Summary
Her presenterer vi protokoller for nybegynner forskere for å starte phenotyping for farmakologisk viktig bakteriell slekten Streptomyces.
Abstract
Streptomycetes er trådformede jord bakterier tilhører rekken Actinobacteria som finnes over hele verden og produserer en rekke antibiotika og andre sekundære metabolitter. Streptomyces coelicolor er et godt karakterisert, ikke-patogene som passer til en rekke analyser i laboratoriet. Phenotyping-metodene som er beskrevet bruker her S. coelicolor som en modell streptomycete; men gjelder metodene for alle medlemmer av denne store gruppen som noen nært beslektede actinomycetes. Phenotyping er nødvendig å karakterisere nye arter av Streptomyces identifisert i miljøet, og det er også et viktig første steg i karakteriserer nylig isolert mutant stammer av Streptomyces. I phenotyping er viktig for mange nye forskerne som inn i feltet av Streptomyces forskning, som omfatter studiet av bakteriell utvikling, celledeling, kromosom segregering og andre messenger signalering. Den siste crowdsourcing av antibiotika funnet isolering av ny jord mikrober har ført til økt behov for opplæring i phenotyping for instruktører nye feltet på Streptomyces forskning og deres skole eller høy studenter. Dette manuskriptet beskriver metoder for bakterielle belastningen forplantning, lagring og karakterisering gjennom visuelle og mikroskopisk undersøkelse. Etter å ha lest denne artikkelen, bør nye forskere (mikrobiologi utdanning laboratorier og borger forskere) kunne manipulere Streptomyces stammer og begynne visuelle karakterisering eksperimenter.
Introduction
Streptomycetes er Gram-positive, trådformede jord bakterier kjent for sin evne til å produsere en rekke sekundære metabolitter, inkludert over to tredeler av kommersielt tilgjengelig antibiotika, så vel som anti-svulst, anti-HIV og anti-parasittiske medisiner 1. S. coelicolor er mest genetisk preget av slekten2,3 og er arten brukes i metodene som er beskrevet her. S. coelicolor har en kompleks livssyklus som starter med spiring om en enkelt spore, videre til en omfattende, forgrening vegetative mycel som vokser til agar medium. Som livssyklusen provenyet, dannes antenne filamenter som bryter overflatespenning av underlaget mycel og endelig er delt inn i lange kjeder som konverteres til slutt til modne, grå-pigmentert sporer. Spredning av disse nyopprettede sporer utgjør begynnelsen av neste livssyklus4.
På grunn av sin komplekse mønster av differensiering fungerer S. coelicolor som en utmerket modell for studiet av bakteriell utvikling. Historisk mutasjoner resultere i blokker for to store stadier av utvikling og produsere forskjellige visuelle fenotyper. Bld (skallet) mutanter blokkeres for antenne mycel dannelse og resultere i mangel på en god antenne mycel formidle en "skallet" kolonien utseende. Mutanter hemmet i spore formasjon og modning kalles whi (hvit) mutanter fordi de vanligvis ikke klarer å produsere vill-type nivåer av grå spore pigment og antenne mycel forblir hvit. Andre interessante mutanter er hemmet i antibiotika produksjon, celledeling, kromosom segregering eller andre viktige prosesser4,5.
Til tross for oppdagelsen av mange utviklingsmessige gener i Streptomyces arter, det er mange mer antas å eksistere basert på mangel på metning av mutant skjermer. Våre laboratorier fortsette å identifisere nye utviklingsmessige gener bruke Mini transposon system som vi har konstruert. Romanen mutant stammer isolert i tilfeldig mutagenese eksperimenter med våre transposon gjennomgå fenotypiske screening for å identifisere mulige rolle hver nye gen oppdaget6,7. Metodene for bakteriell phenotyping beskrevet her gjelder Streptomyces mutanter isolert av transposon mutagenese8,9,10,11,12, 13 og andre tilfeldige metoder, som kjemisk og ultrafiolette (UV) mutagenese14, samt rettet konstruksjonen av mutasjoner som gene slettinger med recombineering15,16 eller CRISPR-Cas9 (gruppert regelmessig Interspaced kort Palindromic gjentar) genomet redigering teknologi17,18,19 og punkt mutasjoner20.
Som antibiotikaresistens blant patogener blir stadig mer utbredt, blir behovet for nye antibiotika stadig mer påtrengende21,22. "Liten verden initiativ" (eller Sveitsisk) er en effektiv vitenskap, teknologi, ingeniørfag og matematikk (STEM) lære23 og forskning strategi-24 for å bekjempe antibiotikaresistens gjennom crowdsourcing studenter, og mer nylig high school-elever. Støttet kurs arbeid inkluderer identifisere nye jord mikrober som produserer romanen antibiotika (http://www.smallworldinitiative.org). Det antas at en viktig kilde til uoppdagede antibiotika vil fortsette å Streptomyces arter finnes i en rekke jord og vann habitater25,26,27,28, 29,31. Nylig, vårt laboratorium og andres arbeid har oppdaget og preget signalnettverk gener i Streptomyces arter som regulerer morfologi og utvikling, inkludert antibiotika produksjon7,32, 33. Endringer i uttrykket av disse genene medføre en endring i mengden og timing av antibiotika produsert. Dyktige phenotyping av nye arter og nye antibiotika-produserende mutanter vil fortsette å være viktig. Som ny instruktører og elevene blir store bidragsytere til feltet i stoffet funnet, er opplæring i bakteriell phenotyping nødvendig for at disse nybegynner individer. Videre er disse eksperimentene medgjørlig for videregående STEM universitetet mikrobiologi utdanning laboratorier. De representerer en demonstrasjon av grunnleggende mikrobiell genetisk prinsipper i en undervisning lab innstilling.
Protocol
1. klargjør instrumenter, kultur medier, løsninger og Petri retter
- Autoclave tannpirkere i en 50 mL kanne dekket med aluminiumsfolie for å holde sterile.
- Sterilisere alle tørre varer som skal brukes (tips, stokker, glass, etc.) i en autoklav.
Merk: Advarsel! Følg alle sikkerhet retninger for autoklav modellen brukes. Prosesseringstid utgjøre en fare for eksplosjoner og brenner fra steam og kontakt med varme flater, materialer og media. Vis "Riktig bruk av autoklavene"34for autoklav sikkerhet. -
Forberede MS agar (Mannitol Soya mel (SFM))14 å vokse kulturer.
- Legge til 5 g av soyamel og 5 g av agar 1 L kolbe.
- Oppløse 5 g av mannitol i 250 mL vann fra springen og dispensere i flasken inneholder soyamel og agar.
- Legg skum kontakten og folie til åpningen av flasken og autoklav ved 121 ° C, 15 psi i minst 30 min.
Advarsel: Dette mediet lett koker over. Bruk en kolbe som kan inneholde minst fire ganger det faktiske volumet av MS agar blir autoklaveres. En standard trykkoker kan brukes i stedet for en autoklav med lignende sikkerhetshensyn. En mikrobølgeovn kan også brukes til å sterilisere media og materialer hvis tilgang til en autoklav ikke er mulig35,36. Videregående skole lærere kan også samarbeide med lokale universiteter til autoklaveres forsyninger. - Kul medier til komfortabel nok til å håndtere. Vær forsiktig så du ikke kult det for lenge fordi agar stivner ved temperaturer under 50 ° C.
- Hell MS agar fra flasken i sterilt Petri retter til bunnen av hver Petriskål er omtrent halvparten full (ca 25 mL av media per Petriskål). La stivne før du bruker agar plater. Lagre agar plater i en plastpose i romtemperatur inntil nødvendig.
Merk: Agar plater kan også lagres i kjøleskap, spesielt hvis antibiotika er nødvendig i media.
2. strek Streptomyces på plater for overføring
- Strek Streptomyces stammer på MS agar plater til enkelt kolonier ved hjelp av en standard metode, for eksempel kvadranten strek metoden som vist i Sanders, 201237.
Merk: En inoculating løkke eller sterilt tannpirkere kan brukes. Valgfritt: Andre medier er ofte brukt for Streptomyces arter, som R2YE og minimal media14. - Inkuber plater på 30 ° C.
- Restreak plater ved å plukke en enkelt koloni hver 4-6 dager. Som kolonier alder de blir utsatt for tilfeldig mutasjon.
3. opprette glyserol Mycelial aksjer for bakteriell lagring
Merk: Mycelial aksjer kan opprettes for alle Streptomyces belastninger, inkludert whi bld stammer og andre utviklingsmessige mutanter som ikke klarer å fullføre sporulation.
- Macerate 15-20 koloniene i 200-500 µL 20% glyserol bruker en steril tre dowel applikator.
- Overføre til slurry macerated kolonier slik 1,5 mL fryser kultur bruker brønnene eller sterilt overføring pipette.
Merk: Grunnleggende av brønnene er dekket andre steder38. - Legg nok 20% glyserol for å gjøre det siste bindet 1 mL og bland forsiktig. Lagre prøver på-80 ° C.
Merk: Advarsel! Bruk kryogene vernehansker og en lab coat å beskytte huden fra kontakt med ekstrem kulde. 20 ° C fryser kan også brukes med potensielle reduksjon i langsiktig lagringstid. Unngå overdreven frysing og tining utvide levedyktighet.
4. Opprett glyserol Spore aksjer for stammer i stand til Sporulation
Merk: Spore aksjer er å foretrekke for langsiktig levedyktighet, men er bare mulig for stammer som er i stand til å fullføre sporulation.
-
Spre 100 µL av macerated materiale (fra trinn 3.1) på en agar plate å få en confluent plen av vekst37.
Merk: Spre plating vises i Sanders37 (modifisering: svingskive kreves ikke.). Platen kan slås med én hånd mens du bruker derimot flytte sprederen i en mild og tilbake bevegelse over agar mediene.- Pipetter 100 µL av macerated mycel til midten av en MS agar plate.
- Sterilisere et glass eller metall sprer verktøy ved delvis submerging i 70% etanol og passerer sprederen når sakte gjennom Bunsen brenner flamme å øke fordampning av etanol.
FORSIKTIG: Etanol er meget brannfarlig. Ikke plasser flaming sprederen til etanol eller tillate flaming dråpe etanol faller i etanol parabolen. Alternativt bruke en engangs steril bomull swab for å spre bakterier på plate, som krever ingen etanol eller flamme. - Slå MS agar plate med én hånd mens du bruker en tilbake og frem bevegelse for å vaksinere platen med sterilt sprederen.
- Inkuber for 5 til 7 dager på 30 ° C til belastningen er godt sporulated.
Merk: Inkubasjon ganger vil variere avhengig av arter og belastning.
- Legge til 2 mL sterilt saltvann (0,8% NaCl) til midten av en confluent plen av Streptomyces celler som har gjennomgått sporulation.
- Høste sporer ved forsiktig pussing overflaten av mycel med et sterilt vaksinere loop (eller en bomullspinne), sakte går mot kanten av plenen.
- Pipetter saltvann inneholder sporer i en 15 mL konisk rør. Vortex kraftig å bryte spore kjeder i enkeltceller.
- Sentrifuge ved romtemperatur for 5 min på ca 2500 x g.
- Pipetter nedbryting og kast. Spre spore pellet av kraftig vortex agitasjon den lille mengden av gjenværende væske.
- Resuspend spores i 1 mL av 20% glyserol ved å tegne løsningen opp og ned med en pipette.
- Overføre glyserol spore aksjen til en 1,5 mL fryser rør. Butikken på-80 ° C.
FORSIKTIG: Bruk kryogene vernehansker og en lab coat å beskytte huden fra kontakt med ekstrem kulde. 20 ° C fryser kan også brukes med potensielle reduksjon av levedyktighet langsiktig lagringstid. Unngå overdreven frysing og tining utvide levedyktighet.
5. Utfør mutagenese
- Utføre mutagenese basert på de ønskede resultatene som refereres i introduksjon og nylig gjennomgått av Baltz, 201639.
Merk: Noen phenotyping eksperimenter krever ikke mutagenese, for eksempel å identifisere nye arter fra miljøet. Metoder for tilfeldige mutagenese omfatter bruk av en transposon8,9,10,11,12,13, UV-stråling eller kjemikalier14. Nettstedet-regissert mutagenese15,16,17,18,19,20 teknikkene kan brukes til å opprette bestemte punkt mutasjoner, slettinger eller andre typer mutasjoner.
6. Sammenlign og registrere utseende
- Ta note av kolonien morfologi for hver mutant sammenlignet med vill-type overordnede belastningen etter striper alle belastninger som i trinn 2. Sammenligne den nye isolere for godt studert Art, som S. coelicolor eller S. venezuelae, når karakteriserer nye Streptomyces arter. Merk egenskaper (figur 1) som grunnleggende form, overflaten av kolonien (fuzzy, skallet, rynkete, etc.), tetthet, høyde og pigmentering (skille mellom vegetative mycel, antenne mycel eller omkringliggende medium).
- Merke en MS agar plate og strek vill-type og mutant stammer i kile mønstre (figur 1). Pass på at ikke berører en annen stamme for å unngå kryss-kontaminering. Merk datoen og klokkeslettet som stammer er stripete på platen. Inkuber platene på 30 ° C.
- Plass vokst Petri retter på farget eller hvitt papir til homogenize bakgrunnen. Skrive på papir belastning navn, dato, inkubasjon temperatur og tid fra første plate striper. Ta digital kinofilmene av platen med informasjon skrevet på papir bakgrunn slik at forvirring er minimert.
Merk: Skriving kan beskjæres fra fotografi senere hvis den skal brukes for figur utarbeidelse.
7. utføre fase kontrast mikroskopi
- Sterilisere pinsett ved å vaske i 70% etanol og deretter passerer gjennom en Bunsen brenner flamme til å fordampe etanol. La den avkjøles.
- Sterilisere coverslips av vaske 70% etanol og deretter la dem tørke i et sterilt Petriskål.
-
Forberede dekkglassvæske heis bakteriell vekst undersøkes.
- Plukke opp en steril dekkglassvæske med sterilt pinsett og plasser dekkglassvæske på en MS agar plate der bakterievekst er tett. Trykk på baksiden av dekkglassvæske forsiktig med pinsett å sikre tilstrekkelig overføring av bakteriell sporer og antenne mycel.
- Hente dekkglassvæske fra platen og plassere den slik at siden med cellen materialet vender mot overflaten av et mikroskop lysbilde, med en 15 µL dråpe 50% glyserol forberedt i vann for montering. Redusere luftbobler ved å plassere dekkglassvæske i 45° vinkel på lysbildet og la det falle på 50% glyserol.
- (Valgfritt) Tett med klart neglelakk for bevaring av lysbildet.
-
Utfør fase kontrast mikroskopi som beskrevet av Frohlich40 i forskjellige tidsintervaller i løpet av livssyklusen.
Merk: Gjentatte imaging gir en mer fullstendig analyse og muligheten til å oppdage forsinkelser i utvikling. Uavhengig gjenta observasjoner for å sikre nøyaktighet og reproduserbarhet.- Plasser forberedt lysbildet på mikroskopet scenen og legge en dråpe neddyppingsolje til midten av cover slip. Rotere 100 X fasen målet i plasser og angi kondensator dreieskiven på riktig "tilsvarende" fase innstilling. Fokus bildet med bare den fine justering knute når linsen er i kontakt med olje.
- Undersøke flere synsfelt å tyde merkbar og konsekvent forskjellene mellom mutant stammer og vill-type, for eksempel skjemaet sporer, spore størrelse og form og samlede antallet sporer (se figur 2).
Merk: Alternativer til kontrast mikroskopi inkluderer differensial forstyrrelser kontrast (DIC) mikroskopi40 og enkle flekker teknikker for bruk med lyse feltet mikroskop41, som krystall violet flekker.
8. utføre fluorescens mikroskopi
- Sterilisere pinsett ved vask i 70% etanol, og deretter kjøre gjennom en Bunsen brenner flamme.
- Plukk opp et sterilt dekkglassvæske med sterilt pinsett og plassere på en MS agar plate der bakterievekst er tydelig. Berør bakenden av dekkglassvæske forsiktig med pinsett å sikre tilstrekkelig overføring av bakteriell sporer og antenne filamenter.
- Hente dekkglassvæske fra platen og plassere den slik at siden med cellen materialet vender opp på kartong for enkel i manipulering av dekkglassvæske.
- Flom dekkglassvæske med iskald metanol (~ 300 µL for en 20 x 20 mm2 dekkglassvæske) og la den helt lufttørke.
FORSIKTIG: Metanol er en mutagen. Unngå direkte kontakt med huden. - Legg til dekkglassvæske tre ganger i fosfat bufret saltvann (PBS)42 ved forsiktig dispensing og fjerne løsningen.
- Legge til 15 µL 100 μg/ml Propidium Iodide og/eller 10 μg/mL hvete Germ Agglutinin konjugert til fluorescein isothiocyanate (WGA-FITC) gjort i 50% glyserol i merket mikroskop lysbildet.
Merk: Propidium iodide flekker DNA rød å oppdage chromosomal DNA sted mens WGA-FITC flekker cellen vegg grønne. - Inverter dekkglassvæske med forsiden ned på slipp av fluorescerende flekk på av objektglass. (Valgfritt) sel med klart neglelakk for bevaring av lysbildet. Som fargestoffer er lys-sensitive, ruge i 15 minutter i et mørkt eller svakt opplyst rom.
- Observere lysbildene under en 100 X linsen med en kontrast eller DIC mikroskop utstyrt med epifluorescence eksitasjon kuber for propidium iodide ('Texas rød' filteret satt eller 535/617 nm eksitasjon/utslipp maxima) og FITC (FITC filtrere sett eller 490/525 nm eksitasjon/utslipp maxima).
- Plass lysbildet på scenen og fokus bruke grov og fin justering knotter.
- Observere fluorescens som vist andre steder43.
- Bruk et gratis bilde analyse-programvarepakke som kan hjelpe med identifikasjonen av sporer med lavere fluorescens intensitet44.
Representative Results
Første phenotyping eksperimenter er nødvendige for å karakterisere nye arter og stammer og kan brukes som en gratis tilnærming til phylogenetics og DNA-DNA hybridisering eksperimenter som er brukt for å karakterisere nye arter. Streptomyces mutanter skyldes tilfeldig mutagenese metoder som kjemisk, UV, eller transposon mutagenese er vanligvis identifisert gjennom direkte, visuelle skjermer på agar plater. Kolonier av Streptomyces undersøkes for endringer i fenotypen sammenlignet med vill-type, foreldrekontroll belastningen. For eksempel en lysere farget antenne mycel kan tyde på et lavere nivå av grå pigment forårsaket en feil i sporulation, eller mangel på en fuzzy utseende er et tegn på en blokk i antenne mycel formasjonen (figur 1). Mange streptomycetes produsere pigmentert antibiotika i vegetative mycel eller omkringliggende agar. S. coelicolor produserer to pigmentert antibiotika samt to ikke-pigmented seg. Actinorhodin er en blå-pigmentert antibiotika og undecylprodigiosin er en rød-pigmentert antibiotika45. Stammer som har gjennomgått første visuelle kolonien skjermer er deretter overført av striper for enkel kolonier.
Etter visuell identifikasjon av potensielt interessant mutanter, stammer er utsatt for mikroskopisk undersøkelse. Kontrast mikroskopi er spesielt egnet til å undersøke Streptomyces mutanter utviklingsmessige feil, med vill-type belastningen som en kontroll (figur 2). Wild type S. coelicolor kolonier vanligvis produserer en antenne mycel ca to dager vekst på 30 ° C på MS agar og lange kjeder av sporer av tre dager med vekst. Livssyklusen vil fremgang litt langsommere eller raskere på andre typer medier. Det er viktig at mutantene analyseres oppstiller vekst som wild når trekke konklusjoner om utviklingsmessige feil og forsinkelser. Skallet mutanter kan produsere spores etter langvarig vekst på agar media. En klasse av mutanter referert til som hvit mutanter kan enten være forsinket for spore formasjon, vise en reduksjon i overflod av sporer produsert, produsere sporer med form og/eller størrelse defekter eller bare produsere lavere nivåer av modne, grå spore pigment46 . Andre mutanter undersøkt så langt kan være forsinket eller akselerert i livssyklusen progresjon som mutanter påvirket for akkumulering signalnettverk molekyler (f.eks, syklisk-di-GMP47).
En enkel oppfølging * lys teknikken beskrevet ovenfor er fluorescens mikroskopi bruker propidium iodide flekken chromosomal DNA nucleoids og fluorescently merket hvetespirer agglutinin stain cellen vegg av sporulation septa. Sporer mangler et kromosom vil være fri for de røde propidium iodide flekker, mens spores som inneholder mindre DNA enn vanlig kan identifiseres hvis de synes å ha gått ned flekker (Figur 3). Hvetespirer agglutinin kan brukes til å flekken cellen vegg og forskjeller i celleveggen flekker mønstre (dvs., celledeling defekter) kan observeres. I Figur 4 vill-type stamme av S. venezuelae, en art som nylig blir brukt som en annen modell har streptomycete på grunn av raskere livssyklus og muligheten til å sporulate i flytende45, blitt farget med WGA-FITC å belyse stige-lignende rekke divisjon septa som er vanligvis sett tidlig under sporulation.
De første phenotyping strategiene beskrevet her skal resultere i følgende: 1) identifikasjon av mutant stammer av interesse for videre studier; 2) ervervet kunnskap om nylig identifisert mutant og potensielle rolle genet som er mutert; 3) utformingen av en påfølgende serie neste eksperimentelle trinn som kan brukes for videre avklare rollen genet i spørsmålet. I en nylig identifisert streptomycete fra miljøet få forskeren kunnskap om potensielle nye arten sammenlignet allerede preget arter av Streptomyces.
Figur 1: Fotografi av en representant agar plate demonstrere makroskopisk kolonien fenotyper av S. coelicolor. Agar platen viser den uklar, grå utseendet til antennen mycel for vill-type S. coelicolor stamme MT1110 (WT) i forhold til ulike tilfeldige transposon innsetting mutanter med utviklingsmessige fenotyper. Mutanter er enten mangler en antenne mycel [skallet (bld)] eller en antenne mycel med redusert spore pigmentering [hvit (whi)]. Transposon mutanter ble generert med mini-Tn5 for innsetting mutagenese6,7. Stammene ble dyrket på MS agar for 5 dager på 30 ° C. Petriskål diameter, 100 mm.
Figur 2: Kontrast micrographs viser en representant antenne filament for S. coelicolor hvite mutant stammer som inneholder tilfeldig transposon innsetting mutasjoner. (A) vist er en representant vill-type antenne filament som har gjennomgått synkron, regelmessig plasserte celledelinger, produsere jevnt formet og størrelse sporer (MT1110). (B-F) Gjenværende panelene viser av svært ulike mikroskopiske fenotyper ulike hvit mutanter som ble isolert via tilfeldig transposon mutagenese. Panelet B viser en antenne filament som ikke har gjennomgått sporulation, men i stedet har produsert svulmende områder innen filament. Lang pilene i C, Dog F angir unormalt store spores som er karakteristisk for mutanter MIC42, MIC43 og TH49. Kort pilen i D -panelet viser et eksempel på en lysed spore kupé. Panelet E viser de delvis trange mindre avdelinger som er typiske for spore kjedene produsert av muterte TH10. Stammene ble dyrket på MS agar for 5 dager på 30 ° C. Mutantene er relatert til de som vises i figur 1. En vill type spore er omtrent 1,1 µm på den lange aksen. Skala bar = 2 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative micrographs viser S. coelicolor mutant kromosom segregering fenotyper. (A) A diag representasjon viser typisk vill-type, regelmessig plasserte flekker utseendet for en kjede av sporer (hver spore inneholder chromosomal DNA) sammenlignet med intermitterende flekker mønsteret for en mutant som viser et kromosom segregering defekt. (B) hvert par paneler viser samme spore kjeden observert av differensial forstyrrelser kontrast (DIC) bildet til venstre og en propidium iodide-farget fluorescens bildet vises til høyre. Vill-type fenotypen (en, b) sammenlignet med to tilfeldige transposon innsetting mutanter (c, d og e, f). Pilene angir sporer blottet for DNA. Stammene ble dyrket på MS agar for 5 dager på 30 ° C. Mutanter vist er relatert til de i figur 1 og figur 2. Skala bar = 1 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Fluorescens mikroskop-bilde av S. venezuelae vill-type belastning beiset med WGA-FITC. (A) A diagram av en antenne filament vises glatt med ingen innrykk og ingen synlige tegn på sporulation med kontrast mikroskopi med stigen-lignende rekke cellevegg flekker som angir et tidlig tidspunkt i sporulation har påbegynt i den samme filament bruker WGA-FITC fluorescens mikroskopi. (B) Micrographs av vill-type S. venezuelae. (en) glatt antenne filamenter finnes blant kjeder av spores. (b) i mycel vises i panelet, en antenne filament på et tidlig stadium i utviklingen besitter en stige som rekke cellevegg deponering. Pilene angir regelmessig plasserte dannelsen av kryss-vegger farget av WGA-FITC som utvikler synkront innenfor en enkelt antenne filament som gjennomgår developmentally-assosiert sporulation. Påkjenningen ble dyrket på MYM (Maltose, Yøst ekstrakt, Malt ekstrakt) MYM agar 38 h på 30 ° C. Skala bar = 2 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Her presenterer vi protokoller for begynnelsen Streptomyces forskere for å starte studier ved å inkludere trinnene for å overføre stammer og forberede aksjer for langtidslagring. Vi beskriver protokollene for visuell og mikroskopiske karakterisering av Streptomyces stammer. Noen typiske første trinnene i phenotyping utviklingsmessige mutanter er: 1) visuell undersøkelse mutant koloniene sammenlignet med vill type kolonier på agar medium; 2) kontrast mikroskopi; og 3) fluorescens mikroskopi av sporogenic antenne hyfer. Basert på fenotypen vises i disse tre trinnene, kan en rekke teknikker være ansatt lenger skjelne fenotypen av en bestemt stamme.
Første phenotyping eksperimenter brukes vanligvis til å beskrive nye arter, identifisere mutanter rundt, delvis karakterisere mutanter og begynner å skjelne typisk rollen som et bestemt gen basert på fenotypen av en identifisert mutant. Metodene som er beskrevet her er allerede brukt i university undervisning laboratorier for å identifisere og karakterisere en rekke Streptomyces mutanter, inkludert de med feil i celledeling48,49, 50 , 51 , 52 , 53 , 54, sporulation55,56, antenne mycel formasjon57,58, antibiotika produksjon59, andre messenger signalnettverk47og kromosom segregering 60. disse teknikkene er de avgjørende første skrittene å bestemme fenotypen av mutanter generelt og avsløre mye viktig informasjon om rollene av gener av interesse. Metoder kan enkelt utvides til andre arter av Streptomyces og har allerede blitt brukt til å beskrive stammer av S. griseus, S. venezuelae, S. scabiesog mange andre streptomycetes. Video protokollene beskrevet her forventes å tjene som en viktig ressurs for nye forskere inn Streptomyces forskningsfelt, som i området i stoffet funnet. Dette inkluderer nye instruktører som arbeider for å bekjempe antibiotikaresistens krisen og utdanne utallige nye en student forskere med crowdsourcing innsats av Small World initiativ.
Teknikkene som beskrives her kan lett tilpasses college og high school klasserommet bruk i tillegg til forskningslaboratorier, bruke endringene beskrevet i video og tekst. Studenter i en første år mikroskopi modul på en liten liberal arts college kunne strek stammer, ta digitale bilder av stammer dyrket på agar media og utføre fase kontrast og fluorescens mikroskopi, som kulminerte i sending av et portefølje av flere paneled tall på slutten av modulen 3 ukers representerer 15t-lab arbeid. Ca 160 første års studenter var ansvarlig for den første phenotyping 320 romanen transposon mutanter. Undergraduate research studenter på tre institusjonene deltok i den første phenotyping av flere mutanter og påfølgende karakterisering av mange av stammene. Omfattende dataene innhentet i en relativt kort tidsperiode, viser verdien av protokollene beskrevet her. Hundrevis av ekstra mutanter er lagret som glyserol mycelial aksjer for fremtidige karakterisering.
Etter initial eksperimenter beskrevet her, kan en rekke metoder benyttes til å forlenge kvaliteten på informasjonen gjelder stammer av interesse. Hvis mutasjon er ukjent, bør genotyperingteknologi metode benyttes til å bestemme type og/eller plasseringen av mutasjon. For eksempel tilfeldige transposon mutagenese av vill-type kromosom6,7,8,9,10,11,12,13 resulterer i koloniene som skal gjennomgå første fenotypiske skjermer som beskrevet ovenfor. Deretter bør plasseringen av transposon identifiseres ved hjelp av en teknikk som inverse utvalg kjedereaksjon (iPCR)61. Avgjøre genotype nyoppdagede mutanter er et viktig skritt etter første karakterisering.
Noen brukte avanserte metoder for påfølgende phenotyping analyse som kan være nevnt i klasserommet eller utdypet videre forskning omfatter grønne fluorescerende protein (GFP) merking for å avgjøre lokaliseringen mønstre for protein av interesse, Gene expression analyser som virkelig tid kvantitative PCR (qPCR) og global gene expression mønstre av vill-type versus mutant via RNA sekvensering (RNA-seq). Phenotyping ferdigheter er også nødvendig for genetiske complementation analyse. I et complementation eksperiment, er vill-type kopi av et gen introdusert i en mutert stamme å fastslå om de nylig tillagte allelet kan kompensere for tap av funksjon av det muterte allelet. Sammenligne fenotypen av complemented belastningen for både den opprinnelige mutant og foreldrekontrollkoden, er vill-type belastning nødvendig.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne Otterbein universitetet Undergraduate stipendiatstillinger Student og Student Research Fund priser til GVK og SGK; Otterbein Professor Gilbert E. Mills minnesmerket utstyrt sabbatsår programmet prisen og Institutt for biologi og Geovitenskap fakultet forskning og stipend utstyrt prisen til JAB. Bert og Jane Horn begavet Student Research Fund i realfag ble tildelt GVK og SGK. Forfatterne vil også takknemlig anerkjenner Duquesne University finansiert Undergraduate stipendiatstillinger programmet GVK og SGK. Tidligere Juniata undergraduate research studenter, Ryan Johnson og Lindsey Draper bidratt mikroskopi bilder for tall 2 og 3, henholdsvis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immersion Oil (Type DF) | Cragille | 16482 | |
| Lens Paper | Fisherbrand | 11-995 | |
| Sterile Water | GeneMate | G-3250-1L | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| Toothpicks (flat) | Target | 081-22-1957 | |
| Pipette Tips (10 mL) | GeneMate | P-1240-10 | |
| Pipette Tips (200 mL) | GeneMate | P-1240-200Y | |
| Pipette Tips (1,250 mL) | GeneMate | P-1240-1250 | |
| Wooden Applicators 6'' | Solon Care | 070809 | |
| Cotton Swabs | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| Soy Flour | Bob's Red Mill | 1516C164 | |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-1KG | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
| Glycerol 100% | VWR amresco life science | 0854-1L | |
| 0.8% NaCl (Saline) | Sigma-Aldrich | SLBB9000V | |
| 1.2 mL freezer tube | NEST | 606101 | |
| Ultra low (-80 °C) freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Cryo Safety Gloves | Bel-Art | H13201 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5856-500EA | |
| Cover slips #1.5 | Thomas Scientific | 64-0721 | |
| Slides | Carolina | 63-2010 | |
| Autoclave | Tuttnauer | 2540E | |
| Phase-Contrast Microscope | Olympus | BX40 | |
| Forceps | Carolina Biological | 624504 | |
| Bunsen Burner | Carolina Biological | 706706 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| PBS (phosphate buffer saline) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| WGA-FITC | Biotium | 29022-1 | |
| Clear nail polish | OPI | 22001009000 | |
| ImageJ | NIH | Free Software | |
| 100 mL beaker | Pyrex USA | 1000-T | |
| 1 L beaker | Carolina Biological | 721253 | |
| 1 L flask | Fisherbrand | S63274 | |
| 250 mL flask | Pyrex USA | 4980 | |
| 100 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721788 | |
| 500 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721792 | |
| Stir Bar | Fisher Scientific | 22-271825 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Camera for Microscope | Olympus | DP72 | |
| Nitrile Examination Gloves (Med) | Bio Excell | 71011002 | |
| Vortex Mixer | Carolina Biological | 701077 |
References
- Barka, E. A., et al. Taxonomy, physiology, and natural products of Actinobacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 1-43 (2015).
- Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (2), 141-147 (2002).
- Redenbach, M., et al. A set of ordered cosmids and a detailed genetic and physical map for the 8 Mb Streptomyces coelicolor A3(2) chromosome. Mol. Microbiol. 21 (1), 77-96 (1996).
- McCormick, J. R., Flardh, K. Signals and regulators that govern Streptomyces development. FEMS Microbiol. Rev. 36 (1), 206-231 (2012).
- Flardh, K., Buttner, M. J. Streptomyces morphogenetics: dissecting differentiation in a filamentous bacterium. Nat. Rev. Microbiol. 7 (1), 36-49 (2009).
- Bennett, J. A. Molecular Genetic analysis of division and development in Streptomyces coelicolor. , Ph.D. Dissertation (2007).
- Hull, T. D., et al. Cyclic Di-GMP phosphodiesterases RmdA and RmdB are involved in regulating colony morphology and development in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 194 (17), 4642-4651 (2012).
- Petzke, L., Luzhetskyy, A. In vivo Tn5-based transposon mutagenesis of streptomycetes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 83 (5), 979-986 (2009).
- Xu, Z., et al. Large-Scale Transposition Mutagenesis of Streptomyces coelicolor Identifies Hundreds of Genes Influencing Antibiotic Biosynthesis. Appl. Environ. Microbiol. 83 (6), (2017).
- Fernandez-Martinez, L. T., et al. A transposon insertion single-gene knockout library and new ordered cosmid library for the model organism Streptomyces coelicolor A3(2). Antonie Van Leeuwenhoek. 99 (3), 515-522 (2011).
- Gehring, A. M., Nodwell, J. R., Beverley, S. M., Losick, R. Genomewide insertional mutagenesis in Streptomyces coelicolor reveals additional genes involved in morphological differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (17), 9642-9647 (2000).
- Bishop, A., Fielding, S., Dyson, P., Herron, P. Systematic insertional mutagenesis of a streptomycete genome: a link between osmoadaptation and antibiotic production. Genome Res. 14 (5), 893-900 (2004).
- Bilyk, B., Weber, S., Myronovskyi, M., Bilyk, O., Petzke, L., Luzhetskyy, A. In vivo random mutagenesis of streptomycetes using mariner-based transposon Himar1. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (1), 351-359 (2013).
- Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. Practical Streptomyces Genetics. , The John Innes Foundation. (2000).
- Gust, B., Kieser, T., Chater, K. F. REDIRECT technology: PCR-targeting system in Streptomyces coelicolor. , John Innes Centre, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 7UH, United Kingdom. (2002).
- Gust, B., Chandra, G., Jakimowicz, D., Yuqing, T., Bruton, C. J., Chater, K. F. Lambda red-mediated genetic manipulation of antibiotic-producing Streptomyces. Adv. Appl. Microbiol. 54, 107-128 (2004).
- Tong, Y., Charusanti, P., Zhang, L., Weber, T., Lee, S. Y. CRISPR-Cas9 based engineering of Actinomycetal genomes. ACS Synth. Biol. 4 (9), 1020-1029 (2015).
- Huang, H., Zheng, G., Jiang, W., Hu, H., Lu, Y. One-step high-efficiency CRISPR/Cas9-mediated genome editing in Streptomyces. Acta BiochimBiophys. Sin.(Shanghai). 47 (4), 231-243 (2015).
- Cobb, R. E., Wang, Y., Zhao, H. High-efficiency multiplex genome editing of Streptomyces species using an engineered CRISPR/Cas system. ACS Synth. Biol. 4 (6), 723-728 (2015).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Brown, E. D., Wright, G. D. Antibacterial drug discovery in the resistance era. Nature. 529 (7586), 336-343 (2016).
- Dodds, D. R. Antibiotic resistance: A current epilogue. Biochem. Pharmacol. 134, 139-146 (2017).
- Caruso, J. P., Israel, N., Rowland, K., Lovelace, M. J., Saunders, M. J. Citizen Science: The Small World Initiative improved lecture grades and California critical thinking skills test scores of nonscience major students at Florida Atlantic University. J. Microbiol. Biol. Educ. 17 (1), 156-162 (2016).
- Davis, E., et al. Antibiotic discovery throughout the Small World Initiative: A molecular strategy to identify biosynthetic gene clusters involved in antagonistic activity. Microbiology Open. 6 (3), (2017).
- van Keulen, G., Dyson, P. J. Production of specialized metabolites by Streptomyces coelicolor A3(2). Adv. Appl. Microbiol. 89, 217-266 (2014).
- Aigle, B., et al. Genome mining of Streptomyces ambofaciens. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 41 (2), 251-263 (2014).
- Antoraz, S., Santamaria, R. I., Diaz, M., Sanz, D., Rodriguez, H. Toward a new focus in antibiotic and drug discovery from the Streptomyces arsenal. Front. Microbiol. 6, 461 (2015).
- Onaka, H. Novel antibiotic screening methods to awaken silent or cryptic secondary metabolic pathways in actinomycetes. J. Antibiot.(Tokyo). 70 (8), 865-870 (2017).
- Chen, J., Wu, Q., Hawas, U. W., Wang, H. Genetic regulation and manipulation for natural product discovery. Appl. Microbiol. Biotechnol. 100 (7), 2953-2965 (2016).
- Katz, L., Baltz, R. H. Natural product discovery: past, present, and future. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 43 (2-3), 155-176 (2016).
- Liu, G., Chater, K. F., Chandra, G., Niu, G., Tan, H. Molecular regulation of antibiotic biosynthesis in Streptomyces. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 77 (1), 112-143 (2013).
- den Hengst, C. D., Tran, N. T., Bibb, M. J., Chandra, G., Leskiw, B. K., Buttner, M. J. Genes essential for morphological development and antibiotic production in Streptomyces coelicolor are targets of BldD during vegetative growth. Mol. Microbiol. 78 (2), 361-379 (2010).
- Tran, N. T., Den Hengst, C. D., Gomez-Escribano, J. P., Buttner, M. J. Identification and characterization of CdgB, a diguanylate cyclase involved in developmental processes in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 193 (12), 3100-3108 (2011).
- Anonymous. Lab Safety. Proper Use of Autoclaves. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
- Border, B. G., Rice-Spearman, L. Microwaves in the laboratory: effective decontamination. Clin. Lab. Sci. 12 (3), 156-160 (1999).
- Bhattacharjee, M. K., Delsol, J. K. Does microwave sterilization of growth media involve any non-thermal effect? J. Microbiol. Methods. 96, 70-72 (2014).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Anonymous, General Laboratory Techniques. An Introduction to the Micropipettor. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
- Baltz, R. H. Genetic manipulation of secondary metabolite biosynthesis for improved production in Streptomyces and other actinomycetes. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 43 (2-3), 343-370 (2016).
- Frohlich, V. C. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. J. Vis. Exp. (18), e844 (2008).
- Anonymous, General Laboratory Techniques. Introduction to Light Microscopy. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory. 3, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1989).
- Anonymous, General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anat. Rec.(Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Chater, K. F. Recent advances in understanding Streptomyces. F1000Res. 5, (2016).
- Chater, K. F. Regulation of sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2): a checkpoint multiplex? Curr. Opin. Microbiol. 4 (6), 667-673 (2016).
- Tschowri, N. Cyclic dinucleotide-controlled regulatory pathways in Streptomyces species. J. Bacteriol. 198 (1), 47-54 (2016).
- Bennett, J. A., et al. Medium-dependent phenotypes of Streptomyces coelicolor with mutations in ftsI or ftsW. J. Bacteriol. 191 (2), 661-664 (2009).
- Mistry, B. V., Del Sol, R., Wright, C., Findlay, K., Dyson, P. FtsW is a dispensable cell division protein required for Z-ring stabilization during sporulation septation in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 190 (16), 5555-5566 (2008).
- Bennett, J. A., Aimino, R. M., McCormick, J. R. Streptomyces coelicolor genes ftsL and divIC play a role in cell division but are dispensable for colony formation. J. Bacteriol. 189 (24), 8982-8992 (2007).
- Bennett, J. A., McCormick, J. R. Two new loci affecting cell division identified as suppressors of an ftsQ-null mutation in Streptomyces coelicolor A3(2). FEMS Microbiol. Lett. 202 (2), 251-256 (2001).
- Dharmatilake, A. J., Kendrick, K. E. Expression of the division-controlling gene ftsZ during growth and sporulation of the filamentous bacterium Streptomyces griseus. Gene. 147 (1), 21-28 (1994).
- McCormick, J. R., Losick, R. Cell division gene ftsQ is required for efficient sporulation but not growth and viability in Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 178 (17), 5295-5301 (1996).
- McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. Growth and viability of Streptomyces coelicolor mutant for the cell division gene ftsZ. Mol. Microbiol. 14 (2), 243-254 (1994).
- Flärdh, K., Findlay, K. C., Chater, K. F. Association of early sporulation genes with suggested developmental decision points in Streptomyces coelicolor A3(2). Microbiology. 145 (9), 2229-2243 (1999).
- van Wezel, G. P., van der Meulen, J., Kawamoto, S., Luiten, R. G., Koerten, H. K., Kraal, B. ssgA is essential for sporulation of Streptomyces coelicolor A3(2) and affects hyphal development by stimulating septum formation. J. Bacteriol. 182 (20), 5653-5662 (2000).
- Capstick, D. S., Willey, J. M., Buttner, M. J., Elliot, M. A. SapB and the chaplins: connections between morphogenetic proteins in Streptomyces coelicolor. Mol. Microbiol. 64 (3), 602-613 (2007).
- Ma, H., Kendall, K. Cloning and analysis of a gene cluster from Streptomyces coelicolor that causes accelerated aerial mycelium formation in Streptomyces lividans. J. Bacteriol. 176 (12), 3800-3811 (1994).
- Xu, Z., et al. Large-scale transposition mutagenesis of Streptomyces coelicolor identifies hundreds of genes influencing antibiotic biosynthesis. Appl. Environ. Microbiol. 83 (6), (2017).
- Dedrick, R. M., Wildschutte, H., McCormick, J. R. Genetic interactions of smc, ftsK, and parB genes in Streptomyces coelicolor and their developmental genome segregation phenotypes. J. Bacteriol. 191 (1), 320-332 (2009).
- Pavlopoulos, A. Identification of DNA sequences that flank a known region by inverse PCR. Methods Mol. Biol. 772, 267-275 (2011).
