Summary
Biz son derece hassas yayılmasından insan kolorektal kanseri tespiti (CRC) hücre dokuları kolonileşmesi izin vermek için burada PDX kaynaklı CRC organoid hücrelere yeşil flüoresan protein (GFP) lentiviral parçacıkların verimli iletim için bir protokol göster stereo-floresan mikroskobik gözlem ile alıcı fareler içine onların enjeksiyon önce.
Abstract
İnsan kolorektal kanser (CRC) tedavisinde güncel gelişmeler rağmen birkaç radikal tedaviler CRC geç aşamaları için etkilidir. Klinik bu meydan okuma, tümör xenograft fare modelleri köklü insan Karsinomu Hücre satırları ve birçok transgenik fare modelleri tümörleri ile geliştirilen preklinik model olarak kullanarak aşmak için. Onlar kısmen insan karsinomlar özelliklerini taklit ama çoğu insan maligniteler işgali ve metastaz dahil olmak üzere önemli yönleri özetlemek başarısız. Böylece, daha iyi insan CRC malign ilerlemesinde temsil alternatif modeller uzun zamandır beklenen.
Burada cerrahi bir hasta disseke küçük CRC parçaları subkutan implantasyonu tarafından hasta kaynaklı tümör xenografts (PDXs) nesil göster. İki nokta üst üste PDXs geliştirmek ve histopathologically hastada CRC benzer. Ancak, birkaç spontan micrometastases etkilenen uzak organlara PDX modelindeki geleneksel kesit tespit vardır. Uzak organlara içine metastatik yayma algılama kolaylaştırmak için iki nokta üst üste PDXs kültür tümör organoid hücreleri elde ve onları GFP lentivirus önce son derece immünyetmezligi NOD/Shi-scid IL2Rγ içine enjeksiyon ile enfektenull (Takoz) fareler. Orthotopically enjekte PDX kaynaklı CRC organoid sürekli olarak alıcı farelerde GFP için formu birincil tümörleri pozitif hücreleri. Ayrıca, kendiliğinden GFP ifade kolonileri özellikle bu fareler akciğerlerde floresans mikroskobu tarafından algılanan micrometastatic geliştirmek. Ayrıca, CRC organoids intrasplenic enjeksiyon sık hepatik kolonizasyon üretir. Birlikte ele alındığında, bu bulgular PDX kaynaklı CRC organoid hücreleri GFP etiketli bir multistep işlemi sırasında görsel olarak algılanabilir olmak işgal-metastaz art arda sıralı olarak adlandırdığı göstermektedir. Açıklanan iletişim kuralları insan CRC PDXs ve 3D kültür GFP lentiviral moleküller tarafından transduced karşılık gelen CRC organoid hücre kurulmasını içerir.
Introduction
Kolorektal kanser (CRC) Kanser ölümleri dünya çapında1ikinci önde gelen nedenidir. İleri evre hastalığı olan hastaların konvansiyonel tedaviler için yetersiz yanıt bloklarındaki radikal tedavi girişimlerine etkisizliği gösterir. Daha etkili tedavi yaklaşımları geliştirmek için bloklarındaki özelliklerini taklit çeşitli preklinik fare modelleri kanser kurulmuştur. Çeşitli CRC hücre satırlarını tümör xenografts kolaylık ve işleme kolaylığı nedeniyle oluşturmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Kanser hücre hatları, uzun vadeli kültür ancak, sık sık güvenilmez sonuçlar ve preklinik ilaç çok önemli sınırlamalar böylece sonuçlanan belirli kültür koşul altında oldukça proliferatif benzersiz hücre popülasyonlarının yelpazesi neden oluyor geliştirme.
Kültürlü vitroolmadan, hasta kaynaklı tümör xenografts (PDXs) da implantasyon insan CRC dokuların cerrahi hastaların2,3,4den disseke hayvan modelleri içine tarafından üretilmedi. PDXs yaygın olarak histopatolojik özellikler recapitulating olarak tanınan ve genetik değişiklikler aslında içinde hangi onlar elde hastalarda tümör mevcut. Ayrıca, hastanın kaynaklı tümör organoids tümör hücre kümeleri kültür yakından orijinal tümör5,6biyolojik özelliklerini taklit 3D koşullar altında tarafından kuruldu oluşur. Bu tümör organoids de böylece kişiselleştirilmiş tedaviler tasarlanmış5olmak izin veren yüksek üretilen iş uyuşturucu tarama için uygulandı. Ancak, belirgin heterojen CRC nüfus içinde tümör mevcut olduğu varsayılır kitle. Belirli CRC nüfus seçmeli olarak çoğalırlar ve PDX ve tümör organoids, pasajlar içinde vivo ve in vitro dizi sırasında sırasıyla genişletmek olabilir. Bu da genel gen ifade profilleri ve epi/genetik durumunu değiştirmek için etkilenen bloklarındaki böylece ebeveyn CRC için çok az benzerlik sonuçlanan izin verebilir.
Hasta kaynaklı CRC organoids ve bu oncogenic mutasyonlar kombinasyonları da insan tümör hücrelerinin tümör işgali ve metastaz tarafından örneği işaretlerinden araştırmak için istihdam edilmiştir liman için tasarlanmış noncancerous insan kolon elde 6,7,8,9. Ancak, hasta kaynaklı CRC orthotopic implantasyonu immünyetmezligi fareler doğan spontan metastaz insidansı çok düşük yaptı içerir işgalinden metastaz art arda sıralı multistep sürecinin çalışmaya zor yerel işgal, intravasation, kan dolaşımına, ekstravazasyonu ve uzak organlara4,10kolonizasyon taşıma. Micrometastasis olarak tümör hücresi birikimi ≤2 mm tarafından temsil edilen, hasta kaynaklı CRC organoids tarafından kurulan, genellikle histopatolojik Analizi deneysel fare modelleri etkilenen uzak organlara bölümleri gözden. Spontan micrometastases görselleştirme da en az vivo verimli bir şekilde alıcı fareler içine onların enjeksiyon önce tümör organoid hücreye floresan işaretleri tanıtımı zorluğu nedeniyle olmuştur. Bu çalışmada, verimli bir şekilde PDX kaynaklı CRC organoid hücrelere alıcı fareler içine enjeksiyon önce 3D kültüründe GFP lentivirus transduce ve son derece hassas algılama, izin vermek için bir iletişim kuralı, stereo-floresans mikroskobu, istihdam geliştirdiğimiz onların formu micrometastases için farklı organları kolonizasyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hastanın Yazılı onam sağlanan ve proje Juntendo Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Fare deneyleri de Tıp Juntendo Fakültesi hayvan Araştırma Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. immünyetmezligi farelerde CRC PDXs kurulması
CRC PDXs (adım 1) kurmak için deneysel prosedürler Şekil 1A' özetlenmiştir.
- Birincil CRC doku hastadan tümör cerrahi rezeksiyon sonra hemen hazırlayın.
- Yıkama birincil CRC doku tarafından buz gibi steril fosfat nazik ajitasyon birkaç kez içinde 30 mL serum fizyolojik (PBS) 50 mL konik tüp içinde tamponlanmış ve buza tutun.
- Doku bir 10 cm steril Cımbız kullanarak Petri yerleştirin, steril makas kullanarak mümkün olduğunca kapsamlı bir şekilde nekrotik alanları kaldırmak ve solid tümör doku küçük parçalar (5 x 5 x 5 mm3 boyutunda) kesilmiş steril jilet kullanarak.
Not: Nekrotik alanlar genellikle daha beyaz, daha yumuşak ve daha kırılgan çevresinde daha vardır. - 6-şey plaka üzerinde buz gibi steril PBS 2 ml steril Cımbız kullanarak tümör küçük parçalar yerleştirin.
- 6 haftalık NOD/Shi-scid IL2Rγ null (takoz) son derece immünyetmezligi fareler mikrop-ücretsiz ve belirli patojen-ücretsiz koşullar altında doğurmak.
- Fareler küçük hayvan inhalasyon Anestezi cihazı kullanarak isoflurane inhalasyon anestezi ve cilt % 70 etanol ile dezenfekte. Normal hızı ve solunum derinliği ve uygun anesthetization için bir ayak çimdik refleks yokluğu sizi temin ederim. Veteriner merhem gözlerde ise anestezi altında göz kuruluğu önlemek için bir seçenektir.
- Kuru sıcaklık sterilizasyon kullanarak tüm cerrahi .aletleri sterilize ve alıcı fareler yara enfeksiyonları önlemek için tüm yordamları için bu araçları kullanın.
- İmzalat fare yüzükoyun laboratuvar tezgah üzerine yerleştirin. Subkutan cepler steril makas kullanarak doku implantasyon için oluşturmak için alıcı fare sağ ve sol kanatları alt kısımlarında üzerinde küçük bir kesi yapmak. Peritoneal membran ponksiyon değil için dikkat ediniz. Bu yordamı ile küçük kanama olmalı.
- Yavaşça yukarıda tümör parçaları yapay hücre dışı matriks 50 µL hazırlanan daldırma ve sonra onları sağ ve sol subkutan cepler alt kısımlarında implant.
- Dikiş yara klipleri cerrahi geçiren farelerde ile belgili tanımlık kesme. İmplante tümör doku bazı kesi derinin altında mesafede yer alan olduğundan emin olun.
Not: cerrahi işlemler en aza indirerek uygun olarak bu çalışmada yok tedaviler ameliyat sonrası ağrı ve enfeksiyon için idare. - Sıcak bir yastık üzerinde fareyi getirin ve yeterli bilinç sağlanana kadar sternal yaslanmış pozisyonu koruyun. Bir kez tam olarak kurtarılan ve tüm dört ayak üzerinde oturmak mümkün, fareler için ev onların kafes döndürülebilir. Avlanma önlemek için sigara işletilen hayvanlarla aynı kafese üreme izin.
- Dikiş sızıntı için kontrol ve fareler cerrahi olarak tedavi grubunda ertesi gün kararlı durumda olduğunu doğrulayın. Fareler için işaret-in hastalık kontrol ve Çap pergeli istihdam haftada bir kez, her fare, tümör boyutu ölçmek.
2. diseksiyon CRC PDXs gelen fareler
CRC PDXs (adım 2) diseksiyon için deneysel prosedürler Şekil 1Badımında özetlenmiştir.
- Tümör subkutan ~ 1 cm3 ' te genellikle yaklaşık 1-3 ay sürer boyutu büyümeye izin.
- Fare küçük hayvan inhalasyon anestezi aygıtını kullanarak isoflurane inhalasyon ile anestezi ve cilt % 70 etanol ile dezenfekte.
- Fare yüzükoyun laboratuvar tezgah üzerine yerleştirin. Cilt deşmek, tümörün ortaya çıkarmak ve dikkatle steril makas kullanarak tümör deriden bağlantısını kesin. Tümör kaldırma sonra bir 10 cm Petri kabına yerleştirin ve herhangi bir fena halde nekrotik bölgeler tümörü sonra PBS ile iki kez 5 mL durulayın.
Not: Nekrotik alanlar genellikle daha beyaz, daha yumuşak ve daha kırılgan çevresinde daha vardır. -
Tümör buza koyun ve eşit 4) dondurma ve 1) CRC organoid kültür, ikincil fare, 3) histolojik inceleme içine nakli 2) dahil olmak üzere farklı uygulamalar ve depolama, tümör parçacıkları için en az 4 parçaya bölün.
- CRC organoids bir nesil için solid tümör dokusu içeren 1 mL steril PBS üzerinde 6 cm petri kabına yerleştirin. Buz üzerinde doku (adım 3) işleme kadar tutun.
- PDX modeli için insan CRC kurmak için ikincil fare taze CRC PDXs geçiş. Tümör doku (5 x 5 x 5 mm3 boyutunda) küçük parçalara kesip steril jilet kullanarak ve yavaşça bu doku parçaları yapay hücre dışı matriks 50 µL daldırma. O zaman, bu parçaları NOG fare sağ ve sol subkutan cepler alt parçalar halinde 1.8-1,11 adımda anlatıldığı gibi implant.
- Histolojik analiz için örnekleri 5 mL % 10 tarafsız tampon formalin oda sıcaklığında 15 mL konik tüp içinde de 2 gündür düzeltin.
- Dondurma, tümör doku (5 x 5 x 5 mm3 boyutunda) küçük parçalara kesilmiş ve yavaşça 500 µL çözüm 1-1.5 mL cryovial tüpler içinde buz gibi hücrenin içine örnekleri daldırma. Ardından tüp-80 ° C dondurucu aktarın.
3. hücre süspansiyon için CRC Organoid kültür içine PDXs çıkarılması
Ayrılma CRC PDXs (adım 3) deneysel prosedürleri Şekil 1Badımında özetlenmiştir.
- Yer yukarıdaki (adım 2.4.1) hazırlanan tümör bir 10 cm Petri kabına parçaları.
- Steril jilet kullanarak parçaları kıyma ve 8 mL % 10 fetal buzağı serum (FCS) içeren 15 mL konik tüp aktarmak-Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) collagenase enzim stokunun 80 µL ile (bkz. Tablo malzeme).
- Tüp sıkıca kapatın ve kap kaçağı önlemek için parafilm ile sarın. Hücre süspansiyon kıyılmış tümör parçaları ayırmak için yavaşça 37 ° C'de 2 h için kışkırtmak Hala sindirilmemiş doku tüpte kalan fazla parçaları olacak unutmayın.
- Santrifüj tüpü 300 x g 4 ° C'de 5 min için de kapasitesi ve süpernatant kaldırın. 10 mL % 10 kullanarak hücre Pelet gidermek hücre süspansiyon yapmak FCS-DMEM.
- Sindirilmemiş doku enkaz ortadan kaldırmak için iki kez bir 50 mL konik tüp ayarla 40 µm hücre süzgeç kullanarak hücre süspansiyon filtre. O zaman, akışı sayesinde 300 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırın ve Pelet buz üzerinde tutun.
4. nesil üzerinde yapay hücre dışı matriks kültürlü CRC Organoids
Kolon PDXs (adım 4) CRC organoid kültürü için deneysel prosedürler Şekil 1Badımında özetlenmiştir.
- (Bkz: Malzemeler tablo, "CRC organoid kültür orta") PDX kaynaklı CRC organoids için uygun bir kültür ortamı kurmak daha önce insan kolon organoids11için tanımlanan medya istihdam.
- Yapay hücre dışı matriks 150 µL uygulayın (bkz. Tablo reçetesi) başına iyi bir 12-şey plaka buz üzerinde ve sonra 30-60 dk bir 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka makinesi jelleri kuvvetlendirmek için kuluçkaya.
- Adım 3.5 CRC organoid kültür orta ile (Kimden adım 4.1) 3 x 105 hücre/ml ayar elde etmek için % 5 FCS ile hücre Pelet askıya alma. Sonra orta 4.2 adımda hazırlanan yapay hücre dışı matriks kaplı plaka üzerine 1 mL tohum. ve bir gecede 37 ° C'de % 5 'un altında kuluçkaya CO2. Bir hemasitometre tümör hücreleri tek hücre ve çok hücreli kümeleri (yapışık hücreleri grubu) hücre süspansiyon gibi sayılması için kullanın.
Not: % 5 FCS collagenase bu çalışmanın kalan enzimatik aktivite gidermek için kullanılır. - Dikkatle kültür orta toplamak, yapay hücre dışı matriks kaplı plaka, 1,5 mL ayırdıktan hücreleri yüzen de dahil olmak üzere tüp ertesi gün santrifüj kapasitesi ve 1400 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi. Ardından, süpernatant kaldırmak ve Pelet buz üzerinde yapay hücre dışı matriks 70 µL yeniden askıya.
- CRC hücre canlılığı arttırmak için tümör hücreleri içeren yapay hücre dışı matriks hücreleri ve yapay hücre dışı matriks kaplı plakasına bağlı bir 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka makinesi kuvvetlendirmek için 30 dk için kuluçkaya tümör organoid üzerine kaplama yapay hücre dışı matriks kaplama. O zaman, bu CRC organoid hücre kültür orta 37 ° C'de % 1 FCS ile 1 mL ile küçük %5 kuluçkaya CO2.
- Kültür orta iki günde değiştirin. CRC organoids orta doldururken, orta günlük değiştirmek gerekli olabilir.
5. nesil ve zenginleştirme GFP Lentiviral parçacıkların
Deneysel yordamlar oluşturma ve zenginleştirme GFP lentiviral parçacıkların (5. adım) için Şekil 1 ciçinde özetlenmiştir.
- Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta içeren % 10 FCS hücrelerle HEK293T kültür ve altı 10 cm yemekleri (çanak başına 2 x 106 hücre) aşağıdaki transfection işlem için hazırlamak.
- DMEM içinde transfection reaktif PRRL-GFP vektör (5 µg)12 ile 20 µL ve pCMV-VSV-G (1 µg) ve pCMV-dR8.2 dvpr (5 µg), steril bir 1,5 ml gibi iki lentiviral ambalaj plazmid gibi karışımı 500 µL çanak başına transfection için hazırlamak microtube. 20 dakika oda sıcaklığında karışımı tutmak ve her 10 cm yemekleri yerleşimi ve onları 18 h için kuluçkaya.
- Orta kaldırmak, her yemek için taze % 10 FCS-RPMI 1640 orta 5 mL eklenir ve ayakta 24 h için bırakılır.
- Klimalı orta her yemeğin 50 mL santrifüj tüpüne toplar ve orta 4 ° C'de 30 mL toplamda gecede saklarız. Taze RPMI 1640 her yemeğin üzerine 5 mL eklenir ve ayakta 24 h için bırakılır.
- Klimalı orta her yemeğin içine a 50 mL santrifüj tüpü ve unutmayın, buz üzerinde orta, toplam 30 mL toplamak. O zaman, hücreleri atın.
- Orta (Kimden adım 5.4-5,5) 60 mL hücreleri kaldırmak ve on iki 5 mL polipropilen santrifüj tüpleri ultrasantrifüj için bu miktarı bölün 0,45 µm filtre ile filtre.
- Virüs konsantre için sallanan bir kova rotor kullanarak santrifüj kapasitesi ( Tablo malzemelerigörmek) 85,327 x g 4 ° C'de 1,5 saat için de
- Hemen orta kaldırın. Konsantre virüs Pelet gidermek için besin Ham'ın karışımı F-12 (F12) 250 µL yer / her on iki DMEM orta FCS olmadan tüpler ve gecede 4 ° C'de sürdürmek. Virüs Pelet kez görünmez olduğunu unutmayın.
- Yavaşça konsantre 5 x GFP lentivirus hisse senedi, muhtemelen GFP lentiviral parçacıkları mL (TU/mL) başına 108 transducing adet ile de dahil olmak üzere, toplam 3 mL toplamak için orta pipette. O zaman, (tüp başına 250 µL dahil) on iki 1.5 mL mikrotüpler-80 ° C'de için bir yıl kadar steril koşullarda saklayın. Özgün çözümünün birden çok donma-tezcan döngüleri önlemek için birçok küçük aliquots hazırlayın.
6. CRC Organoid hücre GFP Lentiviral kültürlü parçacıkları üzerinde yapay hücre dışı matriks ile etiketleme
CRC organoid hücreleri GFP lentivirus (adım 6) ile etiketleme için deneysel prosedürler Şekil 1 ciçinde özetlenmiştir.
- Adım 7-10 gün boyunca müdahale olmadan büyümek ve mekanik olarak steril hücre kazıyıcı kullanarak onları hasat ve sonra 1.5 mL microtube aktarmak için 4,6 hazırlanan CRC organoids izin verir.
Not: Hastaların özgün tümörlerin doğa kültür CRC organoids büyüme bağlıdır. CRC organoids büyüme onları % 60-70 izdiham bir yeni yapay hücre dışı matriks kaplı 12-şey plaka üzerine 1:2 bölünmüş oranında aktarmak için önceden tutarak kaçının. - Microtube 1400 x gde 3 dk santrifüj kapasitesi, kültür orta kaldırmak ve hücre Pelet PBS 500 µL nazik dokunarak içinde çözmek.
- Microtube 1400 x g de 3 dk santrifüj kapasitesi ve PBS ortadan kaldırmak.
- Yapisan CRC organoids ayırmak için 500 µL proteolitik bir hücre dekolmanı çözüm ekleyin ve collagenolytic enzimler hücre için tüpe cips ve nazik dokunarak karıştırın. O zaman, oda sıcaklığında 10 dk razı tüplere bırakın.
- Çok yavaşça % 1'lik ek bir 500 µL ile hücre süspansiyon pipette FCS-DMEM 1.5 mL microtube içinde kabaca hücreleri ayırmak için. Sert pipetting tarafından CRC organoids tek hücre üretimi belirgin hücre canlılığı azaltır. Böylece, bu çok nazikçe bir 1.5 mL microtube pipetting tarafından kitle hücrelerinin hücre süspansiyon görsel olarak tespit terk etmek esastır.
- Hücre süspansiyon için 1400 x g de 3 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
- 5 x GFP lentivirus stokunun 100 µL karışımı ile hücre Pelet gidermek (> 108 TU/mL) ve CRC organoid kültür orta 1.5 mL microtube 5 x 105 bir konsantrasyon için ayarlamak için hafif dokunarak içinde 400 µL ayrışmış tümör hücreleri başına 500 µL . Bir hemasitometre tümör hücreleri tek hücre ve hücre grupları hücre süspansiyon (yukarıdaki adım 4.3) açıklandığı gibi de dahil olmak üzere, sayılması için kullanın.
- Bir yapay hücre dışı matriks kaplı 12-şey plaka, 4.2. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın. Sonra adım 6,7 plaka üzerinde hazırlanan hücre süspansiyon 500 µL yerleştirin ve bırakın 37 ° C'de 18 h için küçük %5 CO2.
- Orta yapay hücre dışı plaka matris kaplı bir 1,5 mL aralıklarla tüpüne müstakil yüzen hücreleri ile toplamak. 1400 x g santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırmak ve Pelet buz üzerinde yapay hücre dışı matriks 70 µL yeniden askıya.
- CRC hücre canlılığı arttırmak için 4.5 adımda anlatıldığı gibi tümör hücreleri içeren yapay hücre dışı matriks yapay hücre dışı matriks kaplı 12-şey plakasına, bağlı tümör organoids üzerine yerleşimi. Ardından, 30 dk içinde bir 37 ° C, % 5 CO2 kuluçka makinesi yapay hücre dışı matriks kaplama kuvvetlendirmek ve sonra bu CRC organoid kültür orta 37 ° C'de % 1 FCS ile 1 mL ile küçük %5 kültür plaka kuluçkaya CO2.
- 3 gün sonra enfeksiyon neredeyse % 100 GFP pozitifliği yüksek titresi lentiviral parçacıkların (bkz. Şekil 2A) kullanımı nedeniyle onaylamak için bir floresan mikroskop altında hücreleri gözlemlemek.
- 7-10 gün hücre büyümesini alıcı fareler içine enjeksiyon önce genişletmek için bir süre için CRC organoids kültür.
7. nesil Metastazlari CRC GFP etiketli Organoids alıcı farelerde tarafından
CRC GFP etiketli organoids (7. adım) kullanarak Metastazlari nesil için deneysel prosedürler Şekil 1 ciçinde özetlenmiştir.
- CRC GFP etiketli organoids hücre süspansiyon ayırmak için mekanik olarak steril hücre kazıyıcı kullanarak onları hasat ve (yukarıdaki adım 6.1) açıklandığı gibi 1.5 mL microtube aktarabilirsiniz.
- Microtube 1400 x gde 3 dk santrifüj kapasitesi, kültür orta kaldırmak ve hücre Pelet PBS 500 µL nazik dokunarak içinde çözmek.
- Microtube 1400 x g de 3 dk santrifüj kapasitesi ve PBS ortadan kaldırmak.
- Hücre dekolmanı çözüm tüp içinde hücre Pelet üzerine 500 µL yerleşimi ve nazik dokunarak karıştırın. O zaman, 10 min için karışım ayakta enzimatik yapisan CRC organoids ayırmak için oda sıcaklığında (yukarıdaki adım 6.4) açıklandığı gibi bırakın.
- Çok yavaşça % 1'lik ek bir 500 µL ile hücre süspansiyon pipette FCS-DMEM 1.5 mL microtube içinde kabaca hücreleri (yukarıdaki adım 6.5) açıklandığı gibi ayırmak için. Sert pipetting tarafından CRC organoids tek hücre üretimi belirgin hücre canlılığı azaltır. Böylece, hücre kütlesi görsel olarak algılanabilir hücre süspansiyon çok nazikçe bir 1.5 mL microtube pipetting tarafından bırakın.
- Hücre süspansiyon için 1400 x g de 3 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
-
CRC PDXs bir spontan metastaz fare modeli kurmak için:
- 5 x 105 hücreleri PBS 50 µL % 50 yapay hücre dışı matriks fare başına ile de dahil olmak üzere hücre süspansiyon hazırlamak. Buz kullanmadan önce kızağa korumak. Bir hemasitometre 4.3 adımda gösterildiği gibi kanser hücrelerinin, sayım için kullanın.
- Bir fare küçük hayvan inhalasyon anestezi aygıtını kullanarak isoflurane inhalasyon ile anestezi ve 1,6 adımda gösterildiği gibi cilt ile % 70 etanol, dezenfekte.
- Laboratuvar tezgah bir sırtüstü pozisyonda NOG fareyi getirin. Rektal mukoza steril cımbız ile tutun ve hafifçe anüs dışına çekin. Sonra hemen bir Ģırınga kullanarak fare rektal submukoza içine adım 7.7.1 hazırlanan hücre süspansiyon enjekte (iğne boyutu: 22 G). Düzenli olarak, 4-6 fareler grup başına sonuçlarını değerlendirmek için kullanılır.
-
CRC PDXs bir deneysel metastaz modelini kurmak için:
- PBS 50 µL fare başına 4 x 104 hücreleri dahil bir CRC organoid hücre süspansiyon hazırlamak. Buz kullanmadan önce kızağa korumak. Bir hemasitometre kanser hücrelerinin (adım 4.3) sayım için kullanın.
- Bir fare küçük hayvan inhalasyon anestezi aygıtını kullanarak isoflurane inhalasyon ile anestezi ve 1,6 adımda gösterildiği gibi cilt ile % 70 etanol, dezenfekte.
- İmzalat NOG fare yüzükoyun laboratuvar tezgah üzerine yerleştirin. Sol kanat alt kısmında küçük bir kesi yapmak ve sonra dikkatli bir şekilde steril makas ve cımbız kullanarak dalak ortaya çıkarmak için Karın zarını kesti. Dalak için steril cımbız ile bağlı yağ dokusu kavramak, sonra yavaş yavaş (yukarıdaki gibi hazırlanan adım 8.1) hücre süspansiyon 50 µL dalak enjekte. Hücre süspansiyon uygun olmadan dışa doğru dalak üzerinden enjekte edilir emin olun. Düzenli olarak, Grup başına 4 fareler sonuçlarını değerlendirmek için kullanılır.
- Tüm fareler üzerinde sıcak bir yastık ameliyattan sonra yerleştirin ve yeterli bilinç sağlanana kadar sternal yaslanmış durumda 1.11 adımda anlatıldığı gibi korumak. Farelerin tamamen iyileşti sonra onları eve onların kafes dönün. Avlanma önlemek için sigara işletilen hayvanlarla aynı kafese üreme izin.
- Dikiş sızıntı için kontrol ve fareler ertesi gün canlı cerrahi olarak tedavi grubunda olduğunu doğrulayın. Çap pergeli, haftada bir kez tüm farelerde istihdam hastalık ve ölçü tümör boyutları belirtileri için fare kontrol edin.
- Fareler (2.5 ay kadar bir süre için) spontan metastaz ve deneysel metastaz (1 ay) algılamak için enjeksiyon sonra gözlemlemek.
- Fareler anestezi ve belirtilen günlerde servikal yerinden çıkması ile kurban. Birincil tümörleri ve karaciğer ve akciğer de dahil olmak üzere çeşitli dokularda incelemek. Disseke tümörleri ve organları 5 mL de buz gibi PBS üzerinde 10 cm Petri kabına yerleştirin ve buza depolayabilirsiniz.
- GFP pozitif CRC organoid hücreleri bulmak için stereo-floresan mikroskop altındaki disseke dokuları gözlemlemek. CCD kamera ile görüntü elde etmek ve standart görüntü işleme yazılımı kullanarak hazırlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir birincil kolorektal adenokarsinom olarak orta derecede farklılaştırılmış tanısı gelen 76 yaşındaki kadın TNM sınıflandırma, sahne IIIA, ameliyat sonrası kemoterapi tarafından takip ile cerrahi olarak rezeke. Birincil CRC hücreleri immunohistochemically carcinoembryonic antijen, Ki-67, pan-cytokeratin ve E-cadherin için olumlu lekeli. Rezeke tümör parçalarını da subkutan kolon PDX modeli oluşturmak için NOG fareler implante edildi. CRC organoid hücreleri sonra bu farelerde subkutan gelişen kolon PDX doku kültürü için elde. CRC organoids sürekli olarak çok hücreli kümeleri pasajlar yapay hücre dışı matriks üzerinde bir dizi sırasında şekillendirme yeteneğine sahip olduğu. Tümör organoids histolojik olarak ve genetik olarak birincil tümörler hastaları5,6doğa yansıtmak gibi in vivo algılama CRC organoid hücre ile yüksek hassasiyet sağlayacak bir fare modeli geliştirmek çalıştı metastatik dağıtım sırasında. Bu hedefe ulaşmak için CRC organoids GFP lentivirus, böylece neredeyse tüm organoids çok parlak GFP (Şekil 2A) gösterilen kaynaklanan ile enfekte. Bu organoids o zaman orthotopically enjekte ve ikincil NOG fareler önce algılama floresan mikroskop altında uzak organlarda GFP pozitif hücrelerinin içine intrasplenically... Biz farelerde incelendiğinde tüm dört (2B şekil, sol) orthotopic sitesinde GFP pozitif birincil tümör oluşumu gözlenen. Ayrıca, üç dört fareler orthotopic enjeksiyonu (Şekil 2B, orta) sonra 2.5 aylıkken muayene akciğerler mikroskobik metastaz bulundu. Ayrıca, karaciğer metastaz yanıt 1 ay sonra (Şekil 2B, sağ) enjeksiyonları, muayene tüm dört fareler içine intrasplenic enjeksiyon olarak tespit edildi.
