Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Høj-følsomhed påvisning af Micrometastases genereret af normal god landbrugspraksis Lentivirus-transduced Organoids kulturperler fra en Patient-afledte tyktarmen tumoren

Published: June 14, 2018 doi: 10.3791/57374
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,4, 5, 1, 1, 1, 3, 2, 1, 2
1Department of Coloproctological Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine, 2Department of Molecular Pathogenesis, Juntendo University Faculty of Medicine, 3Atopy Research Center, Juntendo University Faculty of Medicine, 4Department of Oral Pathobiological Science and Surgery, Tokyo Dental College, 5Department of Gastroenterology, Juntendo University Faculty of Medicine

Summary

For at tillade meget følsomme påvisning af den udbrede menneskelige kolorektal cancer (CRC) celler koloniserer væv, viser vi heri en protokol for effektiv transduktion af grøn fluorescerende proteiner (NGL) lentiviral partikler i PDX-afledte CRC organoid celler forud for deres injektion i modtagerens mus, med stereo-fluorescens mikroskopiske observation.

Abstract

Trods aktuelle fremskridt i menneskelige kolorektal cancer (CRC) behandling er få radikale behandlinger effektive til de sene stadier af CRC. At overvinde denne klinisk udfordring, tumor xenograft musemodeller ved hjælp af veletablerede menneskeligt carcinom cellelinjer og mange Transgene mus er blevet udviklet modeller med tumorer som prækliniske modeller. De efterligne delvis funktioner af menneskelige karcinomer, men ofte undlader at sammenfatte de vigtigste aspekter af menneskelig maligniteter herunder invasion og metastaser. Alternative modeller, at bedre repræsenterer den maligne progression i menneskelige CRC har således længe ventet.

Heri viser vi generation af patient-afledte tumor xenografts (PDXs) af subkutane implantation af små CRC fragmenter kirurgisk dissekeret fra en patient. Tyktarmen PDXs udvikle og histopathologically ligner CRC i patienten. Par spontane micrometastases er imidlertid påvises i konventionelle tværsnit af berørte fjerntliggende organer i PDX-modellen. For at lette påvisning af metastatisk spredning til fjerntliggende organer, vi udtrukket organoid tumorceller fra kolon PDXs i kultur og inficeret dem med normal god landbrugspraksis lentivirus før injektion i stærkt immundefekte NOD/Shi-scid IL2Rγnull (NOG) mus. Orthotopically indsprøjtet PDX-afledte CRC organoid celler konsekvent form primære tumorer positive for normal god landbrugspraksis i modtagerens mus. Desuden, at spontant udvikle micrometastatic kolonier udtryk for normal god landbrugspraksis er især fundet i lungerne af disse mus af Fluorescens mikroskopi. Derudover producerer intrasplenic injektion af CRC organoids ofte hepatisk kolonisering. Taget sammen, viser disse resultater normal god landbrugspraksis-mærket PDX-afledte CRC organoid celler til at være visuelt kan påvises under en omstændelig proces betegnes invasion-metastase cascade. De beskrevne protokoller omfatter etablering af PDXs af menneskelige CRC og 3D kultur af de tilsvarende CRC organoid celler transduced af normal god landbrugspraksis lentiviral partikler.

Introduction

Kolorektal cancer (CRC) er den næststørste årsag til kræft dødsfald på verdensplan1. De utilstrækkelige svar på konventionel behandling af patienter med fremskreden sygdom angiver ineffektive forsøg på at radikalt helbrede CRCs. For at udvikle mere effektive terapeutiske metoder, der er oprettet forskellige prækliniske musemodeller af kræft, der efterligner Karakteristik af CRCs. Forskellige CRC cellelinjer har været meget anvendt til at generere tumor xenografts på grund af deres bekvemmelighed og lethed af manipulation. Langsigtet kultur af kræft cellelinjer, dog forårsager ofte udvalg af unikke cellepopulationer, der er ganske proliferativ under en bestemt kultur tilstand, hvilket resulterer i upålidelige resultater og afgørende begrænsninger i prækliniske stof udvikling.

Uden at være kultiveret in vitro-, har patient-afledte tumor xenografts (PDXs) også været genereret af implantation i dyremodeller for humane CRC væv kirurgisk dissekeret fra patienter2,3,4. PDXs er bredt anerkendt som recapitulating histopatologiske hovedtræk og genetiske ændringer oprindelig præsentere i tumorer af de patienter, som de er fremstillet. Derudover sammensat patient-afledte tumor organoids af tumor celle klynger blev etableret af kultur 3D betingelser, der nøje efterlignede de biologiske egenskaber af den oprindelige tumorer5,6. Disse tumor organoids blev også anvendt til høj overførselshastighed stof screening, hvilket giver mulighed for personlig behandlinger til at være designet5. Dog markant heterogene CRC populationer antages for at være til stede i en tumor masse. Særlig CRC befolkninger kan selektivt formere og udvide under in vivo og in vitro- serien af passager af PDX og tumor organoids, henholdsvis. Dette kan også give samlede gen expression profiler og epi/genetiske status for den berørte CRCs at ændre, hvilket resulterer i minimalt ligner forældrenes CRC.

