Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hoher Durchsatz SiRNA Screening für Chlorpikrin und Fluorwasserstoff-induzierte Hornhaut Epithelzelle Verletzungen

Published: June 16, 2018 doi: 10.3791/57372
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1US Army Medical Research Institute of Chemical Defense

Summary

Hoher Durchsatz kleine hemmende RNA-Screening ist ein wichtiges Instrument, das dazu beitragen könnten, um die molekularen Mechanismen der chemischen Hornhaut epithelialen Verletzungen schneller zu erhellen. Hier präsentieren wir Ihnen die Entwicklung und Validierung der Expositionsmodelle und Methoden für das Hochdurchsatz-Screening von Fluorwasserstoff und Chlorpikrin induzierte Hornhaut epitheliale Schädigung.

Abstract

Schlüpfzeit-induzierte augenfällige Verletzungen ist ein wahre okuläre Notfall weil Chemikalien das Potenzial haben, schnell erheblichen Gewebeschäden verursachen. Behandlungen für Schlüpfzeit-induzierte Verletzung der Hornhaut sind generell unterstützt, da es keine spezifische Therapie gibt um diese Verletzungen zu behandeln. Bei den Bemühungen um Behandlungen und Therapeutika zur Betreuung der Exposition zu entwickeln kann es wichtig zu verstehen, die molekularen und zellulären Mechanismen dieser Verletzungen sein. Schlagen wir die Nutzung der hohen Durchsatz kleine hemmende RNA (SiRNA) Screening ein wichtiges Instrument sein kann, das dazu beitragen könnten, um die molekularen Mechanismen der chemischen Hornhaut epithelialen Verletzungen schneller zu erhellen. SiRNA sind doppelte gestrandete RNA-Moleküle, die 19-25 Nukleotide lang und nutzen die posttranskriptionelle gen-silencing Weg, um mRNA zu degradieren die Homologie, die SiRNA haben. Die daraus resultierende Verringerung der Expression von bestimmten Genen kann dann im vergiftendes exponierten Zellen zu prüfen, die Funktion dieses Gens in die zelluläre Antwort auf die Schlüpfzeit untersucht werden. Die Entwicklung und Validierung von in-vitro- Expositionsmodelle und Methoden für die Hochdurchsatz-screening (HTS) von Fluorwasserstoff (HF) und Chlorpikrin-(CP) induzierte augenfällige Verletzungen werden in diesem Artikel vorgestellt. Obwohl wir diese zwei Giftstoffe ausgewählt haben, sind unsere Methoden auf die Studie von anderen Schadstoffen mit geringfügigen Änderungen des Protokolls vergiftendes Exposition anwendbar. Das SV40 große T Antigen verewigt menschlichen Hornhaut epithelialen Zellinie SV40-HCEC für die Studie ausgewählt wurde. Zellviabilität und IL-8 Produktion wurden als Endpunkte in der Screening-Protokoll ausgewählt. Mehrere Herausforderungen im Zusammenhang mit der Entwicklung von giftigen Belichtung und Zelle Kulturmethoden geeignet für HTS-Studien werden präsentiert. Die Einrichtung von HTS-Modelle für diese Giftstoffe kann für weitere Studien, den Mechanismus der Schädigung und zum Bildschirm für potenzielle Therapeutika für chemische augenfällige Verletzungen besser zu verstehen.

Introduction

Schlüpfzeit-induzierte augenfällige Verletzungen ist ein wahre okuläre Notfall weil Chemikalien das Potenzial haben, schnell erheblichen Gewebeschäden verursachen. Leider sind Behandlungen für Schlüpfzeit-induzierte Verletzung der Hornhaut nur generell unterstützt, da es keine spezifische Therapie gibt um diese Verletzungen zu behandeln. Die aktuellen Behandlungsstrategie ist unspezifisch und umfasst in erster Linie topische Therapien wie Schmierstoffe, Antibiotika, und Cycloplegics gefolgt von Antiphlogistika (z.B. Steroide) einmal die Hornhaut hat wieder epithelialized1 ,2. Trotz der besten aktuellen therapeutischen Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung ist Langzeit-Prognose im Allgemeinen schlecht durch progressive Trübung der Hornhaut und Neovaskularisation2,3.

Tiermodelle haben traditionell verwendet, um chemische Toxizität zu untersuchen und Mechanismen der Schädigung zu verstehen. Tierversuche sind jedoch zeitaufwendig und teuer. Auch gibt es Bestrebungen, Tierversuche zu reduzieren. REACH-Verordnung (EG 1907/2006) in der Europäischen Union hat beispielsweise Vorschriften zur Tierversuche reduzieren. Die Bestimmungen enthalten die Forderung, dass Firmen Daten austauschen, zur Vermeidung von tierischen Prüfung und Billigung der Europäischen Chemikalien Agentur vor dem vorgeschlagenen Tests an Tieren durchführen. Gemäß den Bestimmungen der REACH-Verordnung sollten Tierversuche ein letztes Mittel sein. Außerdem gibt es die Europäische Kosmetik-Verordnung (EG 1223/2009), die die Tests von Kosmetika an Tieren auslaufen. Wenn Tierversuche durchgeführt werden, sie orientieren sich an den Grundsätzen der 3R (Verfeinerung, Minderung und Ersatz), die einen Rahmen für humanere Tierversuche durchführen, Verringerung der Zahl der verwendeten Tiere und mit tierversuchsfreien Alternativen bieten wo möglich. Aus diesen Gründen hat das Gebiet der Toxikologie versucht, in-vitro- Assays beschließen, die können Einblick in die molekularen Mechanismen der Toxizität und kann in höheren Durchsatz4durchgeführt werden. Dies ist ein funktioneller Toxikologie Ansatz, wo Giftstoffe werden durch ihre Funktion nicht allein durch ihre Chemie definiert. Genommen einen Schritt weiter, funktionelle basolaterale versuchen, die Rollen zu verstehen, die bestimmte Gene in den Effekten von Schadstoffen5spielen. Mit der Anwendung der SiRNA-Technologie können bei hohem Durchsatz Bildschirme Genfunktion in der molekularen und zellulären Reaktionen auf Giftstoffe untersuchen erfolgen. SiRNA sind doppelte gestrandete RNA-Moleküle, die 19-25 Nukleotide lang, das Nutzen der Post transkriptionellen Gen-Silencing-Weg in allen Säugetierzellen6vorhanden sind. Diese sind synthetisch hergestellt und entwickelt, um ein bestimmtes Gen Ziel. Die SiRNA wird verarbeitet, wenn Sie in einer Zelle eingeführt, und ein Strang, der Führer-Strang in der RNA-induced silencing-Komplex (RISC) geladen wird. Die SiRNA lenkt das Risiko auf eine ergänzende Region in einem mRNA-Molekül und die RISC verschlechtert die mRNA. Dies führt bei der Verringerung der Expression von bestimmten Genen. Die daraus resultierende Verringerung der Expression von bestimmten Genen kann dann im vergiftendes exponierten Zellen zu prüfen, die Funktion dieses Gens in die zelluläre Antwort auf die Schlüpfzeit untersucht werden. Ein solcher Ansatz wurde verwendet, um weiter zu verstehen, die Mechanismen der Ricin Anfälligkeit und die AHR-abhängige Induktion von CYP1A17,8.

Die chemische Terrorismus Risk Assessment (CTRA) Liste und toxische Industriechemikalien (TIC) Inserate haben ausgewählte Chemikalien aufgrund ihrer Toxizität und Potenzial, während ein Terrorist, Kriegsführung oder Arbeitsunfall Event9freigegeben werden aufgeschlüsselt. Wir wenden eine SiRNA Hochdurchsatz screening (HTS) toxikogenomische Ansatz für die Untersuchung von CTRA Liste Schadstoffen, die mit hohem Risiko für Gebrauch in einem terroristischen Anschlags sein identifiziert wurden. Traditionelle Toxikologie versucht, die negativen Auswirkungen zu verstehen, die Chemikalien auf lebende Organismen haben; Allerdings haben wir einen weiteren Wunsch zu verstehen, die Mechanismen der Schädigung zur Information der Entwicklung von Therapeutika und therapeutische Ansätze und möglicherweise, entdecken Sie Moleküle, die für die therapeutische Entwicklung ausgerichtet werden können. Diese Anstrengung in gewisser Weise kann analog zu den Einsatz von Hochdurchsatz-SiRNA-Screening und zellbasierte Assays in Drug Discovery Prozess10angesehen werden. Ein wesentlicher Unterschied wäre, dass diese Drogeentdeckung in der Regel ein einzigartiges Ziel für therapeutische Entdeckung sucht, in unserem Ansatz ist es eher unwahrscheinlich, daß wäre ein einzigartiges Ziel mit hohem therapeutischen Wert für die Behandlung von giftigen Belichtung. Wir gehen davon aus, dass wirksame behandlungsparadigma für vergiftendes Exposition einen vielschichtigen Ansatz erfordern würde, hohen therapeutischen Wert zu erreichen, und toxikogenomischen Daten können eine wirksame behandlungsparadigma von entscheidender informieren.

