT disposable tip head Agilent or equivalent Option 178 96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 177 96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 179 384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
EnSpire multimode plate reader Perkin Elmer or equivalent 2300-0000 AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit  Perkin Elmer or equivalent AL224F no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates Perkin Elmer or equivalent 6008359
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen or equivalent 13778500 Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium Invitrogen or equivalent 31985070
TrypLE Express Gibco or equivalent 12605010 Cell detachment solution
IncuCyte Zoom Essen Instruments or equivalent ESSEN BIOSCI 4473 Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin Trinity Manufacturing or equivalent N/A Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium Invitrogen or equivalent 11330-057 Contains HEPES
Fetal bovine serum Invitrogen or equivalent 1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade) Invitrogen or equivalent E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 15140122
Hydrocortisone (cell culture grade) Sigma or equivalent H0888-10G
Glucose  (cell culture grade) Sigma or equivalent G7021
PBS  (cell culture grade) Sigma or equivalent P5493
siRNA Dharmacon or equivalent various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide Sigma or equivalent M5655 MTT assay substrate
siRNA buffer Thermo or equivalent B002000
96-well cell culture plates Corning or equivalent CLS3595
T150 cell culture flasks Corning or equivalent CLS430825
BSL-2 cell culture hood Nuaire or equivalent NU-540
300 mL robotic reservoirs Thermo or equivalent 12-565-572 
96 baffled automation reservoirs Thermo or equivalent 1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles Corning or equivalent CLS430282
Microplate heat sealer Thermo or equivalent AB-1443A
Microplate heat sealing foil Thermo or equivalent AB-0475
Cardamonin Tocris or equivalent 2509 Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002  Tocris or equivalent 2008 Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO Sigma or equivalent D8418
48% hydrofluoric acid Sigma or equivalent 339261 Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014382
200 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014391
20 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014392
1000 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17014497
200 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013810
20 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013808
Pipettor tips 1000 μL Rainin or equivalent 17002920
Pipettor tips 200 μL Rainin or equivalent 17014294
Pipettor tips 20 μL Rainin or equivalent 17002928
Chemical fume hood Jamestown Metal Products MHCO_229
384-well sample storage plates Thermo or equivalent 262261
Sodium chloride Sigma or equivalent S6191
50 mL conical tubes Thermo or equivalent 14-959-49A
Serological pipettes 50 mL Corning or equivalent 07-200-576
Serological pipettes 25 mL Corning or equivalent 07-200-575
Serological pipettes 10 mL Corning or equivalent 07-200-574
Serological pipettes 5 mL Corning or equivalent 07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells N/A N/A These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter Millipore or equivalent PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument Affymetrix or equivalent 00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates Affymetrix or equivalent 901257; 901434
Draegger tube HF Draeger or equivalent 8103251
Draegger tube CP Draeger or equivalent 8103421
Draegger pump Draeger or equivalent 6400000
Clear Plate seals Resesarch Products International or Equivalent 202502
Reagent reservoirs VistaLab Technologies or equivalent 3054-1000
Xlfit IDBS or equivalent N/A Excel add-in used for automated curve fitting

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Biologia problema 136 cloropicrina fluoruro dell'idrogeno cellule epiteliali corneali lesione corneale siRNA screening su vasta scala
High Throughput Screening SiRNA per lesione delle cellule epiteliali cloropicrina e Cornea indotta da acido fluoridrico
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Lehman, J. G., Causey, R. D., LaGrasta, C. V., Ruff, A. L. High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury. J. Vis. Exp. (136), e57372, doi:10.3791/57372 (2018).

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