Patient-afledte CRC organoids og dem udvundet fra noncancerous menneskelige kolon manipuleret til havn kombinationer af muterede mutationer har også været ansat til at undersøge kendetegnende for humane tumorceller eksemplificeret ved tumor invasion og metastase 6,7,8,9. Men den meget lav forekomst af spontan metastase udspringer orthotopic implantation af patient-afledte CRC til immundefekte mus, har gjort det vanskeligt at studere de omstændelig proces af invasion-metastase kaskade, der omfatter lokale invasion, intravasation, transport i blodbanen, ekstravasation og kolonisering af fjerntliggende organer4,10. Micrometastasis som repræsenteret ved tumor celle aflejring af ≤2 mm, dannet af patient-afledte CRC organoids, er ofte blevet overset på histopatologiske analyse af sektioner fra berørte fjerntliggende organer i eksperimentel musemodeller. Visualisering af spontan micrometastases har også været minimal i vivo på grund af vanskeligheden ved effektivt at indføre fluorescerende markører i tumorceller organoid før deres injektion i modtagerens mus. I denne undersøgelse, udviklede vi en protokol til effektivt transduce normal god landbrugspraksis lentivirus i PDX-afledte CRC organoid celler i 3D kultur før injektion til recipient mus og at tillade meget følsomme påvisning, beskæftiger stereo-Fluorescens mikroskopi, af deres kolonisering af forskellige organer til form micrometastases.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Patienten skriftlig informeret samtykke og projektet blev godkendt af en videnskabsetisk Komité for Juntendo University Faculty of Medicine. Musen eksperimenter blev også godkendt af den animalsk videnskabsetisk Komité ved det Juntendo Fakultet medicin.

1. etablering af CRC PDXs hos immundefekte mus

Eksperimentelle procedurer for indførelse af CRC PDXs (trin 1) er skitseret i figur 1A.

  1. Forberede den primære CRC væv umiddelbart efter kirurgisk resektion af tumor fra patienten.
  2. Vask det primære CRC væv af blid agitation flere gange i 30 mL af iskold sterile fosfat bufferet saltvand (PBS) i en 50 mL konisk slange og holde det på is.
  3. Placer vævet på en 10 cm petriskål ved hjælp af steril pincet, fjerne de nekrotiske områder så udførligt som muligt ved hjælp af steril saks og klippe solid tumor væv i små stykker (5 x 5 x 5 mm3 i størrelse) ved hjælp af steril barberblade.
    Bemærk: Nekrotiske områder er ofte hvidere, blødere og mere smuldrende end de omkringliggende områder.
  4. Læg små stykker af tumor ved hjælp af steril pincet i 2 mL iskold steril PBS på en 6-godt plade.
  5. Opdrætte 6 uger gamle NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) meget immundefekte mus under Kim-gratis og specifikke patogen-gratis betingelser.
  6. Bedøver musene med isofluran indånding ved hjælp af små dyr inhalation anæstesi enhed og Desinficer huden med 70% ethanol. Sikre den normale sats og dybde af respiration og fraværet af en tå knivspids refleks for korrekt anesthetization. Vet salve på øjnene er en mulighed, for at forhindre okulær tørhed under anæstesi.
  7. Sterilisere alle kirurgiske værktøjer ved hjælp af tørre varme sterilisation og derefter bruge disse værktøjer til alle procedurer til at forhindre sårinfektioner i modtagerens mus.
  8. Opstille den bedøvede mus i en udsat position på laboratoriebænk. Gør et lille snit på de nedre dele af den højre og venstre flanke af den modtagende musen til at generere subkutane lommer til væv implantation ved hjælp af steril saks. Passe på ikke for at punktere den peritoneale membran. Der bør være lidt blødning med denne procedure.
  9. Forsigtigt dyppe ovenstående forberedt tumor fragmenter i 50 µL af kunstige ekstracellulære matrix og derefter implantat dem i de lavere dele af de højre og venstre subkutane lommer.
  10. Sutur snit med sår klip i mus under kirurgiske procedurer. Sørg for, at de indopererede tumor væv er placeret på en vis afstand fra indsnit under huden.
    Bemærk: I henhold til minimering af kirurgiske procedurer, ingen behandlinger for post-operative smerter og infektion blev administreret i denne undersøgelse.
  11. Placer musen på en varm pad og vedligeholde brystbenet liggende stilling indtil tilstrækkelig bevidsthed er genoprettet. Når fuldt genvundne og kan sidde på alle fire ben, kan musene sendes tilbage til deres hjem bure. For at forhindre prædation, ikke Tillad avl med ikke-opererede dyr i samme bur.
  12. Check for sutur lækage og bekræfte, at musene er i stabil tilstand de næste dag, i den kirurgisk behandlede gruppe. Kontrollere mus for tegn på sygdom og måle tumorstørrelse i hvert mus, en gang om ugen, beskæftiger calipre.

2. dissektion af CRC PDXs fra mus

Eksperimentelle procedurer for dissektion af CRC PDXs (trin 2) beskrives i figur 1B.

  1. Tillad tumor til at vokse subkutant til ~ 1 cm3 i størrelse, som normalt tager ca 1-3 måneder.
  2. Bedøver musen med isofluran indånding ved hjælp af små dyr inhalation anæstesi enhed og Desinficer huden med 70% ethanol.
  3. Placere musen i en udsat position på laboratoriebænk. Incise huden, udsætte tumor og forsigtigt løsne hud fra tumor ved hjælp af steril saks. Efter fjernelse af tumor, placere den på en 10 cm petriskål og fjerne enhver groft nekrotisk regioner fra tumor derefter skylles to gange med 5 mL PBS.
    Bemærk: Nekrotiske områder er ofte hvidere, blødere og mere smuldrende end de omkringliggende områder.
  4. Placer tumor på is og opdele det lige i mindst 4 dele til forskellige applikationer herunder 1) CRC organoid kulturen, 2) transplantation til sekundære mus, 3) histologisk undersøgelse og 4) nedfrysning og opbevaring af tumor fragmenter.
    1. Generation af CRC-organoids, at placere solid tumor væv på en 6 cm petriskål indeholdende 1 mL steril PBS. Holde væv på is indtil forarbejdning (trin 3).
    2. For at etablere PDX model for menneskelig CRC, passage den friske CRC PDXs ind i en sekundær mus. Skær tumor væv i små stykker (5 x 5 x 5 mm3 i størrelse) ved hjælp af steril barberblade og forsigtigt dyp disse væv fragmenter i 50 µL af kunstige ekstracellulære matrix. Derefter implantat disse fragmenter i de lavere dele af de højre og venstre subkutane lommer af NOG mus, som beskrevet i trin 1,8-1.11.
    3. For histologiske analyse, lave prøverne i 5 mL 10% neutrale bufferet formalin i en 15 mL konisk slange ved stuetemperatur i 2 dage.
    4. For kryopræservering, skåret tumor væv i små stykker (5 x 5 x 5 mm3 i størrelse) og forsigtigt dyp prøverne i 500 µL af celle frysning løsning i 1 – 1,5 mL cryovial rør. Derefter, overføre røret til en-80 ° C fryser.

3. udvinding af PDXs i cellesuspension til CRC Organoid kultur

Eksperimentelle procedurer for dissociation af CRC PDXs (trin 3) beskrives i figur 1B.

  1. Sted den ovenfor (trin 2.4.1) rede tumor fragmenter på en 10 cm petriskål.
  2. Hakkekød fragmenter ved hjælp af steril barberblade og overføre dem til en 15 mL konisk rør indeholdende 8 mL 10% føtalt kalveserum (FCS)-Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) med 80 µL af collagenase enzym stock (Se Tabel af materialer).
  3. Luk røret stramt og Pak fælles landbrugspolitik med parafilm at forhindre lækage. For at adskille hakket tumor fragmenter i en cellesuspension, agitere det forsigtigt i 2 timer ved 37 ° C. Bemærk, at der stadig vil være mange fragmenter af ufordøjet væv forbliver i røret.
  4. Centrifugeres rør på 300 x g i 5 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten. Løse celle pellet ved hjælp af 10 mL af 10% FCS-DMEM at gøre cellesuspension.
  5. For at eliminere ufordøjet væv vragrester, filtrere cellesuspension to gange ved hjælp af de 40 µm celle si ligger på en 50 mL konisk slange. Derefter centrifugeres gennemstrømnings ved 300 x g i 5 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten og holde pellet på is.

4. generation af CRC Organoids kulturperler på kunstige ekstracellulære Matrix

Eksperimentelle procedurer for CRC organoid kultur af kolon PDXs (trin 4) beskrives i figur 1B.

  1. Etablere et egnet til PDX-afledte CRC organoids (Se Tabel af materialer, "CRC organoid næringssubstratet") næringssubstratet beskæftiger medier tidligere beskrevet for menneskelige kolon organoids11.
  2. Anvend 150 µL af kunstige ekstracellulære matrix (Se Tabel af materialer) pr. godt på en 12-godt plade på is og derefter inkuberes i 30-60 min i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator størkne geler.
  3. Suspendere celle toerstoffet fra trin 3.5 med CRC organoid næringssubstratet (fra trin 4.1) med 5% FCS at opnå justering til 3 x 105 celler/mL. Derefter, frø 1 mL medium på den kunstige ekstracellulære matrix-belagt tallerken forberedt i trin 4.2. og der inkuberes natten over ved 37 ° C under 5% CO2. Bruge en hemocytometer til at tælle antallet af tumorceller herunder enkelt celler og flercellede klynger (en gruppe af vedhængende celler) i en cellesuspension.
    Bemærk: 5% FCS bruges til at slukke den tilbageværende enzymatisk aktivitet af collagenase i denne undersøgelse.
  4. Indsamle omhyggeligt næringssubstratet, herunder flydende celler, der er skilt fra den kunstige ekstracellulære matrix-belagt plade, til en 1,5 mL centrifugeres tube den følgende dag og centrifugeres ved 1.400 x g i 5 min. Derefter Fjern supernatanten og genopslæmmes pellet i 70 µL af kunstige ekstracellulære matrix på is.
  5. For at øge CRC cellernes levedygtighed, overlay den tumor celle, der indeholder kunstige ekstracellulære matrix, på tumor organoid celler knyttet til den kunstige ekstracellulære matrix-belagt plade og Inkuber i 30 min. i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator størkne den kunstige ekstracellulære matrix belægning. Altså Ruger det med 1 mL af CRC organoid cellekulturmedium med 1% FCS ved 37 ° C under 5% CO2.
  6. Ændre næringssubstratet hver anden dag. Som CRC organoids fylde medium, kan det blive nødvendigt at ændre mediet dagligt.

5. generation og berigelse af normal god landbrugspraksis Lentiviral partikler

Eksperimentelle procedurer for generation og berigelse af normal god landbrugspraksis lentiviral partikler (trin 5) er skitseret i figur 1 c.

  1. Kultur HEK293T celler med Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium indeholdende 10% FCS og forberede proceduren følgende Transfektion seks 10 cm retter (2 x 106 celler pr. parabol).
  2. For Transfektion pr skål, forberede 500 µL af den blanding, herunder 20 µL Transfektion reagens i DMEM med en PRRL-NGL vektor (5 µg)12 og to lentiviral emballage plasmider, som pCMV-VSV-G (1 µg) og pCMV-dR8.2 dvpr (5 µg), i en sterile 1,5 mL microtube. Holde blandingen ved stuetemperatur i 20 min. og derefter overlay det på hver af de 10 cm retter og dem der inkuberes i 18 h.
  3. Fjern mediet, tilsættes 5 mL frisk 10% FCS-RPMI 1640 medium til hver tallerken og forlade stående i 24 timer.
  4. Indsamle de konditioneret medium fra hver skål i et 50 mL-centrifugerør og gemme alt af 30 mL af substratet ved 4 ° C natten over. Der tilsættes 5 mL af den friske RPMI 1640 på hver tallerken og forlade stående i 24 timer.
  5. Indsamle konditioneret medium fra hver skål i en 50 mL-centrifugerør og holde, i alt 30 mL medium på is. Derefter, kassere cellerne.
  6. 60 mL af substratet (fra trin 5.4-5.5) filtreres på et 0,45 µm filter til at fjerne cellerne og opdele dette antal til 12 5 mL polypropylen centrifugeglas til ultracentrifugering.
  7. For at koncentrere sig virus, centrifugeres dem ved hjælp af en swingende spand rotor (Se Tabel af materialer) på 85,327 x g for 1,5 h ved 4 ° C.
  8. Straks fjerne medium. At løse koncentreret virus pellet, placere 250 µL af næringsstof skinke blandingen F-12 (F12) / DMEM medium uden FCS i hver af de tolv rør og fastholde det ved 4 ° C natten over. Bemærk, at virussen pellet er ofte usynlige.
  9. Forsigtigt afpipetteres medium til at indsamle 3 mL koncentreret 5 x GFP lentivirus materiel, i alt, formentlig herunder normal god landbrugspraksis lentiviral partikler med 108 transducing enheder pr. mL (TU/mL). Derefter gemme de tolv 1,5 mL microtubes (herunder 250 µL pr. tube) under sterile forhold ved-80 ° C i op til et år. Forberede mange små prøver af den oprindelige løsning til at undgå flere fryse-tø cykler.

6. mærkning af CRC Organoid celler med normal god landbrugspraksis Lentiviral partikler kulturperler på kunstige ekstracellulære Matrix

Eksperimentelle procedurer for mærkning CRC organoid celler med normal god landbrugspraksis lentivirus (trin 6) er skitseret i figur 1 c.

  1. Tillad CRC organoids udarbejdet i trin 4.6 at vokse uden indblanding i 7-10 dage og høste dem mekanisk ved hjælp af en steril celle skraber og derefter overføre dem til en 1,5 mL microtube.
    Bemærk: Væksten af CRC organoids i kultur afhænger af karakteren af de oprindelige tumorer fra patienter. Undgå overvækst af CRC-organoids, ved at fastholde dem på 60 – 70% confluence forudgående at overføre i forholdet 1:2 delt på en ny kunstig ekstracellulære matrix-belagt 12-godt tallerken.
  2. Centrifugeres microtube for 3 min på 1.400 x g, fjerne næringssubstratet og løse celle pellet i 500 µL af PBS af blid aflytning.
  3. Centrifugeres microtube for 3 min på 1.400 x g og fjerne PBS.
  4. For at adskille den vedhængende CRC organoids, tilsættes 500 µL af en celle detachement opløsning af proteolytisk og collagenolytic enzymer til cellen pellet i røret og bland det med blid aflytning. Derefter forlade rør til at nøjes med 10 min ved stuetemperatur.
  5. Meget forsigtigt afpipetteres cellesuspension med en ekstra 500 µL af 1% FCS-DMEM flere gange i en 1,5 mL microtube til nogenlunde afstand celler. Generation af enkelt celler fra CRC organoids af barske pipettering reducerer markant cellernes levedygtighed. Det er således vigtigt at forlade massen af celler visuelt kan påvises i en cellesuspension ved meget forsigtigt pipettering i en 1,5 mL microtube.
  6. Centrifugeres cellesuspension til 3 min på 1.400 x g og Fjern supernatanten.
  7. Løse celle pellet med en blanding af 5 x GFP lentivirus stock 100 µL (> 108 TU/mL) og 400 µL af CRC organoid næringssubstratet i 1,5 mL microtube af blid aflytning at tilpasse sig til en koncentration på 5 x 105 dissocieres tumorceller pr. 500 µL . Bruge en hemocytometer til at tælle antallet af tumorceller, herunder enkelt celler og grupper af celler i cellesuspension, som beskrevet ovenfor (trin 4.3).
  8. Forberede en kunstig ekstracellulære matrix-belagt 12-godt plade, som beskrevet i trin 4.2. Derefter placere 500 µL af cellesuspension forberedt i trin 6.7 på pladen og lad det i 18 timer ved 37 ° C under 5% CO2.
  9. Indsamle medium med flydende celler løsrevet fra den kunstige ekstracellulære matrix-belagt plade i en 1,5 mL centrifugering tube. Det der centrifugeres ved 1.400 x g og derefter Fjern supernatanten og genopslæmmes pellet i 70 µL af kunstige ekstracellulære matrix på is.
  10. For at øge CRC cellernes levedygtighed, overlay den tumor celle, der indeholder kunstige ekstracellulære matrix, på tumor organoids knyttet til den kunstige ekstracellulære matrix-belagt 12-godt plade, som beskrevet i trin 4.5. Næste, inkuberes pladen i 30 min i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator at størkne kunstige ekstracellulære matrix belægning og derefter kultur det med 1 mL af næringssubstratet CRC organoid med 1% FCS ved 37 ° C under 5% CO2.
  11. Iagttage cellerne på 3 dage efter infektion under et fluorescens mikroskop at bekræfte næsten 100% normal god landbrugspraksis positivitet på grund af brugen af en høj titer af lentiviral partikler (Se figur 2A).
  12. Kultur CRC organoids for perioder af 7 – 10 dage at udvide cellevækst før injektion i modtagerens mus.

7. generation af metastaser af normal god landbrugspraksis-mærket CRC Organoids i modtagerens mus

Eksperimentelle procedurer for generation af metastaser ved hjælp af normal god landbrugspraksis-mærket CRC organoids (trin 7) er skitseret i figur 1 c.

  1. For at adskille normal god landbrugspraksis-mærket CRC organoids i cellesuspension, høst dem mekanisk ved hjælp af en steril celle skraber og overføre dem til en 1,5 mL microtube, som beskrevet ovenfor (trin 6.1).
  2. Centrifugeres microtube for 3 min på 1.400 x g, fjerne næringssubstratet og løse celle pellet i 500 µL af PBS af blid aflytning.
  3. Centrifugeres microtube for 3 min på 1.400 x g og fjerne PBS.
  4. Overlay 500 µL af celle detachement løsning på celle pellet i røret og bland det med blid aflytning. Derefter, Lad blandingen stå i 10 min ved stuetemperatur til enzymatisk adskille den vedhængende CRC organoids, som beskrevet ovenfor (trin 6.4).
  5. Meget forsigtigt afpipetteres cellesuspension med en ekstra 500 µL af 1% FCS-DMEM flere gange i en 1,5 mL microtube til omtrent adskille cellerne, som beskrevet ovenfor (trin 6.5). Generation af enkelt celler fra CRC organoids af barske pipettering reducerer markant cellernes levedygtighed. Således forlade massen af celler visuelt kan påvises i en cellesuspension ved meget forsigtigt pipettering i en 1,5 mL microtube.
  6. Centrifugeres cellesuspension til 3 min på 1.400 x g og Fjern supernatanten.
  7. At etablere en spontan metastase musemodel af CRC PDXs:
    1. Forberede en cellesuspension, herunder 5 x 105 celler i 50 µL af PBS med 50% kunstige ekstracellulære matrix pr. mus. Opretholde suspensionen på is før brug. Bruge en hemocytometer til optælling kræftceller, som angivet i trin 4.3.
    2. Bedøver en mus med isofluran indånding ved hjælp af små dyr inhalation anæstesi enhed og Desinficer huden med 70% ethanol, som angivet i trin 1,6.
    3. Sted NOG mus i en liggende stilling på laboratoriebænk. Forstå den rektal slimhinde med sterile pincetter og træk det forsigtigt ud af anus. Derefter indsprøjtes straks cellesuspension forberedt i trin 7.7.1 i den rektal submucosa af musen ved hjælp af en sprøjte (nål størrelse: 22 G). Rutinemæssigt, bruges 4-6 mus pr. gruppe til at evaluere resultaterne.
  8. At etablere en eksperimentel metastase model af CRC PDXs:
    1. Forberede en CRC organoid cellesuspension herunder 4 x 104 celler i 50 µL af PBS pr. mus. Opretholde suspensionen på is før brug. Bruge en hemocytometer til optælling kræftceller (trin 4.3).
    2. Bedøver en mus med isofluran indånding ved hjælp af små dyr inhalation anæstesi enhed og Desinficer huden med 70% ethanol, som angivet i trin 1,6.
    3. Opstille den bedøvede NOG mus i en udsat position på laboratoriebænk. Gør et lille snit på den nedre del af den venstre flanke og derefter skære bughinden at omhyggeligt eksponere milten ved hjælp af steril saks og pincet. Forstå det fedtvæv, der er knyttet til milten med sterile pincetter og derefter langsomt injicere 50 µL af cellesuspension (forberedt som ovenstående trin 8,1) i milten. Være sikker på, at cellesuspension sprøjtes korrekt uden passiv udsivning fra milten. Rutinemæssigt, bruges 4 mus pr. gruppe til at evaluere resultaterne.
  9. Placere alle mus på en varm pad efter operationen og opretholde en brystbenet liggende stilling indtil tilstrækkelig bevidsthed er genoprettet, som beskrevet i trin 1.11. Når musene har fuldt restitueret, bringe dem tilbage til deres hjem bure. For at forhindre prædation, ikke Tillad avl med ikke-opererede dyr i samme bur.
  10. Check for sutur lækage og bekræfte, at musene er i live, i gruppen kirurgisk behandlede den næste dag. Kontrollere mus for tegn på sygdom og foranstaltning tumor størrelser, beskæftiger calipre, i alle mus en gang om ugen.
  11. Observere mus til at registrere spontan metastaser (i perioder på op til 2,5 måneder) og eksperimenterende metastaser (1 måned) efter injektion.
  12. Ofre mus via anæstesi og cervikal dislokation på de angivne dage. Dissekere primære tumorer og forskellige væv, herunder lever og lunger. Placer dissekeret tumorer og organer i 5 mL iskold PBS på en 10 cm petriskål og gemme dem på is.
  13. For at påvise en normal god landbrugspraksis-positive CRC organoid celler, observere dissekeret væv under en stereo-fluorescens mikroskop. Erhverve billeder med en CCD kamera og forberede bruger standard billedbehandling software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En primær kolorektal Adenokarcinom diagnosticeret som moderat differentieret havde kirurgisk resektion fra en 76-årig kvinde med TNM klassifikationen, stage IIIa, fulgt af postoperativ kemoterapi. Den primære CRC celler immunohistochemically farves positiv for carcioembryonisk antigen, Ki-67, pan-cytokeratin og E-cadherin. Stykker af resektion tumor var også subkutant implanteret i NOG mus til at generere kolon PDX model. CRC organoid celler blev så udtrukket til vævskultur fra kolon PDX, som havde udviklet subkutant i disse mus. CRC organoids var i stand til konsekvent danner flercellede klynger i løbet af en serie af passager på kunstige ekstracellulære matrix. Som tumor organoids histologisk og genetisk afspejler arten af primære tumorer fra patienter5,6, forsøgte vi at udvikle en musemodel, der ville tillade i vivo påvisning af CRC organoid celler med høj følsomhed under metastatisk spredning. For at nå dette mål, var CRC organoids smittet med normal god landbrugspraksis lentivirus, hvilket resulterer i næsten alle organoids viser meget lyse normal god landbrugspraksis (figur 2A). Disse organoids blev derefter injiceres orthotopically og intrasplenically i sekundær NOG mus forud for påvisning af normal god landbrugspraksis-positive celler i fjerntliggende organer under et fluorescens mikroskop. Vi observerede dannelsen af normal god landbrugspraksis-positive primære tumorer på webstedet orthotopic i alle fire mus undersøgt (figur 2B, venstre). Desuden fandtes mikroskopiske metastaser i lungerne på tre ud af fire mus undersøgt 2,5 måneder efter orthotopic injektioner (figur 2B, i midten). Derudover blev lever metastaser observeret i svar til intrasplenic injektion i alle fire mus undersøgt på 1 måned efter injektioner (figur 2B, højre).

Taget sammen, viser disse resultater, at høj opløsning normal god landbrugspraksis fluorescens på PDX-afledte CRC organoid celler giver mulighed for deres opdagelse i både spontane micrometastases og udviklet eksperimentelt, i fjerntliggende organer, når de føres ind modtageren mus. Denne høj-følsomhed påvisning i udbrede PDX-afledte CRC organoids vivo tilbyder også en alsidig model til at studere biologi af tumor metastaser, men også for at udvikle målrettede behandlinger i indstillingen prækliniske.

Figure 1
Figur 1: skematisk fremstilling af generation af metastaser af PDX-afledte CRC organoids mærket med normal god landbrugspraksis lentivirus i NOG mus. (A) implantering af små stykker af CRC væv subkutant i NOG mus (trin 1). CRC væv kirurgisk dissekeret fra patienten blev skåret i stykker og implanteret subkutant i NOG mus. s.c.: subkutan implantation. (B) Generation af CRC organoids adskilles fra PDXs (trin 2-4). De udviklede CRC xenografts hakket (trin 2) og overført i en 15 mL rør indeholdende næringssubstratet herunder collagenase (trin 3). Efter inkubering med langsom agitation blev CRC cellesuspension filtreret (trin 3). Derefter var organoid cellesuspension i CRC organoid medium seedet på en kunstig ekstracellulære matrix-belagt tallerken og inkuberes natten over i en CO2 inkubator (trin 4). CRC organoid cellerne er knyttet til den kunstige ekstracellulære matrix var også belagt med yderligere kunstige ekstracellulære matrix og inkuberes i en CO2 inkubator (trin 4). s.c.: subkutan implantation. (C) Generation af CRC organoids transduced af normal god landbrugspraksis lentiviral partikler inden ansættelse injektion i modtagerens mus (trin 5 – 7). Normal god landbrugspraksis lentiviral partikler blev genereret ved en høj titer (trin 5). PDX-afledte CRC organoids dyrkes på kunstige ekstracellulære matrix direkte høstet med en celle skraber og overført til en microtube (trin 6). Efter centrifugering var celle pellet re suspenderet i PBS. Cellesuspension var centrifugeres og celle pellet blev adskilt. Derefter, var CRC organoid cellesuspension inkuberes med normal god landbrugspraksis virus bestand i CRC organoid næringssubstratet på den kunstige ekstracellulære matrix-belagt plade natten over i en CO2 inkubator (trin 6). CRC organoid cellerne er knyttet til den kunstige ekstracellulære matrix var belagt med yderligere kunstige ekstracellulære matrix og inkuberes i en CO2 inkubator størkne kunstige ekstracellulære matrix belægning (trin 6). CRC organoids blev derefter kulturperler i perioder på 7-10 dage at udvide cellevækst (trin 6). For at udvikle en spontan metastase model, var de dissocierede 5 x 105 CRC organoid celler mærket med normal god landbrugspraksis suspenderet i 50 µL af PBS med 50% kunstige ekstracellulære matrix injiceres orthotopically ind i NOG mus (trin 7). For at generere en eksperimentel metastase model, blev 4 x 104 CRC organoid celler mærket med normal god landbrugspraksis i 50 µL af PBS injiceret intrasplenically ind i NOG mus (trin 7). OT: orthotopic injektion, i.s.: intrasplenic injektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: High-resolution af normal god landbrugspraksis visualisering opdaget i kulturperler normal god landbrugspraksis-mærket CRC organoids, primære tumorer og micrometastases. (A) næsten 100% af kulturperler CRC organoids er normal god landbrugspraksis positive. Billederne blev fanget ved hjælp af en stereo-fluorescens mikroskop. Skalalinjen = 250 µm. (B) NGL-positivitet i den primære tumor og micrometastases i lunger og leveren. De dissocierede udtryk for normal god landbrugspraksis CRC organoid cellesuspension blev tilført den rektal submucosa (o.t. inj.) af NOG mus. Fleste af tumorcellerne er vist sig at være positiv for normal god landbrugspraksis i den primære tumor. Normal god landbrugspraksis-positive micrometastases koloniserer lungerne (angivet med en pil) er også vist. Derudover normal god landbrugspraksis-positive micrometastases er fundet i leveren (angivet med en pil), når cellesuspension var intrasplenically injiceres (i.s. inj.) ind i musene. Skalalinjen = 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selvom CRC PDX model har været bredt ansat til at studere primær tumorvækst, om denne model er også relevant at undersøge tumor metastaser har ikke endnu blevet fuldt belyst. Spontan metastaser var også knap påviselig i leveren og lungerne af forskellige rapporterede kolon PDX modeller4,10. For at registrere micrometastases med høj følsomhed, udviklede vi en protokol til transducing normal god landbrugspraksis lentiviral partikler i PDX-afledte CRC organoids forud for deres orthotopic og intravenøse injektioner til recipient mus. Bemærk har vi kunnet vise, at denne metode giver mulighed for meget følsomme påvisning af CRC organoid-afledte micrometastases, danner både spontant og eksperimentelt, i fjerntliggende organer.

Kritiske trin i protokollen omfatter vedligeholdelse intakt klumpformet dannelse uden induktion af anoikis på den kunstige ekstracellulære matrix ved forsigtigt pipettering CRC organoids under den passaging serie. Forberedelse af høj titer lentivirus partikler koncentreret af ultracentrifugering er også vigtige for at opnå næsten 100% normal god landbrugspraksis positivitet af CRC organoids. Derudover anbefales det, at NGL-mærket CRC organoids injiceres inden for 10 – 14 dage i recipient mus. Overdrevent lange perioder for udvidelse af CRC-organoids efter infektion kan begunstige udvalg af svagt normal god landbrugspraksis-udtrykker organoids.

Indsprøjtning af CRC organoids i den rektal submucosa af NOG mus viste deres metastatisk spredning til lungerne, men ikke ind i leveren, formentlig gennem den ringere vena cava. For at generere lever metastaser spontant, ville injektion af CRC organoids i tyktarmen med laparotomi være påkrævet13.

Bemærk, at forekomsten af B-celle lymfomer er lejlighedsvis steg i NOG immundefekte mus implanteret med væv, herunder lymfocytter, inficeret med Epstein-Barr oncovirus, fra menneskelige patienter14. Det er derfor rimeligt at anbefale, at om de nye tumorer stammer fra den indopererede menneskelige CRC bestemmes ved at udføre Immunhistokemi hjælp af human CRC celle markører, såsom carcioembryonisk antigen og cytokeratin 20.

Da vi undersøgte CRC organoids stammer fra kun én patient, ønsker flere prøver fra et større antal patienter skal undersøges for at generalisere vores resultater i fremtiden. Hvis den indopererede PDX-afledte CRC organoids Vis minimal vækst på webstedet orthotopic og sjældent form metastaser på fjerne steder, efterforskere opfordres til at overveje at udvinde CRC organoids fra forskellige patient-afledte PDXs.

Den yderst følsomme påvisning af normal god landbrugspraksis-mærket micrometastasis opnåede med denne metode tilskynder os ikke kun for yderligere at undersøge flere uløste biologiske spørgsmål vedrørende overgangen fra micrometastasis til macrometastasis, dannelsen af det stromale niche for metastatisk kolonisering og erhvervelse af resistens over for lægemidler, men også at vurdere efficacies af nye anti-cancer medicin ved at ansætte PDX-bærende dyr som prækliniske modeller.

Normal god landbrugspraksis-baserede FACS-sortering af levende CRC organoids udvundet af primære og fjerne websteder har også potentiale til at tillade enkelt celle-baserede undersøgelser af genet udtryk, samt de epigenetiske og metabolomic profiler, af en tumor. Sådanne resultater kan føre til udredning af de molekylære mekanismer bag metastatisk spredning af CRC-organoids.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen potentielle interessekonflikter at videregive.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af det Juntendo Universitet Young Investigator Award (2013, 2014 og 2015) år gammel, det fælles projekt Award (2013 og 2014) til K. M., og yder i støtte til videnskabelig forskning fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og Teknologi, Japan (16K 15625 til Y. K. og 16K 15598 til M.G.). Vi er især taknemmelige for alle medlemmer af Dept. af Coloproctological kirurgi og molekylære patologi for nyttige diskussioner og teknisk support. Vi takker også Dr. Hiroyuki Konno (Hamamatsu University School Medicine) og Dr. Hideki Kitajima (International University for sundhed og velfærd) for generøse teknisk vejledning i de kirurgiske procedurer for orthotopic implantation ind i musene og Dr. Yoshitaka Hippo (Chiba Cancer Center) for teknisk rådgivning om udførelse af tumor organoid kultur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions
wound clips
2×10mm		 Natsume manufacturing, Japan #C-21-S Autoclave before use
Hamilton syringe
needle size:22 gauge		 Tokyo Science, Japan Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS.
6-well plate BMBio #92006
12-well plate BMBio #92412
15ml conical tube Sumitono Bakelite MS-57150
50ml conical tube Sumitomo Bakelite MS-57500
microtube Eppendorf #0030120086 Autoclave before use
Hemocytometer Erma #03-202-1
40μm cell strainer Corning #352340
Matrigel basement membrane matrix Corning #354234 Store aliqupts at -20°C.
Place on ice until use
Collagenase type 1 Sigma #C1030 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year
Accutase Innovate Cell Technologies #5V2623A Store at 4°C.
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ Gibco #10565018 Store at 4°C. Warm at 37°C before use
Cell banker 1plus ZENOAQ #628 Store at 4°C. Use within 1 month
Penicillin Gibco #15140122 Store at 4°C. Use within 1 month
Streptomycin Gibco #15140122 Store at 4°C. Use within 1 month
hEGF PEPROTECH #AF-100-15 Store at -20°C. Add to medium on same day as use
Y27632, a ROCK inhibitor Wako #253-00591 Store at -20°C. Add to medium on
same day as use
Culture medium Gibco DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin.
Store at 4°C. Use within 1 month.
CRC organoid culture medium
with 1% or 5% FCS		 DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor.
Store at 4°C. Use within 1 month.
the FuGENE 6 transfection regent Roche 11814 443001
Minisart 0.45 µm filter Sartorius stedim 17598-K
5 ml polypropylene centrifuge tubes Beckman Coulter 326819
PRRL-GFP vector Gift from Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-VSV-G Gift from Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvpr Gift from Dr. Robert A. Weinberg
the SW55Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter
a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).
  2. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
  3. Aparicio, S., Hidalgo, M., Kung, A. L. Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models. Nat Rev Cancer. 15 (5), 311-316 (2015).
  4. Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clin Cancer Res. 19 (24), 6787-6801 (2013).
  5. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  6. Fujii, M., et al. A Colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
  7. Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2357-E2364 (2017).
  8. O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nat Biotechnol. 35 (6), 577-582 (2017).
  9. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nat Biotechnol. 35 (6), 569-576 (2017).
  10. Kuo, T. H., et al. Liver colonization competence governs colon cancer metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (26), 12085-12089 (1995).
  11. Onuma, K., et al. Genetic reconstitution of tumorigenesis in primary intestinal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (27), 11127-11132 (2013).
  12. Onder, T. T., et al. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Res. 68 (10), 3645-3654 (2008).
  13. Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am J Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
  14. Fujii, E., et al. Characterization of EBV-related lymphoproliferative lesions arising in donor lymphocytes of transplanted human tumor tissues in the NOG mouse. Exp Anim. 63 (3), 289-296 (2014).

Tags

Kræftforskning sag 136 menneskelige CRC patient-afledte tumor xenograft (PDXs) normal god landbrugspraksis-mærket PDX-afledte tumor organoids lentiviral transduktion micrometastasis 3D kultur
Høj-følsomhed påvisning af Micrometastases genereret af normal god landbrugspraksis Lentivirus-transduced Organoids kulturperler fra en Patient-afledte tyktarmen tumoren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Okazawa, Y., Mizukoshi, K., Koyama,… More

Okazawa, Y., Mizukoshi, K., Koyama, Y., Okubo, S., Komiyama, H., Kojima, Y., Goto, M., Habu, S., Hino, O., Sakamoto, K., Orimo, A. High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor. J. Vis. Exp. (136), e57374, doi:10.3791/57374 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter