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Immunology and Infection

Streptomyces विकासात्मक म्यूटेंट का दृश्य एवं सूक्ष्म मूल्यांकन

Published: September 12, 2018 doi: 10.3791/57373
Automatic Translation
1, 1, 1, 2
1Department of Biology and Earth Science, Biochemistry and Molecular Biology Program, Otterbein University, 2Department of Biological Sciences, Duquesne University

Summary

यहां हम नौसिखिए शोधकर्ताओं के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल को औषधीय महत्वपूर्ण जीवाणु जीनस Streptomycesके लिए phenotyping शुरू करते हैं ।

Abstract

Streptomycetes जाति Actinobacteria है कि दुनिया भर में पाया जाता है और एंटीबायोटिक दवाओं और अन्य माध्यमिक चयापचयों की एक विस्तृत सरणी का उत्पादन करने के लिए संबंधित रेशा मिट्टी बैक्टीरिया हैं । Streptomyces coelicolor एक अच्छी तरह से विशेषता है, गैर रोगजनक प्रजातियों कि लैब में विश्लेषण की एक किस्म के लिए उत्तरदायी है । phenotyping तरीके यहां वर्णित एक मॉडल streptomycete के रूप में एस coelicolor का उपयोग करें; हालांकि, तरीके इस बड़े जीनस के सभी सदस्यों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कुछ बारीकी से संबंधित actinomycetes के लिए लागू कर रहे हैं । Phenotyping Streptomyces की नई प्रजातियों के वातावरण में पहचान की विशेषता आवश्यक है, और यह भी निस्र्पक में एक महत्वपूर्ण पहला कदम है Streptomycesके नए अलग उत्परिवर्ती उपभेदों । phenotyping में प्रवीणता कई नए शोधकर्ताओं जो Streptomyces अनुसंधान के क्षेत्र में प्रवेश कर रहे हैं, जो जीवाणु विकास के अध्ययन, कोशिका विभाजन, गुणसूत्र अलगाव, और दूसरा दूत संकेतन शामिल है के लिए महत्वपूर्ण है । नई मिट्टी रोगाणुओं के अलगाव के माध्यम से एंटीबायोटिक खोज के हाल के crowdsourcing प्रशिक्षकों के लिए phenotyping में प्रशिक्षण के लिए एक वृद्धि की जरूरत Streptomyces अनुसंधान और उनके कॉलेज या उच्च विद्यालय के छात्रों के क्षेत्र के लिए नए के परिणामस्वरूप है । इस पांडुलिपि दृश्य और सूक्ष्म परीक्षा के माध्यम से बैक्टीरियल तनाव प्रचार, भंडारण, और लक्षण वर्णन के लिए तरीके बताता है । इस लेख को पढ़ने के बाद, नए शोधकर्ताओं (माइक्रोबायोलॉजी शिक्षा प्रयोगशालाओं और नागरिक वैज्ञानिकों) Streptomyces उपभेदों में हेरफेर और दृश्य लक्षण वर्णन प्रयोगों शुरू करने में सक्षम होना चाहिए.

Introduction

Streptomycetes ग्राम पॉजिटिव, रेशा मिट्टी के लिए अपने माध्यमिक चयापचयों की एक किस्म, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबायोटिक दवाओं के दो तिहाई से अधिक, साथ ही विरोधी ट्यूमर, विरोधी एचआईवी, और विरोधी परजीवी दवाओं के उत्पादन की क्षमता के लिए जाना जाता बैक्टीरिया हैं 1. S. coelicolor जीनस2,3 की सबसे आनुवंशिक रूप से विशेषता सदस्य है और यहां वर्णित तरीकों में इस्तेमाल प्रजातियों है । एस coelicolor एक जटिल जीवन चक्र है कि एक एकल बीजाणु के अंकुरण के साथ शुरू होता है, एक व्यापक, वनस्पति mycelium शाखाओं में बढ़ता है कि आगर माध्यम में बढ़ रही है । के रूप में जीवन चक्र आय, हवाई तंतुओं का गठन कर रहे है कि सब्सट्रेट mycelium की सतह तनाव को तोड़ने और अंततः कोशिकाओं है कि अंततः परिपक्व, भूरे रंग के बीजाणुओं में बदल रहे है की लंबी श्रृंखला में विभाजित हैं । इन नवगठित बीजाणुओं के फैलाव का गठन अगले जीवन चक्र की शुरुआत4.

भेदभाव के अपने जटिल पैटर्न के कारण, एस coelicolor बैक्टीरियल विकास के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में कार्य करता है । ऐतिहासिक, उत्परिवर्तनों विकास के दो प्रमुख चरणों के लिए ब्लॉकों में परिणाम और अलग दृश्य phenotypes का उत्पादन । bld (गंजा) म्यूटेंट हवाई mycelium गठन और एक फजी हवाई mycelium की कमी में परिणाम के लिए अवरुद्ध कर रहे है एक "गंजा" कॉलोनी उपस्थिति बीटेक । म्यूटेंट बीजाणु गठन और परिपक्वता में हिचक whi (सफेद) म्यूटेंट के रूप में जाना जाता है क्योंकि वे आम तौर पर भूरे बीजाणु वर्णक के जंगली प्रकार के स्तर का उत्पादन करने में विफल और हवाई mycelium सफेद रहता है । अन्य रोचक म्यूटेंट एंटीबायोटिक उत्पादन, सेल डिवीजन, गुणसूत्र अलगाव, या अन्य महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं में हिचक रहे हैं4,5.

Streptomyces प्रजातियों में कई विकासात्मक जीन की खोज के बावजूद, वहां के उत्परिवर्ती स्क्रीन के संतृप्ति की कमी के आधार पर मौजूद करने के लिए कई और अधिक विश्वास कर रहे हैं । हमारी प्रयोगशालाओं के लिए एक मिनी transposon प्रणाली है कि हम का निर्माण किया है का उपयोग कर नए विकास जीन की पहचान जारी है । उपंयास उत्परिवर्ती हमारे transposon के साथ यादृच्छिक mutagenesis प्रयोगों में अलग उपभेदों phenotypic स्क्रीनिंग से गुजरना करने के लिए प्रत्येक नए जीन की संभावित भूमिका की पहचान6,7की खोज की । यहां वर्णित बैक्टीरियल phenotyping के लिए तरीके transposon mutagenesis8,9,10,11,12द्वारा पृथक Streptomyces म्यूटेंट के लिए प्रासंगिक हैं, 13 और अंय ऐसे रासायनिक और अल्ट्रा वायलेट (यूवी) mutagenesis14के रूप में यादृच्छिक तरीके, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से recombineering का उपयोग कर जीन विलोपन के रूप में उत्परिवर्तनों का निर्देशन निर्माण15,16 या CRISPR-Cas9 (संकुल नियमित रूप से अंतराल लघु Palindromic दोहराता) जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी17,18,19 और अंक उत्परिवर्तनों20।

रोगजनकों के बीच एंटीबायोटिक प्रतिरोध के रूप में तेजी से प्रचलित हो जाता है, नई एंटीबायोटिक दवाओं के लिए की जरूरत तेजी से21,22अत्यावश्यक हो जाता है । "लघु विश्व पहल" (या SWI) एक प्रभावी विज्ञान है, प्रौद्योगिकी, इंजीनियरिंग और गणित (स्टेम) सीखने23 और अनुसंधान रणनीति24 कॉलेज के छात्रों के crowdsourcing के माध्यम से एंटीबायोटिक प्रतिरोध का मुकाबला करने के लिए, और अधिक हाल ही में हाई स्कूल के छात्र । समर्थित पाठ्यक्रमों काम नई मिट्टी रोगाणुओं कि उपंयास एंटीबायोटिक दवाओं (http://www.smallworldinitiative.org) का उत्पादन की पहचान भी शामिल है । यह माना जाता है कि अनदेखा एंटीबायोटिक दवाओं का एक प्रमुख स्रोत Streptomyces प्रजातियों मिट्टी और पानी के निवास की एक विस्तृत श्रृंखला में पाया जारी रहेगा25,26,27,28, 29,31. हाल ही में, हमारी प्रयोगशाला और दूसरों के काम की खोज की है और Streptomyces प्रजातियों में संकेतन जीन विशेषता है कि, एंटीबायोटिक उत्पादन7,३२सहित आकृति विज्ञान और विकास को विनियमित, ३३. इन जीनों की अभिव्यक्ति में परिवर्तन की मात्रा और एंटीबायोटिक दवाओं के समय में परिवर्तन का उत्पादन किया । नई प्रजातियों और नए एंटीबायोटिक उत्पादक म्यूटेंट के कुशल phenotyping के लिए महत्वपूर्ण रहेंगे । के रूप में नए प्रशिक्षकों और उनके छात्रों को दवा की खोज के क्षेत्र में प्रमुख योगदान हो, बैक्टीरियल phenotyping में प्रशिक्षण इन नौसिखिए व्यक्तियों की सफलता के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, इन प्रयोगों उच्च विद्यालय स्टेम या विश्वविद्यालय माइक्रोबायोलॉजी शिक्षा प्रयोगशालाओं के लिए परित्याग कर रहे हैं. वे एक शिक्षण प्रयोगशाला सेटिंग में बुनियादी माइक्रोबियल आनुवंशिक सिद्धांतों के प्रदर्शन का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Protocol

1. तैयार वाद्ययंत्र, संस्कृति मीडिया, समाधान, और पेट्री व्यंजन

  1. आटोक्लेव toothpicks एक ५० मिलीलीटर में एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर चोंच बाँझ रखने के लिए ।
  2. सभी शुष्क वस्तुओं है कि इस्तेमाल किया जाएगा निष्फल (युक्तियां, छड़ें, कांच के बनने का माल, आदि) एक आटोक्लेव में ।
    नोट: सावधानी! उपयोग किए गए आटोक्लेव मॉडल के लिए सभी सुरक्षा निर्देशों का पालन करें । आटोक्लेव विस्फोट के लिए एक जोखिम मुद्रा, और गर्म सतहों, सामग्री, और मीडिया के साथ भाप और संपर्क से जलता है । आटोक्लेव सुरक्षा के लिए, देखें "आटोक्लेव का उचित उपयोग"३४।
  3. तैयार एमएस आगर (Mannitol सोया आटा (SFM))14 संस्कृतियों बढ़ने के लिए ।
    1. 1 L कुप्पी तक 5 ग्राम का सोया आटा और 5 ग्राम आगर के जोड़ें ।
    2. नल के पानी की २५० मिलीलीटर में mannitol के 5 जी भंग और सोया आटा और आगर युक्त कुप्पी में बांटना ।
    3. एक फोम प्लग और कुप्पी और आटोक्लेव के उद्घाटन के लिए पन्नी जोड़ें १२१ ° c, 15 psi पर कम से कम 30 मिनट के लिए.
      सावधानी: इस मध्यम आसानी से अधिक फोड़े । एक कुप्पी कि एमएस आगर की वास्तविक मात्रा autoclaved जा रहा है कम से चार बार पकड़ कर सकते है का प्रयोग करें । एक मानक दबाव कुकर समान सुरक्षा विचार के साथ एक आटोक्लेव के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, एक माइक्रोवेव ओवन मीडिया और सामग्री को निष्फल अगर एक आटोक्लेव के लिए उपयोग संभव३५,३६नहीं है इस्तेमाल किया जा सकता है । उच्च विद्यालय के शिक्षकों को भी autoclaved आपूर्ति का उपयोग करने के लिए स्थानीय कॉलेजों या विश्वविद्यालयों के साथ सहयोग करना चाहते हो सकता है ।
    4. शांत करने के लिए पर्याप्त आराम से मीडिया को संभाल । यह भी लंबे समय के लिए ठंडा नहीं है क्योंकि आगर ५० डिग्री सेल्सियस से नीचे तापमान पर जम सावधान रहना ।
    5. एक पेट्री डिश के तल तक लगभग आधा भरा (पेट्री डिश प्रति मीडिया के लगभग 25 मिलीलीटर) है जब तक सुश्री एक पेट्री व्यंजन में कुप्पी से आगर डालो । आगर प्लेट का उपयोग करने से पहले जमना की अनुमति दें । दुकान आगर जब तक जरूरत कमरे के तापमान पर एक प्लास्टिक की थैली में प्लेटें ।
      नोट: आगार प्लेटें भी एक रेफ्रिजरेटर में संग्रहित किया जा सकता है, खासकर यदि मीडिया में एंटीबायोटिक दवाओं की जरूरत है ।

2. प्रचार के लिए प्लेटों पर लकीर Streptomyces

  1. लकीर Streptomyces पर उपभेदों एकल कालोनियों के लिए एक मानक विधि का उपयोग कर, इस तरह के चक्र लकीर विधि के रूप में सैंडर्स, २०१२३७में दिखाया गया है ।
    नोट: एक inoculating लूप या बाँझ toothpicks उपयोग किया जा सकता है । वैकल्पिक: अन्य मीडिया सामान्यतः Streptomyces प्रजातियों के लिए उपयोग किया जाता है, जैसे कि R2YE और न्यूनतम मीडिया14.
  2. 30 डिग्री सेल्सियस पर मशीन प्लेट ।
  3. एक भी कॉलोनी हर 4-6 दिन में उठा कर लकीरें । के रूप में कालोनियों उंर वे यादृच्छिक उत्परिवर्तन से ग्रस्त हो जाते हैं ।

3. जीवाणु भंडारण के लिए ग्लिसरॉल Mycelial स्टॉक्स बनाएं

नोट: Mycelial स्टॉक्स whi और bld उपभेदों सहित सभी Streptomyces उपभेदों के लिए बनाया जा सकता है, और अंय विकासात्मक म्यूटेंट कि sporulation पूरा करने में असमर्थ हैं ।

  1. Macerate 15 – 20 कालोनियों में 200 – 500 µ l की 20% ग्लिसरॉल एक बाँझ लकड़ी dowel applicator का उपयोग कर.
  2. एक micropipette या बाँझ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर, एक १.५ मिलीलीटर फ्रीजर संस्कृति ट्यूब करने के लिए macerated फ़िल्टर्ड कालोनियों के घोल हस्तांतरण ।
    नोट: micropipette उपयोग की मूल बातें३८कहीं और कवर कर रहे हैं ।
  3. अंतिम खंड 1 मिलीलीटर और धीरे मिश्रण बनाने के लिए पर्याप्त 20% ग्लिसरॉल जोड़ें । -८० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान ।
    नोट: सावधानी! अत्यधिक ठंड के साथ संपर्क से त्वचा की रक्षा के लिए क्रायोजेनिक सुरक्षा दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट का प्रयोग करें । वैकल्पिक रूप से, a-20 ° c फ्रीजर दीर्घकालिक भंडारण समय में संभावित कमी के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । अत्यधिक ठंड से बचें और गल व्यवहार्यता का विस्तार करने के लिए ।

4. Sporulation में सक्षम उपभेदों के लिए ग्लिसरॉल बीजाणु स्टॉक्स बनाएं

नोट: बीजाणु स्टॉक्स दीर्घकालिक व्यवहार्यता के लिए बेहतर हैं, लेकिन केवल उपभेदों कि sporulation को पूरा करने में सक्षम है के लिए व्यवहार्य हैं ।

  1. फैलाओ १०० µ macerated फ़िल्टर्ड सामग्री के एल (३.१ कदम से) एक आगर प्लेट पर विकास३७के एक धाराप्रवाह लॉन प्राप्त करने के लिए ।
    नोट: फैलाओ चढ़ाना सैंडर्स३७ में दिखाया गया है (संशोधन: एक प्लेअर की आवश्यकता नहीं है.) । दूसरे हाथ का उपयोग करते हुए प्लेट को एक हाथ से चालू किया जा सकता है, जबकि आगर मीडिया में कोमल पीठ और आगे की गति में प्रसारकर्ता को स्थानांतरित करने के लिए ।
    1. प्लास्टिक १०० एक एमएस आगार प्लेट के केंद्र के लिए macerated फ़िल्टर्ड mycelium के µ एल ।
    2. एक गिलास या आंशिक रूप से ७०% इथेनॉल में विलय और प्रसारक एक Bunsen बर्नर लौ के माध्यम से एक बार धीरे से इथेनॉल के वाष्पीकरण की गति के माध्यम से फैल धातु प्रसार उपकरण निष्फल ।
      चेतावनी: इथेनॉल अत्यधिक ज्वलनशील है । इथेनॉल में ज्वलंत प्रसार जगह या इथेनॉल के ज्वलंत बूंद इथेनॉल पकवान में गिरावट की अनुमति नहीं है । वैकल्पिक रूप से, एक डिस्पोजेबल बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करने के लिए थाली है, जो कोई इथेनॉल या लौ की आवश्यकता है पर बैक्टीरिया का प्रसार ।
    3. एक हाथ से एमएस आगार प्लेट बारी है, जबकि एक आगे और पीछे गति का उपयोग करने के लिए बाँझ प्रसारकर्ता के साथ थाली inoculate ।
    4. 5 के लिए मशीन-7 दिन 30 डिग्री सेल्सियस तक तनाव अच्छी तरह से sporulated है ।
      ध्यान दें: मशीन बार प्रजातियों और तनाव पर निर्भर करता है भिंन होगा ।
  2. Streptomyces कोशिकाओं है कि sporulation आया है की एक धाराप्रवाह लॉन के केंद्र के लिए बाँझ खारा (०.८% NaCl) के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. एक बाँझ inoculating पाश (या एक कपास की कली) के साथ mycelium की सतह को धीरे से रगड़कर बीजाणुओं को हार्वेस्ट करें, धीमे लॉन के किनारे की ओर बढ़ते हुए ।
  4. 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में बीजाणुओं से युक्त प्लास्टिक । भंवर जोरदार व्यक्तिगत कोशिकाओं में बीजाणु जंजीरों को तोड़ने के लिए ।
  5. लगभग २,५०० x gपर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर केंद्रापसारक
  6. प्लास्टिक को supernatant और त्याग दें । शेष तरल की छोटी राशि में जोरदार भंवर आंदोलन द्वारा बीजाणु गोली फैलाने ।
  7. एक पिपेट के साथ समाधान ड्राइंग द्वारा 20% ग्लिसरॉल के 1 मिलीलीटर में बीजाणुओं को पुनर्निलंबित करें ।
  8. एक १.५ मिलीलीटर फ्रीजर ट्यूब करने के लिए ग्लिसरॉल बीजाणु शेयर हस्तांतरण । पर स्टोर-८० ° c ।
    चेतावनी: अत्यधिक ठंड के साथ संपर्क से त्वचा की रक्षा के लिए क्रायोजेनिक सुरक्षा दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट का उपयोग करें । वैकल्पिक रूप से, a-20 ° c फ्रीजर दीर्घकालिक भंडारण समय में व्यवहार्यता की क्षमता में कमी के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । अत्यधिक ठंड से बचें और गल व्यवहार्यता का विस्तार करने के लिए ।

5. प्रदर्शन Mutagenesis

  1. प्रदर्शन mutagenesis परिचय में संदर्भित के रूप में वांछित परिणामों पर आधारित है और हाल ही में Baltz, २०१६३९द्वारा की समीक्षा की ।
    नोट: कुछ phenotyping प्रयोगों में mutagenesis की आवश्यकता नहीं होगी, जैसे कि पर्यावरण से नई प्रजातियों की पहचान करने के इरादे. यादृच्छिक mutagenesis के तरीके एक transposon8,9,10,11,12,13, यूवी विकिरण, या रसायन14का उपयोग शामिल हैं । साइट-निर्देशित mutagenesis15,16,17,18,19,20 तकनीक के लिए विशिष्ट बिंदु उत्परिवर्तनों, विलोपन बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या उत्परिवर्तनों के अंय प्रकार ।

6. तुलना करें और दृश्य प्रकटन रिकॉर्ड

  1. प्रत्येक उत्परिवर्ती के लिए कॉलोनी आकृति का ध्यान रखें के रूप में चरण 2 में सभी उपभेदों लकीर के बाद जंगली प्रकार के जनक तनाव की तुलना में । नई Streptomyces प्रजातियों निस्र्पक जब coelicolor या एस वेनेजुएला, जैसे एक अच्छी तरह से अध्ययन प्रजातियों में से एक है कि नए अलग तुलना करें । नोट विशेषताओं (चित्रा 1) जैसे बुनियादी आकार, कॉलोनी की सतह (फजी, गंजा, झुर्रियों वाली होती है, आदि), अस्पष्टता, ऊंचाई, और रंजकता (वनस्पति mycelium के बीच भेद, हवाई mycelium, और/
  2. लेबल एक एमएस आगर प्लेट और लकीर जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों कील पैटर्न में (चित्रा 1) । सावधान रहना है कि कोई तनाव को छूता है एक और तनाव पार संक्रमण से बचने के लिए । तिथि और समय है कि उपभेदों प्लेट पर लकीर नोट कर रहे हैं । 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें मशीन ।
  3. पृष्ठभूमि homogenize करने के लिए रंगीन या सफेद कागज पर बड़े पेट्री व्यंजन रखें । कागज पर लिखें तनाव का नाम, तिथि, गर्मी तापमान, और पहली थाली लकीर से समय है । कागज की पृष्ठभूमि पर लिखी गई उत्तरार्द्ध जानकारी के साथ प्लेट की डिजिटल पिक्चर (ओं) लें ताकि भ्रम कम हो जाए ।
    नोट: यदि चित्र तैयार करने के लिए उपयोग किया जाना है तो लेखन को बाद में फोटोग्राफ से क्रॉप किया जा सकता है ।

7. प्रदर्शन चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी

  1. ७०% इथेनॉल में धुलाई द्वारा चिमटी निष्फल और फिर इथेनॉल वाष्पित करने के लिए एक Bunsen बर्नर लौ के माध्यम से गुजर रहा है । शांत करने के लिए अनुमति दें ।
  2. ७०% इथेनॉल में धोने से coverslips निष्फल और फिर उंहें एक बाँझ पेट्री पकवान में शुष्क करने की अनुमति ।
  3. बैक्टीरियल ग्रोथ की एक coverslip लिफ्ट तैयार कर जांच की जाए ।
    1. बाँझ चिमटी के साथ एक बाँझ coverslip उठाओ और एक एमएस आगर प्लेट जहां बैक्टीरियल विकास घने है पर coverslip जगह है । बैक्टीरियल बीजाणुओं और हवाई mycelium के पर्याप्त हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए चिमटी के साथ धीरे coverslip की पीठ पर दबाएँ ।
  4. प्लेट से coverslip उठाओ और यह जगह इतनी है कि सेल सामग्री के साथ पक्ष एक खुर्दबीन स्लाइड की सतह की ओर का सामना करना पड़ रहा है, ५०% के एक 15 µ एल ड्रॉप के साथ बढ़ते के लिए पानी में तैयार ग्लिसरॉल । स्लाइड करने के लिए एक ४५ ° कोण पर coverslip रखकर हवा के बुलबुले को कम करने और यह ५०% ग्लिसरॉल पर गिर जाते हैं ।
  5. वैकल्पिक स्लाइड के संरक्षण के लिए स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ सील ।
  6. जीवन चक्र के दौरान विभिन्न समय अंतराल पर Frohlich४० द्वारा वर्णित के रूप में चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन.
    नोट: दोहराया इमेजिंग एक और अधिक पूर्ण विश्लेषण और विकास में देरी का पता लगाने की क्षमता के लिए अनुमति देता है । स्वतंत्र रूप से अवलोकन सटीकता और reproducibility सुनिश्चित करने के लिए दोहराएँ ।
    1. तैयार स्लाइड को माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें और कवर स्लिप के केंद्र में विसर्जन के तेल की एक बूंद डालें । स्थान में 100X चरण उद्देश्य घुमाएँ और उचित "मिलान" चरण सेटिंग के लिए संघनित्र बुर्ज सेट । केवल ठीक समायोजन घुंडी का उपयोग कर छवि ध्यान केंद्रित एक बार उद्देश्य लेंस तेल के साथ संपर्क में है ।
    2. इस तरह के बीजाणु, बीजाणु आकार और आकार, और बीजाणुओं की कुल संख्या ( चित्रा 2देखें) के रूप में करने की क्षमता के रूप में उत्परिवर्ती उपभेदों और जंगली प्रकार के बीच विचार और लगातार मतभेदों को देखने के कई क्षेत्रों की जांच करें ।
      नोट: चरण के लिए वैकल्पिक विपरीत माइक्रोस्कोपी विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग) माइक्रोस्कोपी४० और सरल चमकदार क्षेत्र माइक्रोस्कोप्स के साथ उपयोग के लिए इस तरह के क्रिस्टल वायलेट धुंधला के रूप में४१, तकनीक शामिल हैं ।

8. प्रदर्शन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

  1. ७०% इथेनॉल में धुलाई द्वारा चिमटी निष्फल और फिर एक Bunsen बर्नर लौ के माध्यम से चल रहा है ।
  2. एक एमएस आगर प्लेट जहां बैक्टीरियल विकास स्पष्ट है पर बाँझ चिमटी और जगह के साथ एक बाँझ coverslip उठाओ. बैक्टीरियल बीजाणुओं और हवाई रेशा के पर्याप्त हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए चिमटी के साथ धीरे coverslip के पीछे स्पर्श करें ।
  3. थाली से coverslip उठाओ और यह जगह इतनी है कि सेल सामग्री के साथ पक्ष ऊपर का सामना करना पड़ रहा है, coverslip के हेरफेर में आसानी के लिए cardstock पर ।
  4. एक 20 x 20 मिमी2 coverslip के लिए बर्फ ठंडा मेथनॉल (~ ३०० µ एल के साथ coverslip बाढ़) और इसे पूरी तरह से शुष्क हवा ।
    सावधानी: मेथनॉल एक mutagen है । त्वचा के साथ सीधे संपर्क से बचें ।
  5. coverslip में तीन बार फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब)४२ धीरे वितरण और समाधान को दूर करने से धो ।
  6. जोड़ें 15 µ एल के १०० μg/एमएल Propidium आयोडाइड और/या 10 μg/एमएल गेहूं-रोगाणु-Agglutinin संयुग्मित को fluorescein isothiocyanate (WGA-FITC) एक लेबल माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए ५०% ग्लिसरॉल में बनाया ।
    नोट: Propidium आयोडाइड दाग डीएनए लाल गुणसूत्र डीएनए स्थान का पता लगाने के लिए, जबकि WGA-FITC सेल दीवार हरे दाग ।
  7. उलटा coverslip कांच स्लाइड पर फ्लोरोसेंट दाग की बूंद पर नीचे चेहरा । (वैकल्पिक) स्लाइड के संरक्षण के लिए स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ सील ।  के रूप में रंजक प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं, एक अंधेरे या dimly जलाया कमरे में 15 मिनट के लिए मशीन ।
  8. एक 100X उद्देश्य लेंस एक चरण के विपरीत या propidium आयोडाइड (' टेक्सास लाल ' फिल्टर सेट या 535/617 एनएम उत्तेजना/उत्सर्जन maxima) और FITC (FITC फ़िल्टर सेट या 490/525 एनएम के लिए epifluorescence उत्तेजना क्यूब्स से सुसज्जित का उपयोग कर के तहत स्लाइड का निरीक्षण उत्तेजना/उत्सर्जन maxima).
  9. मंच पर स्लाइड प्लेस और मोटे और ठीक समायोजन knobs का उपयोग कर ध्यान केंद्रित.
  10. प्रतिदीप्ति के रूप में४३कहीं और दिखाया निरीक्षण ।
  11. एक मुफ्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज है कि कम प्रतिदीप्ति तीव्रता४४के साथ बीजाणुओं की पहचान में मदद कर सकते है का उपयोग करें ।

Representative Results

प्रारंभिक phenotyping प्रयोगों निस्र्पक नई प्रजातियों और उपभेदों के लिए आवश्यक हैं और phylogenetics और डीएनए-डीएनए संकरण प्रयोगों है कि निस्र्पक नई प्रजातियों के लिए उपयोग किया जाता है के लिए एक मानार्थ दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । Streptomyces म्यूटेंट ऐसे रासायनिक, यूवी, या transposon mutagenesis के रूप में यादृच्छिक mutagenesis तरीकों से उत्पंन आम तौर पर सीधे के माध्यम से पहचाने जाते हैं, आगर प्लेटों पर दृश्य स्क्रीन । Streptomyces की कालोनियों की तुलना में phenotype में परिवर्तन के लिए जंगली प्रकार, माता पिता की तनाव की जांच कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, एक हल्के रंग का एरियल mycelium ग्रे sporulation, या एक फजी उपस्थिति की कमी में एक दोष के कारण वर्णक के निचले स्तर का संकेत हो सकता है हवाई mycelium गठन (चित्रा 1) में एक ब्लॉक का संकेत है । कई streptomycetes वनस्पति mycelium या आसपास के आगर में pigmented एंटीबायोटिक दवाओं का उत्पादन । एस coelicolor दो pigmented एंटीबायोटिक दवाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दो गैर pigmented लोगों का उत्पादन । Actinorhodin एक नीली pigmented एंटीबायोटिक है और undecylprodigiosin एक लाल pigmented एंटीबायोटिक४५है । उपभेदों है कि प्रारंभिक दृश्य कॉलोनी स्क्रीन आया है तो एकल कालोनियों के लिए लकीर से प्रचारित कर रहे हैं ।

संभावित दिलचस्प म्यूटेंट के दृश्य की पहचान के बाद, उपभेदों सूक्ष्म परीक्षा के अधीन हैं । चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी विशेष रूप से विकासात्मक दोषों के लिए Streptomyces म्यूटेंट की जांच करने के लिए उपयुक्त है, एक नियंत्रण (चित्रा 2) के रूप में जंगली प्रकार के तनाव का उपयोग कर । जंगली प्रकार एस coelicolor आम तौर पर एमएस आगर पर 30 डिग्री सेल्सियस पर विकास के बारे में दो दिनों के द्वारा एक हवाई mycelium का उत्पादन, और विकास के तीन दिनों तक बीजाणुओं की लंबी श्रृंखला । जीवन चक्र मीडिया के अंय प्रकार पर थोड़ा धीमी या तेजी से प्रगति होगी । यह आवश्यक है कि म्यूटेंट जंगली प्रकार के रूप में एक ही विकास की स्थिति के तहत विश्लेषण किया जा जब विकासात्मक दोषों और देरी के बारे में निष्कर्ष ड्राइंग । गंजा म्यूटेंट आगर मीडिया पर लंबे समय तक विकास के बाद बीजाणु पैदा कर सकता है । सफेद म्यूटेंट के रूप में संदर्भित म्यूटेंट के एक वर्ग बीजाणु गठन के लिए देरी हो सकती है, उत्पादित बीजाणुओं की बहुतायत में कमी दिखाने के लिए, आकार और/या आकार दोषों के साथ बीजाणुओं का उत्पादन, या बस परिपक्व के निचले स्तर का उत्पादन, ग्रे बीजाणु वर्णक४६ . अंय म्यूटेंट इस प्रकार अब तक देरी हो सकती है या इस तरह के संकेत अणुओं के संचय के लिए प्रभावित म्यूटेंट के रूप में जीवन चक्र प्रगति में त्वरित हो सकता है (जैसे, चक्रीय-di-४७जीएमपी) ।

एक सरल अनुवर्ती प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीक को ऊपर वर्णित है प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग propidium आयोडाइड गुणसूत्र डीएनए nucleoids दाग और फ्लोरोसेंट गेहूं रोगाणु agglutinin लेबल को sporulation सेपता के सेल दीवार दाग है । एक गुणसूत्र की कमी बीजाणु लाल propidium आयोडाइड धुंधला से रहित हो जाएगा, जबकि सामांय से कम डीएनए वाले बीजाणुओं की पहचान की जा सकती है अगर वे धुंधला (आंकड़ा 3) में कमी आई है दिखाई देते हैं । गेहूं के बीज agglutinin सेल दीवार और सेल दीवार धुंधला पैटर्न (यानी, कोशिका विभाजन दोष) में मतभेद दाग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है मनाया जा सकता है । चित्रा 4 में जंगली प्रकार के तनाव एस वेनेजुएला, एक प्रजाति है कि हाल ही में अपनी तेजी से जीवन चक्र और तरल४५में sporulate करने की क्षमता की वजह से एक और मॉडल streptomycete के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है, WGA के साथ दाग दिया गया है-FITC स्पष्ट सीढ़ी-विभाजन सेपता की सरणी की तरह है कि आम तौर पर sporulation के दौरान जल्दी देखा जाता है ।

प्रारंभिक phenotyping रणनीतियों यहां वर्णित निंनलिखित में परिणाम चाहिए: 1) आगे के अध्ययन के लिए ब्याज की उत्परिवर्ती उपभेदों की पहचान; 2) नव पहचान उत्परिवर्ती और जीन है कि रूपांतरित किया गया है की संभावित भूमिका के बारे में ज्ञान प्राप्त की; 3) अगले प्रयोगात्मक कदम है कि आगे प्रश्न में जीन की भूमिका स्पष्ट किया जा सकता है की एक बाद की श्रृंखला का निर्माण । पर्यावरण से एक नव पहचान streptomycete के मामले में, शोधकर्ता Streptomycesकी पहले से ही विशेषता प्रजातियों की तुलना में संभावित नई प्रजातियों का ज्ञान प्राप्त होगा ।

Figure 1
चित्रा 1: एक प्रतिनिधि की तस्वीर आगर प्लेट सुधरेगा macroscopic कॉलोनी phenotypes ऑफ एस. coelicolor. आगर प्लेट coelicolor MT1110 के साथ विभिन्न यादृच्छिक transposon सम्मिलन म्यूटेंट की तुलना में जंगली प्रकार के लिए एरियल mycelium के फजी, ग्रे दृश्य उपस्थिति से पता चलता है (WT). म्यूटेंट या तो एक हवाई mycelium [गंजा (bld)] या कम बीजाणु रंजकता के साथ एक हवाई mycelium [सफेद (whi)] कमी कर रहे हैं । Transposon म्यूटेंट6,7लन mutagenesis के लिए मिनी-Tn5 का उपयोग करते हुए उत्पन्न हुए थे. उपभेदों एमएस आगर पर 30 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए बड़े हो रहे थे । पेट्री डिश व्यास, १०० मिमी.

Figure 2
चित्रा 2: चरण कंट्रास्ट माइक्रोग्राफ यादृच्छिक transposon प्रविष्टि उत्परिवर्तन युक्त एस coelicolor व्हाइट उत्परिवर्ती उपभेदों के लिए एक प्रतिनिधि हवाई रेशा दिखा । (a) दिखाया गया है एक प्रतिनिधि जंगली प्रकार एरियल रेशा है कि आया है तुल्यकालिक, नियमित रूप से स्थान दिया सेल डिवीजनों, समान रूप से आकार का उत्पादन और बीजाणुओं (MT1110) आकार । (बीएफ) शेष पैनलों विभिंन सफेद म्यूटेंट कि यादृच्छिक transposon mutagenesis के माध्यम से अलग थे की बेहद अलग सूक्ष्म phenotypes दिखाते हैं । पैनल बी एक हवाई रेशा है कि sporulation नहीं आया है से पता चलता है, लेकिन इसके बजाय रेशा के भीतर उभार क्षेत्रों का उत्पादन किया गया है । C, D, और F में लंबे तीर असामान्य रूप से बड़े बीजाणुओं को इंगित करते हैं जो म्यूटेंट MIC42, MIC43 और TH49 की विशेषता हैं । पैनल डी में छोटा तीर एक लीजड ड बीजाणु डिब्बे का एक उदाहरण इंगित करता है । पैनल ई आंशिक रूप से प्रतिबंधित छोटे डिब्बों कि बीजाणु TH10 द्वारा उत्पादित श्रृंखला की खासियत है दिखाता है । उपभेदों एमएस आगर पर 30 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए बड़े हो रहे थे । म्यूटेंट चित्रा 1में दिखाया गया है उन लोगों के लिए असंबंधित हैं । एक जंगली प्रकार बीजाणु लगभग १.१ µm लंबी धुरी पर है । स्केल बार = 2 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ दिखा रहा है एस coelicolor उत्परिवर्ती गुणसूत्र पृथक्करण phenotypes । (क) एक आरेख प्रतिनिधित्व एक उत्परिवर्ती है कि एक गुणसूत्र को प्रदर्शित करता है के लिए आंतरायिक दाग पैटर्न की तुलना में विशिष्ट जंगली प्रकार, नियमित रूप से-बीजाणुओं की एक श्रृंखला (हर बीजाणु गुणसूत्र डीएनए शामिल है) के लिए उपस्थिति धुंधला दिखाई दिखाता है अलगाव दोष । (ख) पैनलों की एक जोड़ी एक ही बीजाणु श्रृंखला बाईं तरफ अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग) छवि द्वारा मनाया और एक propidium आयोडाइड-सना हुआ प्रतिदीप्ति छवि से पता चलता है सही पर दिखाया गया है । वाइल्ड-टाइप phenotype (a, b) की तुलना दो रैंडम transposon लन म्यूटेंट (c, d and e, f) से की जाती है । तीर डीएनए से रहित बीजाणुओं का संकेत देते हैं । उपभेदों एमएस आगर पर 30 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए बड़े हो रहे थे । दिखाया म्यूटेंट चित्रा 1 और चित्रा 2में उन लोगों के लिए असंबंधित हैं । स्केल बार = 1 µm. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एस के प्रतिदीप्ति micrograph वेनेजुएला जंगली प्रकार WGA-FITC के साथ दाग तनाव । (क) एक हवाई रेशा का एक चित्र कोई इंडेंट के साथ चिकनी प्रकट होता है और sporulation का कोई संकेत के साथ तुलना में चरण के विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कक्ष दीवार धुंधला है कि sporulation के एक प्रारंभिक चरण का संकेत है की सरणी की तरह कि एक ही रेशा में शुरू प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत WGA-FITC का उपयोग कर । (ख) वन्य-प्रकार के माइक्रोग्राफ एस. वेनेजुएला. (क) बीजाणुओं की जंजीरों के बीच चिकनी हवाई रेशा मौजूद हैं । (ख) पैनल एक में दिखाया mycelium के भीतर, विकास में एक प्रारंभिक चरण में एक हवाई रेशा कक्ष दीवार जमाव की सरणी की तरह एक सीढ़ी के पास । तीर पार से दाग WGA-FITC है कि एक भी हवाई रेशा के भीतर तुल्यकालिक विकास के रूप में यह विकास से जुड़े sporulation के माध्यम से सना हुआ की नियमित रूप से दूरी पर गठन का संकेत मिलता है । तनाव MYM पर उगाया गया था (एमaltose, वाईपूर्व निकालें, एमऑल्ट निकालने) MYM आगर 30 डिग्री सेल्सियस पर ३८ ज के लिए । स्केल बार = 2 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां हम शुरुआत Streptomyces शोधकर्ताओं के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए उपभेदों प्रचार और लंबी अवधि के भंडारण के लिए शेयरों को तैयार करने की जरूरत है सहित द्वारा अध्ययन शुरू । हम तो Streptomyces उपभेदों के दृश्य और सूक्ष्म लक्षण वर्णन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन । phenotyping विकासात्मक म्यूटेंट में कुछ ठेठ प्रारंभिक कदम हैं: 1) आगर माध्यम पर जंगली प्रकार की कालोनियों की तुलना में उत्परिवर्ती कालोनियों के दृश्य परीक्षा; 2) चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी; और ३) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी ऑफ sporogenic एरियल hyphae. इन तीन चरणों में प्रदर्शित phenotype पर आधारित है, तकनीक की एक किस्म के आगे एक विशेष तनाव के phenotype विचार नियोजित किया जा सकता है ।

प्रारंभिक phenotyping प्रयोगों आमतौर पर नई प्रजातियों की विशेषता के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, ब्याज की म्यूटेंट की पहचान, आंशिक रूप से म्यूटेंट विशेषताएं, और एक विशेष जीन की विशिष्ट भूमिका एक पहचान उत्परिवर्ती के phenotype के आधार पर विचार शुरू करते हैं । यहां वर्णित तरीके पहले से ही विश्वविद्यालय शिक्षण प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया गया है की पहचान करने और कोशिका विभाजन ४८,४९में दोषों के साथ उन सहित Streptomyces म्यूटेंट, की एक विस्तृत विविधता की विशेषता, ५० , ५१ , ५२ , ५३ , ५४, sporulation५५,५६, हवाई mycelium गठन५७,५८, एंटीबायोटिक उत्पादन५९, दूसरा दूत संकेतन४७, और गुणसूत्र अलगाव ६०. इन तकनीकों में सामान्य रूप से म्यूटेंट के phenotype का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण पहला कदम है और ब्याज की जीन की भूमिकाओं के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी की एक बड़ी राशि का पता चलता है. तरीकों को आसानी से Streptomyces की अंय प्रजातियों के लिए बढ़ाया जा सकता है और पहले से ही एस griseus, एस वेनेजुएला, एस खुजली, और कई अंय streptomycetes के उपभेदों का वर्णन किया गया है । वीडियो प्रोटोकॉल यहां वर्णित नए शोधकर्ताओं Streptomyces अनुसंधान के क्षेत्रों में प्रवेश करने के लिए एक महत्वपूर्ण संसाधन के रूप में सेवा की उंमीद कर रहे हैं, जैसे दवा खोज के क्षेत्र में । यह नए प्रशिक्षकों जो एंटीबायोटिक प्रतिरोध संकट से निपटने और नए स्नातक छात्र छोटे दुनिया की पहल के crowdsourcing प्रयासों में शामिल होने के शोधकर्ताओं के अनगिनत संख्या को शिक्षित करने के लिए काम कर रहे है शामिल हैं ।

यहां वर्णित तकनीकों को आसानी से कॉलेज और अनुसंधान प्रयोगशालाओं के अलावा उच्च विद्यालय कक्षा उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, वीडियो और पाठ में वर्णित संशोधनों का उपयोग कर । एक छोटे से लिबरल आर्ट्स कॉलेज में एक प्रथम वर्ष माइक्रोस्कोपी मॉड्यूल में छात्रों लकीर उपभेदों करने में सक्षम थे, आगर मीडिया पर बड़े उपभेदों के डिजिटल तस्वीरें ले, और चरण-कंट्रास्ट और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, जो एक के प्रस्तुतीकरण में समापन प्रदर्शन 3 सप्ताह के मॉड्यूल के अंत में बहु पैनल आंकड़े के पोर्टफोलियो, में प्रयोगशाला काम के 15 एच का प्रतिनिधित्व । लगभग १६० प्रथम वर्ष के छात्रों को ३२० उपंयास transposon म्यूटेंट के प्रारंभिक phenotyping के लिए जिंमेदार थे । तीन संस्थानों में स्नातक अनुसंधान छात्रों अतिरिक्त म्यूटेंट के प्रारंभिक phenotyping और उपभेदों के कई के बाद के लक्षण वर्णन में भाग लिया । व्यापक डेटा एक अपेक्षाकृत कम समय में प्राप्त की, यहां वर्णित प्रोटोकॉल का मूल्य वर्णन । अतिरिक्त म्यूटेंट के सैकड़ों भविष्य के लक्षण वर्णन के लिए ग्लिसरॉल mycelial स्टॉक के रूप में संग्रहित किया गया है ।

प्रारंभिक प्रयोगों के बाद यहां वर्णित है, तरीकों की एक किस्म के लिए ब्याज की उपभेदों से संबंधित जानकारी की गुणवत्ता का विस्तार नियोजित किया जा सकता है । यदि उत्परिवर्तन अज्ञात है, एक genotyping विधि के प्रकार और/या उत्परिवर्तन के स्थान निर्धारित करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, यादृच्छिक transposon mutagenesis के जंगली प्रकार गुणसूत्र6,7,8,9,10,11,12,13 कालोनियों में परिणाम है कि इस तरह के ऊपर वर्णित के रूप में प्रारंभिक phenotypic स्क्रीन से गुजरना चाहिए । फिर transposon का स्थान विलोम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (iPCR)६१जैसी तकनीक का प्रयोग करके पहचाना जाना चाहिए । नव खोजा म्यूटेंट के जीनोटाइप का निर्धारण प्रारंभिक लक्षण वर्णन के बाद एक महत्वपूर्ण कदम है ।

कुछ आमतौर पर बाद में phenotyping विश्लेषण है कि कक्षा में उल्लेख किया जा सकता है या आगे अनुसंधान के माध्यम से पता लगाया के लिए उंनत तरीकों का इस्तेमाल हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) टैगिंग के लिए ब्याज की प्रोटीन के लिए स्थानीयकरण पैटर्न निर्धारित शामिल हैं, इस तरह के वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) और विश्व जीन के रूप में जंगली-प्रकार बनाम उत्परिवर्ती का एक आरएनए अनुक्रमण के माध्यम से (आरएनए-seq) के रूप में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण । Phenotyping कौशल भी आनुवंशिक पूरक विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं । एक पूरक प्रयोग में, एक जीन की जंगली प्रकार की नकल एक रूपांतरित तनाव में पेश किया है निर्धारित करने के लिए कि क्या नव जोड़ा एलील के नुकसान के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते है--के रूपांतरित एलील के समारोह । दोनों मूल उत्परिवर्ती और पैतृक, जंगली प्रकार के तनाव की है कि करने के लिए पूरित तनाव के phenotype की तुलना की आवश्यकता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक जीवीके और SGK को स्नातक छात्र अनुसंधान फैलोशिप और छात्र अनुसंधान निधि पुरस्कार के लिए Otterbein विश्वविद्यालय को स्वीकार करना चाहते हैं; और Otterbein के प्रोफेसर गिल्बर्ट ई. मिल्स मेमोरियल संपंन विश्राम कार्यक्रम पुरस्कार और जीव विज्ञान और पृथ्वी साइंस संकाय अनुसंधान और छात्रवृत्ति संपंन पुरस्कार के लिए विभाग । विज्ञान में बर्ट व जेन हॉर्न संपन्न छात्र शोध कोष में जीवीके व SGK को सम्मानित किया गया । लेखकों को भी कृतज्ञता स्वीकार Duquesne विश्वविद्यालय वित्त पोषण जीवीके और SGK के लिए स्नातक अनुसंधान कार्यक्रम फैलोशिप पोषित करना चाहूंगा । पूर्व Juniata कॉलेज स्नातक अनुसंधान छात्रों, रयान जॉनसन और Lindsey ड्रेपर 2 और 3, क्रमशः आंकड़े के लिए सूक्ष्म छवियों का योगदान दिया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50% Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Immersion Oil (Type DF) Cragille  16482
Lens Paper Fisherbrand 11-995
Sterile Water GeneMate G-3250-1L
100% Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Propidium Iodide Invitrogen P1304MP
Toothpicks (flat) Target 081-22-1957
Pipette Tips (10 mL) GeneMate P-1240-10
Pipette Tips (200 mL) GeneMate P-1240-200Y
Pipette Tips (1,250 mL) GeneMate P-1240-1250
Wooden Applicators 6'' Solon Care 070809
Cotton Swabs Fisherbrand 23-400-124
Soy Flour  Bob's Red Mill  1516C164
D-Mannitol Sigma-Aldrich M4125-1KG
Agar Sigma-Aldrich A1296-1KG
Glycerol 100% VWR amresco life science  0854-1L
0.8% NaCl (Saline) Sigma-Aldrich SLBB9000V
1.2 mL freezer tube NEST 606101
Ultra low (-80 °C) freezer SO-LOW U85-18
Cryo Safety Gloves Bel-Art H13201
Petri dishes  Sigma-Aldrich P5856-500EA
Cover slips #1.5 Thomas Scientific 64-0721
Slides Carolina 63-2010
Autoclave Tuttnauer 2540E
Phase-Contrast Microscope  Olympus BX40
Forceps Carolina Biological 624504
Bunsen Burner Carolina Biological 706706
Methanol Sigma-Aldrich 34860-1L-R
PBS (phosphate buffer saline) Sigma-Aldrich P4417-50TAB
WGA-FITC Biotium 29022-1
Clear nail polish OPI 22001009000
ImageJ NIH Free Software
100 mL beaker Pyrex USA 1000-T
1 L beaker Carolina Biological 721253
1 L flask Fisherbrand S63274
250 mL flask Pyrex USA 4980
100 mL graduated cylinder Carolina Biological 721788
500 mL graduated cylinder  Carolina Biological 721792
Stir Bar Fisher Scientific 22-271825
Centrifuge Eppendorf 5810R
Camera for Microscope Olympus DP72
Nitrile Examination Gloves (Med) Bio Excell 71011002
Vortex Mixer Carolina Biological 701077

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Bennett, J. A., Kandell, G. V., Kirk, S. G., McCormick, J. R. Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants. J. Vis. Exp. (139), e57373, doi:10.3791/57373 (2018).

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