Benchtop Automatisierung bringt Hochdurchsatz-Methodik in Laboratorien außerhalb der Pharma- oder Biotech-Industrie. Die in-vitro- Studien an unserem Institut wurden historisch traditioneller Assays sind niedriger Durchsatz11,12,13. In den letzten Jahren hat unser Labor die Verwendung der Benchtop-Robotik, hoher Durchsatz SiRNA Screening durchzuführen umgestellt. Hier präsentieren wir die Verfeinerung der okulären zellmodelle und die Entwicklung von in-vitro- Belichtungsmethoden für Fluorwasserstoff (HF) und Chlorpikrin (CP) für hohen Durchsatz SiRNA Screening geeignet. Unser Ziel ist es, Moleküle zu identifizieren, die zelluläre Verletzungen als Reaktion auf diese Giftstoffe zu regulieren. Die SiRNA-Bibliothek von die uns ausgewählten Gehören G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, Proteinkinasen, Proteasen, Phosphatasen, Ionenkanäle und andere potenziell druggable Ziele. HF und CP wurden für die Studie von Querverweise CTRA Liste Agenten mit den ToxNet Berichten von Arbeitsunfällen, diejenigen zu finden, die das größte Risiko der okulären Verletzung über Dampf Exposition9,14präsentieren. CP (chemische Formel Cl3CNO2, CAS-Nummer 76-06-2) wurde ursprünglich als ein Tränengas in WWI15verwendet. Es wird derzeit als eine landwirtschaftliche Räuchermittel und Funktionen als ein Nematizide, Fungizid und Insektizid16verwendet. Fluorwasserstoff (HF) wird in Prozesse einschließlich der Alkylierung in Ölraffinerien und elektrochemische Fluorierung von organischen Verbindungen17verwendet. HF (chemische Formel HF, CAS-Nummer 62778-11-4) ist ein Gas, aber in ihrer wässrigen Form ist Flusssäure (HFA, CAS Nr. 7664-39-3). Daher wir gewählt, um HFA in unserer in Zelle Expositionsmodelle. Das SV40 große T Antigen verewigt menschlichen Hornhaut epithelialen Zellinie SV40-HCEC für die Studie ausgewählt wurde. Zellviabilität und entzündlichen Marker IL-8 wurden als Endpunkte ausgewählt, weil Ziele, die zelluläre Verletzungen beteiligt sind in den Zelltod und die entzündliche Reaktion niederschlagen sollte. Insbesondere sollte ein Ziel in vergiftendes Exposition eine schützende Rolle spielen, sollten Zelltod und/oder Produktion von inflammatorischen Zytokinen erhöhen, wenn der Zielausdruck von SiRNA gehemmt wird. Das Gegenteil wäre auch für Ziele, die eine negative Rolle spielen. Chronischer Entzündung scheint auch eine Rolle in der Pathologie der Hornhaut nach Exposition und Intervention in der Zelle Tod wegen Therapieergebnis2,18verbessern kann.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

(1) Zelle Kultur Wartung

  1. Wachsen die Zellinie SV40-HCEC bei 37 ° C, 5 % CO2und 90 % Luftfeuchtigkeit in DMEM F-12 mit 15 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % L-Glutamin, 10 µg/L epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und 5 mg/L Insulin.
  2. Durchgang der Zell-Linie alle 3 bis 4 Tage (je nach Aussaatdichte) um sicherzustellen, dass Konfluenz nie größer 80 % bei der Wartung der Kultur als.
  3. Die Zellen von Flaschen mit einem Detachement (14 mL Lösung für jede 150 cm2 Kolben) und Inkubation bei 37 ° C für nicht mehr als 8 min zu lösen.
  4. Die Ablösung Lösung mit einem gleichen Volumen Zellkulturmedium zu neutralisieren und pellet-Zellen in 50 mL konische Röhrchen durch Zentrifugation für 7 min bei 160 X g.
  5. Wieder aussetzen der Zelle Pellet in Medium (20 mL für jede 150 cm2 Kolben).
  6. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten handheld Handy Zähler und Samen in neuen Flaschen in einer Dichte, die ihnen ermöglichen, für 3 bis 4 Tagen zu wachsen, ohne mehr als 80 % Konfluenz.

2. Platte Zellen für Experimente

  1. Überprüfen Sie, Fläschchen des SV40-HCECs durch leichte Phasenkontrastmikroskopie um sicherzustellen, dass Konfluenz ist weniger als 80 % und allgemeine Zellgesundheit zu bewerten.
  2. Lösen, pellet, aufschwemmen und zählen SV40-HCECs aus Kolben wie in 1,3 bis 1,6 Zelle Kultur Wartung beschrieben. Verwenden Sie SV40-HCEC 0,5 µg/mL Hydrocortison (HCORT Mittel)-haltigem Medium, um Zellen zu Aufschwemmen.
  3. Bereiten Sie in einer Einweg-mittlere Flasche eine Aussetzung der SV40-HCECs bei 17.857 Zellen/mL in vorgewärmten HCORT Medium.
    1. Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen der Zellsuspension für die Anzahl der Platten gesät werden.
    2. Säen Sie ein Minimum von 14 x 96-Well-Platten mit Zellen für jedes SiRNA-Bibliothek-Platte untersucht werden.
  4. Schwenken Sie die Flasche, um gleichmäßig Anhalten der Zellen, Gießen ein ausreichendes Volumen an die Zellsuspension in einem Stausee auf dem Orbitalschüttler Nest eines automatisierten liquid-Handlers und speichern Sie die Flasche mit der Zellsuspension auf einem 37 ° C Erwärmung Platte in die Zelle-Beschichtung Prozesses.
  5. Verwenden Sie die automatisierte liquiden Handler Platten bei einer Dichte von 1000 Zellen pro Bohrloch (5000 Zellen/cm2) in 70 µL Medium pro Bohrloch einer 96-Well-Platte Zellen hinzu. Verwenden Sie ein 50 µL/s pipettieren Geschwindigkeit für alle Schritte.
    1. Führen Sie die Orbitalschüttler bei 100 u/min, ständig bei der Aussaat.
    2. Mischen Sie die Zellsuspension drei Zeiten (140 µL Mix Volume) mit Hilfe des automatisierten liquiden Handlers.
    3. Aspirieren Sie 140 µL Zellsuspension und verzichten Sie 70 µL in jede Vertiefung der beiden Zellplatten Kultur zu.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 2.5.3 und 2.5.4, bis alle Platten mit Zellen ausgesät worden sind.
    5. Nachfüllen der Zelle Aussetzung Reservoir bei Bedarf bei der Aussaat.
  6. Nachdem die Platten ausgesät haben, entfernen Sie sie aus der automatisierten liquid Handler und inkubieren sie für 30 min bei Raumtemperatur vor der Übertragung in eine Zelle Kultur Inkubator.
  7. Bewerten Sie die Zelldichte von jedem gut für jede Platte am nächsten Morgen mit einem automatisierten imaging System befindet sich in einer Zelle Kultur Inkubator und die Studie die inneren Brunnen haben, die nicht zwischen 15 % und 22 % Zusammenfluss sind alle Platten ausschließen.

(3) transfect Zellen mit siRNA

  1. SiRNA Bibliothek Platten vom Anbieter vorkonfiguriert um 80 SiRNA Ziele pro Platte enthalten zu erwerben (siehe Abbildung 4), mit Spalten 1 und 12 leer gelassen.
  2. Bereiten Sie die SiRNA-Bibliothek-Platte mit SiRNA-Puffer, um eine Endkonzentration von 2 Pmol/µL für jede Vertiefung von SiRNA gemäß des Herstellers Anweisungen19.
  3. Transfizieren Sie die Zellen 24 h nach der Aussaat mit 4 Pmol/Brunnen von SiRNA und 0,3 µL/Well Transfection Reagens. Führen Sie alle Schritte nach der Transfektion Reagens Hersteller-Protokoll (siehe Abbildung 4 Platte Layout)20.
    1. Führen Sie alle die Transfektionen mit einem automatisierten liquid Handler, und verwenden Sie eine 25 µL/s pipettieren Geschwindigkeit für alle Schritte. Verwenden Sie vorkonfigurierte Tip-Boxen ansprechen nur die Brunnen, die transfiziert werden wird.
    2. Verwenden der oberen Hälfte der Bibliothek-Platte auf eine Reihe von sechs replizieren Platten transfizieren als das "Top-Platte-Set bezeichnet" (sechs Wiederholungen pro SiRNA, n = 6).
    3. Verwenden Sie die untere Hälfte der Bibliothek Platte an einen anderen Satz von sechs replizieren Platten transfizieren als das "untere Platte Set bezeichnet" (sechs Wiederholungen pro SiRNA, n = 6).
    4. Verwenden Sie den Begriff "Volle Teller Set" 12 Zellplatten beschreiben, die mit Bibliothek SiRNA transfiziert wurden.
    5. Transfizieren Sie Brunnen B2-B6 alle Platten im vollen Teller-Set mit negativen Pool SiRNA, nachdem alle oberen und unteren Platte-Sets mit Bibliothek SiRNA transfiziert wurden haben.
    6. Auch transfizieren Sie Brunnen B2-B6 ein weiteres zweier Platten, die Bibliothek SiRNA nicht empfangen können und wird als unbelichtete Steuerelemente (eine für die obere Platte gesetzt) und eine für die untere Platte Set, mit negativen Pool SiRNA dienen.
  4. Inkubieren Sie alle Zellplatten in eine Zelle-Kultur-Inkubator für 4 Stunden, nachdem alle Transfektion Mischungen hinzugefügt wurden und Mix durch sanftes antippen jede Stunde.
  5. Einsatz einer automatisierten liquid Handler alle Vertiefungen der Platten zweimal mit vorgewärmten HCORT Medium zu waschen verdünnt 1:5 mit PBS-Puffer. Verwenden Sie ein 50 µL/s pipettieren Geschwindigkeit für alle Schritte.
    1. Aspirieren Sie 100 µL aus jedem Brunnen und verwerfen Sie, die zu einem Abfall Reservoir.
    2. Geben Sie in jedes gut 100 µL/vorgewärmte HCORT Medium verdünnt 1:5 in PBS, die in einem anderen Behälter in ausreichendem Umfang für die Anzahl der Platten enthalten ist.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 3.5.1 und 3.5.2 für jede Platte.
      1. Entleeren Sie Abwasser Behälter, je nach Bedarf.
      2. Nachfüllen der Stausee mit HCORT Medium verdünnt 1:5 mit PBS-Puffer nach Bedarf.
    4. Aspirieren Sie 100 µL aus jedem Brunnen und verwerfen Sie, die in den Abfall-Behälter.
  6. Refeed alle Vertiefungen der Platten mit 100 µL/Well vorgewärmten HCORT Medium, das in einem anderen Behälter in ausreichendem Umfang Mittel für die Anzahl der Platten enthalten ist.
    1. Füllen Sie das Reservoir mit Medium, je nach Bedarf.
  7. Verwenden Sie Brunnen C2-C6 alle Platten als Steuerelemente nicht transfiziert.
  8. Halten Sie Brunnen B7-B11 und C7-C11 alle Platten transfiziert um als Droge und Fahrzeug-Regler für vergiftendes Exposition verwendet werden.

