Summary
Um hochempfindliche Detektion der Verbreitung von menschlichen colorectal Krebses (CRC) Zellen Gewebe besiedeln können, zeigen wir hier ein Protokoll zur effizienten Transduktion des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Lentivirale Partikel in PDX-abgeleitete CRC organoide Zellen vor der Injektion in Empfänger Mäuse mit Stereo-Fluoreszenz-mikroskopische Beobachtung.
Abstract
Trotz aktueller Fortschritte in der Behandlung der menschlichen kolorektalen Karzinoms (CRC) sind einige radikale Therapien effektiv für den späten Stadien der CRC. Zur Überwindung dieser klinische Herausforderung, Tumor-Xenograft-Maus-Modellen alteingesessenen mit menschlichen Karzinom-Zell-Linien und viele transgenen Mausmodellen mit Tumoren wurden als präklinischen Modellen entwickelt. Sie teilweise die Funktionen der menschlichen Karzinome zu imitieren, aber oft nicht auf die wesentlichen Aspekte der menschlichen Tumoren einschließlich Invasion und Metastasierung zu rekapitulieren. Alternative Modelle, die besser die maligne Progression in menschlichen CRC darstellen sind so lange erwartet worden.
Wir zeigen hier Generation von Patienten abgeleitet Tumor Xenografts (PDXs) durch subkutane Implantation von kleinen CRC-Fragmente von einem Patienten chirurgisch seziert. Der Doppelpunkt, den pdxs entwickeln und histopathologisch ähneln die CRC des Patienten. Allerdings sind einige spontane Fixierungsprotokoll nachweisbar in konventionellen Querschnitte der betroffenen entfernte Organe des PDX-Modells. Um die Erkennung von metastasierendem Verbreitung in entfernten Organen zu erleichtern, wir Doppelpunkt PDXs in Kultur organoide Tumorzellen entnommen und mit GFP Lentivirus vor der Injektion in stark immungeschwächte NOD/Shi-scid IL2Rγ infiziertNull (NOG) Mäuse. Orthotopically injiziert PDX-abgeleitete CRC organoide Zellen konsequent Form Primärtumoren positiv für GFP im Empfänger Mäuse. Darüber hinaus entwickeln spontan Micrometastatic, die Kolonien mit dem Ausdruck GFP vor allem in den Lungen von diesen Mäusen durch Fluoreszenzmikroskopie erkannt werden. Darüber hinaus produziert intrasplenic Injektion von CRC Organellen häufig hepatische Kolonisation. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse GFP gekennzeichnet PDX-abgeleitete CRC organoide Zellen visuell erkennbaren in einem mehrstufigen Prozess werden die Invasion Metastasierung Kaskade genannt. Die beschriebenen Protokolle gehört die Einrichtung der PDXs der menschlichen CRC und 3D Kultur der entsprechenden CRC organoide Zellen durch GFP Lentivirale Partikel ausgestrahlt.
Introduction
Kolorektales Karzinom (CRC) ist die zweithäufigste Ursache von Krebs Todesfälle weltweit1. Die unzureichende Reaktion auf konventionelle Therapien von Patienten mit fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung zeigt die Unwirksamkeit der Versuche, CRCs radikal zu heilen. Um eine effektivere therapeutische Ansätze zu entwickeln, entstanden verschiedene präklinische Mausmodelle von Krebs, die die Eigenschaften des SFB zu imitieren. Verschiedene CRC-Zell-Linien wurden weithin zur Tumor Xenografts aufgrund ihrer Bequemlichkeit und Leichtigkeit der Manipulation zu generieren. Langfristige Kultur von Krebszelllinien, führt jedoch oft zu Auswahl an einzigartigen Zell-Populationen, die ziemlich proliferative unter einer bestimmten Kultur Bedingung, damit was zu unzuverlässigen Ergebnissen und entscheidende Einschränkungen in präklinischen Droge Entwicklung.
Ohne kultiviert in Vitro, wurden auch durch Implantation in Tiermodellen der CRC Gewebe chirurgisch seziert von Patienten2,3,4Patienten abgeleitet Tumor Xenografts (PDXs) generiert. PDXs sind weithin als Rekapitulation der histopathologischen Haupteigenschaften und genetische Veränderungen, die ursprünglich in Tumoren der Patienten, von denen sie abgeleitet wurden. Darüber hinaus bestehend Patienten abgeleitet Tumor Organellen aus Tumorzellen, die Cluster von Kultur unter 3D Bedingungen entstanden, die genau die biologischen Eigenschaften des ursprünglichen Tumoren5,6nachgeahmt. Dieser Tumor Organellen wurden auch für Hochdurchsatz-Drogen-Screening, wodurch personalisierte Therapien gestaltete5übernommen. Jedoch deutlich heterogene CRC-Populationen sind davon ausgegangen, dass innerhalb eines Tumors sein Masse. Bestimmte CRC Populationen könnte gezielt vermehren und während der in Vivo und in Vitro Reihe von Passagen des PDX und Tumor Organellen, bzw. zu erweitern. Dies kann die gesamte gen expressionsprofile und Epi/genetischen Status der betroffenen CRCs zu verändern, auch damit was zu minimalen Ähnlichkeit mit der elterlichen CRC.
