Summary
Hier presenteren we protocollen voor beginnende onderzoekers om te starten fenotypering voor het farmacologisch belangrijke bacteriële genus Streptomyces.
Abstract
Streptomyceten zijn draadvormige bodem bacteriën behorend tot het phylum Straalzwammen die zijn gevonden over de hele wereld en produceren een breed scala van antibiotica en andere secundaire metabolieten. Streptomyces coelicolor is een goed gekarakteriseerd, niet-pathogene soorten die is vatbaar voor allerlei analyses in het lab. De fenotypering methoden beschreven hier maken gebruik van S. coelicolor als een model streptomycete; de methoden zijn echter voor alle leden van dit geslacht, evenals sommige nauw verwante Actinomyceten. Fenotypering moet karakteriseren van nieuwe soorten Streptomyces geïdentificeerd in het milieu, en het is ook een belangrijke eerste stap in karakterisering van nieuwe geïsoleerde gemuteerde stammen van Streptomyces. Vaardigheid in fenotypering is belangrijk voor de vele nieuwe onderzoekers die komen op het gebied van Streptomyces onderzoek, waarin de studie van bacteriële ontwikkeling, celdeling, chromosoom segregatie en tweede messenger signalering. De recente crowdsourcing antibiotica ontdekkingstocht door het isolement van de nieuwe bodem-microben heeft geleid tot een toegenomen behoefte aan opleiding in fenotypering voor instructeurs nieuwe op het gebied van Streptomyces onderzoek en hun hogeschool of middelbare school studenten. Dit manuscript worden methoden beschreven voor bacteriële stam verspreiding, opslag en karakterisatie door middel van visuele en microscopisch onderzoek. Na het lezen van dit artikel, moet de nieuwe onderzoekers (Microbiologie Onderwijs laboratoria en burger wetenschappers) kunnen manipuleren van Streptomyces stammen en visuele karakterisering experimenten beginnen.
Introduction
Streptomyceten zijn gram-positieve bacteriën, draadvormige bodem bacteriën bekend om hun vermogen om te produceren een aantal secundaire metabolieten, met inbegrip van meer dan tweederde van de verkrijgbare antibiotica, zo goed als anti-tumor, anti-HIV-virus en anti-parasitaire drugs 1. S. coelicolor is het meest genetisch gekarakteriseerd lid van het geslacht2,3 en is van de soort gebruikt in de hier beschreven methoden. S. coelicolor heeft een complexe levenscyclus, die begint met de ontkieming van een enkele spore, tot een uitgebreide, vertakkende vegetatieve mycelium die groeit uit tot het medium van de agar. Aangezien de levenscyclus te werk gaat, zijn luchtfoto door samensmelting van filamenten die breken de oppervlaktespanning van het substraat mycelium en ten slotte zijn onderverdeeld in lange ketens van cellen die uiteindelijk in volwassen, grijs-gepigmenteerde sporen omgezet zijn gevormd. Verspreiding van deze nieuw gevormde sporen vormt het begin van de volgende levenscyclus4.
Vanwege het complexe patroon van differentiatie dient S. coelicolor als een uitstekend model voor de studie van bacteriële ontwikkeling. Historisch, mutaties resulteren in blokken voor twee grote stadia van ontwikkeling en produceren verschillende visuele fenotypen. De (kale) mutants bld worden geblokkeerd voor luchtfoto mycelium vorming en het ontbreken van een fuzzy luchtfoto mycelium meegeven van een "kale" kolonie uiterlijk geven. Mutanten in spore vorming geremd en rijping worden aangeduid als whi (wit) mutanten omdat ze meestal niet produceren wild-achtige velden van het grijze spore pigment en de antenne mycelium blijft wit. Andere interessante mutanten zijn geremd in antibiotica productie, celdeling, chromosoom segregatie of andere belangrijke processen4,5.
Ondanks de ontdekking van vele developmental genen in Streptomyces -soorten zijn er veel meer geloofde bestaan op basis van het gebrek aan verzadiging van mutant schermen. Onze laboratoria blijven om nieuwe ontwikkelings genen met behulp van een mini transposon-systeem dat we hebben opgebouwd te identificeren. Roman gemuteerde stammen geïsoleerd in willekeurige mutagenese experimenten met onze transposon ondergaan fenotypische screening om te identificeren van de mogelijke rol van elke nieuwe gen ontdekt6,7. De methoden voor bacteriële fenotypering beschreven hier zijn relevant voor Streptomyces mutanten geïsoleerd door transposon mutagenese8,9,10,11,12, 13 en andere willekeurige methoden, zoals chemische en ultra violet (UV) mutagenese14, evenals de gestuurde bouw van mutaties als gene standaardknop te definiëren met behulp van recombineering15,16 of CRISPR-Cas9 (geclusterd regelmatig Interspaced korte palindromische herhaalt) genoom technologie17,18,19 en puntmutaties20bewerken.
Antibiotica-resistentie bij ziekteverwekkers naarmate steeds meer voorkomende, wordt de behoefte aan nieuwe antibiotica steeds urgenter21,22. De "Kleine wereld-initiatief" (of SWI) is een effectieve wetenschap, technologie, techniek en wiskunde (STEM) leren23 en onderzoek strategie24 ter bestrijding van resistentie tegen antibiotica via de crowdsourcing van studenten, en meer onlangs middelbare scholieren. Ondersteund cursussen werk omvat het identificeren van nieuwe bodem-microben die produceren van nieuwe antibiotica (http://www.smallworldinitiative.org). Het is van mening dat een belangrijke bron van onontdekte antibiotica blijven zal Streptomyces -soorten gevonden in een brede waaier van bodem en water habitats25,26,27,28, 29,31. Onlangs, ons laboratorium en het werk van anderen hebben ontdekt en gekenmerkt signalering genen in Streptomyces -soorten die regelen morfologie en ontwikkeling, met inbegrip van antibiotica productie7,32, 33. Veranderingen in de expressie van genen die deze resulteren in een verandering in de hoeveelheid en de timing van antibiotica geproduceerd. Geschoolde fenotypering van nieuwe soorten en nieuwe antibioticum-producerende mutanten blijft belangrijk. Naarmate nieuwe instructeurs en hun leerlingen belangrijke leverden op het gebied van Geneesmiddelenontwikkeling, is opleiding in bacteriële fenotypering noodzakelijk voor het welslagen van deze beginnende individuen. Bovendien zijn deze experimenten hanteerbare voor middelbare school stam of universiteit microbiologie onderwijs laboratoria. Zij vertegenwoordigen een demonstratie van microbiële genetische basisprincipes van een onderwijs-lab instellen.