(4) den Zellen refeed folgende Tag

  1. Verwenden Sie einen automatisierte liquiden Handler, um refeed alle Vertiefungen der Platten. Verwenden Sie ein 50 µL/s pipettieren Geschwindigkeit für alle Schritte.
    1. Aspirieren Sie 100 µL aus jedem Brunnen und verwerfen Sie, die zu einem Abfall Reservoir.
    2. Refeed jeweils gut mit 100 µL/Well vorgewärmten HCORT Medium, das in einem anderen Behälter enthalten ist und hat ein ausreichendes Volumen des Mediums für die Anzahl der Platten zu refed werden.
    3. Wiederholen Sie 4.1.1 und 4.1.2 Bedarf refeed alle Zellplatten.
      1. Entleeren Sie Abwasser Behälter, je nach Bedarf.
      2. Füllen Sie das Reservoir mit Medium, je nach Bedarf.

5. positive Kontrolle Ergänzung

  1. Bereiten Sie zwei Tage nach der Transfektion und zwei Stunden vor der Belichtung, eine 62,5 µM-Lösung der Positivkontrolle cadamonin in HCORT Medium für HFA Belichtungen verwendet werden und Zeile B eines 8-reihige Verdünnung Reservoirs hinzufügen.
    1. Für CP Belichtung vorzubereiten und eine 25 µM-Lösung von SKF 86002 verwenden.
    2. Bereiten Sie ein Volumen von Positivkontrolle ausreichend für die Anzahl der Platten getestet werden.
  2. Bereiten Sie eine 0,625 % Lösung von DMSO in HCORT Medium (Fahrzeugkontrolle) und Reihe C des gleichen Reservoirs hinzufügen.
    1. Bereiten Sie für CP-Exposition vor und verwenden Sie eine 0,5 % ige Lösung von DMSO.
    2. Bereiten Sie ein Volumen von Fahrzeugkontrolle ausreichend für die Anzahl der Platten getestet werden.
  3. Einsatz der automatisierten liquidere Handler Brunnen B7-B11 und C7-C11 jeder Zelle Platte positiv und Fahrzeug Steuerelemente hinzu und verwenden Sie ein 50 µL/s pipettieren Geschwindigkeit für alle Schritte. Verwenden Sie vorkonfigurierte Tip-Boxen an nur die Brunnen, die die Steuerelemente positiv und Fahrzeug erhalten.
    1. Entfernen Sie 10 µL Medium aus Brunnen B7-B11 und C7-C11 jeder Zelle Platte und entsorgen Sie es in Zeilen, G und H des 8-reihige Verdünnung Reservoirs.
    2. 10 µL der Steuerelemente positiv und Fahrzeug in diese Vertiefungen zu übertragen und 3 mal mischen.
  4. Diese Zelle Platten in den Inkubator zurück.
  5. Wiederholen Sie Schritte 5.3, 5.4, bis alle Zellplatten positive erhalten haben und Fahrzeug-Kontrollen.

6. HF-Exposition von kultivierten Zellen

Achtung: HFA ist ätzend und akut toxisch.

  1. Operationen Sie alle Exposition gegenüber chemischen Stoffen in einem chemischen Abzug Doppel Nitril-Handschuhe, ein Laborkittel, Einweg-Polyäthylen Hülse Protektoren und Schutzbrille tragen.
    1. HFA als 48 % Lösung zu erwerben.
    2. HFA 1 % mit Reinstwasser zu verdünnen und speichern in 5 mL Aliquots in 10 mL dickwandigen Polyethylen Fläschchen zur Verbesserung der Sicherheit.
    3. Dekontaminieren Sie Pipettenspitzen und Stauseen, die mit HFA und jede übrig gebliebene Flüssigkeit HFA mit 2,5 % Kalzium Gluconat vor der Entsorgung in den gefährlichen Abfällen Strom in Berührung gekommen sind.
  2. Für jede SiRNA-Bibliothek-Platte untersucht, bereiten die 0.0036 % HFA mittlere Lösung durch Zugabe von 1 % 288 µL HFA, 80 mL vorgewärmten HCORT Medium in einer 150 mL Flasche.
    1. Schwenken Sie die Flasche und inkubieren Sie die verdünnte HFA in einem Inkubator 37 ° C in der chemischen Dampfhaube für 10 min.
  3. Mischen Sie die HFA mittlere Lösung wieder durch Schütteln der Flaschenhals und die HFA mittlere Lösung mit einem Reagenz Reservoir auf einer Warmhalteplatte.
  4. Führen Sie die Belichtung mit zwei Techniker arbeiten im Tandem.
    1. Den Techniker auf die richtige aspirat 100 µL aus jedem der inneren Brunnen einer Zelle Platte mit einem 12-Kanal-Pipette und übergeben Sie die Platte an dem Techniker auf der linken Seite.
    2. Haben Sie die Techniker auf der linken Seite 100 µL pro Bohrloch der HFA mittlere Lösung hinzufügen.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 6.4.1 und 6.4.2 für alle Zellplatten, die Schlüpfzeit ausgesetzt werden.
    4. Auch wiederholen Sie die Schritte 6.4.1 und 6.4.2 für unbelichteten Steuerplatten, frisches HCORT Medium anstatt die HFA mittlere Lösung nutzen.
  5. Legen Sie die Platten in den chemischen Rauch Haube Inkubator für 20 min und dann wieder in die Zelle Kultur Inkubator.
  6. Wiederholen Sie die Positivkontrolle Zusatz Schritt (Schritte 5.1 bis 5.5) wie zuvor gezeigt, sobald alle Platten wurden ausgesetzt und kehrte in die Zelle-Kultur-Inkubator.

(7) CP Exposition von kultivierten Zellen

Achtung: CP ist akut giftig und reizend.

  1. Operationen Sie alle Exposition gegenüber chemischen Stoffen in einem chemischen Abzug Doppel Nitril-Handschuhe, ein Laborkittel, Einweg-Polyäthylen Hülse Protektoren und Schutzbrille tragen.
    1. CP zu erwerben.
    2. CP auf 5 % DMSO zu verdünnen und speichern in 10 mL Aliquots in 10 mL Funkeln Fläschchen zur Verbesserung der Sicherheit.
    3. Dekontaminieren Sie Pipettenspitzen und Stauseen, die mit CP und jede übrig gebliebene Flüssigkeit CP mit 2,5 % Natrium Bisulfit vor der Entsorgung in den gefährlichen Abfällen Strom in Berührung gekommen sind.
  2. Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen des vorgewärmten HCORT Medium mit 1 x Pen/Strep und vorgewärmten PBS für die Anzahl der Platten ausgesetzt sein.
  3. Fügen Sie für jede Top Platte eingestellt oder Bodenplatte, 8.04 µL 5 % CP in DMSO, eine 50 mL-aliquoten vorgewärmten HCORT Medium und eine CP-Endkonzentration von 0,0008 % gut mischen. Röhrchen Sie das fest und inkubieren Sie die Lösung in einem Inkubator 37 ° C in der chemischen Dampfhaube für 1 h.
    1. Zeit die Ergänzung des CP 50 mL Aliquote des Mediums, so dass jeder Top Platte eingestellt ausgesetzt und untere Platte gesetzt erhält Schlüpfzeit genau 1 h nach CP 50 mL Aliquot Medium hinzugefügt wurde.
  4. Entfernen Sie eine Top Platte eingestellt und 1 unbelichteten Steuerplatte aus der Zelle Kultur Inkubator und legen Sie sie in der chemischen Dampfhaube nahe dem Ende der Inkubationszeit.
  5. Mischen Sie die CP-Lösung durch das Rohr zu invertieren und dann mit einem Reagenz Reservoir am Ende der Inkubationszeit 1 h Dekantieren.
  6. Führen Sie die Belichtung mit zwei Techniker arbeiten im Tandem.
    1. Den Techniker auf die richtige aspirat 100 µL aus jedem der inneren Brunnen einer Zelle Platte mit einem 12-Kanal-Pipette und übergeben Sie die Platte an dem Techniker auf der linken Seite.
    2. Haben Sie die Techniker auf der linken Seite 100 µL pro Bohrloch der CP mittlere Lösung hinzufügen.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 7.6.1 und 7.6.2 für alle Zellplatten des Top-Platte-Sets Schlüpfzeit ausgesetzt werden.
    4. Wiederholen Sie auch 7.6.1 und 7.6.2 für unbelichteten Steuerplatten, frisches HCORT Medium anstatt die CP mittlere Lösung nutzen.
  7. Legen Sie die Platten in einem Inkubator 37 ° C in der chemischen Dampfhaube für 10 Minuten.
  8. Fügen Sie ein ausreichendes Volumen an PBS und HCORT Medium mit 1 x Pen/Strep Reagenz Stauseen am Ende der Inkubationszeit 10 min.
  9. Entfernen Sie die CP-Lösung aus Zellplatten mit einem 12-Kanal-Pipette und ersetzen sie mit 100 µL pro Bohrloch von PBS am Ende der Inkubationszeit 10 min.
  10. Sofort die PBS aus Zellplatten entfernen und ersetzen Sie es mit 100 µL pro Bohrloch des HCORT Mediums mit 1 x Pen/Strep.
  11. Auch wiederholen Sie Schritte 7.9 und 7.10 für die unbelichteten Steuerplatten.
  12. Eine Standardzelle Kultur Inkubator die Zellplatten zurückzukehren.
  13. Wiederholen Sie die Schritte 7.3, 7,12 für die untere Platte gesetzt.
  14. Wiederholen Sie die Positivkontrolle Zusatz Schritt (Schritte 5.1 bis 5.5) wie zuvor beschrieben, sobald alle Platten wurden ausgesetzt und kehrte in die Zelle-Kultur-Inkubator.