Birlikte ele alındığında, bu bulgular göstermektedir PDX kaynaklı CRC organoid hücreleri üzerinde yüksek çözünürlüklü GFP floresans kendiliğinden micrometastases ve bu deneysel, zaman alıcı tanıtıldı uzak organlarda geliştirilmiş algılama sağlar Fareler. Yayılmasından PDX kaynaklı CRC organoids vivo içinde bu yüksek-duyarlı tespiti de sadece tümör metastazı biyoloji okuyan için aynı zamanda preklinik ortamda hedefli tedaviler geliştirmek için çok yönlü bir model sunuyor.
Şekil 1: Metastazlari GFP lentivirus NOG farelerde etiketlenmiş PDX kaynaklı CRC organoids tarafından nesil şematik Gösterim. CRC doku küçük parçalar (A) implantasyonu subkutan NOG fareler (adım 1) içine. Ameliyatla hastanın disseke CRC doku parçalar halinde kesilmiş ve subkutan NOG fareler implante. SC: subkutan implantasyon. (B) PDXs (adım 2 – 4) ayrışmış CRC üretimi organoids. Gelişmiş CRC xenografts kıyılmış (adım 2) idi ve kültür collagenase (adım 3) dahil olmak üzere orta içeren bir 15 mL tüp içine aktarılır. Yavaş ajitasyon ile kuluçka sonra filtre uygulanmış (adım 3) CRC hücre askıya alınmıştır. Sonra organoid hücre süspansiyon CRC organoid orta bir yapay hücre dışı matriks kaplı tabağa tohumlari ve gecede inkübe bir CO2 kuluçka (adım 4). Yapay hücre dışı matriks için bağlı CRC organoid hücreleri de ek yapay hücre dışı matriks ile kaplı ve bir CO2 kuluçka (adım 4) inkübe. SC: subkutan implantasyon. (C) alıcı fareler (adım 5-7) içine enjeksiyon istihdam önce GFP lentiviral parçacıklar tarafından transduced CRC üretimi organoids. GFP lentiviral parçacıklar bir yüksek titresi (5. adım) oluşturulan. Yapay hücre dışı matriks üzerinde yetiştirilen PDX kaynaklı CRC organoids doğrudan hücre sıyırıcı hasat ve bir microtube (adım 6) aktarılır. Santrifüjü sonra hücre Pelet PBS içinde yeniden askıya alınmış. Hücre süspansiyon centrifuged ve hücre Pelet ayrışmış. Sonra CRC organoid hücre süspansiyon GFP virüs stok CRC organoid kültür orta yapay ekstraselüler matrisi kaplı plaka geceleme bir CO2 kuluçka (adım 6) ile inkübe. Yapay hücre dışı matriks için bağlı CRC organoid hücreleri ek yapay hücre dışı matriks ile kaplı ve yapay hücre dışı matriks kaplama (adım 6) katılaşmaya CO2 kuluçka makinesine inkübe edildi. CRC organoids sonra hücre büyümesini (adım 6) genişletmek için 7-10 gün süre kültürlü. Spontan metastaz modeli geliştirmek için PBS 50 µL % 50 yapay hücre dışı matriks ile askıya GFP ile etiketli Disosiye 5 x 105 CRC organoid hücreleri NOG fareler (7. adım) orthotopically enjekte edildi. Bir deneysel metastaz modeli oluşturmak için 4 x 104 CRC organoid hücreleri ile GFP PBS 50 µL içinde etiketli intrasplenically NOG fareler (7. adım) enjekte edildi. Tuvalete girmem: orthotopic enjeksiyon, ı.s.: intrasplenic enjeksiyon. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: GFP yüksek çözünürlüklü görsel öğe algılandı kültürlü CRC GFP etiketli organoids, birincil tümörleri ve micrometastases. (A) neredeyse kültürlü CRC organoids % 100'ünü GFP olumlu vardır. Görüntüleri bir stereo-floresan mikroskop kullanarak ele geçirildi. Ölçek çubuğu 250 µm. (B) = GFP-pozitif birincil tümör ve akciğer ve karaciğer micrometastases. Disosiye GFP ifade CRC organoid hücre süspansiyon NOG fareler rektal submukoza (tuvalete girmem inj.) enjekte ettiler. Tümör hücrelerinin çoğunluğu birincil tümör GFP için pozitif olarak gösterilir. GFP pozitif micrometastases (bir okla gösterilen) akciğer kolonileşmesi de gösterilir. Ayrıca, GFP pozitif micrometastases (bir okla gösterilen) karaciğerde tespit edilir ne zaman hücre süspansiyon intrasplenically enjekte (ı.s. inj.) fareler. Ölçek çubuğu 500 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRC PDX modeli yaygın olarak birincil tümör büyüme çalışmaya istihdam edilmiş olsa da, bu model de tümör metastazı soruşturma için uygulanabilir olup olmadığı henüz tam aydınlatılmamıştır değil. Spontan Metastazlari ancak algılanabilir karaciğer ve akciğer çeşitli bildirilen iki nokta üst üste PDX modelleri4,10' da vardı. Micrometastases ile yüksek hassasiyet algılamak için PDX kaynaklı CRC organoids önce kendi orthotopic ve İntravenöz enjeksiyonlar alıcı fareler içine içine GFP lentiviral parçacıklar transducing için bir protokol geliştirdi. Not, her ikisi de kendiliğinden ve deneysel, uzak organlarda oluşturan bu yöntem CRC organoid elde edilen micrometastases, son derece hassas algılanmasını sağlar göstermek başardık.
İletişim kuralına kritik adımlar sağlam küresel oluşumu üzerinde yapay hücre dışı matriks anoikis indüksiyon olmadan hafifçe CRC organoids sırasında passaging serisi pipetting tarafından bakımı içerir. Yüksek titresi lentivirus parçacıklar tarafından ultrasantrifüj konsantre hazırlanması da neredeyse % 100 GFP pozitifliği CRC organoids. , ulaşmak için önemlidir Ayrıca, bu CRC GFP etiketli organoids 10-14 gün içinde alıcı fareler enjekte edilir önerilir. CRC organoids genişlemesi enfeksiyon sonra aşırı derecede uzun süre zayıf GFP ifade organoids seçim lehine olabilir.
CRC organoids enjeksiyon NOG farelerin rektal submukoza içine karaciğer rağmen muhtemelen inferior vena kava yoluyla içine onların metastatik yayma ciğerlerine gösterdi. Karaciğer metastaz kendiliğinden oluşturmak için CRC organoids enjeksiyon laparotomi ile kolon içine gerekli13olur.
B hücre lenfomalarin bazilarinin insidansı zaman zaman NOG immünyetmezligi farelerde lenfositler, insan hasta14Epstein-Barr oncovirus ile enfekte dahil olmak üzere dokularda ile implante arttığını unutmayın. Bu nedenle carcinoembryonic antijen ve cytokeratin 20 gibi insan CRC hücre işaretçileri kullanarak immünhistokimya gerçekleştirerek belirlenecek gelişmekte olan tümörler implante insan CRC kaynaklı olup olmadığını tavsiye etmek uygun olur.
Biz tek bir hasta türetilmiş CRC organoids araştırdık gibi hastaların daha büyük sayıda daha fazla örnekleri bizim bulgular geleceğe genellemek için muayene olmak gerekir. Eğer implant PDX kaynaklı CRC organoids göstermek orthotopic sitesinde en az büyüme ve nadiren uzak sitelerdeki formu Metastazlari müfettişler CRC organoids farklı hasta kaynaklı PDXs açılan düşünmeye teşvik etti.
Bu yöntemle elde GFP etiketli micrometastasis son derece hassas tespiti bize sadece daha ayrıntılı micrometastasis macrometastasis, stromal oluşumu için geçiş ile ilgili birkaç biyolojik çözülmemiş araştırmaya teşvik eder metastatik kolonizasyon ve ilaç direnci, aynı zamanda roman anti-kanser ilaçlar efficacies PDX taşıyan hayvanlar preklinik modelleri olarak istihdam ederek değerlendirmek için satın alma için niş.
GFP tabanlı FACS-sıralama yaşam birincil ve uzak sitelerden çıkarılan CRC organoids da tek hücre tabanlı gen ifadeleri, hem de tümör epigenetik ve metabolomic profilleri imtihanlarını izin potansiyeline sahiptir. Bu tür bulgular CRC organoids metastatik yaygınlaştırılması temel moleküler mekanizmaları aydınlatma için kurşun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir potansiyel ifşa etmek çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Bu eser Juntendo Üniversitesi genç araştırmacı Ödülü (2013, 2014 ve 2015) yaşında, ortak proje Ödülü (2013 ve 2014) K. M. tarafından desteklenen ve Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim bilimsel araştırma için yardım verir ve Teknolojisi, Japonya (Y. K. için 16K 15625 ve M.G. için 16K 15598). Özellikle Coloproctological cerrahi bölümü ve moleküler patoloji tüm üyelerine yararlı tartışmalar ve teknik destek için minnettar olduğumuzu. Biz Ayrıca Dr. Hiroyuki Konno (Hamamatsu Üniversitesi bildirmektenmutluluk tıp) ve Dr. Hideki Kitajima (Uluslararası Üniversitesi Sağlık ve refah) cerrahi fareler ve Dr orthotopic implantasyon için cömert teknik yardım için teşekkür ederiz. Yoshitaka su aygırı (Chiba Kanser Merkezi) tümör organoid kültür yapılması hakkında teknik danışmanlık için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
References
- Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Aparicio, S., Hidalgo, M., Kung, A. L. Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models. Nat Rev Cancer. 15 (5), 311-316 (2015).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clin Cancer Res. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Fujii, M., et al. A Colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2357-E2364 (2017).
- O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nat Biotechnol. 35 (6), 577-582 (2017).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nat Biotechnol. 35 (6), 569-576 (2017).
- Kuo, T. H., et al. Liver colonization competence governs colon cancer metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (26), 12085-12089 (1995).
- Onuma, K., et al. Genetic reconstitution of tumorigenesis in primary intestinal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (27), 11127-11132 (2013).
- Onder, T. T., et al. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Res. 68 (10), 3645-3654 (2008).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am J Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Fujii, E., et al. Characterization of EBV-related lymphoproliferative lesions arising in donor lymphocytes of transplanted human tumor tissues in the NOG mouse. Exp Anim. 63 (3), 289-296 (2014).