Protocol
1. Prepareer instrumenten, cultuurmedia, oplossingen en petrischalen
- Autoclaaf tandenstokers in een 50 mL-bekerglas, bedekt met aluminiumfolie te houden steriele.
- Steriliseren van alle droge goederen die zullen worden gebruikt (tips, stokken, glaswerk, enz.) in een autoclaaf.
Opmerking: Let op! Volg alle aanwijzingen van de veiligheid voor de autoclaaf model gebruikt. Autoclaven vormen een risico voor explosies, en brandwonden van stoom en contact met hete oppervlakken, materialen en media. Bekijk voor de autoclaaf veiligheid, "Het juiste gebruik van autoclaven"34. -
Bereiden de MS agar (Mannitol soja meel (SFM))14 culturen groeien.
- Voeg toe 5 g van sojameel en 5 g agar in de maatkolf van 1 L.
- Los 5 g mannitol in 250 mL leidingwater en afzien in de kolf, met de soja meel en agar.
- Voeg een schuim plug en de folie aan de opening van de kolf en de autoclaaf bij 121 ° C, 15 psi voor minstens 30 min.
Let op: Dit medium kookt makkelijk over. Gebruik een kolf die ten minste viermaal het werkelijke volume van MS agar worden gesteriliseerde met autoclaaf kan houden. Een standaard snelkookpan kan worden gebruikt in plaats van een autoclaaf met soortgelijke overwegingen van veiligheid. Anderzijds kan een magnetron worden gebruikt voor het steriliseren van media en materialen als toegang tot een autoclaaf niet mogelijk35,,36 is. Middelbare school docenten willen kunnen ook samenwerken met de lokale hogescholen of universiteiten tot gesteriliseerde met autoclaaf leveringen. - Cool media tot comfortabel genoeg om te behandelen. Wees voorzichtig om niet te lang koel, omdat agar bij temperaturen lager dan 50 ° C. stolt
- Giet MS agar uit de kolf in steriele petrischalen totdat de onderkant van elke petrischaal ongeveer de helft is volle (ongeveer 25 mL media per petrischaal). Laat stollen voordat u agar platen. Agar platen worden opgeslagen in een plastic zak op kamertemperatuur totdat het nodig is.
Opmerking: Agar platen kunnen ook worden opgeslagen in een koelkast, vooral als antibiotica nodig zijn in de media.
2. streak Streptomyces op borden voor vermeerdering
- Streak Streptomyces stammen op MS agar platen aan één kolonies met behulp van een standaardmethode, zoals het kwadrant strijk methode zoals in Sanders, 201237.
Opmerking: Een inoculating lus of steriele tandenstokers kunnen worden gebruikt. Optioneel: Andere media worden vaak gebruikt voor Streptomyces -soorten, zoals R2YE en minimale media14. - Incubeer de platen bij 30 ° C.
- Restreak platen door het plukken van een één kolonie elke 4-6 dagen. Als kolonies leeftijd ze gevoelig voor willekeurige mutatie.
3. Maak Glycerol Mycelial voorraden voor bacteriële opslag
Opmerking: Mycelial voorraden kunnen worden gemaakt voor alle Streptomyces stammen, met inbegrip van de whi en bld stammen en andere ontwikkelingsstoornissen mutanten die nu niet kunnen voltooien sporevorming.
- Maceraat 15 – 20 kolonies in 200 – 500 µL 20% glycerol met behulp van een steriele houten deuvel-applicator.
- De gier van gemacereerde kolonies overbrengen in een vriezer cultuur tube 1,5 mL, met behulp van een micropipet of steriele overdracht pipet.
Opmerking: De grondbeginselen van micropipet gebruik vallen elders38. - Voeg genoeg 20% glycerol zodat het eindvolume 1 mL en meng voorzichtig. Winkel monsters bij-80 ° C.
Opmerking: Let op! Gebruik Cryogene Veligheid handschoenen en een laboratoriumjas te beschermen van de huid tegen contact met extreme koude. U kunt ook mogen een vriezer van-20 ° C worden gebruikt met potentiële vermindering van lange termijn opslagtijd. Vermijd buitensporige bevriezen en ontdooien om uit te breiden van de levensvatbaarheid.
4. Maak Glycerol Spore voorraden voor stammen staat sporevorming
Opmerking: Spore voorraden zijn voorkeur voor de levensvatbaarheid op lange termijn, maar zijn alleen haalbaar voor stammen die in staat is van de voltooiing van de sporevorming zijn.
-
100 µL van gemacereerde materiaal (uit stap 3.1) op een agarplaat te verkrijgen van een confluente gazon van groei37verspreid.
Opmerking: Spread beplating wordt weergegeven in Sanders37 (wijziging: een draaitafel is niet verplicht.). De plaat kan worden omgezet met één hand tijdens het gebruik van de andere hand de spreider verplaatsen in een zachte heen en weer beweging in de agarmedia.- Pipetteer 100 µL van gemacereerde mycelium naar het midden van een MS agarplaat.
- Steriliseren een glas of metaal verspreiding gereedschap door gedeeltelijk ondergedompeld in 70% ethanol en passeren de spreider eens langzaam door een vlam Bunsenbrander om sneller de verdamping van de ethanol.
Let op: Ethanol is zeer ontvlambaar. Laat niet de vlammende spreider plaats in ethanol en laat de vlammende daling van ethanol te vallen in de ethanol schotel. Ook gebruiken een steriele wegwerp wattenstaafje te verspreiden van de bacteriën op de plaat, die geen ethanol of vlam vereist. - Draai van de MS-agar plaat met de ene hand, terwijl het gebruiken van een rug en weer beweging om te enten van de plaat met de steriele spreider.
- Incubeer gedurende 5-7 dagen bij 30 ° C, totdat de spanning goed sporevorm is.
Opmerking: Incubatie tijden zullen variëren afhankelijk van het soort en de stam.
- Voeg toe 2 mL steriele zoutoplossing (0,8% NaCl) naar het midden van een confluente gazon van Streptomyces cellen dat sporevorming heeft ondergaan.
- Sporen van de oogst door wrijven zachtjes het oppervlak van het mycelium met een steriele enten lus (of een wattenstaafje), langzaam richting de rand van het gazon.
- Pipetteer de zoute bevat sporen in een conische tube van 15 mL. Vortex krachtig te breken spore ketens in afzonderlijke cellen.
- Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten bij ongeveer 2.500 x g.
- Pipetteer het supernatant en negeren. De spore-pellet verspreiden door krachtige draaikolk agitatie in de kleine hoeveelheid resterende vloeistof.
- Resuspendeer de sporen in 1 mL 20% glycerol door het tekenen van de oplossing op en neer met een pipet.
- De voorraad van de spore glycerol overbrengen in een tube van 1,5 mL vriezer. Winkel bij-80 ° C.
Let op: Gebruik Cryogene Veligheid handschoenen en een laboratoriumjas te beschermen van de huid tegen contact met extreme koude. U kunt ook kan een vriezer van-20 ° C worden gebruikt met potentiële vermindering van de levensvatbaarheid op lange termijn opslagtijd. Vermijd buitensporige bevriezen en ontdooien om uit te breiden van de levensvatbaarheid.
5. Voer mutagenese
- Mutagenese op basis van de gewenste resultaten waarnaar wordt verwezen in de Inleiding en onlangs herzien door Baltz, 201639uitvoeren
Opmerking: Sommige experimenten fenotypering vergt niet mutagenese, zoals de bedoeling om te identificeren van nieuwe soorten uit de omgeving. Methoden van willekeurige mutagenese omvatten het gebruik van een transposon8,9,10,11,12,13, UV-straling of chemicaliën14. Plaats-geleide mutagenese15,16,17,18,19,20 technieken kunnen worden gebruikt om te maken van specifieke puntmutaties, verwijderingen, of andere soorten mutaties.
6. vergelijk en opnemen van de visuele verschijning
- Neem nota van de morfologie van de kolonie voor elke mutant in vergelijking met de wild-type ouderstam na strepen van alle stammen zoals in stap 2. Vergelijk het nieuwe isolaat met die van een goed bestudeerde soorten, zoals S. coelicolor en S. venezuelae, wanneer de karakterisering van nieuwe Streptomyces -soorten. Opmerking kenmerken (Figuur 1) zoals de basisvorm, oppervlakte van kolonie (fuzzy, kaal, gerimpeld, etc.), dekking, hoogte, en de pigmentatie (onderscheid worden gemaakt tussen de vegetatieve mycelium, luchtfoto mycelium en/of het omringende medium).
- Label een MS-agar plaat en streep wild-type en gemuteerde stammen in wedge patronen (Figuur 1). Wees voorzichtig dat geen spanning een andere stam raakt Voorkom kruisbesmetting. Noteer de datum en de tijd die stammen zijn streaked op het bord. Incubeer de platen bij 30 ° C.
- Plaats gegroeid petrischalen op gekleurde of witboek te homogeniseren van de achtergrond. Schrijven op het papier de stam naam, datum, incubatietemperatuur en tijd van de eerste plaat strepen. Neem digitale afbeelding(en) van de plaat met de laatste informatie over de achtergrond van het papier zo geschreven dat verwarring wordt geminimaliseerd.
Opmerking: Het schrijven kan worden bijgesneden vanaf de foto op een later tijdstip als het is om te worden gebruikt voor de voorbereiding van de figuur.
7. het uitvoeren van fase-Contrast microscopie
- Steriliseer de pincet door wassen in 70% ethanol en vervolgens passeren een vlam Bunsenbrander te verdampen de ethanol. Laat afkoelen.
- Steriliseren coverslips door wassen in 70% ethanol en dan het toestaan van hen om te drogen in een steriele petrischaal.
-
Bereiden een dekglaasje aan oplichting van de bacteriële groei worden onderzocht.
- Een steriele dekglaasje aan halen met een steriel pincet en plaats het dekglaasje aan op een MS agarplaat waar bacteriegroei is dicht. Druk op op de achterkant van het dekglaasje aan voorzichtig met een pincet om voldoende overdracht van bacteriële sporen en luchtfoto mycelium.
- Het dekglaasje aan van de plaat halen en plaats deze zodat de zijde met het materiaal van de cel is naar de richting van het oppervlak van een microscoopglaasje, met een daling van 15 µL 50% glycerol bereid in water voor montage. Luchtbellen te verminderen door het plaatsen van het dekglaasje aan in een hoek van 45° aan de dia en laat het vallen op de 50% glycerol.
- (Optioneel) Zegel met duidelijke nail polish voor behoud van de dia.
-
Het uitvoeren van fase-contrast microscopie zoals beschreven door Frohlich40 op verschillende tijdstippen tijdens de levenscyclus.
Opmerking: Herhaalde imaging zorgt voor een meer volledige analyse en de mogelijkheid om te detecteren van vertragingen in de ontwikkeling. Onafhankelijk Herhaal de opmerkingen om ervoor te zorgen nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid.- Plaats de voorbereide dia in het werkgebied van de Microscoop en voeg een druppel immersie-olie naar het midden van de cover slip. Draai de 100 X fase doelstelling in plaats en het torentje van de condensor ingesteld op de juiste instelling voor "overeenkomende" fase. Focus van het beeld met behulp van alleen de fijne instelknop zodra het objectief in contact met de olie is.
- Onderzoeken van verschillende gezichtsveld te onderscheiden merkbaar en consistent verschillen tussen de gemuteerde stammen en de wild-type, zoals de mogelijkheid om te formulier sporen, spore-grootte en vorm en totale aantal sporen (Zie Figuur 2).
Opmerking: Alternatieven voor fase contrast microscopie omvatten differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie40 en eenvoudige kleuring technieken voor gebruik met helder veld microscopen41, zoals kristalviolet kleuring.
8. Voer fluorescentie microscopie
- Pincet door wassen in 70% ethanol en vervolgens uit te voeren door middel van een bunsenbrander vlam steriliseren.
- Een steriele dekglaasje aan pikken met steriel pincet en plaats op een MS agarplaat waar bacteriële groei duidelijk is. De achterkant van het dekglaasje aan zachtjes aanraken met de pincet om voldoende overdracht van bacteriële sporen en luchtfoto door samensmelting van filamenten.
- Het dekglaasje aan van de plaat halen en plaats deze zodat de zijde met het materiaal van de cel boven ligt, op cardstock voor gemak in de manipulatie van het dekglaasje aan.
- Overstroming van het dekglaasje aan met ijskoude methanol (~ 300 µL voor een 20 x 20 mm2 dekglaasje aan) en laat het volledig droge lucht.
Let op: Methanol is een mutagene stof. Vermijd direct contact met de huid. - Spoel het dekglaasje aan driemaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)42 door zachtjes verstrekking en het verwijderen van de oplossing.
- Voeg 15 µL van 100 μg/ml Propidium jodide en/of 10 μg/mL tarwe-kiem-Agglutinin geconjugeerd met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC-WGA) in 50% glycerol aangebracht in een gelabelde microscoopglaasje.
Opmerking: Propidium jodide vlekken DNA rode locatie te detecteren chromosomale DNA terwijl WGA-FITC de celwand groene vlekken. - Omkeren dekglaasje aan bedrukte zijde naar beneden op de daling van fluorescerende vlek op het glasplaatje. (Optioneel) zegel met duidelijke nagellak voor behoud van dia. De kleurstoffen zijn lichtgevoelig, Incubeer gedurende 15 minuten in een verduisterde of schemerige kamer.
- Observeren van de dia's onder een 100 X-objectief met een fase-contrast of DIC Microscoop uitgerust met epifluorescence excitatie kubussen voor propidium jodide ('Texas Red' Filter ingesteld of 535/617 nm excitatie/emissie maxima) en FITC (FITC filteren instellen of 490/525 nm excitatie/emissie-maxima).
- Plaats de dia op het podium en de focus met behulp van de knoppen van de grove en fijne aanpassing.
- Observeer de fluorescentie zoals elders43.
- Gebruik een gratis image analyse softwarepakket dat bij de identificatie van sporen met lagere intensiteit van de fluorescentie44 helpen kan.
Representative Results
Eerste fenotypering experimenten nodig zijn voor het karakteriseren van nieuwe soorten en stammen en kunnen worden gebruikt als een gratis benadering de fylogenie en DNA-DNA hybridisatie experimenten die worden gebruikt voor het karakteriseren van nieuwe soorten. Streptomyces mutanten die voortvloeien uit willekeurige mutagenese methoden zoals chemische, UV, of transposon mutagenese worden normaal gesproken aangeduid door directe, visuele schermen op agar platen. Koloniën van Streptomyces worden onderzocht op wijzigingen in fenotype in vergelijking met de wild-type, ouderlijke stam. Bijvoorbeeld, een lichter gekleurde luchtfoto mycelium kan duiden op een lager niveau van grijze pigment veroorzaakt door een defect van de sporevorming, of het ontbreken van een vage uitstraling is een indicatie van een blok in luchtfoto mycelium vorming (Figuur 1). Vele Streptomyceten produceren gepigmenteerde antibiotica in vegetatieve mycelium of omliggende agar. S. coelicolor produceert twee gepigmenteerde antibiotica evenals twee niet-gepigmenteerde ones. Actinorhodin is een antibioticum blauw-gepigmenteerde en undecylprodigiosin is een rood-gepigmenteerde antibiotica45. Stammen die eerste visuele kolonie schermen hebben ondergaan worden vervolgens doorgegeven door strepen voor enkele kolonies.
Naar aanleiding van visuele identificatie van potentieel interessante mutanten, stammen zijn onderworpen aan microscopisch onderzoek. Fase contrast microscopie is vooral geschikt voor de behandeling van Streptomyces mutanten voor ontwikkelingsstoornissen gebreken, met behulp van de wild-type stam als een besturingselement (Figuur 2). Wild type S. coelicolor kolonies produceren meestal een luchtfoto mycelium door ongeveer twee dagen van de groei bij 30 ° C op MS agar en lange ketens van sporen door drie dagen van de groei. De levenscyclus zal de voortgang iets langzamer of sneller op andere soorten media. Het is noodzakelijk dat de mutanten onder dezelfde voorwaarden als het wild type groei worden geanalyseerd wanneer de conclusies over de ontwikkelingstoxiciteit gebreken en vertragingen. Kale mutanten kunnen produceren sporen na langdurige groei op agarmedia. Een klasse van mutanten genoemd witte mutanten kunnen ofwel worden uitgesteld voor spore vorming, geven een vermindering in de overvloed aan sporen geproduceerd, produceren sporen met vorm en/of grootte defecten of gewoon produceren lagere niveaus van de volwassen, grijze spore pigment46 . Andere mutanten die tot nu toe onderzocht kunnen worden vertraagd of versneld in de progressie van de levenscyclus zoals de mutanten getroffen voor de accumulatie van signalering van moleculen (b.v., cyclische-di-GMP47).
Een eenvoudige opvolger van de techniek van de lichte microscopie van hierboven beschreven is fluorescentie microscopie propidium jodide vlek chromosomale DNA nucleoids en fluorescently geëtiketteerde tarwekiemen agglutinin gebruiken om de celwand van de sporevorming septa vlek. Sporen ontbreekt een chromosoom zullen verstoken van de rode propidium jodide kleuring, terwijl de sporen die minder DNA bevatten dan gebruikelijke kan worden geïdentificeerd als ze lijken te zijn gedaald kleuring (Figuur 3). Tarwekiemen agglutinin kan worden gebruikt om de celwand vlek en verschillen in de celwand kleuring patronen (d.w.z., celdeling gebreken) kunnen worden waargenomen. In Figuur 4 het wild-type stam van S. venezuelae, een soort die onlangs wordt gebruikt als een ander model heeft streptomycete vanwege de snellere levenscyclus en de mogelijkheid om te sporulate in vloeibare45, zijn gekleurd met WGA-FITC ophelderen de ladder-achtige array van divisie septa die meestal vroeg tijdens sporevorming gezien.
De eerste fenotypering strategieën hier beschreven moeten leiden tot het volgende: 1) identificatie van gemuteerde stammen van belang voor verdere studie; 2) verworven kennis over de onlangs vastgestelde mutant en de potentiële rol van het gen dat gemuteerd is geweest; 3) het formuleren van een volgende reeks van experimentele vervolgstappen die kan worden gebruikt om de rol van het gen in kwestie verder te verduidelijken. In het geval van een nieuw geïdentificeerde streptomycete uit de omgeving krijgt de onderzoeker kennis van de potentiële nieuwe soorten t.o.v. al gekenmerkt soorten Streptomyces.
Figuur 1: Foto van een representatieve agarplaat demonstreren macroscopische kolonie fenotypes van S. coelicolor. De agarplaat toont de fuzzy, grijze uiterlijk van de antenne mycelium voor wild-type S. coelicolor stam MT1110 (WT) in vergelijking met verschillende willekeurige transposon insertiemutanten met ontwikkelingsstoornissen fenotypen. Mutanten ontbreken ofwel een luchtfoto mycelium [kale (bld)] of een luchtfoto mycelium met verminderde spore pigmentatie [white (whi)]. Transposon mutanten werden gegenereerd met behulp van mini-Tn5 voor invoegpositie mutagenese6,7. De stammen werden geteeld op MS agar voor 5 dagen bij 30 ° C. De diameter van de petrischaal, 100 mm.
Figuur 2: Fase contrast microfoto tonen een vertegenwoordiger luchtfoto gloeidraad voor S. coelicolor witte mutant stammen met willekeurige transposon invoeging mutaties. (A) getoond is een representatieve wild type antenne gloeidraad die heeft ondergaan synchrone, regelmatig regelafstand celdelingen, produceren gelijkmatig gevormde en sporen (MT1110) formaat. (B--F) De overige panelen tonen de enorm verschillende microscopische fenotypes van verschillende witte mutanten die geïsoleerd via willekeurige transposon mutagenese werden. Paneel B toont een luchtfoto gloeidraad die geen sporevorming heeft ondergaan, maar in plaats daarvan heeft geproduceerd uitpuilende gebieden binnen de gloeidraad. Lange pijlen in C, Den F geven aan abnormaal grote sporen die karakteristiek voor mutanten, MIC42, MIC43 en TH49 zijn. De korte pijl in deelvenster D geeft een voorbeeld van een compartiment lysed spore. Paneel E toont de gedeeltelijk vernauwde kleinere compartimenten die kenmerkend voor de ketens van de spore geproduceerd door de mutant TH10 zijn. De stammen werden geteeld op MS agar voor 5 dagen bij 30 ° C. De mutanten zijn niets te maken met die worden weergegeven in Figuur 1. Een wild type spore is ongeveer 1.1 µm op de lengteas. Schaal bar = 2 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Vertegenwoordiger microfoto weergegeven: S. coelicolor mutant chromosoom segregatie fenotypen. (A) A diagram vertegenwoordiging toont de typische wild-type, regelmatig regelafstand kleuring uitstraling voor een keten van sporen (elke spore bevat chromosomale DNA) in vergelijking met de intermitterende kleuring patroon voor een mutant waarin een chromosoom segregatie defect. (B) elk paar panelen toont de dezelfde spore keten waargenomen door differentiële interferentie Contrast (DIC) beeld aan de linkerkant en een beeld van de jodide gebeitste fluorescentie propidium wordt weergegeven aan de rechterkant. Het fenotype van de wild-type (a, b) wordt vergeleken met twee willekeurige transposon insertiemutanten (c, d en e, f). Pijlen geven aan sporen verstoken van DNA. De stammen werden geteeld op MS agar voor 5 dagen bij 30 ° C. De mutanten die weergegeven zijn niets te maken met die in Figuur 1 en Figuur 2. Schaal bar = 1 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Fluorescentie opname van S. venezuelae wild-type stam gekleurd met WGA-FITC. (A) A diagram van een luchtfoto gloeidraad verschijnt glad met geen inspringingen en geen zichtbare tekenen van sporevorming met fase contrast microscopie in vergelijking met de ladder-achtige matrix van de celwand kleuring die aangeeft van een vroeg stadium van de sporevorming heeft begonnen in dat dezelfde gloeidraad met WGA-FITC onder fluorescentie microscopie. (B) microfoto van wild-type S. venezuelae. (een) glad luchtfoto filamenten staan onder kettingen van sporen. (b) binnen het mycelium weergegeven in het deelvenster, een luchtfoto gloeidraad in een vroeg stadium van ontwikkeling bezit een ladder-achtige serie van afzetting van de celwand. Pijlen geven aan de vorming van regelmatig regelafstand van cross-muren gekleurd door WGA-FITC die synchroon te ontwikkelen binnen een enkele antenne gloeidraad als het ontwikkelingsachterstand-geassocieerde sporevorming ondergaat. De spanning werd gekweekt op MYM ( Y-Oosten extract,Maltose, Malt extract) MYM agar voor 38 h bij 30 ° C. Schaal bar = 2 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Hier presenteren we protocollen voor beginnende Streptomyces onderzoekers om uit te voeren studies door de benodigde stappen voor het uitdragen van stammen en voorbereiding van voorraden voor langdurige opslag. Vervolgens beschrijven we de protocollen voor visuele en microscopische karakterisering van Streptomyces stammen. Enkele typische eerste stappen in fenotypering developmental mutanten zijn: 1) visueel onderzoek van de mutant kolonies in vergelijking met wild type kolonies op de drager van de agar; 2) fase contrast microscopie; en 3) fluorescentie microscopie van sporogenic luchtfoto schimmeldraden. Gebaseerd op het fenotype weergegeven in deze drie stappen, kan een verscheidenheid van technieken worden gebruikt om te verder onderscheiden het fenotype van een bepaalde spanning.
Eerste fenotypering experimenten worden gewoonlijk gebruikt om te karakteriseren van nieuwe soorten, het identificeren van mutanten van belang gedeeltelijk karakteriseren van mutanten en beginnen te onderscheiden van de typische rol van een bepaald gen op basis van het fenotype van een geïdentificeerde mutant. Al zijn de hier beschreven methoden gebruikt in het universitair onderwijs laboratoria te identificeren en te karakteriseren van een grote verscheidenheid van Streptomyces mutanten, met inbegrip van die met gebreken in celdeling48,49, 50 , 51 , 52 , 53 , 54, sporevorming55,56, luchtfoto mycelium vorming57,58, antibiotica productie59, tweede boodschapper signalering47en chromosoom segregatie 60. deze technieken zijn de essentiële eerste stappen om het bepalen van het fenotype van mutanten in het algemeen en het onthullen van een grote hoeveelheid belangrijke informatie over de functies van genen van belang. Het kan gemakkelijk worden uitgebreid tot andere soorten van Streptomyces methodenen al zijn gebruikt om te beschrijven van stammen van S. griseus, S. venezuelae, S. schurften vele andere Streptomyceten. De video protocollen die hier beschreven worden verwacht om te dienen als een belangrijke bron voor nieuwe onderzoekers invoeren van Streptomyces onderzoeksgebieden, zoals op het gebied van Geneesmiddelenontwikkeling. Het gaat hierbij om de nieuwe instructeurs die werken aan de bestrijding van de crisis van de resistentie tegen antibiotica en opleiden van de talloze aantallen nieuwe undergraduate student onderzoekers toetreden tot de inspanningen van crowdsourcing van de kleine wereld-initiatief.
De hier beschreven technieken kunnen gemakkelijk aangepast worden aan college en high school gebruik in de klas naast onderzoekslaboratoria, met behulp van de wijzigingen beschreven in de video en tekst. Studenten in een eerste jaar microscopie module op een kleine liberal arts college konden strijk stammen, digitale foto's nemen van stammen geteeld op agarmedia, en het uitvoeren van fase-contrast en fluorescentie microscopie, wat in de indiening van uitmondde een portfolio van meerdere panelen cijfers aan het einde van de module 3 week, 15 h-lab werk vertegenwoordigen. Ongeveer 160 eerstejaarsstudenten waren verantwoordelijk voor de eerste fenotypering van 320 roman transposon mutanten. Undergraduate onderzoek studenten aan drie instellingen deelgenomen aan de eerste fenotypering voor extra mutanten en de daaropvolgende karakterisering van veel van de stammen. De uitgebreide gegevens die zijn verkregen in een relatief korte periode van tijd, illustreren de waarde van de hier beschreven protocollen. Honderden extra mutanten zijn opgeslagen als glycerol mycelial voorraden voor toekomstige karakterisering.
Na de eerste experimenten hier beschreven, kan een verscheidenheid van methoden worden gebruikt om uit te breiden van de kwaliteit van de informatie met betrekking tot de stammen van belang. Als de mutatie niet bekend is, moet een genotypering-methode worden gebruikt om te bepalen het type en/of de locatie van de mutatie. Bijvoorbeeld, willekeurige transposon mutagenese van het wild-type chromosoom6,7,8,9,10,11,12,13 resulteert in kolonies die eerste fenotypische schermen zoals die beschreven hierboven moeten ondergaan. Vervolgens moet de locatie van het transposon worden vastgesteld met behulp van een techniek zoals inverse polymerase kettingreactie (iPCR)61. Bepaling van het genotype van de pas ontdekte mutanten is een belangrijke stap na eerste karakterisering.
Sommige veelgebruikte geavanceerde methoden voor de analyse van de latere fenotypering die kunnen worden vermeld in de klas of onderzocht door middel van verder onderzoek omvatten groen fluorescente proteïne (GFP) tagging om te bepalen van lokalisatie patronen voor de proteïne van belang, gen expressie analyses uitgevoerd, zoals real time kwantitatieve PCR (qPCR) en wereldwijde gen expressiepatronen van wild-type versus mutant via RNA Sequencing (RNA-seq). Fenotypering vaardigheden zijn eveneens vereist voor genetische complementatie analyse. In een experiment complementatie is de wild-type kopie van een gen in een gemuteerde stam om te bepalen of het toegevoegde allel van de verlies-van-functie van het gemuteerde allel compenseren kan binnengebracht. Het vergelijken van het fenotype van de aangevuld stam met die van de oorspronkelijke mutant zowel de ouderlijke, is wild-type stam vereist.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs wil erkennen Otterbein University voor Undergraduate Student onderzoeksbeurzen en Student Research Fund Awards GVK en SGK; de Otterbein Professor Gilbert E. Mills Memorial begiftigd Sabbatical programma Award en het departement biologie en aardwetenschappen faculteit Research and Scholarship Award naar JAB begiftigd. De Bert en Jane hoorn begiftigd Student Fonds voor onderzoek in de wetenschappen werd toegekend aan GVK en SGK. De auteurs wil ook graag mijn dankbaarheid uitspreken dat Duquesne University gefinancierd Undergraduate programma onderzoeksbeurzen voor GVK en SGK. Voormalige Juniata College undergraduate onderzoek studenten, Ryan Johnson en Lindsey Draper bijgedragen de microscopie beelden voor figuren 2 en 3, respectievelijk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immersion Oil (Type DF) | Cragille | 16482 | |
| Lens Paper | Fisherbrand | 11-995 | |
| Sterile Water | GeneMate | G-3250-1L | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| Toothpicks (flat) | Target | 081-22-1957 | |
| Pipette Tips (10 mL) | GeneMate | P-1240-10 | |
| Pipette Tips (200 mL) | GeneMate | P-1240-200Y | |
| Pipette Tips (1,250 mL) | GeneMate | P-1240-1250 | |
| Wooden Applicators 6'' | Solon Care | 070809 | |
| Cotton Swabs | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| Soy Flour | Bob's Red Mill | 1516C164 | |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-1KG | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
| Glycerol 100% | VWR amresco life science | 0854-1L | |
| 0.8% NaCl (Saline) | Sigma-Aldrich | SLBB9000V | |
| 1.2 mL freezer tube | NEST | 606101 | |
| Ultra low (-80 °C) freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Cryo Safety Gloves | Bel-Art | H13201 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5856-500EA | |
| Cover slips #1.5 | Thomas Scientific | 64-0721 | |
| Slides | Carolina | 63-2010 | |
| Autoclave | Tuttnauer | 2540E | |
| Phase-Contrast Microscope | Olympus | BX40 | |
| Forceps | Carolina Biological | 624504 | |
| Bunsen Burner | Carolina Biological | 706706 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| PBS (phosphate buffer saline) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| WGA-FITC | Biotium | 29022-1 | |
| Clear nail polish | OPI | 22001009000 | |
| ImageJ | NIH | Free Software | |
| 100 mL beaker | Pyrex USA | 1000-T | |
| 1 L beaker | Carolina Biological | 721253 | |
| 1 L flask | Fisherbrand | S63274 | |
| 250 mL flask | Pyrex USA | 4980 | |
| 100 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721788 | |
| 500 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721792 | |
| Stir Bar | Fisher Scientific | 22-271825 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Camera for Microscope | Olympus | DP72 | |
| Nitrile Examination Gloves (Med) | Bio Excell | 71011002 | |
| Vortex Mixer | Carolina Biological | 701077 |
References
- Barka, E. A., et al. Taxonomy, physiology, and natural products of Actinobacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 1-43 (2015).
- Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (2), 141-147 (2002).
- Redenbach, M., et al. A set of ordered cosmids and a detailed genetic and physical map for the 8 Mb Streptomyces coelicolor A3(2) chromosome. Mol. Microbiol. 21 (1), 77-96 (1996).
- McCormick, J. R., Flardh, K. Signals and regulators that govern Streptomyces development. FEMS Microbiol. Rev. 36 (1), 206-231 (2012).
- Flardh, K., Buttner, M. J. Streptomyces morphogenetics: dissecting differentiation in a filamentous bacterium. Nat. Rev. Microbiol. 7 (1), 36-49 (2009).
- Bennett, J. A. Molecular Genetic analysis of division and development in Streptomyces coelicolor. , Ph.D. Dissertation (2007).
- Hull, T. D., et al. Cyclic Di-GMP phosphodiesterases RmdA and RmdB are involved in regulating colony morphology and development in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 194 (17), 4642-4651 (2012).
- Petzke, L., Luzhetskyy, A. In vivo Tn5-based transposon mutagenesis of streptomycetes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 83 (5), 979-986 (2009).
- Xu, Z., et al. Large-Scale Transposition Mutagenesis of Streptomyces coelicolor Identifies Hundreds of Genes Influencing Antibiotic Biosynthesis. Appl. Environ. Microbiol. 83 (6), (2017).
- Fernandez-Martinez, L. T., et al. A transposon insertion single-gene knockout library and new ordered cosmid library for the model organism Streptomyces coelicolor A3(2). Antonie Van Leeuwenhoek. 99 (3), 515-522 (2011).
- Gehring, A. M., Nodwell, J. R., Beverley, S. M., Losick, R. Genomewide insertional mutagenesis in Streptomyces coelicolor reveals additional genes involved in morphological differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (17), 9642-9647 (2000).
- Bishop, A., Fielding, S., Dyson, P., Herron, P. Systematic insertional mutagenesis of a streptomycete genome: a link between osmoadaptation and antibiotic production. Genome Res. 14 (5), 893-900 (2004).
- Bilyk, B., Weber, S., Myronovskyi, M., Bilyk, O., Petzke, L., Luzhetskyy, A. In vivo random mutagenesis of streptomycetes using mariner-based transposon Himar1. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (1), 351-359 (2013).
- Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. Practical Streptomyces Genetics. , The John Innes Foundation. (2000).
- Gust, B., Kieser, T., Chater, K. F. REDIRECT technology: PCR-targeting system in Streptomyces coelicolor. , John Innes Centre, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 7UH, United Kingdom. (2002).
- Gust, B., Chandra, G., Jakimowicz, D., Yuqing, T., Bruton, C. J., Chater, K. F. Lambda red-mediated genetic manipulation of antibiotic-producing Streptomyces. Adv. Appl. Microbiol. 54, 107-128 (2004).
- Tong, Y., Charusanti, P., Zhang, L., Weber, T., Lee, S. Y. CRISPR-Cas9 based engineering of Actinomycetal genomes. ACS Synth. Biol. 4 (9), 1020-1029 (2015).
- Huang, H., Zheng, G., Jiang, W., Hu, H., Lu, Y. One-step high-efficiency CRISPR/Cas9-mediated genome editing in Streptomyces. Acta BiochimBiophys. Sin.(Shanghai). 47 (4), 231-243 (2015).
- Cobb, R. E., Wang, Y., Zhao, H. High-efficiency multiplex genome editing of Streptomyces species using an engineered CRISPR/Cas system. ACS Synth. Biol. 4 (6), 723-728 (2015).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Brown, E. D., Wright, G. D. Antibacterial drug discovery in the resistance era. Nature. 529 (7586), 336-343 (2016).
- Dodds, D. R. Antibiotic resistance: A current epilogue. Biochem. Pharmacol. 134, 139-146 (2017).
- Caruso, J. P., Israel, N., Rowland, K., Lovelace, M. J., Saunders, M. J. Citizen Science: The Small World Initiative improved lecture grades and California critical thinking skills test scores of nonscience major students at Florida Atlantic University. J. Microbiol. Biol. Educ. 17 (1), 156-162 (2016).
- Davis, E., et al. Antibiotic discovery throughout the Small World Initiative: A molecular strategy to identify biosynthetic gene clusters involved in antagonistic activity. Microbiology Open. 6 (3), (2017).
- van Keulen, G., Dyson, P. J. Production of specialized metabolites by Streptomyces coelicolor A3(2). Adv. Appl. Microbiol. 89, 217-266 (2014).
- Aigle, B., et al. Genome mining of Streptomyces ambofaciens. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 41 (2), 251-263 (2014).
- Antoraz, S., Santamaria, R. I., Diaz, M., Sanz, D., Rodriguez, H. Toward a new focus in antibiotic and drug discovery from the Streptomyces arsenal. Front. Microbiol. 6, 461 (2015).
- Onaka, H. Novel antibiotic screening methods to awaken silent or cryptic secondary metabolic pathways in actinomycetes. J. Antibiot.(Tokyo). 70 (8), 865-870 (2017).
- Chen, J., Wu, Q., Hawas, U. W., Wang, H. Genetic regulation and manipulation for natural product discovery. Appl. Microbiol. Biotechnol. 100 (7), 2953-2965 (2016).
- Katz, L., Baltz, R. H. Natural product discovery: past, present, and future. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 43 (2-3), 155-176 (2016).
- Liu, G., Chater, K. F., Chandra, G., Niu, G., Tan, H. Molecular regulation of antibiotic biosynthesis in Streptomyces. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 77 (1), 112-143 (2013).
- den Hengst, C. D., Tran, N. T., Bibb, M. J., Chandra, G., Leskiw, B. K., Buttner, M. J. Genes essential for morphological development and antibiotic production in Streptomyces coelicolor are targets of BldD during vegetative growth. Mol. Microbiol. 78 (2), 361-379 (2010).
- Tran, N. T., Den Hengst, C. D., Gomez-Escribano, J. P., Buttner, M. J. Identification and characterization of CdgB, a diguanylate cyclase involved in developmental processes in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 193 (12), 3100-3108 (2011).
- Anonymous. Lab Safety. Proper Use of Autoclaves. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
- Border, B. G., Rice-Spearman, L. Microwaves in the laboratory: effective decontamination. Clin. Lab. Sci. 12 (3), 156-160 (1999).
- Bhattacharjee, M. K., Delsol, J. K. Does microwave sterilization of growth media involve any non-thermal effect? J. Microbiol. Methods. 96, 70-72 (2014).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Anonymous, General Laboratory Techniques. An Introduction to the Micropipettor. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
- Baltz, R. H. Genetic manipulation of secondary metabolite biosynthesis for improved production in Streptomyces and other actinomycetes. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 43 (2-3), 343-370 (2016).
- Frohlich, V. C. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. J. Vis. Exp. (18), e844 (2008).
- Anonymous, General Laboratory Techniques. Introduction to Light Microscopy. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory. 3, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1989).
- Anonymous, General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anat. Rec.(Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Chater, K. F. Recent advances in understanding Streptomyces. F1000Res. 5, (2016).
- Chater, K. F. Regulation of sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2): a checkpoint multiplex? Curr. Opin. Microbiol. 4 (6), 667-673 (2016).
- Tschowri, N. Cyclic dinucleotide-controlled regulatory pathways in Streptomyces species. J. Bacteriol. 198 (1), 47-54 (2016).
- Bennett, J. A., et al. Medium-dependent phenotypes of Streptomyces coelicolor with mutations in ftsI or ftsW. J. Bacteriol. 191 (2), 661-664 (2009).
- Mistry, B. V., Del Sol, R., Wright, C., Findlay, K., Dyson, P. FtsW is a dispensable cell division protein required for Z-ring stabilization during sporulation septation in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 190 (16), 5555-5566 (2008).
- Bennett, J. A., Aimino, R. M., McCormick, J. R. Streptomyces coelicolor genes ftsL and divIC play a role in cell division but are dispensable for colony formation. J. Bacteriol. 189 (24), 8982-8992 (2007).
- Bennett, J. A., McCormick, J. R. Two new loci affecting cell division identified as suppressors of an ftsQ-null mutation in Streptomyces coelicolor A3(2). FEMS Microbiol. Lett. 202 (2), 251-256 (2001).
- Dharmatilake, A. J., Kendrick, K. E. Expression of the division-controlling gene ftsZ during growth and sporulation of the filamentous bacterium Streptomyces griseus. Gene. 147 (1), 21-28 (1994).
- McCormick, J. R., Losick, R. Cell division gene ftsQ is required for efficient sporulation but not growth and viability in Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 178 (17), 5295-5301 (1996).
- McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. Growth and viability of Streptomyces coelicolor mutant for the cell division gene ftsZ. Mol. Microbiol. 14 (2), 243-254 (1994).
- Flärdh, K., Findlay, K. C., Chater, K. F. Association of early sporulation genes with suggested developmental decision points in Streptomyces coelicolor A3(2). Microbiology. 145 (9), 2229-2243 (1999).
- van Wezel, G. P., van der Meulen, J., Kawamoto, S., Luiten, R. G., Koerten, H. K., Kraal, B. ssgA is essential for sporulation of Streptomyces coelicolor A3(2) and affects hyphal development by stimulating septum formation. J. Bacteriol. 182 (20), 5653-5662 (2000).
- Capstick, D. S., Willey, J. M., Buttner, M. J., Elliot, M. A. SapB and the chaplins: connections between morphogenetic proteins in Streptomyces coelicolor. Mol. Microbiol. 64 (3), 602-613 (2007).
- Ma, H., Kendall, K. Cloning and analysis of a gene cluster from Streptomyces coelicolor that causes accelerated aerial mycelium formation in Streptomyces lividans. J. Bacteriol. 176 (12), 3800-3811 (1994).
- Xu, Z., et al. Large-scale transposition mutagenesis of Streptomyces coelicolor identifies hundreds of genes influencing antibiotic biosynthesis. Appl. Environ. Microbiol. 83 (6), (2017).
- Dedrick, R. M., Wildschutte, H., McCormick, J. R. Genetic interactions of smc, ftsK, and parB genes in Streptomyces coelicolor and their developmental genome segregation phenotypes. J. Bacteriol. 191 (1), 320-332 (2009).
- Pavlopoulos, A. Identification of DNA sequences that flank a known region by inverse PCR. Methods Mol. Biol. 772, 267-275 (2011).