(8) Probe Sammlung und Zelle Lebensfähigkeit Assay

  1. Vierundzwanzig Stunden nach der Exposition, bereiten Sie eine Lösung von 0,5 mg/mL MTT Substrat in PBS mit 10 g/L Glukose und warm bis 37 ° C21. Bereiten Sie 10 mL Substrat für jede Platte, untersucht werden.
  2. Fügen Sie für die Anzahl der Platten, untersucht werden ein ausreichendes Volumen an MTT Substratlösung zu einem Reservoir auf einem automatisierten liquid Handler hinzu.
  3. Einsatz der automatisierten liquidere Handler Probe sammeln und MTT-Substrat mit einer 50 µL/s pipettieren Geschwindigkeit für alle Schritte. Vorkonfigurieren Sie Tip-Boxen Bewältigung nur jene Brunnen, untersucht werden.
    1. Aspirat 95 µL des Mediums aus dem inneren 60 Brunnen der Zellplatte und Kaution 42,5 µL in jeder der beiden 384-Well Storage Platten.
    2. Sofort die Zellplatten 100 µL pro Bohrloch der MTT-Substrat-Lösung hinzu, und inkubieren sie bei 37 ° C in einer Zelle-Kultur-Inkubator für 1,5 h.
    3. Füllen Sie den Behälter mit MTT Substratlösung nach Bedarf.
  4. Inkubieren Sie die Zelle-Platten bei 37 ° C in einer Zelle Kultur Inkubator für 1 h.
  5. 384-Well Storage Platten versiegeln und bei-80 ° C für spätere Analysen zu speichern.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 8,3 und 8,5 für alle oberen und unteren Platte-Sets und die damit verbundenen unbelichteten Steuerelemente.
    1. Wiederverwenden Sie Tipps auf Wiederholungen, wenn gewünscht, aber waschen Sie sie beim Hinzufügen von MTT Substratlösung und beim Umschalten zwischen Platte setzt.
  7. Fügen Sie nach 1 h Inkubation ein ausreichendes Volumen an DMSO zu einem Reservoir auf einem automatisierten liquid Handler hinzu.
  8. Einsatz der automatisierten liquidere Handler DMSO hinzufügen und verwenden Sie ein 50 µL/s pipettieren Geschwindigkeit für alle Schritte.
    1. Aspirieren Sie 100 µL aus jedem der inneren Brunnen der Zelle Platten und entsorgen Sie MTT-Substratlösung in einen Abfall Behälter.
      1. Entleeren Sie Abwasser Behälter, je nach Bedarf.
    2. Überlagern Sie jedes gut mit 100 µL DMSO.
      1. Füllen Sie das DMSO Reservoir nach Bedarf.
  9. Schütteln Sie die Platten auf einer Platte Shaker für 3 min.
  10. Messen Sie Extinktion bei 570 und 690 nm mit einer Platte Spektralphotometer.
  11. Subtrahieren Sie den Hintergrund und berechnen Sie die Zellviabilität % durch Division der exponierten Absorption Werte durch die unbelichteten Steuerelemente zu. Verwenden Sie die durchschnittliche unbelichteten negative Pool SiRNA-Steuerelement, um % Zellviabilität bei allen Zielen berechnen.

(9) Maßnahme IL-8-Konzentration in der Zelle Kultur Überstände

  1. Messen die Konzentration von IL-8 in der Zelle Kultur Überstände mit einem Nein waschen Bead-based Assays laut des Herstellers Anweisungen22. Erstellen Sie eine Assay Platte Layout um Proben und Standardkurve unterzubringen.
  2. Entfernen Sie die 384-Well Storage Platten aus dem-80 ° C Gefrierschrank, bei Raumtemperatur tauen Sie auf und kurz Zentrifugieren Sie die Platten um die Probe in der Unterseite der Brunnen zu sammeln.
  3. Stellen Sie für die Anzahl der Assay-Platten ausgeführt werden ein ausreichendes Volumen an Anti-IL-8 Akzeptor Perlen und biotinylierte Anti-IL-8 Antikörper in testpuffer im Bausatz enthalten. Verwenden Sie das Verhältnis von 50 µL Anti-IL8 Akzeptor Perlen und 50 µL biotinylierte Antikörper Anti-IL8 9,9 mL testpuffer.
    1. Fügen Sie mithilfe einer Mehrkanal-Pipette Perle/Antikörper Mischung an einer schwarzen 384-Well-Lagerung-Platte.
      1. Die Brunnen, die für den Gebrauch für Proben und Standardkurve nach Assay Platte Layout fügen Sie Akzeptor Perle/Antikörper hinzu.
      2. Fügen Sie ein ausreichendes Volumen pro Bohrloch für die Anzahl der Assay-Platten ausgeführt werden.
  4. Rekonstruieren von IL-8 Standard 1000 Pg/ml mit Zellkulturmedium mit 354 µM NaCl. Machen Sie ein ausreichendes Volumen für die Anzahl der Assay-Platten ausgeführt werden.
  5. Stellen Sie acht zweifache Verdünnungsreihen der Standardkurve.
  6. Fügen Sie der Standardkurve in dreifacher Ausfertigung in die entsprechenden Vertiefungen einer schwarzen 384-Well Storage Platte gemäß der Assay-Platte-Layout. Fügen Sie ein ausreichendes Volumen pro Bohrloch für die Anzahl der Assay-Platten ausgeführt werden.
    1. In ähnlicher Weise hinzufügen Zellkulturmedium mit 354 µM NaCl mit IL-8 für Hintergrundmessung.
  7. Verwenden Sie einen automatisierte liquiden Handler, den Test durchzuführen. Verwenden Sie vorkonfigurierte Tipp Kontrollkästchen, um nur die Brunnen der Assay-Platte-Layout bezeichneten Adresse. Verwenden Sie ein 50 µL/s pipettieren Geschwindigkeit für alle Schritte.
    1. Übertragen Sie 8 µL Akzeptor-Perle-Antikörper-Mischung in die Vertiefungen der weißen flachen 384-Well gut Assay Platten.
      1. Fügen Sie nur in die Vertiefungen für Proben und Standardkurve nach Assay Platte Layout bezeichnet.
    2. Übertragen Sie in die entsprechenden Vertiefungen der flachen gut Assay Platten gemäß der Assay-Platte-Layout 2 µL der Standardkurve.
    3. Zubereiten einer 3,54 M NaCl-Lösung und ein ausreichendes Volumen für die Anzahl der Platten, flachen Stausee auf der automatisierten liquid Handler untersucht werden.
    4. Passen Sie die Salzkonzentration der Proben der Standardkurve angleichen von 4,5 µL NaCl-Lösung auf die Proben in den schwarzen 384-Well Storage Platten übertragen.
    5. Mischen der Proben dreimal mit einem Mischpult Volumen von 30 µL und Transfer 2 µL der Proben zu den weißen flachen assay auch Platten nach der Assay-Platte-Layout.
      1. Ändern Sie Tipps zwischen Musterplatten.
    6. 1 h im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
    7. Stellen Sie für die Anzahl der Assay-Platten ausgeführt werden ein ausreichendes Volumen an Akzeptor Perlen in testpuffer. Verwenden Sie das Verhältnis von 200 µL des sekundären Akzeptor Perlen auf 12,3 mL testpuffer.
    8. Fügen Sie mithilfe einer Mehrkanal-Pipette sekundäre Perlen mit einer schwarzen 384-Well-Lagerung-Platte.
      1. Fügen Sie sekundäre Perlen in die Vertiefungen für den Gebrauch für Proben und Standardkurve nach Assay Platte Layout hinzu.
      2. Fügen Sie ein ausreichendes Volumen pro Bohrloch für die Anzahl der Assay-Platten ausgeführt werden.
    9. Mit der automatisierten liquid Handler übertragen Sie 10 µL der sekundären Perlen in die Vertiefungen der weißen flachen 384-Well gut Assay Platten.
      1. Fügen Sie nur in die Vertiefungen, die Proben und Standardkurve nach Assay Platte Layout erhalten und waschen Sie die Spitzen zwischen jeder Platte.
    10. Noch eine Stunde im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
  8. Der Assay Platten mit klar Platte Dichtungen und Scannen Sie mit einem Teller Reader kompatibel mit dem Assay zu versiegeln. Verwenden Sie 0,2 mm Abstand zwischen Platte und Detektor, 180 ms Erregung Zeit und 550 ms Messzeit für den Scan.
  9. Importieren Sie die raw-Daten aus der IL-8-Assays in eine Tabellenkalkulation.
  10. Verwenden Sie automatische Kurvenanpassung für die Standardkurve von IL-8-Assays, und dann konvertieren Sie die raw-Daten in Pg/mL für jede Probe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Exposition Methodenentwicklung

Wir verfeinert und die Eignung der menschlichen Hornhaut epithelialen Zellinie SV40-HCEC für HTS Studien ausgewertet. SV40-HCEC waren mit dem SV-40 große T Antigen verewigt und waren ein Geschenk von Dhanajay Pal23. Gab es zu viele Variablen in Exposition Methodik Entwicklung prägnant hierin präsentieren erforscht, und so, nur einige Beispiele für Ergebnisse, die wir glauben ganz allgemein anwendbar sind auf mehrere Giftstoffe werden präsentiert.

Vergiftendes Exposition durch Spike oder Datenträgeraustausch

Ursprünglich wollten wir setzen Sie Zellen durch einen 5 µL einer Arbeit Konzentration des Giftstoffs verdünnt in Wasser, Kochsalzlösung oder Medium in 95 µL Medium bereits vorhanden in jeder gut von den Zellen in einer 96-Well-Platte, die letzte gewünschte Expositionskonzentration zu erreichen. SV40-HCEC ausgesetzt waren, über diese Spitze Expose/refeed Methodik, 1 X LD50 der HFA für 24 h (1 X LD50 = 0,02 % HFA durch diese Methode, wenn der HFA-Spike in Medium verdünnt wurde), und Brunnen mit frischem Medium 10 min später refed wurden. Nach 24 Stunden waren die Zellen mit MTT Substrat überlagert, wie oben beschrieben für die Zelle Lebensfähigkeit Assay. Die Bilder wurden von photomicroscopy vor Solubilisierung der Formazan-Kristalle mit DMSO aufgenommen. Genaue Untersuchung der Brunnen hat gezeigt, dass ein hohes Maß an Zelltod wurde an einer Stelle lokalisiert, und dies trotz der Tatsache, dass die Platte für 15 erschüttert wurde s sofort nach der Spitze wurde hinzugefügt, um die gesamte Platte (Abb. 1a). Dieses Phänomen wurde beobachtet, wenn die Spitze an der Unterseite des gut oder wenn hinzugefügten am Meniskus hinzugefügt wurde. Eine höhere Vergrößerung Bild dieses Gebiets mit Phase Kontrast zeigt, die Zellen sind noch vorhanden im Bereich unbefleckt von MTT (Abbildung 1 b). Wir testeten auch ein Datenträgeraustausch Expose/refeed Methodik wo Medium aus dem Brunnen, ersetzt mit Zellkulturmedium, enthält 1 X LD-50 der HFA entfernt wurde (1 X LD50 = 0,035 % HFA durch diese Methode) und Brunnen wurden mit frischen mittlere 10 min refed später. Nach 24 Stunden waren die Zellen mit MTT Substrat überlagert, wie oben beschrieben. Diese Methode erreicht eine anscheinend mehr sogar Zelle Tod Reaktion von Zellen in jedem Bohrloch (Abbildung 1 c und 1D). Unbelichtete Steuerelemente dienen als Referenz und zeigen keine lokalisierten Bereichen des Zelltods (Abb. 1e und 1f). Für CP-Belichtungen ergaben die Spike-Methode kein hohes Maß an Zelltod um eins innerhalb jedes gut lokalisiert; die Zelle Tod Antwort war jedoch konsequenter von einer Iteration zur nächsten mit Datenträgeraustausch belichtungsmethode (Daten nicht gezeigt).

Figure 1
Abbildung 1 : Zelltod ausgelöst durch Spike und Datenträgeraustausch Belichtungsmethoden. Alle Bilder wurden erfassten 1,5 h nach Zugabe von MTT Substrat. Panel (a) ist ein Hellfeld-Bild des SV40-HCEC HFA Spike Expose/refeed Methodik ausgesetzt. Panel (b) ist eine höhere Vergrößerung des gleichen Brunnens im Bedienfeld "(a) mit Phasenkontrast. Feld (c) ist ein Hellfeld-Bild des SV40-HCEC durch Datenträgeraustausch Expose/refeed Methodik ausgesetzt. Panel (d) ist eine höhere Vergrößerung des gleichen Brunnens in Feld (c) mit Phasenkontrast. Panels (e) und (f) sind von einem unbelichteten gut, helle Bereich und Phase Kontrast höhere Vergrößerung, beziehungsweise. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Vergiftendes Stabilität im Medium

Es wurde beobachtet, dass sobald in Medium verdünnt, die scheinbare Zytotoxizität von HF und CP ändert und dann stabilisiert. HFA war in Mittel-bis 0.0036 % verdünnt und Inkubation bei 37 ° C für 1-60 min vor der Freilegung SV40-HCECs, wie oben beschrieben. Für HFA erhöht die Zytotoxizität innerhalb der ersten 5 min, die HFA wird im Medium verdünnt und dann für mindestens eine Stunde (Abbildung 2a) stabil. Einweg-ANOVA gefolgt von Dunnett Multiple-Vergleich-Test zeigte, dass % Zellviabilität überhaupt Zeitpunkte unterschieden sich signifikant von 1 min Zeitpunkt. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen 2,5 bis 60 min Zeitpunkte. CP ist organisch und ist zunächst auf 5 % DMSO verdünnt. Es war dann in Mittel-bis 0,0008 % verdünnt und Inkubation bei 37 ° C für 5-120 min vor Aufdeckung SV40-HCECs, wie oben beschrieben. Sobald im Medium verdünnt, die Zytotoxizität von CP verringert sich über 60 min und dann für mindestens die nächsten h (Abb. 2 b) stabilisiert. Einweg-ANOVA gefolgt von Dunnett Multiple-Vergleich-Test zeigte, dass % Zellviabilität überhaupt Zeitpunkte unterschieden sich signifikant von den 5 min Zeit-Punkt. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen 60 bis 120 min Zeitpunkten.

Figure 2
Abbildung 2 : Vergiftendes Verlust der Zytotoxizität in mittlerer Verdünnungen. Die Daten werden als der Durchschnitt der prozentuale Rentabilität ± SD ausgedrückt (n = 6). (A) zeigt die Stabilität der 0.0036 % HFA Cytotoxizität als Medium verdünnt und bei Raumtemperatur 1-60 min. vor Aufdeckung SV40-HCECs, wie oben beschrieben inkubiert. (B) zeigt die Stabilität des 0,0008 % CP Zytotoxizität wenn in Medium verdünnt und Inkubation bei 37 ° C für 5-120 min vor Aufdeckung SV40-HCECs, wie oben beschrieben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Expose/Refeed oder Expose nur

Ein weiterer Faktor in der Exposition Methodik untersucht wurde ob: A) hinzufügen Schlüpfzeit für 10 min, waschen, refeed, Platten aus der chemischen Dampfhaube entfernen und inkubieren Sie 24 h in einer Standardzelle Kultur Inkubator (Expose/refeed Methode); oder B) Schlüpfzeit hinzufügen, lassen Sie es auf Platten aus der chemischen Dampfhaube entfernen und inkubieren Sie 24 h in einer Standardzelle Kultur Inkubator (Expose einzige Methode). Sicherheit ist ein wichtiger Faktor, da es möglicherweise nicht zulässig, Platten von Zellen zu entfernen, die verdünnten Schlüpfzeit aus der chemischen Dampfhaube enthalten, da die Schlüpfzeit wird Abgas und Personal verfügbar zu machen. Eine ähnliche Überlegung ist die Anzahl der Platten zu einem bestimmten Zeitpunkt seit mehr Platten ausgesetzt sind, eine größere Lautstärke ab-Begasung werden. In unserem HTS-Methoden setzen wir 48 x 96-Well Platten in einem gegebenen Studientag. Wir exponierten Zellplatten Kultur in einem versiegelten Beutel gelegt und dann farbmetrischen Gas Detektor Röhren CP und HF off-Begasung von belichteten Platten bewerten. Wir fanden, dass auszusetzen 48 Platten bis 1 x LD50 der HFA nicht zu jedem nachweisbar HF off-Begasung (Daten nicht gezeigt) geführt hat. Für CP-Belichtungen fanden wir, dass es genügend CP aus-Begasung von 48 Platten ausgesetzt, 1 x LD50 , zumindest einige Sicherheitsbedenken (Daten nicht gezeigt) zu präsentieren. Expose/refeed und setzen nur Methoden wurden für HFA Aufnahmen ausgewertet. SV40-HCEC Zellen wurden HFA ausgesetzt und Rentabilität wurde durch MTT-Assay 24 h nach der Belichtung beurteilt. Dosis-Antwort-Iterationen wurden an verschiedenen Tagen durchgeführt. Verglichen mit der Expose/refeed Methode (Abbildung 3a), fanden wir, dass die einzige Methode Expose konsequenter Zelle Lebensfähigkeit Untersuchungsergebnisse (Abb. 3 b) produziert. Daher wurde diese Methode als Teil der letzten Exposition Methodik ausgewählt. Für CP, keine Unterschiede in der Konsistenz der Zelle Lebensfähigkeit Untersuchungsergebnisse zwischen den zwei andere Belichtung Methoden konnte nicht ausgewertet werden, da Sicherheitsbedenken ausgeschlossen entfernen die CP ausgesetzt-Platten aus der chemischen Dampfhaube für 24 h Inkubation in einem Standardzellen Kultur Inkubator.

Figure 3
Abbildung 3 : Exposition Konsistenz mit Expose/refeed und setzen nur Methoden. Die Daten werden als der Durchschnitt der prozentuale Rentabilität ± SD ausgedrückt (n = 6). (a) HFA wurde in Medium verdünnt auf 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann verwendet, um Zellen zu setzen durch die Expose/refeed-Methode. (b) HFA war in Medium verdünnt, in 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann SV40-HCEC aussetzen von Expose einzige Methode verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Zelle Modell Raffinesse

Mittlere Bestandteile

Wir eingehalten die Kulturbedingungen der ursprünglichen Forscher für die Passage und die Wartung von diesen Zelllinien etabliert; Allerdings haben wir sie für Zellen in Experimente modifiziert. Vorgeschrieben durch die ursprüngliche Ermittler für die SV40-HCEC Zellen Zellkulturmedium beinhaltet keine Hydrocortison, aber wir verwendet ein niedriges Niveau der Hydrocortison (0,5 µg/mL) während der Belichtung Studien, die gelegentlichen Anstieg der Produktion von Zytokinen zu unterdrücken gesehen in naiven SV40-HCEC (Daten nicht gezeigt) negativ beeinflusst die Datenanalyse aus einer Iteration zur nächsten während des Studiums Raffinesse.

Phänotypische Stabilität

Wir fanden, dass während unserer Modellstudien Verfeinerung Zelle SV40-HCEC beginnen, die Produktion von Zytokinen in Reaktion auf vergiftendes Exposition ab etwa Passagenanzahl 60 (Daten nicht gezeigt) gesunken. Aus diesem Grund wir gepflegt Cryostocks niedrigen Durchgang Zellen, alle Studien mit Zellen unter Passagenanzahl 60 ausgeführt und überwacht die Produktion von Zytokinen in der Screening-Prozess.

Platte-Layout

Eine wichtige Quelle für experimentelle Variabilität im Hochdurchsatz-Studien ist Randeffekte von Multi-well-Platten. Wir fanden, dass die Cytokine Reaktionen der Zellen im Rand Brunnen nicht entsprachen, oder Äquivalent zu inneren Brunnen in beiden HFA und CP-Studien (Daten nicht gezeigt). Median Polnisch der Daten eine statistische Übung zur Minimierung der Kante Auswirkungen auf einen Datensatz konnte nicht ausreichend das Problem (Daten nicht gezeigt) behoben. Daher wurden keine Zellplatte Rand Brunnen für Experimente oder Steuerelemente (Abbildung 4) verwendet.

Figure 4
Abbildung 4 : Bibliothek und Zellplatte Layouts. Die grau schattierten Bereiche in der Bibliothek Platte Layout darstellen Brunnen, die SiRNA enthalten. Die weißen Brunnen sind leer. Die 40 Ziele von Zeilen A-D der Bibliothek Platte dienen im "Oberen Teller-Set", und 40 Ziele von E-H Reihen der Bibliothek Platte in das "untere Platte Set" verwendet werden. Wells B2-B6 sind für negative Pool SiRNA Steuerelemente verwendet. Wells C2-C6 sind nicht transfiziert. Wells B7-B11 dienen entweder cadamonin oder SKF 86002 Positivkontrolle Drogen wie beschrieben, und Brunnen C7-C11 für DMSO Fahrzeugkontrolle genutzt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

In vitro-Modell Validierung für HTS

Wir verwendeten Z' Faktor Analyse zur Eignung des SV40-HCEC für HTS-Studien zu bestimmen, wie dieser statistischen Test verwendet wird, um Test-Qualität für HTS24bestimmen. Für HF-Z' Faktor Analyse, Zellen wurden ausgesät auf 1,25 x 103 Zellen/Brunnen, mit negativen Pool SiRNA transfiziert (wie oben beschrieben) 24 h nach Aussaat und exponierten 48 h nach Transfektion 0.0036 % HFA (1 x LD50), n = 3. Für CP Z' Faktor Analyse, Zellen wurden ausgesät und transfizierten wie oben beschrieben und 48 h nach Transfektion 0,0008 % ausgesetzt CP (1 x LD50), n = 5. Eine größere n wurde für die CP-Studien durch die größere Variabilität in dieser Exposition-Modell verwendet. Z' Faktor für IL-8 Ausdruck vom unbelichteten vs. ausgesetzt Zellen und negativen Pool SiRNA transfiziert unbelichteten vs. ausgesetzt Datenzellen für CP und HFA Belichtungen berechnet wurde. Wir analysieren auch nicht transfizierten Zellen, um festzustellen, ob es Auswirkungen auf Assay Qualität durch SiRNA Transfection. Viele Iterationen der Validierungsstudien wurden durchgeführt, während Verfeinerung Belichtung und Kultur Bedingungen in dem Bemühen, die Z zu maximieren "Faktor Ergebnisse. SV40-HCEC bestanden Validierung und die meisten Iterationen hatte Z' Faktor Werte größer als 0,50 für HF Belichtungszeiten (Tabelle 1) und CP Belichtungen (Tabelle 2). Jede Wiederholung in diesen Tabellen wurde aus Zellen, die an verschiedenen Tagen vergoldet.

Belastungsgruppen Z'-Faktor Analyse
Rep #1 Rep #2 Rep #3
HF-exponierten Negativkontrolle vs. unbelichteten Negative Kontrolle 0,68 0,5 0,56
HF-exponierten vs. naiv 0,4 0,68 0,56

Tabelle 1: SV40-HCEC HFA Exposition Z' Faktor Analyse von IL-8

Belastungsgruppen Z'-Faktor Analyse
Rep #1 Rep #2 Rep #3
CP-exponierten Negativkontrolle vs. unbelichteten Negative Kontrolle 0,6 0.18 0,46
CP-exponierten vs. naiv 0,42 0.29 0,42

Tabelle 2: SV40-HCEC CP Exposition Z' Faktor Analyse von IL-8

Primäre SiRNA Screening-Ergebnisse der HFA verletzten Zellen

Transfektion Optimierungsstudien wurden vor dem Screening und SiRNA targeting Cyclophilin b wurde für diese Studien verwendet. Ein in Situ RNA Erkennung Assay wurde verwendet, um Cyclophilin b mRNA Niveaus zu messen, und eine hohe Content Analyzer wurde verwendet, um die Ergebnisse zu quantifizieren. Wir erreichten in der Nähe von 90 % Niederschlag von Cyclophilin b und in der Regel nicht mehr als 5-10 % Zellverlust mit 4 Pmol von SiRNA/gut und 0,3 µL/Well Transfection Reagens (Daten nicht gezeigt). Höhere Mengen von SiRNA führte tatsächlich zu ärmeren Cyclophilin b Zuschlag (Daten nicht gezeigt). Mit 1,2 Pmol/gut von SiRNA und 0,09 µL/Well Transfection Reagens wurden ähnliche Knockdown erreicht, aber wir gewählt, 4 Pmol pro Bohrloch zu verwenden, um alle Ziele zu begegnen, die größere Mengen von SiRNA wirksam Zuschlag Erzielung erfordern könnte. Ziel Knockdown Kinetik wurden auch ausgewertet, und es wurde beobachtet, war dieses Ziel Zuschlag maximal von zwei Tage nach Transfektion (Daten nicht gezeigt). Ziel Knockdown Konsistenz über die Platte war auch validiert (Daten nicht gezeigt). Die Anti-inflammatory Drogen cadamonin und SKF 86002 sind als Positivkontrollen zur Hemmung der Produktion von Zytokinen für HFA und CP Belichtung bzw. verwendet. Diese wurden durch die Prüfung einer Vielzahl von Verbindungen mit bekannten Anti-inflammatorische Eigenschaften in exponierten Zellen ausgewählt. Die Dosis in screening-Studien genutzt wurde von Dosis-Antwort-Optimierungsstudien ausgewählt.

Die hohen Durchsatz SiRNA screening-Strategie, die wir genutzt ist Industriestandard und besteht aus drei großen Schritten: (1) Vorabsiebung, 2) Bibliothek Dekonvolution und (3) Target-Validierung. Im primärscreening, ist der Phänotyp der einzelnen Ziele bewertet unter Verwendung einer Mischungaus aus verschiedenen SiRNA Animationssequenzen als einzigen Reagens, jedes Gen Ziel. Ziele sind dann nach unten zum Bibliothek Dekonvolution ausgewählt. In diesem Schritt jeweils die verschiedenen SiRNA-Sequenzen, die gebündelt werden, um jedes Gen im primärscreening Ziel sind separat getestet. Ziele werden eine andere Down-Auswahl in Target-Validierung in der Ziel-Phänotyp mit Drogen, Phänotyp Wiederherstellung und/oder SiRNA von einem anderen Anbieter bestätigt ist. Für unsere primären Bildschirm gewählt wir eine fokussierte Sub-genomische Bildschirm anstatt ein Genom Breitbild-aus Gründen der Wirtschaftlichkeit durchführen. Microarray Daten von HF und CP verletzte Maus Hornhaut und Einfallsreichtum Pathway Analyse (IPA) wurden verwendet, um unser Zielbibliothek für den primären Bildschirm (Manuskripte in Vorbereitung) zu konzentrieren. Kurz gesagt, waren Maus Hornhaut vergiftendes Dampf mit einer Dampf-Tasse ähnlich wie zuvor beschriebenen Methoden25ausgesetzt. Exponierten Hornhaut Schaltflächen und Steuerelemente wurden an verschiedene Punkte Exposition post Mal geerntet. RNA wurde isoliert, und überwacht die Qualität und Menge der RNA. Alle Microarray Experimente wurden laut des Herstellers Protokoll26durchgeführt. Rohe Signalintensitäten wurden normalisiert und durch Hauptkomponentenanalyse (PCA) zu bestimmen, die bedeutenden Quellen der Variabilität in den Daten analysiert. Gene waren Rang sortiert nach statistische Signifikanz. Die Daten wurden abgebaut und im Vergleich zu Gen Listen von vorkonfigurierten SiRNA-Bibliotheken. Aus diesen Listen gen wählten wir 3120 Ziele für das Screening. Die SiRNA-Bibliothek wurde in SV40-HCEC Zellen gezeigt (siehe Abbildung 5 für ein Flussdiagramm des HTS-Protokolls für den primären Bildschirm). Endpunkt-Bewertungen enthalten IL-8 Ebenen im Zellkulturmedium von keine-Wash Bead-based Assays und Zellviabilität von MTT-Assay. 0.0036%HFA, wie oben beschrieben, waren die Zellen ausgesetzt ist ca. 1 x LD50. Zellviabilität wurde von MTT-Assay 24 h nach Exposition bewertet. Die Wirkung der einzelnen SiRNA-Pools im Zellviabilität wurde für statistische Signifikanz bezogen auf den Durchschnitt der belichteten negativen Pool für jede Platte mit streng standardisierten mittlere Differenz (SSMD)27analysiert. Ein Dual-Taschenlampe Grundstück der SSMD und Zelle Lebensfähigkeit Falte-Änderung ist in Abbildung 6dargestellt. Die hit Auswahl Schwellenwerte für Ziele, die verschärft Zelltod oder verbesserte Zellviabilität SSMD ≤-1.28 und SSMD ≥ 1,28, bzw. wurden gewählt.

Figure 5
Abbildung 5 : Primäre Bildschirm HTS Protokoll Flussdiagramm. Dieses Flussdiagramm zeigt die wesentlichen Schritte, die an jedem Tag für das HTS-Protokoll durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Dual-Taschenlampe Grundstück von SiRNA Wirkung auf Zellen Cell Viability of HFA-Exposed SV40-HCEC. Für jedes Ziel die dargestellten Ergebnisse sind im Durchschnitt von sechs Wiederholungen (n = 6). Lebensfähigkeit Zelldaten werden ausgedrückt als Falten-Veränderung bezogen auf die belichteten negative Pool Kontrolle SiRNA und statistischer Signifikanz wurde von SSMD analysiert. Ziele, die einen SSMD ≤-1.28 oder ≥ 1,28 hatte wurden als Treffer ausgewählt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Die Wirkung der einzelnen SiRNA-Pools auf HFA-induzierte IL-8 Produktion wurde für statistische Signifikanz bezogen auf den Durchschnitt der belichteten negativen Pool für jede Platte analysiert. IL-8 in der Zellkultur überstand wurde bewertet Assay 24 h nach der Exposition. Ein Dual-Taschenlampe Grundstück der SSMD und IL-8 fach-Änderung ist in Abbildung 7dargestellt. Die hit Auswahl Schwellenwerte für Ziele, die verringerte Produktion von IL-8 ausgewählt wurden ein Rückgang um 40 % und SSMD ≤ -1.0. Die hit Auswahl Schwellenwerte für Ziele, die erhöhte Produktion von IL-8 eine Verfünffachung und SSMD wurden gewählt > 1,28.

Figure 7
Abbildung 7 : Dual-Taschenlampe Grundstück von SiRNA-Wirkung auf die Produktion von IL-8 durch HFA-Exposed SV40-HCEC Zellen. Die dargestellten Ergebnisse sind im Durchschnitt von sechs Wiederholungen (n = 6). IL-8 Ausdruck-Level-Daten werden als eine Falte-Änderung bezogen auf die belichteten negative Pool SiRNA ausgedrückt, und statistischer Signifikanz wurde von SSMD analysiert. Treffer wurden definiert als Ziele, die hatten eine 40 % Abnahme der IL-8 Ebenen und SSMD ≤ -1.0 oder eine fünffache Steigerung IL-8 Ebenen und SSMD > 1,28. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier beschreiben wir unsere Methoden und Ergebnisse über die Entwicklung des einen hohen Durchsatz Hornhaut Epithelzelle screening-Modell für die Untersuchung von HF und CP Verletzungen. Außerdem präsentieren wir die Ergebnisse aus dem primären SiRNA-Bildschirm für HF-Verletzungen. Es gab viele Herausforderungen an die Entwicklung der HTS-Modelle für die Untersuchung von TIC Verletzungen. Methoden, die wir in der Literatur im Zusammenhang mit der Studie von HF, HFA oder CP in zellmodellen Kultur finden konnte waren wenig hilfreich. Die meisten in-vitro- Studien über das Fluorid-Ion mündliche Zellen beinhalten und Natriumfluorid und nicht HF oder HFA (für Beispiele siehe28,29) genutzt. Einige Methodik auf die in-vitro- Exposition von bronchialen Epithelzellen zu CP wurde von Pesonen Et Al. veröffentlicht 30. letztendlich fanden wir keine spezifischen Methoden in der Literatur im Zusammenhang mit der HTS-Studie von HF, HFA oder CP und die überwiegende Mehrheit der Herausforderungen und Variablen im Zusammenhang mit der Studie von diesen Schadstoffen in HTS erforderliche Entwicklung. Besonderes Augenmerk galt den hohen Grad der Exposition Konsistenz über Zeit und zahlreiche siebungplatten notwendig für eine erfolgreiche HTS-Studie zu erreichen.

Eine Art von Herausforderung begegnet bezog sich auf die Anwendung der Schlüpfzeit auf Zellkultursysteme. Einige Giftstoffe sind entweder mit reaktiven oder instabil in wässrigen Lösungen. Die Giftstoffe, die wir für die Studie ausgewählt gelten nicht als diese Instabilität Probleme. Eine landwirtschaftliche Studie untersucht Photohydrolysis CP zeigte, dass eine 0,001 M Lösung von CP im Wasser eine Halbwertszeit von 31,1 h wenn ein 1100 Lux Xenon-Lichtquelle (Sonnenlicht-Intensität an einem bewölkten Tag) für 10 Tage, 12 Stunden pro Tag31ausgesetzt. Es gab keine messbare Hydrolyse im gleichen Zeitraum 10 Tage wenn die Lösung im Dunkeln aufbewahrt wurde. Das Proton und Fluorid Ion der HFA sind eindeutig stabil im Wasser. Es gibt jedoch zusätzliche Stabilität Überlegungen in Bezug auf vergiftendes Verdünnungen in Zellkulturmedium gemacht. Wir fanden, dass gab es eine erste Änderung der Zytotoxizität zu einem gewissen Grad, wenn die Giftstoffe zuerst im Zellkulturmedium verdünnt wurden, die dann nach kurzer Zeit stabilisiert. Wir glauben, dass dies aufgrund der vergiftendes Bindung oder Komplexbildner mit Bestandteilen des Mediums ist. Zelle Medium enthält Kalzium, Magnesium, Protein, etc. , die bekanntermaßen zur Interaktion mit der Fluorid-Ionen32,33. CP ist bekannt, dass oxidative Reaktionen mit biologischen Thiole, aber es kann auch binden DNA, Proteine und andere nukleophile34,35. Sobald diese Reaktionen und Interaktionen abgeschlossen haben oder Gleichgewicht erreicht, die Menge der verfügbaren Schlüpfzeit stabilisiert und somit die scheinbare Zytotoxizität stabilisiert. Wir haben zunächst die Verwendung von Kochsalz und Wasser Verdünnungen von Schadstoffen für funktionierende Bestände für Forderungen zur Vermeidung von vergiftendes Interaktionen mit mittleren Wähler in Arbeit Verdünnungen verwendet. Die Verwendung von Kochsalzlösung würde auch die Säurekomponente HFA Verletzungsgefahr für Belichtungen durchgeführt durch Datenträgeraustausch bewahren. Wir fanden, dass die Zelle Tod Antworten auf Giftstoffe im Wasser und Kochsalzlösung Verdünnungen variabler als die Methode, die Zelle Kulturmedium Verdünnungen mit Datenträgeraustausch (Daten nicht gezeigt) verwendet. Über die Spitze belichtungsmethode mit HFA möglicherweise die Variabilität aufgrund von Inkonsistenzen in der Spike Dispergieren in der gut zum zellulären Ziele im Wettbewerb mit mittlerer Bestandteile für die verfügbaren Fluorid-Ionen. Die Gründe für die Variabilität der HFA Expositionen durch Datenträgeraustausch mit HFA saline Verdünnungen sind völlig unklar. Auf jeden Fall wurden Belichtungsmethoden mit Kochsalzlösung Verdünnungen für HFA aufgegeben und nicht für CP erforscht. Die Toxizität von unseren HFA Verdünnungen in Medium imitiert wahrscheinlich eng Studien mit Natriumfluorid, weil die Zelle Medium freien Protons in unserem HFA Verdünnungen puffert.

Andere Herausforderungen, denen, die wir begegnet, bezogen sich auf Verfeinerung der Kultur zellmodelle für den Einsatz in HTS Wir fanden es notwendig, die Zellbestandteilen Kulturmedium für Zellen in Experimente, insbesondere Hydrocortison und Antibiotika zu ändern. Wir nutzten ein niedriges Niveau der Hydrocortison (0,5 µg/mL) während der Belichtung Studien zu unterdrücken, die gelegentlichen Anstieg der Produktion von Zytokinen in naiven SV40-HCEC gesehen. Diese geringe Menge an Hydrocortison keine negativen Auswirkungen auf die Reaktionen der Zellen auf Schlüpfzeit und war unter dem Niveau in der Regel verwendet, um Produktion von Zytokinen unterdrücken von kultivierten Zellen als Reaktion auf stimulierende36,37. Die genauen Gründe warum naive SV40-HCEC Zellen gelegentlich überschüssige Zytokine produzieren sind nicht bekannt, aber es ist möglich, dass die Zellen variabel empfindlich auf geringfügige Stressoren, die während Zelle passagierung und Beschichtung auftreten. Viele Labore gehören routinemäßig Antibiotika in Zellkulturmedium Wartung, aber einige Antibiotika, Tetracycline insbesondere haben gezeigt, dass Anti-inflammatorische Effekte auf kultivierten Zellen darunter Hornhaut Epithelzellen38aufweisen. Im allgemeinen vermeidet unser Labor den Einsatz von Antibiotika wann immer möglich, da diese Studien möglicherweise verwirren können. Wir untersuchten auch die phänotypische Drift über mehrere Passagen unserer Zellen in Kultur. Es ist üblich, dass verewigt Zellen genetische und/oder phänotypische Drift über mehrere Passagen zu unterziehen, wenn Sie nicht gepflegt in der exponentiellen Phase erlaubt, Konfluenz zu erreichen, ob bestimmte Umweltstressfaktoren39,40 ausgesetzt ,41. Daher ist es wichtig, während ein hoher Durchsatz-Bildschirm, die Zell-Linien sind ordnungsgemäß gewartet und dass der Bildschirm ist abgeschlossen mit Zellzahlen Passage, die die bekannten phänotypische Antwort zu erhalten. Multi-well-Platte Randeffekte ist das Phänomen, dass Zellen gewachsen in den äußeren Rand Vertiefungen der Multi-well-Platten oft dasselbe nicht reagieren oder mit die gleiche Konsistenz wie Zellen gewachsen im inneren42 Brunnen. Es gibt statistische Übungen, wie z. B. Median Polnisch, die genutzt werden können, um Randeffekte auf ein DataSet43zu minimieren. Allerdings gibt es keine statistische Übung, die Randeffekte auf ein bestimmtes Ziel oder ein Steuerelement beseitigen können, wenn es ist immer eine Kante gut getestet und die Platte Layout zwischen unterschiedlichen repliziert, um Ziele zu bewegen oder Steuerelemente aus der Kante Brunnen nicht logistisch praktisch und kostengünstig. Wir sind der Meinung, das die Entscheidung, den Einsatz von Edge-Brunnen in zellbasierten HTS-Assays sind vorsichtig gemacht werden soll. Da fanden wir es notwendig, die Verwendung von Zellen gewachsen in Rand Brunnen für Kontrollen und Ziele zu beseitigen.

Unsere HTS Zelle Modell und Belichtung Methodik für in-vitro- HF-Verletzungen wurde verwendet, um die primäre SiRNA-Bildschirm 3120 Ziele erfolgreich abgeschlossen. SSMD war für hit Auswahl verwendet, da es vorgeschlagen wurde, speziell um das Ausmaß des Unterschieds zwischen einem Steuerelement und einem SiRNA-27zu messen. Unsere Ergebnisse für Zellviabilität zufolge gab es eine lineare Beziehung zwischen SSMD und Falten-Änderung für nahezu alle Ziele in der Dual-Taschenlampe. Aus diesem Grund haben wir das einzige Kriterium der SSMD für hit Auswahl für diesen Endpunkt verwendet. Die IL-8-Daten unterschieden, dass einige Ziele schwache, aber konsequente Auswirkungen gehabt, während andere starke aber inkonsistente Auswirkungen zeigte. Daher werden Falten-Änderung und SSMD für hit Auswahlkriterien für diesen Endpunkt verwendet. Die SSMD Werte für hit Auswahl für beide Zellviabilität und IL-8-Daten wurden ausgewählt, weil Abschaltungen zwischen 1 und 1.645 (oder-1 und-1.65) niedrige false Discovery und nicht-Entdeckung Preise44erreichen. Es gab einige Ziele, die Hits im Zellviabilität und IL-8-Daten waren. In diesen Fällen für die Aufnahme in die Bibliothek Dekonvolution wurde bevorzugt jene Ziele, die ihre Wirkung in die gleiche Richtung der Verbesserung der allgemeinen Gesundheit (verbesserte Rentabilität und verminderte IL-8) oder Verletzung verschlimmern ausgeübt (erhöhte Zelltod und erhöhte IL-8). Insgesamt haben wir insgesamt 250 Ziele zwischen der Zellviabilität und IL-8 Endpunkte der Dekonvolution Bibliothek für HF Verletzungen ausmachen. Der primäre Bildschirm für in-vitro- CP-Verletzung ist im Gange.

Zusammenfassend haben wir Belichtung und Kultur Bedingungen für die HTS-Studie okuläre Verletzungsgefahr durch HF und CP entwickelt. Mehrere Variablen in Belichtung und Kultur Bedingungen wurden verfeinert und optimiert, und die Modelle wurden überprüft, um für HTS Studien geeignet von Z' Faktor Analyse. Weiter haben wir die Nützlichkeit dieser Modelle bewiesen, durch den Abschluss der primären Bildschirm einer SiRNA-Bibliothek in der HF-Modell. Es gibt viele Verletzungen und Krankheiten, die keine sind oder begrenztes Interesse der Pharma- oder Biotech-Industrie, vergiftendes Verletzungen von CP und HF enthalten und das Aufkommen der Benchtop-Robotik erleichtert die HTS-Studie von Verletzungen und Krankheiten in praktisch jedem Labor . Hoher Durchsatz Genomdaten Sätze stark zum Verständnis der Rollen kann dazu beitragen, die bestimmte Gene bei Verletzung oder Erkrankung, die helfen können, sich effizienter spielen folgen auf in Vitro oder in Vivo Studien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Haftungsausschluss: die in diesem Artikel geäußerten Meinungen sind diejenigen der Autoren und spiegeln nicht die offizielle Politik der Abteilung der Armee, US-Verteidigungsministerium oder die US-Regierung. Diese Forschung wurde unterstützt durch eine interinstitutionelle Vereinbarung zwischen NIH/NIAID und die USAMRICD und teilweise durch einen Termin Postgraduate Forschungsprogramm für Teilnahme an der US Armee medizinische Forschung Institut chemische Verteidigungsministerium verwaltet durch die Eiche Ridge-Institut für Wissenschaft und Bildung durch eine interinstitutionelle Vereinbarung zwischen dem U.S. Department of Energy und USAMRMC.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde von den nationalen Instituten der Gesundheit entgegenzuwirken Programm Interagency Vereinbarung # AOD13015-001 unterstützt. Wir möchten danken Stephanie Froberg und Peter Hurst für ihre Bemühungen und ihr Know-how auf Videoproduktion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bravo liquid handing platform Agilent or equivalent G5409A
Bravo plate shaker Agilent or equivalent Option 159
Bravo 96LT disposable tip head Agilent or equivalent Option 178 96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 177 96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 179 384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
EnSpire multimode plate reader Perkin Elmer or equivalent 2300-0000 AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit  Perkin Elmer or equivalent AL224F no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates Perkin Elmer or equivalent 6008359
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen or equivalent 13778500 Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium Invitrogen or equivalent 31985070
TrypLE Express Gibco or equivalent 12605010 Cell detachment solution
IncuCyte Zoom Essen Instruments or equivalent ESSEN BIOSCI 4473 Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin Trinity Manufacturing or equivalent N/A Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium Invitrogen or equivalent 11330-057 Contains HEPES
Fetal bovine serum Invitrogen or equivalent 1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade) Invitrogen or equivalent E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 15140122
Hydrocortisone (cell culture grade) Sigma or equivalent H0888-10G
Glucose  (cell culture grade) Sigma or equivalent G7021
PBS  (cell culture grade) Sigma or equivalent P5493
siRNA Dharmacon or equivalent various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide Sigma or equivalent M5655 MTT assay substrate
siRNA buffer Thermo or equivalent B002000
96-well cell culture plates Corning or equivalent CLS3595
T150 cell culture flasks Corning or equivalent CLS430825
BSL-2 cell culture hood Nuaire or equivalent NU-540
300 mL robotic reservoirs Thermo or equivalent 12-565-572 
96 baffled automation reservoirs Thermo or equivalent 1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles Corning or equivalent CLS430282
Microplate heat sealer Thermo or equivalent AB-1443A
Microplate heat sealing foil Thermo or equivalent AB-0475
Cardamonin Tocris or equivalent 2509 Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002  Tocris or equivalent 2008 Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO Sigma or equivalent D8418
48% hydrofluoric acid Sigma or equivalent 339261 Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014382
200 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014391
20 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014392
1000 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17014497
200 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013810
20 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013808
Pipettor tips 1000 μL Rainin or equivalent 17002920
Pipettor tips 200 μL Rainin or equivalent 17014294
Pipettor tips 20 μL Rainin or equivalent 17002928
Chemical fume hood Jamestown Metal Products MHCO_229
384-well sample storage plates Thermo or equivalent 262261
Sodium chloride Sigma or equivalent S6191
50 mL conical tubes Thermo or equivalent 14-959-49A
Serological pipettes 50 mL Corning or equivalent 07-200-576
Serological pipettes 25 mL Corning or equivalent 07-200-575
Serological pipettes 10 mL Corning or equivalent 07-200-574
Serological pipettes 5 mL Corning or equivalent 07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells N/A N/A These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter Millipore or equivalent PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument Affymetrix or equivalent 00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates Affymetrix or equivalent 901257; 901434
Draegger tube HF Draeger or equivalent 8103251
Draegger tube CP Draeger or equivalent 8103421
Draegger pump Draeger or equivalent 6400000
Clear Plate seals Resesarch Products International or Equivalent 202502
Reagent reservoirs VistaLab Technologies or equivalent 3054-1000
Xlfit IDBS or equivalent N/A Excel add-in used for automated curve fitting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Randleman, B. Drugs, Diseases and Procedures. Hampton, R. , Medscape. (2011).
  2. Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
  3. Wang, X. A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects. Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).
  4. Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing. Frontiers in Genetics. 5, 110 (2014).
  5. North, M., Vulpe, C. D. Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).
  6. McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).
  7. Bassik, M. C. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
  8. Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).
  9. Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006. , U.S. Department of Homeland Security, Science and Technology Directorate, Chemical Security Analysis Center. Aberdeen Proving Ground, MD. (2012).
  10. Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).
  11. Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture. Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).
  12. Ruff, A. L., Dillman, J. F. 3rd Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).
  13. Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity. Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).
  14. Toxnet. , https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  15. Bancroft, W. D. The Medical Department of the United States Army in the World War. 14, Otis Historical Archives, National Museum of Health and Medicine. (1926).
  16. Chloropicrin Risk Characterization Document. , California Environmental Protection Agency. (2012).
  17. Aigueperse, J., et al. Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH. (2000).
  18. Sotozono, C. Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair. Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).
  19. Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries. , http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf (2015).
  20. Lipofectamine RNAiMAX Reagent. , https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf (2017).
  21. Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).
  22. IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points. , http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3 (2016).
  23. Araki-Sasaki, K. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  25. Ruff, A. L. Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression. Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).
  26. GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V). , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372 (2018).
  27. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  28. He, H. Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells. Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).
  29. Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).
  30. Pesonen, M. Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells. Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).
  31. Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H. Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis. Seiber, J. N., et al. 652, American Chemical Society. Ch. 8 (1997).
  32. Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity. Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).
  33. Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).
  34. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice. Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).
  35. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).
  36. Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4. Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).
  37. van der Poll, T., Lowry, S. F. Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone. Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).
  38. Solomon, A. Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).
  39. Mishra, P. K. Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells. International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).
  40. Stockholm, D. The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro. PLoS One. 2 (4), e394 (2007).
  41. ATCC Animal Cell Culture Guide. , American Type Culture Collection. Manassas, VA. (2014).
  42. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  43. Mpindi, J. P. Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data. Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).
  44. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).

Tags

Biologie Ausgabe 136 Chlorpikrin Fluorwasserstoff Hornhaut Epithelzellen Verletzung der Hornhaut SiRNA Hochdurchsatz-Screening
Hoher Durchsatz SiRNA Screening für Chlorpikrin und Fluorwasserstoff-induzierte Hornhaut Epithelzelle Verletzungen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lehman, J. G., Causey, R. D.,… More

Lehman, J. G., Causey, R. D., LaGrasta, C. V., Ruff, A. L. High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury. J. Vis. Exp. (136), e57372, doi:10.3791/57372 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter