Summary
Här presenterar vi protokoll för nybörjare forskare för att initiera fenotypning för farmakologiskt viktiga bakteriell släktet Streptomyces.
Abstract
Streptomycetes är trådformiga jordbakterier som tillhör stammen Actinobacteria och som förekommer i hela världen och producerar ett brett utbud av antibiotika och andra sekundära metaboliter. Streptomyces coelicolor är en välkarakteriserad, sjukdomsframkallande arter som är mottagliga för en mängd olika analyser i labbet. De fenotypning metoder som beskrivs använder här S. coelicolor som en modell streptomycete; dock är metoderna som tillämpliga på alla medlemmar i detta stora släkte samt vissa närbesläktade aktinomyceter. Fenotypning är nödvändigt att karakterisera nya arter av Streptomyces identifieras i miljön, och det är också ett viktigt första steg i kännetecknar nyligen isolerade mutant stammar av Streptomyces. Kunskaper i fenotypning är viktigt för många nya forskare som går in Streptomyces forskningsområdet, som omfattar studiet av bakteriell utveckling, celldelning, kromosomsegregering och andra messenger signalering. Den senaste crowdsourcing antibiotika upptäcktsfärd genom isolering av ny jord mikrober har resulterat i ett ökat behov av utbildning i fenotypning för instruktörer som är nya på området av Streptomyces forskning och deras college eller high school studenter. Detta manuskript beskriver metoder för bakteriestam förökning, lagring och karakterisering genom visuella och mikroskopiska undersökningar. Efter att ha läst denna artikel, bör nya forskare (mikrobiologi utbildning laboratorier och medborgaren forskare) kunna manipulera Streptomyces stammar och påbörja visuella karaktärisering experiment.
Introduction
Streptomycetes är grampositiva, fintrådiga jordbakterier kända för sin förmåga att producera en mängd sekundära metaboliter, inklusive mer än två tredjedelar av de kommersiellt tillgängliga antibiotika, samt som anti-tumör, mot HIV, och antiparasitära läkemedel 1. S. coelicolor är mest genetiskt kännetecknas av släktet2,3 och är den art som används i de metoder som beskrivs här. S. coelicolor har en komplicerad livscykel som börjar med groning av en enda spore, utvecklas till en omfattande, förgrenade vegetativa mycel som växer in i agarsubstratet. Som livscykel vinning, bildas antenn filament som bryter ytspänningen av substrat mycel och slutligen är indelade i långa kedjor av celler som omvandlas slutligen till mogen, grå-pigmenterade sporer. Spridning av dessa nybildade sporer utgör i början av nästa livscykel4.
På grund av dess komplexa mönster av differentiering fungerar S. coelicolor som en utmärkt modell för studier av bakteriell utveckling. Historiskt sett mutationer resulterar i block för två stora utvecklingsstadier och producera distinkta visuella fenotyper. Bld (skallig) mutanter blockeras för antenn mycel bildandet och leder avsaknaden av en fuzzy antenn mycel förmedla ett ”skallig” koloni utseende. Mutanter hämmas i spore bildning och mognad benämns som whi (vit) mutanter eftersom de vanligtvis inte vildtyp halter av grå spore pigment och antenn mycelet förblir vit. Andra intressanta mutanter hämmas i antibiotiska produktion, celldelning, kromosomsegregering eller andra viktiga processer4,5.
Trots upptäckten av många utvecklande gener i Streptomyces arter finns det många fler tros existera utifrån avsaknaden av mättnad av muterade skärmar. Våra laboratorier fortsätter att identifiera nya utvecklande gener med en mini transposon-system som vi har konstruerat. Nya mutant stammar isolerade i slumpmässig mutagenes experiment med våra transposon genomgå fenotypiska screening för att identifiera den eventuella betydelsen av varje ny gen upptäckt6,7. Metoderna för bakteriell fenotypning beskrivs här är relevanta för Streptomyces mutanter isolerat av transposon mutagenes8,9,10,11,12, 13 och andra random metoder, såsom kemiska och ultraviolett (UV) mutagenes14, samt riktade byggandet av mutationer som gen strykningar med recombineering15,16 eller CRISPR-Cas9 (klustrade regelbundet mellanliggande kort Palindromic repeteras) genomet redigering teknik17,18,19 och punktmutationer20.
Som antibiotikaresistens hos patogener blir allt vanligare, blir behovet av nya antibiotika alltmer brådskande21,22. Den ”lilla världen Initiative” (eller SWI) är en effektiv vetenskap, teknik, ingenjörsvetenskap och matematik (STEM) lärande23 och forskning strategi24 för att bekämpa antibiotikaresistens genom crowdsourcing av Collegestudenter, och mer Nyligen gymnasieelever. Stöd för kurser i arbetet ingår att identifiera nya jord mikrober som producerar nya antibiotika (http://www.smallworldinitiative.org). Man tror att en viktig källa till oupptäckta antibiotika kommer att fortsätta vara Streptomyces arter Funna i ett brett utbud av jord och vatten livsmiljöer25,26,27,28, 29,31. Nyligen har vårt laboratorium och andras arbete upptäckt och kännetecknas signalering gener i Streptomyces arter som reglerar morfologi och utveckling, inklusive antibiotika produktion7,32, 33. Förändringar i uttryck av dessa gener resultera i en förändring i de belopp och tidpunkten för antibiotika som produceras. Skickliga fenotypning av nya arter och nya antibiotika-producerande mutanter fortsätter att vara viktigt. Som ny lärare och deras elever blivit stora bidragsgivare inom läkemedelsutveckling, är utbildning i bakteriell fenotypning nödvändigt för att lyckas med dessa nybörjare individer. Dessa experiment är dessutom lätthanterlig för gymnasiet STEM eller mikrobiologi utbildning universitetslaboratorier. De representerar en demonstration av mikrobiella genetiska grundprinciperna i en undervisning lab inställning.
Protocol
1. Förbered instrument, kultur Media, lösningar och petriskålar
- Autoklav tandpetare i en 50 mL bägare täckt med aluminiumfolie att hålla sterila.
- Sterilisera alla torra varor som kommer att användas (tips, pinnar, glasvaror, etc.) i en autoklav.
Obs: varning! Följ alla säkerhetsföreskrifter för autoklav modellen används. Autoklaver utgör en risk för explosioner och brännskador från steam och kontakt med heta ytor, material och media. Visa ”korrekt användning av autoklaver”34för autoklav säkerhet. -
Förbereda en MS agar (Mannitol soja mjöl (SFM))14 att växa kulturer.
- Tillsätt 5 g sojamjöl och 5 g agar i 1 L kolv.
- Lös upp 5 g av mannitol i 250 mL kranvatten och fördela i kolven som innehåller sojamjöl och agar.
- Lägga till en skum plug och folie till öppnandet av kolven och autoklav vid 121 ° C, 15 psi för minst 30 min.
Varning: Detta medium enkelt kokar över. Använd en kolv som rymmer minst fyra gånger den faktiska volymen av MS agar som autoklaveras. En standard tryckkokare kan användas i stället för en autoklav med liknande säkerhetsöverväganden. En mikrovågsugn kan alternativt användas för att sterilisera media och material om tillgång till en autoklav inte är möjligt35,36. High school lärare kanske också vill samarbeta med lokala högskolor eller universitet tillgång till Ånghärdad leveranser. - Cool media tills bekväma nog att hantera. Var noga med att inte kyla för länge eftersom agar stelnar vid temperaturer under 50 ° C.
- Häll sterila petriskålar MS agar från kolven tills botten av varje petriskål är ungefär hälften full (ca 25 mL media per petriskål). Låt stelna innan du använder agarplattor. Lagra agarplattor i en plastpåse i rumstemperatur tills den behövs.
Obs: Agarplattor kan även förvaras i kylskåp, särskilt om antibiotika behövs i media.
2. strimma Streptomyces på plattor för förökning
- Strimma Streptomyces stammar på MS agarplattor till enstaka kolonier med en standard metod, såsom kvadranten strimma metod som visas i Sanders, 201237.
Obs: En inoculating loop eller steril tandpetare kan användas. Tillval: Andra medier används ofta för Streptomyces arter, såsom R2YE och minimal media14. - Inkubera plattorna vid 30 ° C.
- Restreak plattor genom att plocka en enda koloni var 4 – 6 dagar. Som kolonier ålder blir de benägna att slumpmässigt mutation.
3. skapa Glycerol Mycelial bestånd för bakteriell lagring
Obs: Mycelial bestånd kan skapas för alla Streptomyces stammar, inklusive whi bld stammar och andra utvecklingsmässiga mutanter som inte kan slutföra sporulering.
- Lös upp 15 – 20 kolonier i 200 – 500 µL 20% glycerol med hjälp av en steril träpinne applikatorn.
- Överföra suspensionen av kärlringsvävnaden kolonier till ett 1,5 mL frys kultur rör, med hjälp av en mikropipett eller sterila pipett.
Obs: Grunderna i mikropipett användning täcks någon annanstans38. - Lägg tillräckligt 20% glycerol för att göra den slutliga volymen 1 mL och blanda försiktigt. Lagra prover vid-80 ° C.
Obs: varning! Användning kryogen skyddshandskar och en labbrock att skydda huden från kontakt med extrem kyla. -20 ° C frys kan alternativt användas med potentiell minskning av långsiktig lagringstid. Undvik överdriven frysning och upptining för att förlänga livskraft.
4. skapa Glycerol Spore bestånd för stammar kan sporulering
Obs: Spore bestånd är att föredra för långsiktig lönsamhet men är bara möjligt för stammar som klarar av att slutföra sporulering.
-
Sprida 100 µL av kärlringsvävnaden material (från steg 3.1) på en agarplatta att erhålla en konfluenta gräsmatta i tillväxt37.
Obs: Spridningen plätering visas i Sanders37 (ändring: det krävs inte en skivspelare.). Plattan kan stängas med en hand medan du använder å andra sidan för att flytta spridaren i en mild och tillbaka rörelse över agar media.- Pipettera 100 µL av kärlringsvävnaden mycel till mitten av en MS agarplatta.
- Sterilisera en glas eller metall sprida verktyg genom delvis dränka i 70% etanol och passerar spridaren en gång långsamt genom en bunsenbrännare låga snabbare avdunstning av etanol.
Varning: Etanol är mycket brandfarliga. Inte placera flammande spridaren till etanol eller medge den flammande droppen etanol att falla i etanol skålen. Alternativt använda en disponibel steril bomullspinne för att sprida bakterier på plattan, vilket kräver ingen etanol eller flamma. - Sväng MS ägarn tallrik med ena handen medan du använder en tillbaka och tillbaka rörelse för att Inokulera plattan med steril spridaren.
- Inkubera i 5 – 7 dagar vid 30 ° C tills stammen är väl sulfitreducerande.
Obs: Inkubationstider varierar beroende på art och stam.
- Tillsätt 2 mL steril koksaltlösning (0,8% NaCl) till mitten av en konfluenta gräsmatta av Streptomyces celler som har genomgått sporulering.
- Skörda sporer genom att försiktigt gnugga ytan av mycelet med en steril ympning loop (eller en bomullspinne), långsamt går mot kanten av gräsmattan.
- Pipettera en saltlösning innehållande sporer i en 15 mL koniska rör. Vortex kraftfullt att bryta spore kedjor i enskilda celler.
- Centrifugera vid rumstemperatur för 5 min vid ca 2 500 x g.
- Pipettera supernatanten och kassera. Skingra spore pelleten av kraftig vortex agitation i den lilla mängden kvarvarande vätska.
- Återsuspendera sporer i 1 mL 20% glycerol genom att rita lösningen upp och ner med en pipett.
- Överföra glycerol spore beståndet till ett 1,5 mL frys rör. Förvaras vid-80 ° C.
FÖRSIKTIGHET: Använd kryogen skyddshandskar och en labbrock att skydda huden från kontakt med extrem kyla. Frys-20 ° C kan alternativt användas med potentiell minskning av lönsamheten lång sikt lagringstid. Undvik överdriven frysning och upptining för att förlänga livskraft.
5. utför mutagenes
- Utföra mutagenes baserat på önskade resultat som det hänvisas till i Introduktion och Nyligen recenserade av Baltz, 201639.
Obs: Vissa fenotypning experiment kommer inte att kräva mutagenes, såsom avsikt att identifiera nya arter från miljön. Metoder för slumpmässig mutagenes inkluderar användning av en transposon8,9,10,11,12,13, UV-strålning eller kemikalier14. Webbplats riktad mutagenes15,16,17,18,19,20 tekniker kan användas för att skapa specifika punktmutationer, borttagningar, eller andra typer av mutationer.
6. Jämför och registrera det visuella utseendet
- Ta del av kolonin morfologi för varje mutant jämfört med vildtyp parentalstammen efter strimmor alla stammar som i steg 2. Jämför den nya isolaten med en väl studerat arter, såsom S. coelicolor eller S. venezuelae, när kännetecknar nya Streptomyces arter. Observera egenskaper (figur 1) såsom grundläggande form, yta av kolonin (fuzzy, skallig, skrynkliga, etc.), opacitet, höjd och pigmentering (skilja mellan vegetativa mycel, antenn mycel eller omgivande medium).
- Märka en MS agar plattan och streak vildtyp och muterade stammar i Kil mönster (figur 1). Var noga med att ingen stam vidrör en annan stam för att undvika korskontaminering. Notera datum och tid som stammar är streckade på plattan. Inkubera plattorna vid 30 ° C.
- Placera odlade petriskålar på färgat eller vitt papper för att homogenisera bakgrunden. Skriva på papper stam namn, datum, inkubation temperatur och tid från första plattan strimmor. Ta digitala bilder av plattan med den senare information som skrivs på papper bakgrunden så att förväxling minimeras.
Obs: Handstilen kan beskäras från fotografiet vid ett senare tillfälle om det är för figur förberedelse.
7. utföra faskontrast mikroskopi
- Sterilisera pincett genom tvättning i 70% etanol och sedan passerar en bunsenbrännare låga avdunstat etanol. Låt svalna.
- Sterilisera coverslips genom tvättning i 70% etanol och sedan låta dem torka i en steril petriskål.
-
Förbereda ett täckglas lyft av bakteriell tillväxt ska undersökas.
- Plocka upp ett sterilt täckglas med steril pincett och placera täckglaset på en MS agarplatta där bakterietillväxt är tät. Tryck på baksidan av täckglas försiktigt med pincett att säkerställa tillräcklig överföring av bakteriesporer och antenn mycel.
- Plocka upp täckglaset från tallriken och placera den så att sidan med cell material är vänd mot ytan på ett objektglas, med en 15 µL droppe 50% glycerol beredd i vatten för montering. Minska luftbubblor genom att placera täckglaset i 45° vinkel till bild och låt den falla på 50% glycerol.
- (Valfritt) Tätning med clear nagellack för bevarandet av bilden.
-
Utföra faskontrast mikroskopi som beskrivs av Frohlich40 vid olika tidpunkter under livscykeln.
Obs: Upprepade imaging tillåter för en mer komplett analys och förmågan att upptäcka förseningar i utvecklingen. Självständigt upprepa observationerna för att säkerställa noggrannhet och repeterbarhet.- Placera den förberedda bilden på Mikroskop scenen och Lägg en droppe av nedsänkning olja till mitten av täckglaset. Rotera fasen 100 X mål i plats och Ställ kondensorn tornet till inställningen korrekt ”matchande” fas. Fokusera bilden med bara fina justerskruven när objektivet är i kontakt med oljan.
- Undersöka flera synfält för att urskilja märkbar och konsekventa skillnader mellan mutant stammar och den vilda typen, exempelvis möjligheten att bilda sporer, spore storlek och form och totala antalet sporer (se figur 2).
Obs: Alternativ till faskontrast mikroskopi inkluderar differentiell störningar kontrast (DIC) mikroskopi40 och enkla färgning tekniker för användning med ljusa fält Mikroskop41, såsom kristallviolett färgning.
8. utföra fluorescensmikroskopi
- Sterilisera pincett tvätt i 70% etanol och kör sedan genom en bunsenbrännare flamma.
- Plocka upp ett sterilt täckglas med steril pincett och plats på en MS agarplatta där bakterietillväxt är uppenbart. Tryck på baksidan av täckglaset försiktigt med en pincett för att säkerställa tillräcklig överföring av bakteriesporer och antenn filament.
- Plocka upp täckglaset från tallriken och placera den så att sidan med cell material är vänd uppåt, på cardstock för att underlätta i manipulation av täckglaset.
- Dränk täckglaset med iskall metanol (~ 300 µL för ett 20 x 20 mm2 täckglas) och låta det lufttorka helt.
Varning: Metanol är ett mutagen. Undvik direkt kontakt med huden. - Tvätta täckglaset och tre gånger i fosfat buffrad saltlösning (PBS)42 genom försiktigt dispensering och ta bort lösningen.
- Tillsätt 15 µL av 100 μg/ml Propidium jodid och/eller 10 μg/mL vete-groddar-Agglutinin konjugerat med fluorescein isotiocyanat (WGA-FITC) tillverkad i 50% glycerol till ett märkt objektglas.
Obs: Propidium jodid fläckar DNA röd för att upptäcka kromosomala DNA läge medan WGA-FITC fläckar cellväggen grön. - Invertera täckglas nedåtvänt på släpp av fluorescerande fläck på en glasskiva. (Valfritt) täta med clear nagellack för bevarandet av bilden. Färgerna är ljuskänsliga, inkubera i 15 minuter i ett mörklagt eller svagt upplyst rum.
- Se bilderna under en 100 X objektiv med en fas-kontrast eller DIC Mikroskop utrustat med epifluorescence magnetisering kuber för propidium jodid ('Texas Red' Filter Set eller 535/617 nm excitation/utsläpp maxima) och FITC (FITC filter set eller 490/525 nm magnetisering/utsläpp maxima).
- Placera bilden på scenen och fokus med hjälp av grova och fina justeringsreglagen.
- Observera fluorescensen som visas någon annanstans43.
- Använda en gratis bild analys programpaket som kan bidra till identifiering av sporer med lägre fluorescens intensitet44.
Representative Results
Inledande fenotypning experiment är nödvändiga för att karaktärisera nya arter och stammar och kan användas som en gratis strategi för fylogenianalys och DNA-DNA hybridisering experiment som används för att karaktärisera nya arter. Streptomyces mutanter som härrör från slumpmässig mutagenes metoder såsom kemiska, UV, eller transposon mutagenes identifieras vanligen genom direkt, visuella skärmar på agarplattor. Kolonier av Streptomyces undersöks för förändringar i fenotyp i jämförelse med vildtyp, föräldrakontroll stammen. Till exempel en ljusare färgade antenn mycel kan tyda på en lägre nivå av grå pigment orsakas av en defekt i sporulering, eller avsaknaden av ett luddigt utseende är ett tecken på ett block i antenn mycel formation (figur 1). Många streptomycetes producera pigmenterade antibiotika i vegetativa mycel eller omgivande agar. S. coelicolor producerar två pigmenterade antibiotika samt två icke-pigmenterade kära. Actinorhodin är en blå-pigmenterade antibiotikum och undecylprodigiosin är en röd-pigmenterade antibiotika45. Stammar som har genomgått första visuella kolonin skärmar sedan fortplantas genom strimmor för enstaka kolonier.
Efter visuell identifiering av potentiellt intressant mutanter, stammar utsätts för mikroskopisk undersökning. Faskontrast mikroskopi är särskilt lämpad till att undersöka Streptomyces mutanter för defekter, med vildtyp påfrestningen som en kontroll (figur 2). Vildtyp S. coelicolor kolonier producerar vanligtvis en antenn mycel av cirka två dagars tillväxt vid 30 ° C på MS-agar och långa kedjor av sporer av tre dagars tillväxt. Livscykel kommer att utvecklas något långsammare eller snabbare på andra typer av media. Det är absolut nödvändigt att mutanter analyseras på samma tillväxt villkor som den vilda typen när slutsatser om defekter och förseningar. Skallig mutanter kan producera sporer efter långvarig tillväxt på agar media. En klass av mutanter avses som vita mutanter kan antingen försenas för spore bildandet, visar en minskning i överflödet av sporer produceras, producera sporer med form eller storlek defekter, eller helt enkelt producera lägre nivåer av de mogna, grå spore pigment46 . Andra mutanter som undersökt hittills kan vara försenad eller tilltog i livscykel progressionen såsom mutanter påverkas för ackumulering av signalmolekyler (t.ex., cykliska-di-GMP47).
En enkel uppföljning av ljusmikroskop teknik som beskrivs ovan är fluorescensmikroskopi använder propidium jodid att fläcken kromosomala DNA nucleoids och fluorescently märkt vetegroddar agglutinin för att färga cellväggen av sporulering septa. Sporer som saknar en kromosom kommer sakna den röda propidium jodid färgning, medan sporer som innehåller mindre DNA än vanligt kan identifieras om de verkar ha minskat färgning (figur 3). Vetegroddar agglutinin kan användas för att färga cellväggen och skillnader i cellväggen färgning mönster (dvs, celldelning defekter) kan observeras. I figur 4 vildtyp stam av S. venezuelae, en art som används nyligen som en annan modell har streptomycete på grund av dess snabbare livscykel och förmåga att sporulate i flytande45, färgats med WGA-FITC att belysa stege-liknande utbud av division septa som vanligtvis ses tidigt under sporulering.
De inledande fenotypning strategier beskrivs här bör resultera i följande: 1) identifiering av muterade stammar av intresse för vidare studier; (2) förvärvade kunskaper om den nyligen identifierade muterat och den potentiella rollen för den gen som har varit muterat; 3) utformning av en efterföljande serie nästa experimentella steg som kan användas för att ytterligare klargöra rollen av genen i fråga. Vid en nyligen identifierade streptomycete från miljön, kommer forskaren få kunskap om de potentiella nya arter jämfört med redan kännetecknas arter av Streptomyces.
Figur 1: Fotografi av en representativ agarplatta visar makroskopiska kolonin fenotyper av S. coelicolor. På agarplattan visar den luddiga, grå utseendet på antenn mycel för vildtyp S. coelicolor stam MT1110 (WT) i jämförelse med olika slumpmässiga transposon införande mutanter med utvecklingsmässiga fenotyper. Mutanter saknas antingen en antenn mycel [skallig (bld)] eller en antenn mycel med reducerad spore pigmentering [vit (whi)]. Transposon mutanter genererades med hjälp av mini-Tn5 för införande mutagenes6,7. Stammarna odlades på MS agar i 5 dagar vid 30 ° C. Petriskål diameter 100 mm.
Figur 2: Faskontrast micrographs visar en representant antenn glödtråden för S. coelicolor vit mutant stammar innehållande slumpmässiga transposon insertions mutation. (A) visas är en representativ vildtyp antenn glödtråd som genomgått synkron, regelbundet fördelade celldelningar, producerar jämnt formade och storlek sporer (MT1110). (B–F) De återstående panelerna visar de väldigt olika mikroskopiska fenotyperna av olika vita mutanter som isolerades via slumpmässiga transposon mutagenes. Panel B visar en antenn glödtråden som inte har genomgått sporulering, men istället har producerat utbuktande områden inom glödtråden. Långa pilar i C, Doch F visar onormalt stora sporer som är karakteristiska för mutanter MIC42, MIC43 och TH49. På korta pilen i panelen D visar ett exempel på en lyserat spore kupé. Panelen E visar de delvis förträngda mindre fack som är typiska för spore kedjorna produceras av mutant TH10. Stammarna odlades på MS agar i 5 dagar vid 30 ° C. Mutanter är relaterade till de som visas i figur 1. En vildtyp spor är cirka 1,1 µm på den långa axeln. Skalstapeln = 2 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa micrographs visar S. coelicolor mutant kromosom segregation fenotyper. (A) A diagram representation visar typiska vildtyp, regelbundet fördelade färgning utseende för en kedja av sporer (varje spor innehåller kromosomala DNA) jämfört intermittent färgning mönstret för en mutant som visar en kromosom segregation defekt. (B) varje par paneler visar samma spor kedja observeras av Differential störningar kontrast (DIC) bilden till vänster och en propidium jodid-färgade fluorescens bilden visas till höger. Vildtyp fenotypen (a, b) jämfört med två slumpmässiga transposon införande mutanter (c, d och e, f). Pilarna anger sporer saknar DNA. Stammarna odlades på MS agar i 5 dagar vid 30 ° C. Mutanter visas är relaterade till de i figur 1 och figur 2. Skalstapeln = 1 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: Fluorescens Mikrograf S. venezuelae vildtyp stam färgas med WGA-FITC. (A) A diagram över en antenn glödtråden visas smidigt med inga fördjupningar och inga synliga tecken på sporulering med faskontrast mikroskopi i jämförelse med den stege-liknande matris av cellväggen färgning som anger ett tidigt skede av sporulering har i den samma glödtråden använda WGA-FITC under fluorescensmikroskopi börjat. (B) Micrographs av vildtyp S. venezuelae. (en) smidig antenn filament är närvarande bland kedjor av sporer. (b) inom mycelet visas i panelen, en antenn glödtråden på ett tidigt stadium i utvecklingen äger en stege-liknande rad cellvägg nedfall. Pilarna visar regelbundet fördelade bildandet av cross-väggar färgas av WGA-FITC som utveckla synkront inom en enda antenn glödtråd som genomgår utvecklingsmässigt-associerade sporulering. Stammen har odlats på MYM (Maltose, Yöst extrakt, Malt extrakt) MYM agar för 38 h vid 30 ° C. Skalstapeln = 2 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Här presenterar vi protokoll för början Streptomyces forskare för att initiera studier av bland annat de steg som behövs för att sprida stammar och förbereda bestånd för långsiktig lagring. Sedan beskriver vi protokollen för visuell och mikroskopisk karakterisering av Streptomyces stammar. Några typiska inledande steg i fenotypning utvecklingsmässiga mutanter är: 1) visuell undersökning av de mutanta kolonier jämfört med vildtyp kolonier på agarsubstrat; (2) faskontrast-mikroskopi; och 3) fluorescensmikroskopi av sporogenic antenn hyfer. Baserat på fenotypen visas i dessa tre steg, kan en mängd olika tekniker användas till ytterligare urskilja fenotypen av en viss stam.
Inledande fenotypning experiment används ofta att karakterisera nya arter, identifiera mutanter av intresse, delvis karakterisera mutanter och börja urskilja en särskild gen baserat på fenotypen av en identifierad mutant typiska roll. Metoderna som beskrivs här har redan använts i universitetsundervisning laboratorier för att identifiera och karaktärisera ett brett utbud av Streptomyces mutanter, inklusive dem med defekter i celldelning48,49, 50 , 51 , 52 , 53 , 54, sporulering55,56, antenn mycel bildandet57,58, antibiotika produktion59, andra messenger signalering47och kromosomsegregering 60. dessa tekniker är viktiga första stegen för att fastställa fenotypen av mutanter i allmänhet och avslöjar en stor mängd viktig information om roller i gener av intresse. Metoderna kan enkelt förlängas till andra arter av Streptomyces och har redan använts för att beskriva stammar av S. griseus, S. venezuelae, S. skabboch många andra streptomycetes. De video protokoll som beskrivs här förväntas fungera som en viktig resurs för nya forskare in Streptomyces forskningsområden, såsom i området i läkemedelsutveckling. Detta inkluderar de nya instruktörer som arbetar för att bekämpa antibiotikaresistens krisen och utbilda oräkneligt antal nya grundutbildningsprogram student forskare att gå med crowdsourcing ansträngningar av initiativet för små världen.
De tekniker som beskrivs här kan lätt anpassas till college och gymnasiet användning i klassrummet förutom forskningslaboratorier, med de ändringar som beskrivs i video och text. Studenterna i en första året mikroskopi modul på en liten liberal arts college kunde strimma stammar, ta digitala fotografier av stammar som odlas på agar media och utföra faskontrast och fluorescence mikroskopi, som kulminerade i inlämnandet av en portfölj av flera träpaneler siffror i slutet av den 3 vecka modul, som representerar 15 h i-lab arbete. Cirka 160 första årets studerande var ansvariga för den inledande fenotypning av 320 roman transposon mutanter. Grundutbildning forskarstuderande vid tre lärosäten deltog i den inledande fenotypning av ytterligare mutanter och efterföljande karakterisering av många av stammarna. Omfattande uppgifter som erhållits i en relativt kort tidsperiod, illustrerar värdet av de protokoll som beskrivs här. Hundratals ytterligare mutanter har lagrats som glycerol mycelial lager för framtida karakterisering.
Efter de inledande experiment som beskrivs här, kan en mängd metoder användas för att utvidga kvaliteten på information som rör stammar av intresse. Om mutationen är okänd, bör en genotypning metod användas att avgöra typ och/eller placeringen av mutationen. T ex slumpmässiga transposon mutagenes av vildtyp kromosom6,7,8,9,10,11,12,13 resulterar i kolonier som bör genomgå inledande fenotypiska skärmar såsom de som beskrivs ovan. Då platsen för transposon bör identifieras med hjälp av en teknik såsom omvänd polymerasen kedjar reaktion (iPCR)61. Att bestämma vilken genotyp av nyupptäckta mutanter är ett viktigt steg efter första karakterisering.
Vissa vanliga avancerade metoder för efterföljande fenotypning analys som kan vara i klassrummet utforskas genom ytterligare forskning inkluderar grönt fluorescerande protein (GFP) taggning för att bestämma localizationen mönster för proteinet av intresse, gen uttryck analyser såsom real time kvantitativ PCR (qPCR) och globala gen uttrycksmönster av vildtyp kontra mutant via RNA sekvensering (RNA-seq). Fenotypning kompetens krävs också för genetiska komplettering analys. I ett experiment med komplettering införs den vildtyps-kopian av en gen i en muterad stam att avgöra huruvida den nytillagda allelen kan kompensera för den förlust-av-funktionen av muterade allelen. Jämföra fenotypen av kompletteras stammen som både den ursprungliga muterat och föräldrarorganismen, krävs vildtyp stam.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Otterbein universitet för grundutbildning forskningsstipendier för Student och Student Research Fund Awards till GVK och SGK; och den Otterbein Professor Gilbert E. Mills Memorial begåvad sabbatsår Program Award och Institutionen för biologi och geovetenskap fakulteten forskning och stipendium begåvad Award till JAB. I Bert och Jane Horn begåvad Student forskningsfond i vetenskaperna tilldelades GVK och SGK. Författarna vill också tacksamt erkänna Duquesne universitet finansieras grundutbildning forskningsstipendier Program för GVK och SGK. F.d. Juniata grundutbildning forskning högskolestudenter, Ryan Johnson och Lindsey Draper bidrog mikroskopi bilderna för figurerna 2 och 3, respektive.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immersion Oil (Type DF) | Cragille | 16482 | |
| Lens Paper | Fisherbrand | 11-995 | |
| Sterile Water | GeneMate | G-3250-1L | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| Toothpicks (flat) | Target | 081-22-1957 | |
| Pipette Tips (10 mL) | GeneMate | P-1240-10 | |
| Pipette Tips (200 mL) | GeneMate | P-1240-200Y | |
| Pipette Tips (1,250 mL) | GeneMate | P-1240-1250 | |
| Wooden Applicators 6'' | Solon Care | 070809 | |
| Cotton Swabs | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| Soy Flour | Bob's Red Mill | 1516C164 | |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-1KG | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
| Glycerol 100% | VWR amresco life science | 0854-1L | |
| 0.8% NaCl (Saline) | Sigma-Aldrich | SLBB9000V | |
| 1.2 mL freezer tube | NEST | 606101 | |
| Ultra low (-80 °C) freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Cryo Safety Gloves | Bel-Art | H13201 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5856-500EA | |
| Cover slips #1.5 | Thomas Scientific | 64-0721 | |
| Slides | Carolina | 63-2010 | |
| Autoclave | Tuttnauer | 2540E | |
| Phase-Contrast Microscope | Olympus | BX40 | |
| Forceps | Carolina Biological | 624504 | |
| Bunsen Burner | Carolina Biological | 706706 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| PBS (phosphate buffer saline) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| WGA-FITC | Biotium | 29022-1 | |
| Clear nail polish | OPI | 22001009000 | |
| ImageJ | NIH | Free Software | |
| 100 mL beaker | Pyrex USA | 1000-T | |
| 1 L beaker | Carolina Biological | 721253 | |
| 1 L flask | Fisherbrand | S63274 | |
| 250 mL flask | Pyrex USA | 4980 | |
| 100 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721788 | |
| 500 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721792 | |
| Stir Bar | Fisher Scientific | 22-271825 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Camera for Microscope | Olympus | DP72 | |
| Nitrile Examination Gloves (Med) | Bio Excell | 71011002 | |
| Vortex Mixer | Carolina Biological | 701077 |
References
- Barka, E. A., et al. Taxonomy, physiology, and natural products of Actinobacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 1-43 (2015).
- Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (2), 141-147 (2002).
- Redenbach, M., et al. A set of ordered cosmids and a detailed genetic and physical map for the 8 Mb Streptomyces coelicolor A3(2) chromosome. Mol. Microbiol. 21 (1), 77-96 (1996).
- McCormick, J. R., Flardh, K. Signals and regulators that govern Streptomyces development. FEMS Microbiol. Rev. 36 (1), 206-231 (2012).
- Flardh, K., Buttner, M. J. Streptomyces morphogenetics: dissecting differentiation in a filamentous bacterium. Nat. Rev. Microbiol. 7 (1), 36-49 (2009).
- Bennett, J. A. Molecular Genetic analysis of division and development in Streptomyces coelicolor. , Ph.D. Dissertation (2007).
- Hull, T. D., et al. Cyclic Di-GMP phosphodiesterases RmdA and RmdB are involved in regulating colony morphology and development in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 194 (17), 4642-4651 (2012).
- Petzke, L., Luzhetskyy, A. In vivo Tn5-based transposon mutagenesis of streptomycetes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 83 (5), 979-986 (2009).
- Xu, Z., et al. Large-Scale Transposition Mutagenesis of Streptomyces coelicolor Identifies Hundreds of Genes Influencing Antibiotic Biosynthesis. Appl. Environ. Microbiol. 83 (6), (2017).
- Fernandez-Martinez, L. T., et al. A transposon insertion single-gene knockout library and new ordered cosmid library for the model organism Streptomyces coelicolor A3(2). Antonie Van Leeuwenhoek. 99 (3), 515-522 (2011).
- Gehring, A. M., Nodwell, J. R., Beverley, S. M., Losick, R. Genomewide insertional mutagenesis in Streptomyces coelicolor reveals additional genes involved in morphological differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (17), 9642-9647 (2000).
- Bishop, A., Fielding, S., Dyson, P., Herron, P. Systematic insertional mutagenesis of a streptomycete genome: a link between osmoadaptation and antibiotic production. Genome Res. 14 (5), 893-900 (2004).
- Bilyk, B., Weber, S., Myronovskyi, M., Bilyk, O., Petzke, L., Luzhetskyy, A. In vivo random mutagenesis of streptomycetes using mariner-based transposon Himar1. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (1), 351-359 (2013).
- Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. Practical Streptomyces Genetics. , The John Innes Foundation. (2000).
- Gust, B., Kieser, T., Chater, K. F. REDIRECT technology: PCR-targeting system in Streptomyces coelicolor. , John Innes Centre, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 7UH, United Kingdom. (2002).
- Gust, B., Chandra, G., Jakimowicz, D., Yuqing, T., Bruton, C. J., Chater, K. F. Lambda red-mediated genetic manipulation of antibiotic-producing Streptomyces. Adv. Appl. Microbiol. 54, 107-128 (2004).
- Tong, Y., Charusanti, P., Zhang, L., Weber, T., Lee, S. Y. CRISPR-Cas9 based engineering of Actinomycetal genomes. ACS Synth. Biol. 4 (9), 1020-1029 (2015).
- Huang, H., Zheng, G., Jiang, W., Hu, H., Lu, Y. One-step high-efficiency CRISPR/Cas9-mediated genome editing in Streptomyces. Acta BiochimBiophys. Sin.(Shanghai). 47 (4), 231-243 (2015).
- Cobb, R. E., Wang, Y., Zhao, H. High-efficiency multiplex genome editing of Streptomyces species using an engineered CRISPR/Cas system. ACS Synth. Biol. 4 (6), 723-728 (2015).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Brown, E. D., Wright, G. D. Antibacterial drug discovery in the resistance era. Nature. 529 (7586), 336-343 (2016).
- Dodds, D. R. Antibiotic resistance: A current epilogue. Biochem. Pharmacol. 134, 139-146 (2017).
- Caruso, J. P., Israel, N., Rowland, K., Lovelace, M. J., Saunders, M. J. Citizen Science: The Small World Initiative improved lecture grades and California critical thinking skills test scores of nonscience major students at Florida Atlantic University. J. Microbiol. Biol. Educ. 17 (1), 156-162 (2016).
- Davis, E., et al. Antibiotic discovery throughout the Small World Initiative: A molecular strategy to identify biosynthetic gene clusters involved in antagonistic activity. Microbiology Open. 6 (3), (2017).
- van Keulen, G., Dyson, P. J. Production of specialized metabolites by Streptomyces coelicolor A3(2). Adv. Appl. Microbiol. 89, 217-266 (2014).
- Aigle, B., et al. Genome mining of Streptomyces ambofaciens. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 41 (2), 251-263 (2014).
- Antoraz, S., Santamaria, R. I., Diaz, M., Sanz, D., Rodriguez, H. Toward a new focus in antibiotic and drug discovery from the Streptomyces arsenal. Front. Microbiol. 6, 461 (2015).
- Onaka, H. Novel antibiotic screening methods to awaken silent or cryptic secondary metabolic pathways in actinomycetes. J. Antibiot.(Tokyo). 70 (8), 865-870 (2017).
- Chen, J., Wu, Q., Hawas, U. W., Wang, H. Genetic regulation and manipulation for natural product discovery. Appl. Microbiol. Biotechnol. 100 (7), 2953-2965 (2016).
- Katz, L., Baltz, R. H. Natural product discovery: past, present, and future. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 43 (2-3), 155-176 (2016).
- Liu, G., Chater, K. F., Chandra, G., Niu, G., Tan, H. Molecular regulation of antibiotic biosynthesis in Streptomyces. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 77 (1), 112-143 (2013).
- den Hengst, C. D., Tran, N. T., Bibb, M. J., Chandra, G., Leskiw, B. K., Buttner, M. J. Genes essential for morphological development and antibiotic production in Streptomyces coelicolor are targets of BldD during vegetative growth. Mol. Microbiol. 78 (2), 361-379 (2010).
- Tran, N. T., Den Hengst, C. D., Gomez-Escribano, J. P., Buttner, M. J. Identification and characterization of CdgB, a diguanylate cyclase involved in developmental processes in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 193 (12), 3100-3108 (2011).
- Anonymous. Lab Safety. Proper Use of Autoclaves. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
- Border, B. G., Rice-Spearman, L. Microwaves in the laboratory: effective decontamination. Clin. Lab. Sci. 12 (3), 156-160 (1999).
- Bhattacharjee, M. K., Delsol, J. K. Does microwave sterilization of growth media involve any non-thermal effect? J. Microbiol. Methods. 96, 70-72 (2014).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Anonymous, General Laboratory Techniques. An Introduction to the Micropipettor. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
- Baltz, R. H. Genetic manipulation of secondary metabolite biosynthesis for improved production in Streptomyces and other actinomycetes. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 43 (2-3), 343-370 (2016).
- Frohlich, V. C. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. J. Vis. Exp. (18), e844 (2008).
- Anonymous, General Laboratory Techniques. Introduction to Light Microscopy. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory. 3, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1989).
- Anonymous, General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anat. Rec.(Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Chater, K. F. Recent advances in understanding Streptomyces. F1000Res. 5, (2016).
- Chater, K. F. Regulation of sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2): a checkpoint multiplex? Curr. Opin. Microbiol. 4 (6), 667-673 (2016).
- Tschowri, N. Cyclic dinucleotide-controlled regulatory pathways in Streptomyces species. J. Bacteriol. 198 (1), 47-54 (2016).
- Bennett, J. A., et al. Medium-dependent phenotypes of Streptomyces coelicolor with mutations in ftsI or ftsW. J. Bacteriol. 191 (2), 661-664 (2009).
- Mistry, B. V., Del Sol, R., Wright, C., Findlay, K., Dyson, P. FtsW is a dispensable cell division protein required for Z-ring stabilization during sporulation septation in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 190 (16), 5555-5566 (2008).
- Bennett, J. A., Aimino, R. M., McCormick, J. R. Streptomyces coelicolor genes ftsL and divIC play a role in cell division but are dispensable for colony formation. J. Bacteriol. 189 (24), 8982-8992 (2007).
- Bennett, J. A., McCormick, J. R. Two new loci affecting cell division identified as suppressors of an ftsQ-null mutation in Streptomyces coelicolor A3(2). FEMS Microbiol. Lett. 202 (2), 251-256 (2001).
- Dharmatilake, A. J., Kendrick, K. E. Expression of the division-controlling gene ftsZ during growth and sporulation of the filamentous bacterium Streptomyces griseus. Gene. 147 (1), 21-28 (1994).
- McCormick, J. R., Losick, R. Cell division gene ftsQ is required for efficient sporulation but not growth and viability in Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 178 (17), 5295-5301 (1996).
- McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. Growth and viability of Streptomyces coelicolor mutant for the cell division gene ftsZ. Mol. Microbiol. 14 (2), 243-254 (1994).
- Flärdh, K., Findlay, K. C., Chater, K. F. Association of early sporulation genes with suggested developmental decision points in Streptomyces coelicolor A3(2). Microbiology. 145 (9), 2229-2243 (1999).
- van Wezel, G. P., van der Meulen, J., Kawamoto, S., Luiten, R. G., Koerten, H. K., Kraal, B. ssgA is essential for sporulation of Streptomyces coelicolor A3(2) and affects hyphal development by stimulating septum formation. J. Bacteriol. 182 (20), 5653-5662 (2000).
- Capstick, D. S., Willey, J. M., Buttner, M. J., Elliot, M. A. SapB and the chaplins: connections between morphogenetic proteins in Streptomyces coelicolor. Mol. Microbiol. 64 (3), 602-613 (2007).
- Ma, H., Kendall, K. Cloning and analysis of a gene cluster from Streptomyces coelicolor that causes accelerated aerial mycelium formation in Streptomyces lividans. J. Bacteriol. 176 (12), 3800-3811 (1994).
- Xu, Z., et al. Large-scale transposition mutagenesis of Streptomyces coelicolor identifies hundreds of genes influencing antibiotic biosynthesis. Appl. Environ. Microbiol. 83 (6), (2017).
- Dedrick, R. M., Wildschutte, H., McCormick, J. R. Genetic interactions of smc, ftsK, and parB genes in Streptomyces coelicolor and their developmental genome segregation phenotypes. J. Bacteriol. 191 (1), 320-332 (2009).
- Pavlopoulos, A. Identification of DNA sequences that flank a known region by inverse PCR. Methods Mol. Biol. 772, 267-275 (2011).