Patienten-abgeleitete CRC Organellen und diejenigen extrahiert aus noncancerous menschlichen Dickdarm zum Hafen, die Kombinationen von Onkogenen Mutationen auch beschäftigt sind, zu untersuchen, die Kennzeichen der menschlichen Tumorzellen von Tumorinvasion und Metastasierung beispielhaft entwickelt 6,7,8,9. Jedoch hat die sehr niedrige Inzidenz von spontanen Metastasen aus orthotopen Implantation des Patienten abgeleitet CRC in immungeschwächte Mäuse es schwierig gemacht, mehrstufigen Prozess der Invasion Metastasierung Kaskade zu studieren, die enthält lokale Invasion, Intravasation, Transport in der Blutbahn, Extravasation und Besiedlung von entfernten Organen4,10. Micrometastasis als Prozessbevollmächtigte Tumor Zelle Ablagerung von ≤2 mm, durch Patienten abgeleitet CRC Organellen gebildet, wurde histopathologischen Analyse der Abschnitte von betroffenen entfernte Organe in experimentellen Mausmodellen oft übersehen. Visualisierung von spontanen Fixierungsprotokoll wurde auch minimal in Vivo aufgrund der Schwierigkeiten der Tumorzellen organoide vor deren Injektion Empfänger Mäuse effizient fluoreszierenden Marker einzuführen. In dieser Studie entwickelt wir ein Protokoll, um effizient GFP Lentivirus in 3D Culture vor der Injektion in Empfänger Mäuse PDX-abgeleitete CRC organoide Zellen transduzieren und hochempfindlichen Erkennung ermöglichen Einsatz Stereo-Fluoreszenz-Mikroskopie, der ihre Besiedlung der verschiedenen Organe zu Form Fixierungsprotokoll.
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Protocol
Der Patienten zur Verfügung gestellt schriftliche Einwilligungserklärung und das Projekt wurde von der Ethikkommission der Forschung der Juntendo University Fakultät genehmigt. Die Maus-Experimente stimmten auch die Tier-Forschung-Ethik-Kommission der Juntendo Fakultät für Medizin.
1. Aufbau der CRC PDXs in immungeschwächte Mäuse
Experimentelle Verfahren für die Festlegung von CRC PDXs (Schritt 1) sind in Abbildung 1Askizziert.
- Bereiten Sie das primäre CRC Gewebe unmittelbar nach der chirurgischen Resektion des Tumors vom Patienten.
- Waschen das primäre CRC-Gewebe durch sanfte Agitation mehrmals in 30 mL eiskaltes sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einem 50 mL konische Röhrchen und halten sie auf dem Eis.
- Legen Sie das Gewebe auf einer 10 cm Petrischale mit einer sterilen Pinzette, entfernen Sie die nekrotischen Bereiche so umfassend wie möglich mit einer sterilen Schere und schneiden die solide Tumorgewebe in kleine Stücke (5 x 5 x 5 mm-3 in der Größe) mit sterilen Rasierklingen.
Hinweis: Nekrotischen Bereiche sind oft weißer, weicher und mehr mürbe als die umliegenden Gebiete. - Legen Sie die kleine Stücke des Tumors mit einer sterilen Pinzette in 2 mL eiskaltes sterile PBS auf einer 6-Well-Platte.
- 6 Wochen altes Baby NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) stark immungeschwächte Mäuse unter Keim–frei und spezifischen Erreger–freien Bedingungen zu züchten.
- Betäuben Sie die Mäuse mit Isofluran Inhalation mit dem kleinen Tier Inhalationsgerät Anästhesie zu und Desinfizieren Sie die Haut mit 70 % Ethanol. Sichern Sie den Normaltarif und Tiefe der Atmung und des Fehlens einer Zehe Prise Reflex für richtige Anesthetization. Tierarzt Salbe für die Augen ist eine Option, um okuläre Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente mit trockener Hitze-Sterilisation zu und verwenden Sie diese Tools für alle Verfahren, um Wundinfektionen bei Empfänger Mäusen zu verhindern.
- Platzieren Sie die narkotisierten Maus in Bauchlage auf dem Labortisch. Machen Sie einen kleinen Schnitt an den unteren Teilen der rechten und linken Flanken der Empfänger Maus, subkutane Taschen für die Gewebe-Implantation mit einer sterilen Schere zu generieren. Achten Sie darauf, nicht die peritoneale Membrane durchstechen. Kleine Blutung mit diesem Verfahren soll.
- Tauchen Sie sanft die oben genannten Tumor Fragmente in 50 µL künstliche extrazelluläre Matrix vorbereitet und implantieren sie dann in den unteren Teilen der rechten und linken subkutanen Taschen.
- Naht der Schnitt mit Wunde Clips in den Mäusen chirurgische Verfahren unterziehen. Stellen Sie sicher, dass die implantierten Tumorgewebe in einiger Entfernung von der Schnitt unter der Haut befinden.
Hinweis: Gemäß chirurgische Eingriffe zu minimieren, wurden in dieser Studie keine Behandlungen für postoperative Schmerzen und Infektionen verabreicht. - Platzieren Sie den Mauszeiger auf einer warmen Unterlage und pflegen Sie der sternalen Liegeradposition, bis genügend Bewusstsein wiederhergestellt ist. Sobald vollständig erholt und in der Lage, auf allen vier Beinen zu sitzen, können die Mäuse in ihrer Heimat Käfige zurückgegeben werden. Um zu verhindern, dass Prädation, lassen Sie Zucht mit Tieren nicht betrieben, in den gleichen Käfig nicht zu.
- Naht Leckage prüfen Sie und bestätigen Sie, dass die Mäuse in einem stabilen Zustand am nächsten Tag in der chirurgisch behandelten Gruppe. Die Mäuse auf Anzeichen von Krankheit prüfen und Messen der Größe des Tumors in jeder Maus, einmal in der Woche beschäftigt Bremssättel.
2. Präparation des CRC PDXs von Mäusen
Experimentelle Verfahren zur Zerlegung von CRC PDXs (Schritt 2) sind in Abbildung 1 bbeschrieben.
- Lassen Sie den Tumor subkutan auf ~ 1 cm3 in der Größe wachsen, was in der Regel etwa 1 – 3 Monate dauert.
- Betäuben Sie die Maus mit Isofluran Inhalation mit dem kleinen Tier Inhalationsgerät Anästhesie zu und Desinfizieren Sie die Haut mit 70 % Ethanol.
- Platzieren Sie den Mauszeiger in Bauchlage auf dem Labortisch. Die Haut einzuschneiden, aussetzen des Tumors und die Haut aus dem Tumor mit einer sterilen Schere vorsichtig lösen. Nach dem Entfernen des Tumors, legen Sie es auf einer 10 cm Petrischale und entfernen Sie grob nekrotischen Bereiche aus dem Tumor zu, dann spülen Sie zweimal mit 5 mL PBS.
Hinweis: Nekrotischen Bereiche sind oft weißer, weicher und mehr mürbe als die umliegenden Gebiete. -
Den Tumor auf Eis legen und ebenso in mindestens 4 Teile für verschiedene Anwendungen einschließlich (1) die CRC organoide Kultur, 2) Transplantation in sekundären Mäuse, 3) histologische Untersuchung und (4) Einfrieren und Lagerung der Tumor Fragmente aufteilen.
- Das solide Tumorgewebe Platz für Generation von CRC Organellen auf eine 6 cm Petrischale mit 1 mL sterile PBS. Halten Sie das Gewebe auf dem Eis bis Verarbeitung (Schritt 3).
- Das PDX-Modell für menschliche CRC zu schaffen, frische CRC PDXs Durchgang in eine sekundäre Maus. Das Tumorgewebe klein geschnitten (5 x 5 x 5 mm-3 in der Größe) mit sterilen Rasierklingen und sanft tauchen diese gewebefragmente in 50 µL künstliche extrazelluläre Matrix. Dann, Implantat diese Fragmente in den unteren Teilen der rechten und linken subkutanen Taschen der NOG Maus, wie in Schritt 1,8 – 1.11 beschrieben.
- Für die histologische Analyse fix Proben in 5 mL 10 % neutral gepuffertem Formalin in einem 15 mL konische Röhrchen bei Raumtemperatur für 2 Tage.
- Kleinschneiden Sie für die Kryokonservierung das Tumorgewebe (5 x 5 x 5 mm-3 in der Größe) und Tauchen Sie sanft die Proben in 500 µL Zelle Lösung in 1 – 1,5 mL Cryoröhrchen Rohre einfrieren. Übertragen Sie anschließend das Rohr auf einem-80 ° C Gefrierschrank.
3. Gewinnung von PDXs in der Zellsuspension für die CRC organoide Kultur
Experimentelle Verfahren zur Dissoziation des CRC PDXs (Schritt 3) sind in Abbildung 1 bbeschrieben.
- Statt der oben genannten (Schritt 2.4.1) vorbereiteten Tumor Fragmente auf einer 10 cm Petrischale.
- Zerkleinere die Fragmente mit sterilen Rasierklingen und übertragen Sie sie in einem 15 mL konische Röhrchen mit 8 mL 10 % fetalen Kälberserum (FCS)-Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 80 µL Kollagenase Enzym Lager (siehe Tabelle der Materialien).
- Schließen Sie das Rohr dicht und wickeln Sie die Kappe mit Parafilm auslaufen zu verhindern. Um die Hackfleisch / Tumor-Fragmente in der Zellsuspension distanzieren, schütteln Sie es sanft für 2 h bei 37 ° C. Beachten Sie, dass es noch viele Fragmente von unverdauten Gewebe noch in die Röhre.
- Zentrifugieren Sie das Rohr auf 300 X g für 5 min bei 4 ° C und entfernen Sie den überstand zu. Lösen der Zelle Pellet mit 10 mL 10 % FCS-DMEM, die Zellsuspension zu machen.
- Unverdaute Gewebe Trümmer zu beseitigen, Filtern Sie die Zellsuspension zweimal mit den 40 µm Zelle Sieb auf eine 50 mL konische Rohr gesetzt. Dann, Zentrifuge der Durchfluss bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. Den überstand und das Pellet auf Eis.
4. Generation von der CRC Organellen kultiviert auf künstliche extrazelluläre Matrix
Experimentelle Verfahren für die CRC organoide Kultur des Colon PDXs (Schritt 4) sind in Abbildung 1 bbeschrieben.
- Schaffen einen Nährboden für die CRC PDX-abgeleitete Organellen (siehe Tabelle der Materialien, "das CRC organoide Kulturmedium") Einsatz von Medien, die zuvor für menschlichen Dickdarm Organellen11beschrieben.
- 150 µL künstliche extrazelluläre Matrix anwenden (siehe Tabelle der Materialien) pro nun über eine 12-Well-Platte auf dem Eis und inkubieren Sie es für 30-60 min in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator der Gele zu festigen.
- Aussetzen der Zelle Pellet aus Schritt 3.5 mit dem CRC organoide Kulturmedium (aus Schritt 4.1) mit 5 % FCS, Anpassung an 3 x 105 Zellen/mL zu erreichen. Dann Samen Sie 1 mL des Mediums auf die künstliche extrazelluläre Matrix-beschichtete Platte in Schritt 4.2 vorbereitet. und Inkubation über Nacht bei 37 ° C weniger als 5 % CO2. Verwenden Sie eine Hemocytometer zum zählen der Anzahl der Tumorzellen einschließlich Einzelzellen und mehrzelligen Cluster (eine Gruppe von adhärenten Zellen) in der Zellsuspension.
Hinweis: 5 % FCS wird verwendet, um die enzymatische Restaktivität der Kollagenbildung in dieser Studie zu stillen. - Sorgfältig sammeln das Kulturmedium, einschließlich Einzelfelder, das von der künstliche extrazelluläre Matrix-beschichtete Platte in ein 1,5 mL getrennt haben Zentrifugieren Rohr am Folgetag und 1.400 x g für 5 min zentrifugieren. Dann entfernen Sie den überstand und wieder auszusetzen Sie das Pellet in 70 µL künstliche extrazelluläre Matrix auf Eis.
- Steigerung der CRC Zellviabilität überlagern Sie die Tumor Zelle-haltigen künstliche extrazelluläre Matrix auf den Tumor organoide Zellen an die künstliche extrazelluläre Matrix-beschichtete Platte befestigt und inkubieren Sie für 30 min. in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator zu festigen die künstliche extrazelluläre Matrix-Beschichtung. Dann Brüten sie mit 1 mL der CRC organoide Zellkulturmedium mit 1 % FCS bei 37 ° C unter 5 % CO2.
- Ändern Sie das Kulturmedium jeden zweiten Tag. Wie die CRC Organellen das Medium füllen, kann es erforderlich, das Medium täglich ändern werden.
5. Generation und Bereicherung der GFP Lentivirale Partikel
Experimentelle Verfahren zur Generierung und Bereicherung der GFP Lentivirale Partikel (Schritt 5) sind in Abbildung 1aufgeführt.
- Kultur HEK293T Zellen mit Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10 % FCS und Transfektion folgt sechs Gerichte in 10 cm (2 x 106 Zellen pro Schale) vorbereiten.
- Vorbereitung Transfection pro Schale 500 µL des Gemischs einschließlich 20 µL des Transfection Reagens in DMEM mit PRRL-GFP Vektor (5 µg)12 und zwei Lentivirale Verpackung Plasmide, wie pCMV-VSV-G (1 µg) und pCMV-dR8.2 Dvpr (5 µg), in einer sterilen 1,5 mL reaktionscup. Halten Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20 min und dann auf jedes der 10-cm-Gerichte zu überlagern Sie und inkubieren sie bis 18 Uhr.
- Entfernen Sie das Medium, jedes Gericht 5 mL frisches 10 % FCS-RPMI 1640 Medium hinzu, und lassen Sie stehen für 24 h.
- Sammeln Sie die konditionierte Medium jedes Gericht in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen und speichern Sie insgesamt 30 mL des Mediums bei 4 ° C über Nacht. Fügen Sie 5 mL frisches RPMI-1640 auf jedes Gericht und lassen Sie stehen für 24 h.
- Sammeln Sie die konditionierte Medium jedes Gericht in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen und halten Sie in insgesamt 30 mL des Mediums auf Eis. Verwerfen Sie die Zellen.
- Filtern Sie 60 mL des Mediums (aus Schritt 5.4 – 5,5) durch einen 0,45 µm-Filter, um die Zellen zu entfernen und teilen Sie diese Menge in zwölf 5 mL Polypropylen Zentrifuge Rohre für Ultrazentrifugation.
- Virus zu konzentrieren, sie mit einem schwingenden Eimer Rotor Zentrifugieren (siehe Tabelle der Materialien) 85.327 x g für 1,5 h bei 4 ° C.
- Das Medium sofort zu entfernen. Aufzulösenden konzentrierter Virus Pellet Platz 250 µL Nährstoff Schinken Mischung f-12 (F12) / DMEM Medium ohne FCS in jedem der zwölf Röhren und über Nacht bei 4 ° C zu erhalten. Beachten Sie, dass das Virus Pellet oft unsichtbar ist.
- Pipette vorsichtig das Medium, um 3 mL der 5 X GFP Lentivirus kraftbouillon, insgesamt, vermutlich einschließlich der GFP Lentivirale Partikel mit 108 3D-Steuerung Einheiten pro mL (TU/mL) zu sammeln. Speichern Sie dann die zwölf 1,5 mL mikroröhrchen (einschließlich 250 µL pro Röhre) unter sterilen Bedingungen bei-80 ° C bis zu einem Jahr. Bereiten Sie viele kleine Aliquote der ursprünglichen Lösung für mehrere Einfrieren–Auftau-Zyklen zu vermeiden.
6. Kennzeichnung der CRC organoide Zellen mit GFP Lentivirale Partikel kultivierten auf künstliche extrazelluläre Matrix
Experimentelle Verfahren zur Kennzeichnung der CRC organoide Zellen mit GFP Lentivirus (Schritt 6) sind in Abbildung 1dargestellt.
- Lassen Sie die CRC Organellen in Schritt 4.6 ohne Störungen für 7 – 10 Tage wachsen und ernten sie mechanisch mit einem sterilen Zelle Schaber und dann übertragen Sie sie in eine 1,5 mL reaktionscup vorbereitet.
Hinweis: Das Wachstum der CRC Organellen in der Kultur richtet sich nach der Art der ursprünglichen Tumoren von Patienten. Vermeiden Sie Überwucherung der CRC-Organellen, durch die Aufrechterhaltung am Zusammenfluss von 60 – 70 % vor der im Verhältnis 1:2 Split auf eine neue künstliche extrazelluläre Matrix-beschichtete 12-Well-Platte übertragen. - Zentrifugieren Sie die reaktionscup für 3 min bei 1.400 X g, entfernen Sie das Kulturmedium und lösen Sie die Zelle Pellet in 500 µL PBS durch sanftes antippen.
- Die reaktionscup für 3 min bei 1.400 X g Zentrifugieren und PBS zu beseitigen.
- Um die anhaftenden CRC Organellen zu distanzieren, fügen Sie 500 µL einer Zelle Ablösung Lösung von proteolytischen und Collagenolytic Enzyme in die Zelle pellet in das Rohr und mischen Sie es durch sanftes antippen. Verlassen Sie die Rohre für 10 min bei Raumtemperatur zu begleichen.
- Sehr sanft pipette die Zellsuspension mit einer zusätzliche 500 µL 1 % FCS-DMEM mehrmals in einem 1,5 mL reaktionscup, etwa die Zellen zu trennen. Generation von Einzelzellen von CRC Organellen durch harte pipettieren reduziert deutlich Zellviabilität. So ist es wichtig, die Masse von Zellen in der Zellsuspension visuell erkennbaren verlassen, indem sehr sanft in eine 1,5 mL reaktionscup pipettieren.
- Die Zellsuspension für 3 min bei 1.400 X g Zentrifugieren und den überstand zu entfernen.
- Lösen der Zelle Pellet mit einer Mischung aus den 100 µL 5 X GFP Lentivirus Lager (> 108 TU/mL) und 400 µL der CRC organoide Nährmedium in einem 1,5 mL reaktionscup durch sanftes antippen Anpassung zu einer Konzentration von 5 x 105 dissoziiert Tumorzellen pro 500 µL . Verwenden Sie eine Hemocytometer zum zählen der Anzahl der Tumorzellen, einschließlich einzelner Zellen und Zellgruppen in der Zellsuspension wie beschrieben (Schritt 4.3).
- Bereiten Sie eine künstliche extrazelluläre Matrix-beschichtete 12-Well-Platte, wie unter Punkt 4.2 beschrieben. Dann 500 µL Zellsuspension in Schritt 6,7 auf dem Teller zubereitet und lassen es 18 h bei 37 ° C unter 5 % CO2.
- Sammeln Sie das Medium mit den schwimmenden Zellen, die losgelöst von der künstliche extrazelluläre Matrix-beschichtete Platte in ein 1,5 mL Zentrifugation Rohr. Entfernen Sie bei 1.400 X g Zentrifugieren den überstand zu und wieder auszusetzen Sie das Pellet in 70 µL künstliche extrazelluläre Matrix auf Eis.
- Um die Zellviabilität CRC erhöhen, überlagern Sie die Tumor Zelle-haltigen künstliche extrazelluläre Matrix auf den Tumor Organellen befestigt, die künstliche extrazelluläre Matrix-beschichtete 12-Well-Platte, wie unter Punkt 4.5 beschrieben. Als nächstes inkubieren Sie die Platte für 30 min in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator zu festigen die künstliche extrazelluläre Matrix-Beschichtung und dann Kultur es mit 1 mL des CRC organoide Kulturmediums mit 1 % FCS bei 37 ° C unter 5 % CO2.
- Beobachten Sie die Zellen, 3 Tage nach der Infektion unter dem Fluoreszenzmikroskop um fast 100 % GFP Positivität durch den Einsatz von einen hohen Titer Lentivirale Partikel zu bestätigen (siehe Abb. 2A).
- Kultur der CRC Organellen für Zeiträume von 7 – 10 Tage, Zellwachstum vor der Injektion in Empfänger Mäuse zu erweitern.
7. Generation von Metastasen von GFP-Label CRC Organellen im Empfänger Mäuse
Experimentelle Verfahren zur Erzeugung von Metastasen mit der GFP-gekennzeichnete CRC Organellen (Schritt 7) sind in Abbildung 1dargestellt.
- Um die GLP-Label CRC Organellen in der Zellsuspension distanzieren, Ernten sie mechanisch mit einem sterilen Zelle Schaber und in einem 1,5 mL reaktionscup überführen Sie, wie beschrieben (Schritt 6.1).
- Zentrifugieren Sie die reaktionscup für 3 min bei 1.400 X g, entfernen Sie das Kulturmedium und lösen Sie die Zelle Pellet in 500 µL PBS durch sanftes antippen.
- Die reaktionscup für 3 min bei 1.400 X g Zentrifugieren und PBS zu beseitigen.
- Überlagern Sie 500 µL der Zelle Ablösung Lösung auf die Zelle Pellet in das Rohr zu und mischen Sie es durch sanftes antippen. Dann lassen Sie die Mischung steht für 10 min bei Raumtemperatur enzymatisch die anhaftenden CRC Organellen, distanzieren wie beschrieben (Schritt 6.4).
- Sehr sanft pipette die Zellsuspension mit einer zusätzliche 500 µL 1 % FCS-DMEM mehrmals in einem 1,5 mL reaktionscup etwa die Zellen zu trennen, wie beschrieben (Schritt 6.5). Generation von Einzelzellen von CRC Organellen durch harte pipettieren reduziert deutlich Zellviabilität. So lassen Sie die Masse von Zellen durch sehr sanft in eine 1,5 mL reaktionscup pipettieren visuell erkennbaren in der Zellsuspension.
- Die Zellsuspension für 3 min bei 1.400 x g zentrifugieren und den überstand zu entfernen.
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Um eine spontane Metastasen-Maus-Modell der CRC PDXs herzustellen:
- Bereiten Sie eine Zellsuspension einschließlich 5 x 105 Zellen in 50 µL PBS mit 50 % künstliche extrazelluläre Matrix per Mausklick. Pflegen Sie die Suspension auf dem Eis vor Gebrauch. Verwenden Sie eine Hemocytometer für die Krebszellen zu zählen, wie in Schritt 4.3 angegeben.
- Betäuben Sie eine Maus mit Isofluran Inhalation mit dem kleinen Tier Inhalationsgerät Anästhesie zu und Desinfizieren Sie die Haut mit 70 % Ethanol, wie in Schritt 1.6 angegeben.
- Platzieren Sie die NOG Maus in Rückenlage auf dem Labortisch. Greifen Sie die rektale Schleimhaut mit einer sterilen Pinzette und ziehen Sie es vorsichtig aus dem Anus. Dann sofort die Zellsuspension vorbereitet in 7.7.1 betreten die rektale Submukosa der Maus mit einer Spritze injizieren (Nadelstärke: 22 G). Routinemäßig werden 4 – 6 Mäuse pro Gruppe die Ergebnisse zu bewerten.
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Um eine experimentelle Metastasierung Modell der CRC PDXs herzustellen:
- Bereiten Sie eine CRC organoide Zellsuspension einschließlich 4 x 104 Zellen in 50 µL PBS per Mausklick. Pflegen Sie die Suspension auf dem Eis vor Gebrauch. Verwenden Sie eine Hemocytometer für die Zählung der Krebszellen (Schritt 4.3).
- Betäuben Sie eine Maus mit Isofluran Inhalation mit dem kleinen Tier Inhalationsgerät Anästhesie zu und Desinfizieren Sie die Haut mit 70 % Ethanol, wie in Schritt 1.6 angegeben.
- Platzieren Sie den narkotisierten NOG Mauszeiger in Bauchlage auf dem Labortisch. Machen Sie einen kleinen Schnitt am unteren Teil der linken Flanke und schneiden Sie das Bauchfell um die Milz mit steriler Schere und Pinzette sorgfältig verfügbar zu machen. Fassen Sie das Fettgewebe an der Milz mit einer sterilen Pinzette befestigt, dann injizieren Sie langsam 50 µL Zellsuspension (zubereitet wie oben Schritt 8.1) in der Milz. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension entsprechend ohne äußere Leckage aus der Milz injiziert wird. Routinemäßig werden 4 Mäuse pro Gruppe die Ergebnisse zu bewerten.
- Alle Mäuse auf einem warmen Pad nach der Operation und pflegen in einem sternale Liegeradposition, bis genügend Bewusstsein wiederhergestellt ist, wie in Schritt 1.11. Sobald die Mäuse vollständig erholt haben, kehren sie an ihren Hause Käfigen. Um zu verhindern, dass Prädation, lassen Sie Zucht mit Tieren nicht betrieben, in den gleichen Käfig nicht zu.
- Naht Dichtheit prüfen Sie und bestätigen Sie, dass die Mäuse leben, in der chirurgisch behandelten Gruppe am nächsten Tag. Überprüfen Sie die Mäuse auf Anzeichen von Krankheit und Maßnahme Tumor Grösse mit Bremssättel in alle Mäuse einmal pro Woche.
- Beobachten Sie Mäuse, spontane Metastasierung (über einen Zeitraum von bis zu 2,5 Monaten) und experimentelle Metastasierung (1 Monat) zu erkennen, nach der Injektion.
- Die Mäuse über Anästhesie und zervikale Dislokation an den angegebenen Tagen zu opfern. Sezieren Sie Primärtumoren und verschiedenen Geweben einschließlich Leber und Lunge. Legen Sie die seziert Tumoren und Organe in 5 mL eiskaltem PBS auf einer 10 cm Petrischale und speichern Sie diese auf Eis.
- Um GFP-positiven CRC organoide Zellen erkennen, beobachten Sie die seziert Gewebe unter dem Stereo-Fluoreszenz-Mikroskop. Abrufen von Bildern mit einer CCD-Kamera und bereiten mit standard Bildbearbeitungs-Software.
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Representative Results
Eine primäre kolorektalen Adenokarzinom diagnostiziert als mäßig differenziert hatte von einer 76 Jahre alten Frau mit TNM-Klassifikation, Stadium IIIa, gefolgt von postoperativen Chemotherapie chirurgisch reseziert worden. Die primäre CRC Zellen-Proteins gebeizt für carcinoembryonales Antigen, Ki-67, Pan-Cytokeratin und E-Cadherin positiv. Stücke des resezierten Tumors waren NOG Mäuse um den Doppelpunkt PDX Modell erzeugen auch subkutan implantiert. CRC organoide Zellen wurden dann für Gewebekultur von Doppelpunkt PDX extrahiert, die subkutan in diesen Mäusen entwickelt hatte. Die CRC Organellen waren in der Lage ist, konsequent mehrzelligen Cluster bilden, während eine Reihe von Passagen auf künstliche extrazelluläre Matrix. Als Tumor Organellen histologisch und genetisch die Natur des Primärtumoren von Patienten5,6Rechnung zu tragen, haben wir versucht, ein Maus-Modell zu entwickeln, die in Vivo Nachweis CRC organoide Zellen mit hoher Empfindlichkeit erlauben würde bei metastasierendem Verbreitung. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden die CRC Organellen mit GFP Lentivirus, wodurch in fast allen Organellen zeigt sehr hell GFP (Abbildung 2A) infiziert. Diese Organellen wurden dann Orthotopically injiziert und intrasplenically in sekundären NOG Mäuse vor der Entdeckung von GFP-positiven Zellen in entfernte Organe unter dem Fluoreszenzmikroskop. Wir beobachteten Bildung von GFP-positiven Primärtumoren am Standort orthotopen alle vier Mäuse untersucht (Abbildung 2 b, Links). Darüber hinaus fanden sich mikroskopisch kleine Metastasen in der Lunge von drei von vier Mäusen untersucht 2,5 Monate nach orthotopen Injektionen (Abb. 2 b, Mitte). Darüber hinaus wurden Lebermetastasen als Reaktion auf intrasplenic Injektion alle vier Mäuse untersucht 1 Monat nach den Injektionen (Abb. 2 b, rechts) beobachtet.
Zusammen genommen, diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass hochauflösende GFP Fluoreszenz auf PDX-abgeleitete CRC organoide Zellen ihre Erfassung sowohl spontane Fixierungsprotokoll als auch experimentell in entfernten Organen entwickelt, wenn Empfänger eingeführt ermöglicht Mäusen. Dieser hochempfindlichen Nachweis von der Verbreitung von PDX-abgeleitete CRC Organellen in Vivo bietet auch ein vielseitiges Modell nicht nur für das Studium der Biologie der Tumor Metastasen, sondern auch für die Entwicklung von zielgerichteten Therapien in der präklinischen Einstellung.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Generation von Metastasen durch die CRC PDX-abgeleitete Organellen beschriftet mit GFP Lentivirus NOG Mäuse. (A) Implantation von kleinen Stücken des CRC Gewebes subkutan in NOG Mäuse (Schritt 1). Das CRC-Gewebe chirurgisch vom Patienten seziert wurde in Stücke geschnitten und in NOG Mäusen subkutan implantiert. s.c.: subkutane Implantation. (B) Generation von CRC Organellen von PDXs (Schritt 2 – 4) getrennt. Die entwickelten CRC Xenotransplantate wurden Hackfleisch (Schritt 2) und in eine 15 mL Röhrchen mit dem Kulturmedium darunter Kollagenase (Schritt 3) überführt. Nach der Inkubation mit langsamen Agitation war die CRC-Zellsuspension gefilterten (Schritt 3). Dann wurde die Zellsuspension organoide CRC organoide Mittel-auf eine künstliche extrazelluläre Matrix-beschichtete Platte ausgesät und über Nacht in eine CO2 Inkubator (Schritt 4) inkubiert. Die CRC organoide Zellen an die künstliche extrazelluläre Matrix angebracht wurden auch mit zusätzliche künstliche extrazelluläre Matrix beschichtet und in eine CO2 Inkubator (Schritt 4) inkubiert. s.c.: subkutane Implantation. (C) Generation von CRC Organellen ausgestrahlt von GFP Lentivirale Partikel vor der Injektion Empfänger Mäuse (Schritt 5 – 7) beschäftigt. Die GFP Lentivirale Partikel wurden auf einen hohen Titer (Schritt 5) erzeugt. Die CRC PDX-abgeleitete Organellen auf künstliche extrazelluläre Matrix angebaut wurden direkt mit einem Schaber Zelle geerntet und in eine reaktionscup (Schritt 6) überführt. Nach Zentrifugation war die Zelle Pellet mit PBS-Puffer wieder ausgesetzt. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert und die Zelle Pellet wurde getrennt. Anschließend wurde die Zellsuspension CRC organoide mit GFP Virus bestand in der CRC organoide Kulturmedium auf die künstliche extrazelluläre Matrix-beschichtete Platte über Nacht in eine CO2 -Inkubator (Schritt 6) inkubiert. Die CRC organoide Zellen an die künstliche extrazelluläre Matrix angeschlossen wurden mit zusätzliche künstliche extrazelluläre Matrix beschichtet und in eine CO2 Inkubator, festigen die künstliche extrazelluläre Matrix-Beschichtung (Schritt 6) inkubiert. Die CRC Organellen wurden dann über einen Zeitraum von 7 – 10 Tagen Zellwachstum (Schritt 6) erweitern gezüchtet. Um eine spontane Metastasen-Modell zu entwickeln, wurden die dissoziierten 5 x 105 CRC organoide Zellen gekennzeichnet mit GFP ausgesetzt in 50 µL PBS mit 50 % künstliche extrazelluläre Matrix NOG Mäuse (Schritt 7) Orthotopically injiziert. Um eine experimentelle Metastasen-Modell zu erzeugen, wurden 4 x 104 CRC organoide Zellen gekennzeichnet mit GFP in 50 µL PBS intrasplenically NOG Mäuse (Schritt 7) injiziert. o.t.: orthotopen Injektion i.s.: intrasplenic Injektion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: High-Resolution der GFP Visualisierung erkannt kultivierten GFP-Label CRC Organellen, Primärtumoren und Fixierungsprotokoll. (A) fast 100 % der kultivierten CRC Organellen sind GFP positive. Die Bilder wurden aufgenommen mit einem Stereo-Fluoreszenz-Mikroskop. Maßstabsleiste = 250 µm. (B) GLP-Positivität in den Primärtumor und Fixierungsprotokoll in Lunge und Leber. Die dissoziierte GFP exprimierenden CRC organoide Zellsuspension wurde in die rektale Submukosa (o.t. Inj) NOG Mäuse injiziert. Die Mehrheit der Tumorzellen erweisen sich als positiv für GLP in der Primärtumor. GFP-positiven Fixierungsprotokoll besiedeln die Lunge (durch einen Pfeil gekennzeichnet) sind ebenfalls dargestellt. Darüber hinaus werden GFP-positiven Fixierungsprotokoll erkannt, in der Leber (durch einen Pfeil gekennzeichnet), wenn die Zellsuspension wurde intrasplenically (i.s. Inj) in Mäuse injiziert. Maßstabsleiste = 500 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Obwohl das CRC PDX-Modell weithin eingesetzt worden, hat um primäre Tumorwachstum zu studieren, ob dieses Modell auch für Tumor Metastasen zu untersuchen gilt hat nicht noch nicht vollständig aufgeklärt. Spontane Metastasen waren auch kaum nachweisbar in Leber und Lunge von verschiedenen gemeldeten Doppelpunkt PDX Modelle4,10. Um Fixierungsprotokoll mit hoher Empfindlichkeit zu erkennen, haben wir ein Protokoll für transducing GFP Lentivirale Partikel in CRC PDX-abgeleitete Organellen vor der orthotopen und intravenöse Injektionen in Empfänger Mäuse entwickelt. Der Hinweis konnten wir zeigen, dass mit dieser Methode hochempfindliche Detektion von CRC organoide abgeleitet Fixierungsprotokoll können, bilden beide spontan und experimentell, in entfernten Organen.
Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls gehören Aufrechterhaltung intakt Sphäroid Bildung ohne Induktion von Anoikis auf die künstliche extrazelluläre Matrix durch sanft pipettieren der CRC Organellen während der passaging Serie. Die Vorbereitung der hohe Titer Lentivirus Partikel durch Ultrazentrifugation konzentriert ist auch wichtig für die Erreichung der fast 100 % GFP Positivität der CRC Organellen. Darüber hinaus empfiehlt es sich, dass die GFP-Label CRC Organellen innerhalb von 10 – 14 Tagen in Empfänger Mäuse injiziert werden. Übermäßig lange Zeiträume für die Expansion der CRC Organellen nach der Infektion können Auswahl an schwach GFP exprimierenden Organellen begünstigen.
Die Injektion von CRC Organellen in der rektalen Submukosa NOG Mäuse zeigten ihre metastasierendem Verbreitung in die Lunge, wenn nicht in der Leber, vermutlich durch die minderwertige Vena Cava. Um Lebermetastasen spontan zu erzeugen, wäre die Injektion von CRC Organellen in den Darm mit Laparotomie benötigt13.
Beachten Sie, dass die Inzidenz von B-Zell-Lymphomen in NOG immungeschwächte Mäuse implantiert mit Gewebe einschließlich der Lymphozyten, infiziert mit Epstein-Barr onkoviren, von menschlichen Patienten14gelegentlich erhöht wird. Daher ist es vernünftig zu empfehlen, ob die entstehenden Tumoren von implantierten menschlichen CRC stammen durch Durchführung von Immunohistochemistry mit menschlichen CRC Zelle Marker wie Carcinoembryonales Antigen und Cytokeratin 20 bestimmt werden.
Da wir CRC Organellen abgeleitet von nur einem Patienten untersucht, müssten weitere Proben von größeren Anzahl von Patienten untersucht werden, um unsere Ergebnisse in der Zukunft zu verallgemeinern. Wenn die implantierten CRC PDX-abgeleitete Organellen zeigen geringes Wachstum am Standort orthotopen und selten Metastasen bilden an entfernten Standorten Ermittler sollen prüfen, Gewinnung von CRC Organellen aus verschiedenen Patienten abgeleitet PDXs.
Die hochempfindliche Erkennung von GFP-mit der Bezeichnung Micrometastasis, die mit dieser Methode erreicht ermutigt uns nicht nur um mehrere ungelöste biologische Fragestellungen betreffend Übergang von Micrometastasis zu Macrometastasis, Bildung von den Stromazellen weiter zu untersuchen Nische für metastatische Besiedlung und Erwerb von Resistenzen, sondern auch um die Wirksamkeiten der neuartigen Anti-Krebs-Medikamente zu bewerten, durch den Einsatz von PDX-tragenden Tieren als präklinischen Modellen.
Die GFP-basierte FACS-Sortierung der lebenden CRC Organellen extrahiert aus primären und entfernten Standorten auch hat das Potenzial, einzelne zellbasierten Untersuchungen gen Ausdrücken, als auch die epigenetische und Metabolomic Profile eines Tumors ermöglichen. Solche Erkenntnisse können gut zur Aufklärung der molekularen Mechanismen metastasierendem Verbreitung von CRC Organellen führen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine potenzielle Interessenkonflikte offenlegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von der Juntendo University Young Investigator Award (2013, 2014 und 2015) Y.O., das gemeinsame Projekt Award (2013 und 2014), K. M., und gewährt in Beihilfen für die wissenschaftliche Forschung vom Bundesministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technology, Japan (16K 15625, Y. K. und 16K 15598, M.G.). Wir sind besonders dankbar für alle Mitglieder der Abt. für Coloproctological Chirurgie und Molekularpathologie für nützliche Diskussionen und technischen Support. Wir danken auch Dr. Hiroyuki Konno (Hamamatsu University Schoolof Medicine) und Dr. Hideki Kitajima (Internationale Hochschule für Gesundheit und Soziales) für großzügige fachliche Anleitung in den chirurgischen Verfahren zur orthotopen Implantation in Mäusen und Dr. Yoshitaka Hippo (Chiba Cancer Center) für technische Beratung bezüglich die Tumor organoide Kultur durchführen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
References
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