Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הערכות חזותי מיקרוסקופיים של מוטציות התפתחותית Streptomyces

Published: September 12, 2018 doi: 10.3791/57373
Automatic Translation
1, 1, 1, 2
1Department of Biology and Earth Science, Biochemistry and Molecular Biology Program, Otterbein University, 2Department of Biological Sciences, Duquesne University

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור המתחיל החוקרים ליזום phenotyping עבור סוג חיידקים חשובים פרמקולוגית של Streptomyces.

Abstract

Streptomycetes הם חיידקים אדמה filamentous השייכת שלקרוא Actinobacteria פזורים ברחבי העולם, לייצר מגוון רחב של אנטיביוטיקה, מטבוליטים משניים אחרים. Streptomyces coelicolor הוא מין מאופיין היטב, פתוגניים שאינם זה לבצע מגוון רחב של ניתוחים במעבדה. Phenotyping בשיטות המתוארות כאן להשתמש ס coelicolor כמו streptomycete דגם; עם זאת, השיטות ישימות כל בני הסוג גדולים, כמו גם כמה actinomycetes הקשורים קשר הדוק. Phenotyping יש צורך לאפיין מינים חדשים של Streptomyces זיהה בסביבה, זה גם צעד ראשון חיוני באפיון לאחרונה מבודד מוטציה זנים של Streptomyces. מיומנות ב phenotyping חשוב עבור החוקרים חדשים רבים אשר נכנסים לשדה המחקר Streptomyces , כולל המחקר של התפתחות חיידקים, חלוקת התא, כרומוזום סגרגציה השליח השני איתות. מיקור המונים האחרונות של גילוי לאנטיביוטיקה תוך בידודו של חיידקים אדמה חדשה הביאה צורך בהכשרה phenotyping למדריכים החדשים בשטח המחקר Streptomyces , מכללה או תיכון שלהם מוגבר סטודנטים. כתב יד זה מתאר שיטות הפצת זן חיידקי, אחסון של אפיון באמצעות בדיקה חזותית, מיקרוסקופיים. לאחר קריאת מאמר זה, חוקרים חדשים (מעבדות מיקרוביולוגיה החינוך ומדענים אזרח) אמור להיות מסוגל לתמרן זנים Streptomyces ולהתחיל אפיון ויזואלי ניסויים.

Introduction

Streptomycetes הם חיידקים גראם חיוביים, filamentous קרקע ידועה וביכולתם לייצר מגוון של מטבוליטים משניים, כולל שני שלישים של אנטיביוטיקה זמין מסחרית, כמו גם כמה אנטי הגידול, תרופות נגד איידס, ואני נגד טפילים 1. ס coelicolor הוא החבר מאופיין ביותר גנטית של סוג2,3 , והוא המין בשימוש בשיטות המתוארות כאן. ס coelicolor יש מחזור חיים מורכב מתחיל עם הנביטה של נבג יחיד, ומתחזקים נרחב, מסעף תפטיר צמח שגדל לתוך המדיום אגר. כל מחזור החיים של התמורה, חוטים אווירי נוצרות לשבור את מתח הפנים של תפטיר המצע, סוף סוף מחולקים שרשראות ארוכות של תאים מומרים בסופו של דבר נבגים בוגרת, גריי-פיגמנט. פיזור של נבגים שהוקם אלה מהווה את תחילת מחזור החיים הבא4.

בגלל שלה דפוס מורכבות של בידול, ס coelicolor משמש מודל מצוין עבור חקר התפתחות חיידקים. מבחינה היסטורית, מוטציות כתוצאה בבלוקים עבור שני שלבים עיקריים של פיתוח ומפיקים פנוטיפים חזותיים ברורים. המוטציות (קירח) בנין נחסמות על היווצרות תפטיר אווירי ולהוביל חוסר תפטיר אוויר מעורפל להקניית מראה המושבה "קירח". מוטציות עכבות במבנה נבג, ההבשלה מכונים מוטציות הל (לבן) כי הם בדרך כלל נכשלים לייצר רמות פראי-סוג של הפיגמנט נבג אפור תפטיר אוויר נשאר לבן. מוטאנטים מעניינים אחרים הם והשרירי לאנטיביוטיקה ייצור, חלוקת התא, סגרגציה כרומוזום או תהליכים חשובים אחרים,4,5.

למרות גילוי גנים התפתחותיים רבים במינים Streptomyces , ישנם רבים יותר האמינו להתקיים בהתבסס על חוסר הרוויה של מסכי מוטציה. מעבדות שלנו להמשיך לזהות גנים התפתחותיים חדשים באמצעות מערכת transposon מיני ואנחנו יש נבנה. הרומן זנים מוטציה מבודד בניסויים מוטגנזה מכוונת אקראי עם transposon שלנו עוברים סינון פנוטיפי כדי לזהות את תפקיד אפשרי של כל חדש ג'ין גילה6,7. שיטות phenotyping חיידקי המתוארים כאן הרלוונטיים מוטציות Streptomyces מבודדים-transposon מוטגנזה מכוונת8,9,10,11,12, 13 ו אקראית בשיטות אחרות, כגון כימי, אולטרה סגול (UV) מוטגנזה מכוונת14, כמו גם בנייה בבימויו של מוטציות כגון מחיקות הגן באמצעות15,recombineering16 או CRISPR-Cas9 (מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר) הגנום עריכה טכנולוגיה17,18,19 ו מוטציות נקודה20.

עמידות לאנטיביוטיקה בקרב פתוגנים הופך נפוץ יותר ויותר, הצורך אנטיביוטיקה חדשה הופך יותר ויותר דחוף21,22. "היוזמה עולם קטן" (או מושכל) הוא יעיל המדע, טכנולוגיה, הנדסה, מתמטיקה (גזע) למידה23 ומחקר אסטרטגיה24 כדי להילחם עמידות לאנטיביוטיקה דרך מיקור המונים של סטודנטים, ועוד לאחרונה תלמידי תיכון. תמיכה קורסים עבודתו כוללת זיהוי חיידקים אדמה חדשה לייצר אנטיביוטיקה הרומן (http://www.smallworldinitiative.org). הוא האמין כי המקור העיקרי של אנטיביוטיקה שעדיין לא התגלו ימשיכו להיות Streptomyces מינים נמצאו במגוון רחב של אדמה ומים בתי גידול25,26,27,28, 29,31. לאחרונה, המעבדה שלנו עבודתם של אחרים גילו והם יהיו מאופיין איתות גנים במינים Streptomyces המסדירים מורפולוגיה ופיתוח, לרבות ייצור לאנטיביוטיקה7,32. 33. שינויים בביטוי הגנים האלה לגרום שינוי הכמות ואת העיתוי של אנטיביוטיקה המיוצר. Phenotyping מיומן של מינים חדשים, המוטנטים מייצרי אנטיביוטיקה החדשים ימשיכו להיות חשוב. כמו מדריכים חדשים ותלמידים שלהם להיות התורמים העיקריים בתחום של גילוי תרופות, הכשרה phenotyping חיידקי הוא הכרחי עבור ההצלחה של אנשים אלה המתחיל. יתר על כן, הניסויים האלה הם צייתן בתיכון גזע או אוניברסיטת מיקרוביולוגיה החינוך מעבדות. הם מייצגים הפגנה של עקרונות יסוד גנטי מיקרוביאלי מעבדת הוראה הגדרת.

Protocol

1. מכינים כלי נגינה, תרבות המדיה, פתרונות, צלחות פטרי

  1. אוטוקלב קיסמים בתוך 50 מ ל מכוסה ברדיד אלומיניום, כדי לשמור על סטריליות.
  2. לעקר כל אבזרי זה יהיה בשימוש החיטוי (טיפים, מקלות, כלי זכוכית, וכו ').
    הערה: זהירות! בצע את ההוראות כל בטיחות עבור דגם אוטוקלב בשימוש. אוטוקלאבים להוות סיכון פיצוצים, כוויות אדים, מגע עם משטחים חמים, חומרים, מדיה. אוטוקלב בטיחות, להציג "שימוש נאות של אוטוקלאבים"34.
  3. הכינו MS אגר (מניטול סויה קמח (SFM))14 לגדול תרבויות.
    1. להוסיף 5 g של קמח סויה, 5 g של אגר בקבוק 1 ליטר.
    2. להמיס 5 גר' מניטול ב 250 מ של מי ברז, לוותר על תוך הבקבוק המכילות את קמח הסויה ואת אגר.
    3. להוסיף את קצף תקע ו רדיד אלומיניום לפתיחה של הבקבוק, החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס, 15 psi במשך לפחות 30 דקות.
      התראה: בינוני שחין בקלות. השתמש בקבוקון שיכול להכיל לפחות ארבע פעמים נפח בפועל של MS אגר להיות בלוק. סיר לחץ סטנדרטי יכול לשמש במקום החיטוי עם שיקולי בטיחות דומה. לחלופין, ניתן להשתמש תנור מיקרוגל לחטא מדיה וחומרים אם גישה החיטוי אינו אפשרי35,36. מורים בתיכון ייתכן שתרצה גם לשתף פעולה עם מקומיים מכללות או אוניברסיטאות לגשת אספקה בלוק.
    4. מדיה מגניב עד נוח מספיק כדי להתמודד. להיזהר לא לצנן את זה במשך זמן רב מדי, כי אגר עפור בטמפרטורה שמתחת 50 מעלות צלזיוס.
    5. שופכים את MS אגר מ הבקבוק לתוך צלחות פטרי סטריליות עד בתחתית כל צלחת פטרי הוא בערך חצי מלא (כ 25 מ"ל של מדיה לכל צלחת פטרי). אפשר לגבש לפני השימוש פלטות אגר. חנות פלטות אגר בשקית ניילון בטמפרטורת החדר עד שהוא נדרש.
      הערה: פלטות אגר גם ניתן לאחסן במקרר, במיוחד אם אנטיביוטיקה יש צורך בכלי התקשורת.

2. רצף Streptomyces על גבי לוחות עבור הפצת

  1. זני Streptomyces פס על גבי פלטות אגר MS למושבות יחיד באמצעות שיטה סטנדרטית, כגון המשולש צובעות שיטה כפי שמוצג סנדרס, 201237.
    הערה: ללולאה לחסן או קיסמים סטרילי עשוי לשמש. אופציונלי: מדיה אחרים משמשים עבור מינים Streptomyces , כגון R2YE ותקשורתי מזערי14.
  2. דגירה הצלחות ב- 30 ° C.
  3. Restreak הצלחות על-ידי בחירת שמושבה בודדת כל 4-6 ימים. כמו מושבות גיל שהם הופכים נוטה מוטציה אקראית.

3. ליצור את מניות Mycelial גליצרול לאחסון חיידקי

הערה: Mycelial מניות יהיה ליצור עבור כל זני Streptomyces , כולל בעת שנסע בנין זנים, ואת מוטאנטים התפתחותיים אחרים, כי הם אפשרות להשלים הנבגה.

  1. Macerate 15-20 מושבות ב 200-500 µL של גליצרול 20% שימוש של המוליך פינים מעץ סטרילי.
  2. להעביר את slurry של המושבות התמוסס 1.5 mL מקפיא תרבות צינור, באמצעות micropipette או פיפטה העברה סטרילי.
    הערה: היסודות של שימוש micropipette מכוסים במקום38.
  3. להוסיף גליצרול 20% מספיק כדי להפוך את עוצמת הקול הסופי 1 מ"ל ומערבבים בעדינות. מאגר דגימות ב-80 מעלות צלזיוס.
    הערה: זהירות! כפפות בטיחות קריוגני שימוש, חלוק מעבדה כדי להגן על העור מפני מגע עם קור עז. לחלופין, ניתן להשתמש מקפיא-20 ° C עם פוטנציאל הפחתה בזמן אחסון לטווח ארוך. הימנע מוגזמת הקפאה והפשרה של להרחיב את יכולת הקיום.

4. ליצור גליצרול נבג מניות עבור זנים מסוגל הנבגה

הערה: נבג מניות עדיפים הכדאיות לטווח ארוך אבל רק ריאלי עבור זנים המסוגלים השלמת הנבגה.

  1. מורחים µL 100 התמוסס חומר (מתוך שלב 3.1) על צלחת אגר להשיג דשא confluent של צמיחה37.
    הערה: התפשטות ציפוי מוצג סנדרס37 (שינוי: מסתובב אינה נדרשת.). הלוח ניתן להפעיל ביד אחת תוך שימוש ביד האחרת כדי להזיז את מפזר באופן עדין הלוך תנועה על פני התקשורת אגר.
    1. Pipet 100 µL של תפטיר התמוסס למרכז צלחת אגר MS.
    2. לחטא של זכוכית או מתכת הפצת הכלי על ידי חלקית השוקע 70% אתנול ולהעביר את מפזר פעם לאט דרך להבה מבער בונזן לזרז האידוי של האתנול.
      התראה: אתנול הוא דליק. אין למקם את מפזר בוערים אתנול או לאפשר על ירידה הבוערים של אתנול ליפול לתוך המנה אתנול. לחלופין, השתמש ספוגית כותנה סטרילי חד פעמיות כדי להפיץ את החיידקים בצלחת, אשר דורשת אתנול או להבה.
    3. התור אגר MS צלחת עם יד אחת, תוך שימוש גב ותנועה הלאה כדי לחסן את הצלחת עם מפזר סטרילי.
    4. תקופת דגירה של 5 – 7 ימים ב- 30 ° C עד המתח sporulated היטב.
      הערה: הדגירה פעמים ישתנה בהתאם המין ואת המתח.
  2. להוסיף 2 מ ל תמיסת סטרילית (0.8% NaCl) למרכז של מדשאה confluent של תאים Streptomyces עבר הנבגה.
  3. הקציר נבגים על ידי שפשוף בעדינות את פני השטח של תפטיר עם סטרילי מזריקים לולאה (או במקלון צמר גפן), לאט לאט נע לכיוון הקצה של הדשא.
  4. Pipet מלוחים המכילים נבגים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. מערבולת נמרצות כדי לפרוץ נבג שרשראות תאים בודדים.
  5. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב x כ 2500 גרם.
  6. Pipet תגובת שיקוע, להשליך. לפזר בגדר נבג על ידי מערבולת נמרצת עצבנות סכום קטן של הנוזל הנותר.
  7. Resuspend הנבגים ב 1 מ"ל של גליצרול 20% על ידי ציור הפתרון למעלה ולמטה עם פיפטה.
  8. העברת המניות נבג גליצרול צינור מקפיא 1.5 mL. חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
    התראה: שימוש כפפות בטיחות קריוגני, חלוק מעבדה כדי להגן על העור מפני מגע עם קור עז. לחלופין, ניתן להשתמש מקפיא-20 ° C עם פוטנציאל הפחתה של הכדאיות בזמן אחסון לטווח ארוך. הימנע מוגזמת הקפאה והפשרה של להרחיב את יכולת הקיום.

5. ביצוע מוטגנזה מכוונת

  1. לבצע מוטגנזה מכוונת בהתבסס על התוצאה הרצויה כמו המופנה מבוא ונבדקים לאחרונה על ידי Baltz, 201639.
    הערה: ניסויים phenotyping לא יחייבו את מוטגנזה מכוונת, כגון כוונה לזהות מינים חדשים מן הסביבה. שיטות מוטגנזה מכוונת אקראי כוללות השימוש של transposon8,9,10,11,12,13, קרינת UV, או כימיקלים14. האתר מכוון מוטגנזה מכוונת15,16,17,18,19,20 טכניקות יכול לשמש ליצירת מוטציות נקודה ספציפית, מחיקות, או סוגים אחרים של מוטציות.

6. להשוות ולהקליט את המראה החזותי

  1. שימו לב המושבה מורפולוגיה עבור כל מוטציה לעומת המתח פראי-סוג האב אחרי שהתרוצץ כל זנים כמו שלב 2. להשוות את בידוד חדשים לזה של זן למד היטב, כגון ס' coelicolor או S. venezuelae, בעת אפיון של זנים חדשים של Streptomyces . הערה המאפיינים (איור 1) כגון הצורה הבסיסית, משטח המושבה (מטושטש, קירח, מקומט, וכו), אטימות, העלאת ופיגמנטציה (להבדיל בין תפטיר וגטטיבי, תפטיר אווירי, ו/או בינוני שמסביב).
  2. תווית של אגר MS זנים פראי-סוג של מוטציה צלחת, פס בדפוסי טריז (איור 1). להיזהר כי זן לא נוגע עוד מאמץ כדי למנוע זיהום לחצות. הערה את התאריך והשעה שבהם זנים הם קווצות שער לצלחת. דגירה הצלחות ב- 30 ° C.
  3. המקום גדל פטרי בצבע או נייר לבן כדי homogenize את הרקע. לכתוב על נייר שם זן, תאריך, בטמפרטורת דגירה, זמן בצלחת הראשונה ומבטא. קח תמונות דיגיטליות של הצלחת עם המידע האחרון נכתב על רקע נייר כך בלבול הוא ממוזער.
    הערה: הכתיבה יכול להיחתך מן התצלום במועד מאוחר יותר אם זה שישמש עבור איור הכנה.

7. ביצוע שלב-ניגודיות מיקרוסקופ

  1. לעקר את תגליתו על ידי שטיפה 70% אתנול, ואז עובר להבה מבער בונזן מתמוססות האתנול. לאפשר להתקרר.
  2. לחטא coverslips על ידי שטיפה אתנול 70% ומאפשר להם להתייבש בצלחת פטרי סטריליות אז.
  3. להכין טרמפ coverslip של הגידול חיידקי להיבדק.
    1. להרים coverslip עקר עם פינצטה סטרילי ולמקם את coverslip על צלחת אגר MS איפה צפופה התפתחות חיידקים. לחץ על גב coverslip בעדינות עם פינצטה כדי להבטיח העברת מספיק נבגים של חיידקים, תפטיר אווירי.
  4. לאסוף את coverslip מהצלחת ולמקם אותו כך הצד עם החומר תא פונה לכיוון פני השטח של שקופית מיקרוסקופ, עם טיפת 15 µL גליצרול 50% במים מוכנים הרכבה. להפחית את בועות אוויר על-ידי הצבת את coverslip בזווית של 45° לשקופית ולתת לו ליפול על גבי גליצרול 50%.
  5. (אופציונלי) חותם עם נקי לק לשימור של השקופית.
  6. ביצוע שלב-ניגודיות מיקרוסקופ כפי שתואר על ידי פרוליך40 במרווחי זמן שונים במהלך מחזורי החיים.
    הערה: הדמיה חוזרות מאפשר ניתוח מלא יותר את היכולת לזהות את עיכוב בהתפתחות. באופן עצמאי חזור על התצפיות כדי להבטיח דיוק הפארמצבטית.
    1. למקם את השקופית מוכנים על הבמה מיקרוסקופ, להוסיף טיפה של שמן טבילה למרכז של תגית כיסוי. לסובב את שלב X 100 מטרת למקם ולהגדיר צריח מעבה את הרקע המתאים שלב "תואמים". למקד את התמונה באמצעות רק הידית התאמת משובח פעם העדשה אובייקטיבית הוא במגע עם השמן.
    2. בחן מספר שדות ראייה להבחין ההבדלים ניכרת ועקבית בין זנים מוטציה לסוג הפראי, כגון היכולת טופס נבגים, נבג ו צורה בגודל המספר הכולל של נבגים (ראה איור 2).
      הערה: חלופות במיקרוסקופ ניגוד שלב כוללים התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC) מיקרוסקופיה40 , טכניקות צביעת פשוטה עבור שימוש עם שדה בהיר מיקרוסקופים41, כגון צביעת קריסטל ויולט.

8. ביצוע מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

  1. לעקר את תגליתו על ידי שטיפה אתנול 70% ולאחר מכן הפעלה דרך להבה מבער בונזן.
  2. להרים coverslip עקר עם פינצטה סטרילי והמקום על צלחת אגר MS שבו ניכרת התפתחות חיידקים. לגעת בגב coverslip בעדינות עם הפינצטה כדי להבטיח העברת מספיק נבגים של חיידקים, חוטים אווירי.
  3. לאסוף את coverslip מהצלחת ולמקם אותו כך הצד עם החומר תא פונה למעלה, על כרטיסים על מנת להקל על מניפולציה של coverslip.
  4. להציף את coverslip עם מתנול כקרח (~ 300 µL עבור coverslip2 20 x 20 מ מ) ולתת לו לחלוטין אוויר יבש.
    זהירות: מתנול היא מוטגן. יש להימנע ממגע ישיר עם העור.
  5. לשטוף את coverslip שלוש פעמים פוספט Buffered מלוחים (PBS)42 על ידי בעדינות dispensing והסרה של הפתרון.
  6. להוסיף 15 µL של 100 μg/ml יודיד Propidium ו/או μg/מ"ל נבט-חיטה-Agglutinin מצומדת כדי fluorescein isothiocyanate (WGA-FITC) שבוצעו ב- 50% גליצרול שקופית שכותרתו מיקרוסקופ.
    הערה: Propidium יודיד כתמי DNA אדום כדי לזהות בהכפלת ה-DNA מיקום בזמן WGA-FITC כתמי קיר התא הירוק.
  7. היפוך coverslip עם הפנים כלפי מטה על גבי הירידה של הכתם פלורסנט בשקופית זכוכית. (אופציונלי) חותם עם לק ברורים לשימור של שקופית.  כמו הצבעים הם רגישים לאור, תקופת דגירה של 15 דקות בחדר החשוך או בתאורה עמומה.
  8. לצפות בשקופיות תחת עדשת 100 X המטרה באמצעות ניגוד שלב או מיקרוסקופ DIC מצויד epifluorescence עירור קוביות propidium יודיד (להגדיר מסנן 'טקסס אדום' או maxima עירור/פליטת 535/617 nm), FITC (FITC לסנן nm לקבוע או 490/525 maxima עירור/פליטה).
  9. במקום השקופית על הבמה ונוחות שימוש את ידיות התאמת בסדר וגסים.
  10. להתבונן על ידי קרינה פלואורסצנטית כפי שמוצג במקום43.
  11. השתמש חבילת תוכנה של תמונה חופשית ניתוח שיכול לעזור בזיהוי נבגים עם פלורסצנטיות נמוך העוצמה44.

Representative Results

Phenotyping הראשונית ניסויים נחוצים עבור אפיון מינים חדשים, זנים, יכול לשמש בגישה חינם פילוגנטיקה, DNA-DNA הכלאה ניסויים המשמשות לטיפול באפיון של זנים חדשים. Streptomyces מוטציות הנובעות מוטגנזה מכוונת אקראית בשיטות כגון כימיקלים, UV, או transposon מוטגנזה מכוונת מזוהים בדרך כלל דרך מסכי ישירה, חזותי על פלטות אגר. מושבות של Streptomyces נבדקים לשינויים בפנוטיפ לעומת המתח פראי-סוג, הורים. לדוגמה, תפטיר אווירי בצבע בהיר מצביעים על רמה נמוכה יותר של פיגמנט האפור הנגרם על ידי פגם הנבגה, או חוסר מראה מטושטש מעידה על חסימה במבנה תפטיר אווירי (איור 1). Streptomycetes רבים לייצר אנטיביוטיקה פיגמנט תפטיר וגטטיבי או אגר שמסביב. ס coelicolor מייצרת שני סוגי אנטיביוטיקה פיגמנט, כמו גם שני אלה ללא פיגמנט. Actinorhodin הוא אנטיביוטיקה-פיגמנט כחול והוא undecylprodigiosin45-פיגמנט אדום לאנטיביוטיקה. זנים שעברו ראשוני המושבה החזותית מסכי מופצים ואז על ידי ומבטא עבור מושבות יחיד.

בעקבות זיהוי חזותי של פוטנציאל מעניין מוטציות, זנים הם נתון בבדיקה מיקרוסקופית. שלב-ניגודיות מיקרוסקופ מתאימה במיוחד לבחינת Streptomyces מוטציות פגמים התפתחותית, באמצעות הלחץ פראי-סוג כפקד (איור 2). מושבות ס coelicolor פראי סוג בדרך כלל לייצר של תפטיר מהאוויר על ידי כיומיים של צמיחה ב 30 מעלות צלזיוס על אגר MS, שרשראות ארוכות של נבגים על ידי שלושה ימים של צמיחה. מחזור חיי יתפתחו מעט איטי או מהיר יותר על סוגי מדיה אחרים. זה הכרחי כי המוטציות לנתח בתנאים צמיחה אותו כסוג פראי בעת הסקת מסקנות על ליקויים התפתחותיים, עיכובים. מוטציות קירח עשויה לייצר נבגי לאחר צמיחה ממושכת במדיה אגר. מחלקה של מוטציות המכונה מוטציות לבן עשוי להתעכב גם על היווצרות נבג, להראות ירידה השפע של נבגים המיוצר, נבגים תוצרת עם פגמים צורה ו/או גודל, או פשוט לייצר רמות נמוכות יותר של פיגמנט ספורה בוגרת, אפור46 . מוטאנטים אחרים נחקרו עד כה מתעכבת או מואצת בהתקדמות מחזור החיים כגון המוטציות יושפע עבור ההצטברות של מולקולות (למשל, מחזורית-di-GMP47) איתות.

המשך פשוט הטכניקה מיקרוסקופ אור שתוארו לעיל היא מיקרוסקופ פלורסצנטיות באמצעות propidium יודיד הכתם בהכפלת ה-DNA nucleoids, agglutinin fluorescently שכותרתו נבט חיטה כתם בדופן התא הנבגה septa. נבגים חסר כרומוזום יהיה חסר יודיד propidium אדום מכתים, בעוד נבגים המכילים את הדנ א פחות מכפי הרגיל ניתן לזהות אם הם מופיעים כדי ירדו מכתים (איור 3). נבט חיטה agglutinin עשוי לשמש כדי להכתים את דופן התא, ייבחנו הבדלים דופן התא מכתים דפוסים (כלומר, חלוקת התא פגמים). בזן איור 4 הפראי-סוג של ס' venezuelae, זן לאחרונה משמשת כמודל עוד streptomycete בשל מחזור החיים מהיר יותר היכולת sporulate ב נוזלי45, יש נוטף WGA-FITC להבהיר המערך דמוי סולם של החטיבה septa שהם ראו בדרך כלל מוקדם במהלך הנבגה.

האסטרטגיות phenotyping הראשונית המתוארים כאן יביא הפעולות הבאות: 1) זיהוי זנים mutant הריבית ללימוד נוסף; 2) רכשה את הידע החשבונאי שזוהה ועל התפקיד הפוטנציאלי של גן זה יש כבר מוטציה; 3) ניסוח של סדרת השלבים הבאים ניסיוני יכול לשמש כדי להבהיר עוד יותר את התפקיד של הגן המדובר עוקבות. במקרה של streptomycete שזוהה מן הסביבה, החוקר יקבל ידע של מינים חדשים פוטנציאליים בהשוואה כבר מאופיין מינים של Streptomyces.

Figure 1
איור 1: תצלום של צלחת אגר נציג הוכחת המושבה מאקרוסקופית פנוטיפים של S. coelicolor. צלחת אגר מראה מעורפל, אפור המראה החזותי של תפטיר אווירי עבור פראי-סוג coelicolor ס זן MT1110 (WT) בהשוואה transposon אקראיים שונים ההכנסה מוטציות עם פנוטיפים התפתחותית. מוטציות חסרים גם של תפטיר אווירי [קירח (בנין)] או של תפטיר אווירי עם פיגמנטציה נבג מופחתת [לבן (א)]. מוטציות transposon נוצרו באמצעות מיני-Tn5 עבור הכניסה מוטגנזה מכוונת6,7. הזנים היו מבוגרים על MS אגר במשך 5 ימים ב- 30 ° C. צלחת פטרי קוטר 100 מ מ.

Figure 2
איור 2: שלב-ניגודיות micrographs מציג נציג אווירי בשביל המוטציה S. coelicolor לבן זנים המכילים transposon אקראיים ההכנסה מוטציות. (א) מוצג הוא פילמנט אווירי נציג פראי סוג עבר חלוקות תאים סינכרונית, המרווחות באופן קבוע, ייצור אחיד בצורת, בגודל נבגים (MT1110). (B–F) הלוחות הנותרים מראים על הפנוטיפים מיקרוסקופיים שונה לחלוטין של מוטציות לבן שונים שהיו מבודדים באמצעות מוטגנזה מכוונת transposon אקראיים. פאנל B מראה של פילמנט אווירי לא עבר הנבגה, אך במקום זאת הפיק בולטות שטחים בתוך חוט הלהט. חיצים ארוכים ב- C, Dו- F מציינים נבגים גדולה באופן חריג האופייניים של מוטציות MIC42, MIC43 ו- TH49. החץ קצר בחלונית D מציין דוגמה תא נבג lysed. פאנל E מראה התאים קטנים יותר בחלקו מכווץ האופייניים של הרשתות נבג המיוצר על ידי מוטציה TH10. הזנים היו מבוגרים על MS אגר במשך 5 ימים ב- 30 ° C. המוטציות אינן קשורות לאלו המוצגות באיור1. נבג פראי סוג הוא כ 1.1 מיקרומטר על ציר זמן. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: נציג micrographs מראה coelicolor ס מוטציה כרומוזום פנוטיפים סגרגציה. (א) A תרשים ייצוג מראה פראי-סוג, המרווחות באופן קבוע צביעת במראה הטיפוסי של שרשרת של נבגים (כל נבג מכיל DNA כרומוזומלית) לעומת התבנית מכתימים לסירוגין עבור מוטנט המציג כרומוזום סגרגציה פגם. (B) לכל זוג פאנלים מראה הנבג באותה שרשרת שנצפה על ידי ניגודיות התערבות דיפרנציאלית (DIC) התמונה משמאל תמונת פלורסצנטיות שהוכתמו יודיד propidium מוצגת בצד הימין. פנוטיפ פראי-סוג (a, b) לעומת שתי מוטציות ההכנסה transposon אקראיים (c, d ו- e, f). חיצים מציינים נבגים ללא ה-DNA. הזנים היו מבוגרים על MS אגר במשך 5 ימים ב- 30 ° C. המוטציות המוצגות אינן קשורות לאלו איור 1 ו- 2 איור. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: זריחה micrograph של זן פראי-סוג venezuelae ס מוכתם WGA-FITC. (א) A תרשים של פילמנט אווירי מופיעה חלקה עם אין כניסות ויש סימנים נראים לעין הנבגה באמצעות מיקרוסקופ שלב-ניגודיות בהשוואה המערך דמוי סולם של צביעת קיר התא, זה מצביע על שלב מוקדם הנבגה החלה את הלהט אותו באמצעות WGA-FITC תחת מיקרוסקופ זריחה. Micrographs (B) של פראי-סוג venezuelae ס. חוטים אווירי חלקה () נמצאים בין שרשראות של נבגים. (b) במרחק תפטיר שמוצג בחלונית, אחד נימה אווירי בשלב מוקדם בהתפתחות הנו מערך דמוי סולם של דופן התא התצהיר. חיצים מציינים היווצרות המרווחות באופן קבוע של צלב-קירות מוכתמת WGA-FITC המתפתחים באופן סינכרוני בתוך פילמנט אווירי יחיד כמו זה עובר הנבגה הקשורים נכה. המתח היה גדל על MYM MYM (altoseמ', תמצית מזרח Y, תמצית alt מ') אגר במשך 38 h ב- 30 ° C. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור מתחילים Streptomyces החוקרים ליזום מחקרים על-ידי הכללת השלבים הדרושים כדי להפיץ זנים ולהכין מניות לאחסון לטווח ארוך. לאחר מכן נתאר את הפרוטוקולים עבור אפיון ויזואלי, מיקרוסקופיים של זנים Streptomyces . כמה צעדים הראשונית טיפוסי phenotyping התפתחותית המוטציות הן: 1) בדיקה חזותית של המושבות מוטציה בהשוואה פראי סוג המושבות של אגר בינוני; 2) מיקרוסקופ שלב חדות; ו 3) זריחה מיקרוסקופיה של sporogenic hyphae אווירית. בהתבסס על פנוטיפ מוצגים שלושה שלבים אלה, במגוון טכניקות עשוי להיות מועסק להבחין נוספת של פנוטיפ למתח מסוים.

Phenotyping הראשונית ניסויים משמשים כדי לאפיין מינים חדשים, לזהות מוטציות של עניין, חלקית לאפיין מוטציות, ולהתחיל להבחין את התפקיד טיפוסי של גן מסוים על סמך על פנוטיפ של מזוהה מוטציה. כבר בשימוש בשיטות המתוארות כאן באוניברסיטה מלמד מעבדות כדי לזהות ולאפיין מגוון רחב של מוטציות Streptomyces , כולל אלה בעלי פגמים בחלוקת התא48,49, 50 , 51 , 52 , 53 , 54הנבגה55,56, תפטיר אווירי היווצרות57,58, ייצור לאנטיביוטיקה59, השליח השני איתות47, כרומוזום סגרגציה 60. שיטות אלה צעדים חיוניים לקביעת של פנוטיפ של מוטציות באופן כללי ולחשוף את כמות גדולה של מידע חשוב אודות התפקידים של הגנים של עניין. השיטות בקלות יורחב כדי מינים אחרים של Streptomyces , כבר השתמשו כדי לתאר את זני תזונתם העיקרי ס, ס venezuelae, גרדת סו streptomycetes רבים אחרים. הפרוטוקולים וידאו המתוארים כאן צפויים לשמש משאב חשוב עבור חוקרים חדשים נכנסים תחומי מחקר Streptomyces , כמו למשל בתחום גילוי תרופות. זה כולל את המדריכים החדשים אשר עובדים כדי להתמודד עם המשבר עמידות לאנטיביוטיקה ולחנך את מספרי אינספור של חוקרים הסטודנטים לתואר ראשון חדשים מצטרפים המאמצים מיקור המונים של היוזמה עולם קטן.

מהטכניקות שתוארו כאן ניתן בקלות להתאים לשימוש בכיתה במכללה ובתיכון בנוסף מעבדות מחקר, באמצעות השינויים המתוארים וידאו, טקסט. סטודנטים במודול מיקרוסקופ השנה הראשונה במכללה קטנה שבע האמנויות החופשיות הצליחו צובעות זנים, לקחת תמונות דיגיטליות של זנים גדל על אגר מדיה, ולבצע מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, זריחה, אשר הגיע לשיאו הגשת תיק של דמויות רב ספון בקצה של המודול 3 בשבוע, המייצג h 15 של עבודה בבית-lab. כ 160 לתלמידי השנה הראשונה היו אחראים phenotyping הראשונית של מוטציות transposon הרומן 320. תלמידי מחקר לתואר ראשון במוסדות שלושה השתתפו את phenotyping הראשוני של מוטציות נוספות ואפיון עוקבות של הזנים רבים. הנתונים מקיף שהושג תוך תקופה קצרה יחסית של זמן, ממחישים את הערך של הפרוטוקולים המתוארים כאן. מאות מוטציות נוספות אוחסנו גליצרול מניות mycelial של אפיון בעתיד.

בעקבות הניסויים הראשוניים המתוארים כאן, מגוון שיטות עשוי להיות מועסק כדי להאריך את האיכות של מידע המתייחס זנים מעניינים. אם המוטציה אינם ידועים, שיטה genotyping צריך להיות מועסק כדי לקבוע את סוג ו/או מיקום המוטציה. לדוגמה, transposon אקראיים מוטגנזה מכוונת פראי-סוג כרומוזום6,7,8,9,10,11,12,13 תוצאות במושבות צריך עוברים הראשונית פנוטיפי במסכים כגון מהמתואר לעיל. אז המיקום של transposon צריכה להיות מזוהה באמצעות טכניקה כגון פולימראז הופכי תגובת שרשרת (iPCR)61. קביעת של גנוטיפ של מוטציות שהתגלתה היא צעד חשוב בעקבות משלב האפיון הראשוני.

כמה שיטות מתקדמות נפוץ לניתוח phenotyping הבאים עשויים להיות הזכיר בכיתה או חקר באמצעות מחקרי המשך כוללים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תיוג כדי לקבוע תבניות לוקליזציה עבור החלבון של עניין, ג'ין ביטוי ניתוחים כגון נדל בפעם ה-PCR כמותי (qPCR) ודפוסי ביטוי גנים הכללית של פראי-סוג לעומת מוטציה באמצעות ה-RNA רצף (RNA-seq). Phenotyping מיומנויות נדרשות גם לניתוח קומפלמנטציה גנטי. בניסוי קומפלמנטציה, העותק פראי-סוג של גנים מוחדרים זן שעבר שינוי כדי לקבוע אם אלל שנוספו לאחרונה יכול לפצות על האובדן-של-הפונקציה של אלל מוטציה. השוואת של פנוטיפ של המתח המלווים לזה של המוטציה המקורי והן את ההורים, פראי-סוג מאמץ נדרש.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצה להכיר Otterbein אוניברסיטת מענקי מחקר של סטודנטים לתואר ראשון, תלמיד מחקר קרן פרסים GVK, SGK; האנדרטה פרופסור גילברט אי מילס Otterbein ניחן פרס תוכנית שבתון, המחלקה לביולוגיה, מדעי כדור הארץ סגל מחקר ולמדנות ניחן פרס מכה. ברט וקרן ג'יין קרן ניחן תלמיד מחקר במדעי הוענק GVK ו- SGK. המחברים גם רוצה להכיר בהכרת תודה שדוקיין האוניברסיטה במימון מלגות תוכנית מחקר לתואר ראשון עבור GVK ו- SGK. תלמידי מחקר לתואר ראשון לשעבר Juniata קולג ', ריאן ג'ונסון ודרייפר לינדסי תרם את התמונות במיקרוסקופ על דמויות 2 ו- 3, בהתאמה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50% Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Immersion Oil (Type DF) Cragille  16482
Lens Paper Fisherbrand 11-995
Sterile Water GeneMate G-3250-1L
100% Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Propidium Iodide Invitrogen P1304MP
Toothpicks (flat) Target 081-22-1957
Pipette Tips (10 mL) GeneMate P-1240-10
Pipette Tips (200 mL) GeneMate P-1240-200Y
Pipette Tips (1,250 mL) GeneMate P-1240-1250
Wooden Applicators 6'' Solon Care 070809
Cotton Swabs Fisherbrand 23-400-124
Soy Flour  Bob's Red Mill  1516C164
D-Mannitol Sigma-Aldrich M4125-1KG
Agar Sigma-Aldrich A1296-1KG
Glycerol 100% VWR amresco life science  0854-1L
0.8% NaCl (Saline) Sigma-Aldrich SLBB9000V
1.2 mL freezer tube NEST 606101
Ultra low (-80 °C) freezer SO-LOW U85-18
Cryo Safety Gloves Bel-Art H13201
Petri dishes  Sigma-Aldrich P5856-500EA
Cover slips #1.5 Thomas Scientific 64-0721
Slides Carolina 63-2010
Autoclave Tuttnauer 2540E
Phase-Contrast Microscope  Olympus BX40
Forceps Carolina Biological 624504
Bunsen Burner Carolina Biological 706706
Methanol Sigma-Aldrich 34860-1L-R
PBS (phosphate buffer saline) Sigma-Aldrich P4417-50TAB
WGA-FITC Biotium 29022-1
Clear nail polish OPI 22001009000
ImageJ NIH Free Software
100 mL beaker Pyrex USA 1000-T
1 L beaker Carolina Biological 721253
1 L flask Fisherbrand S63274
250 mL flask Pyrex USA 4980
100 mL graduated cylinder Carolina Biological 721788
500 mL graduated cylinder  Carolina Biological 721792
Stir Bar Fisher Scientific 22-271825
Centrifuge Eppendorf 5810R
Camera for Microscope Olympus DP72
Nitrile Examination Gloves (Med) Bio Excell 71011002
Vortex Mixer Carolina Biological 701077

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barka, E. A., et al. Taxonomy, physiology, and natural products of Actinobacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 1-43 (2015).
  2. Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (2), 141-147 (2002).
  3. Redenbach, M., et al. A set of ordered cosmids and a detailed genetic and physical map for the 8 Mb Streptomyces coelicolor A3(2) chromosome. Mol. Microbiol. 21 (1), 77-96 (1996).
  4. McCormick, J. R., Flardh, K. Signals and regulators that govern Streptomyces development. FEMS Microbiol. Rev. 36 (1), 206-231 (2012).
  5. Flardh, K., Buttner, M. J. Streptomyces morphogenetics: dissecting differentiation in a filamentous bacterium. Nat. Rev. Microbiol. 7 (1), 36-49 (2009).
  6. Bennett, J. A. Molecular Genetic analysis of division and development in Streptomyces coelicolor. , Ph.D. Dissertation (2007).
  7. Hull, T. D., et al. Cyclic Di-GMP phosphodiesterases RmdA and RmdB are involved in regulating colony morphology and development in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 194 (17), 4642-4651 (2012).
  8. Petzke, L., Luzhetskyy, A. In vivo Tn5-based transposon mutagenesis of streptomycetes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 83 (5), 979-986 (2009).
  9. Xu, Z., et al. Large-Scale Transposition Mutagenesis of Streptomyces coelicolor Identifies Hundreds of Genes Influencing Antibiotic Biosynthesis. Appl. Environ. Microbiol. 83 (6), (2017).
  10. Fernandez-Martinez, L. T., et al. A transposon insertion single-gene knockout library and new ordered cosmid library for the model organism Streptomyces coelicolor A3(2). Antonie Van Leeuwenhoek. 99 (3), 515-522 (2011).
  11. Gehring, A. M., Nodwell, J. R., Beverley, S. M., Losick, R. Genomewide insertional mutagenesis in Streptomyces coelicolor reveals additional genes involved in morphological differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (17), 9642-9647 (2000).
  12. Bishop, A., Fielding, S., Dyson, P., Herron, P. Systematic insertional mutagenesis of a streptomycete genome: a link between osmoadaptation and antibiotic production. Genome Res. 14 (5), 893-900 (2004).
  13. Bilyk, B., Weber, S., Myronovskyi, M., Bilyk, O., Petzke, L., Luzhetskyy, A. In vivo random mutagenesis of streptomycetes using mariner-based transposon Himar1. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (1), 351-359 (2013).
  14. Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. Practical Streptomyces Genetics. , The John Innes Foundation. (2000).
  15. Gust, B., Kieser, T., Chater, K. F. REDIRECT technology: PCR-targeting system in Streptomyces coelicolor. , John Innes Centre, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 7UH, United Kingdom. (2002).
  16. Gust, B., Chandra, G., Jakimowicz, D., Yuqing, T., Bruton, C. J., Chater, K. F. Lambda red-mediated genetic manipulation of antibiotic-producing Streptomyces. Adv. Appl. Microbiol. 54, 107-128 (2004).
  17. Tong, Y., Charusanti, P., Zhang, L., Weber, T., Lee, S. Y. CRISPR-Cas9 based engineering of Actinomycetal genomes. ACS Synth. Biol. 4 (9), 1020-1029 (2015).
  18. Huang, H., Zheng, G., Jiang, W., Hu, H., Lu, Y. One-step high-efficiency CRISPR/Cas9-mediated genome editing in Streptomyces. Acta BiochimBiophys. Sin.(Shanghai). 47 (4), 231-243 (2015).
  19. Cobb, R. E., Wang, Y., Zhao, H. High-efficiency multiplex genome editing of Streptomyces species using an engineered CRISPR/Cas system. ACS Synth. Biol. 4 (6), 723-728 (2015).
  20. Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
  21. Brown, E. D., Wright, G. D. Antibacterial drug discovery in the resistance era. Nature. 529 (7586), 336-343 (2016).
  22. Dodds, D. R. Antibiotic resistance: A current epilogue. Biochem. Pharmacol. 134, 139-146 (2017).
  23. Caruso, J. P., Israel, N., Rowland, K., Lovelace, M. J., Saunders, M. J. Citizen Science: The Small World Initiative improved lecture grades and California critical thinking skills test scores of nonscience major students at Florida Atlantic University. J. Microbiol. Biol. Educ. 17 (1), 156-162 (2016).
  24. Davis, E., et al. Antibiotic discovery throughout the Small World Initiative: A molecular strategy to identify biosynthetic gene clusters involved in antagonistic activity. Microbiology Open. 6 (3), (2017).
  25. van Keulen, G., Dyson, P. J. Production of specialized metabolites by Streptomyces coelicolor A3(2). Adv. Appl. Microbiol. 89, 217-266 (2014).
  26. Aigle, B., et al. Genome mining of Streptomyces ambofaciens. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 41 (2), 251-263 (2014).
  27. Antoraz, S., Santamaria, R. I., Diaz, M., Sanz, D., Rodriguez, H. Toward a new focus in antibiotic and drug discovery from the Streptomyces arsenal. Front. Microbiol. 6, 461 (2015).
  28. Onaka, H. Novel antibiotic screening methods to awaken silent or cryptic secondary metabolic pathways in actinomycetes. J. Antibiot.(Tokyo). 70 (8), 865-870 (2017).
  29. Chen, J., Wu, Q., Hawas, U. W., Wang, H. Genetic regulation and manipulation for natural product discovery. Appl. Microbiol. Biotechnol. 100 (7), 2953-2965 (2016).
  30. Katz, L., Baltz, R. H. Natural product discovery: past, present, and future. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 43 (2-3), 155-176 (2016).
  31. Liu, G., Chater, K. F., Chandra, G., Niu, G., Tan, H. Molecular regulation of antibiotic biosynthesis in Streptomyces. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 77 (1), 112-143 (2013).
  32. den Hengst, C. D., Tran, N. T., Bibb, M. J., Chandra, G., Leskiw, B. K., Buttner, M. J. Genes essential for morphological development and antibiotic production in Streptomyces coelicolor are targets of BldD during vegetative growth. Mol. Microbiol. 78 (2), 361-379 (2010).
  33. Tran, N. T., Den Hengst, C. D., Gomez-Escribano, J. P., Buttner, M. J. Identification and characterization of CdgB, a diguanylate cyclase involved in developmental processes in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 193 (12), 3100-3108 (2011).
  34. Anonymous. Lab Safety. Proper Use of Autoclaves. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
  35. Border, B. G., Rice-Spearman, L. Microwaves in the laboratory: effective decontamination. Clin. Lab. Sci. 12 (3), 156-160 (1999).
  36. Bhattacharjee, M. K., Delsol, J. K. Does microwave sterilization of growth media involve any non-thermal effect? J. Microbiol. Methods. 96, 70-72 (2014).
  37. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
  38. Anonymous, General Laboratory Techniques. An Introduction to the Micropipettor. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
  39. Baltz, R. H. Genetic manipulation of secondary metabolite biosynthesis for improved production in Streptomyces and other actinomycetes. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 43 (2-3), 343-370 (2016).
  40. Frohlich, V. C. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. J. Vis. Exp. (18), e844 (2008).
  41. Anonymous, General Laboratory Techniques. Introduction to Light Microscopy. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
  42. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory. 3, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1989).
  43. Anonymous, General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
  44. Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anat. Rec.(Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
  45. Chater, K. F. Recent advances in understanding Streptomyces. F1000Res. 5, (2016).
  46. Chater, K. F. Regulation of sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2): a checkpoint multiplex? Curr. Opin. Microbiol. 4 (6), 667-673 (2016).
  47. Tschowri, N. Cyclic dinucleotide-controlled regulatory pathways in Streptomyces species. J. Bacteriol. 198 (1), 47-54 (2016).
  48. Bennett, J. A., et al. Medium-dependent phenotypes of Streptomyces coelicolor with mutations in ftsI or ftsW. J. Bacteriol. 191 (2), 661-664 (2009).
  49. Mistry, B. V., Del Sol, R., Wright, C., Findlay, K., Dyson, P. FtsW is a dispensable cell division protein required for Z-ring stabilization during sporulation septation in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 190 (16), 5555-5566 (2008).
  50. Bennett, J. A., Aimino, R. M., McCormick, J. R. Streptomyces coelicolor genes ftsL and divIC play a role in cell division but are dispensable for colony formation. J. Bacteriol. 189 (24), 8982-8992 (2007).
  51. Bennett, J. A., McCormick, J. R. Two new loci affecting cell division identified as suppressors of an ftsQ-null mutation in Streptomyces coelicolor A3(2). FEMS Microbiol. Lett. 202 (2), 251-256 (2001).
  52. Dharmatilake, A. J., Kendrick, K. E. Expression of the division-controlling gene ftsZ during growth and sporulation of the filamentous bacterium Streptomyces griseus. Gene. 147 (1), 21-28 (1994).
  53. McCormick, J. R., Losick, R. Cell division gene ftsQ is required for efficient sporulation but not growth and viability in Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 178 (17), 5295-5301 (1996).
  54. McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. Growth and viability of Streptomyces coelicolor mutant for the cell division gene ftsZ. Mol. Microbiol. 14 (2), 243-254 (1994).
  55. Flärdh, K., Findlay, K. C., Chater, K. F. Association of early sporulation genes with suggested developmental decision points in Streptomyces coelicolor A3(2). Microbiology. 145 (9), 2229-2243 (1999).
  56. van Wezel, G. P., van der Meulen, J., Kawamoto, S., Luiten, R. G., Koerten, H. K., Kraal, B. ssgA is essential for sporulation of Streptomyces coelicolor A3(2) and affects hyphal development by stimulating septum formation. J. Bacteriol. 182 (20), 5653-5662 (2000).
  57. Capstick, D. S., Willey, J. M., Buttner, M. J., Elliot, M. A. SapB and the chaplins: connections between morphogenetic proteins in Streptomyces coelicolor. Mol. Microbiol. 64 (3), 602-613 (2007).
  58. Ma, H., Kendall, K. Cloning and analysis of a gene cluster from Streptomyces coelicolor that causes accelerated aerial mycelium formation in Streptomyces lividans. J. Bacteriol. 176 (12), 3800-3811 (1994).
  59. Xu, Z., et al. Large-scale transposition mutagenesis of Streptomyces coelicolor identifies hundreds of genes influencing antibiotic biosynthesis. Appl. Environ. Microbiol. 83 (6), (2017).
  60. Dedrick, R. M., Wildschutte, H., McCormick, J. R. Genetic interactions of smc, ftsK, and parB genes in Streptomyces coelicolor and their developmental genome segregation phenotypes. J. Bacteriol. 191 (1), 320-332 (2009).
  61. Pavlopoulos, A. Identification of DNA sequences that flank a known region by inverse PCR. Methods Mol. Biol. 772, 267-275 (2011).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 139 Streptomyces phenotyping מורפולוגי פיתוח מוטגנזה מכוונת מוטציות אנטיביוטיקה תיכון גזע מיקרוביולוגיה חינוך הוראה במעבדה היוזמה עולם קטן חיידקים
הערכות חזותי מיקרוסקופיים של מוטציות התפתחותית <em>Streptomyces</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bennett, J. A., Kandell, G. V.,… More

Bennett, J. A., Kandell, G. V., Kirk, S. G., McCormick, J. R. Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants. J. Vis. Exp. (139), e57373, doi:10.3791/57373 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter