Summary
For at svært følsom påvisning av formidle menneskelige kolorektal kreft (CRC) celler kolonisere vev, viser vi her en protokoll for effektiv signaltransduksjon grønne fluorescerende protein (GFP) lentiviral partikler i PDX-avledet CRC organoid celler før deres injeksjon i mottakerens mus, med stereo-fluorescens mikroskopiske observasjon.
Abstract
Til tross for gjeldende fremskritt i menneskelig tykktarmskreft (CRC) behandling er noen radikale behandlingsformer effektive for de senere fasene av CRC. Å overvinne denne kliniske utfordringen, svulst xenograft musen modeller av veletablert menneskelige karsinom linjer og mange transgene musen modeller med svulster er utviklet prekliniske modeller. De etterligner delvis funksjonene i menneskelig kreftsvulster, men ofte ikke recapitulate nøkkelen aspektene ved menneskelig malignitet inkludert invasjon og metastasering. Dermed har alternative modeller som bedre representerer ondartet progresjon i menneskelig CRC lenge vært ventet.
Her viser vi generasjon av pasient-avledede svulst xenografts (PDXs) av subkutan implantasjon av små CRC kirurgisk dissekert fra en pasient. Kolon PDXs utvikle og histopathologically ligner CRC hos pasienten. Men er noen spontan micrometastases i konvensjonelle tverrsnitt av berørte fjerne organer i PDX modellen. For å lette oppdagelsen av metastatisk spredning i fjerne organer, vi hentet organoid kreftceller fra kolon PDXs i kultur og infisert dem med GFP lentivirus før injeksjon i svært immunodeficient hilsen/Shi-scid IL2Rγnull (NOG) mus. Orthotopically injisert PDX-avledet CRC organoid celler konsekvent skjemaet primære svulster positiv for GFP i mottakerens mus. Videre utvikler spontant micrometastatic kolonier uttrykke GFP oppdages særlig inne lungen av disse musene av fluorescens mikroskopi. Videre produserer intrasplenic injeksjon av CRC organoids ofte hepatic kolonisering. Sammen viser disse funnene GFP-merket PDX-avledet CRC organoid celler å være visuelt synlig under må kalles invasjonen-metastasering kaskade. Beskrevet protokollene inkluderer etablering av PDXs av menneskelig CRC og 3D kultur tilsvarende CRC organoid cellene transduced av GFP lentiviral partikler.
Introduction
Tykktarmskreft (CRC) er den andre ledende årsaken til kreft dødsfall verden1. Utilstrekkelige svaret konvensjonell terapi for pasienter med avansert stadium sykdom angir ineffectiveness av forsøk på å kurere radikalt CRC. For å utvikle mer effektive behandlingsmetoder, er ulike prekliniske musen modeller av kreft som etterligner egenskapene til CRC etablert. Ulike CRC linjer har vært mye brukt til å generere svulst xenografts på grunn av sin bekvemmelighet og brukervennlighet manipulasjon. Langsiktig kultur kreftcelle linjer, men fører ofte utvalg av unike celle populasjoner som er ganske proliferativ under en bestemt kultur tilstand, og dermed resulterer i upålitelige resultater og avgjørende begrensninger i preklinisk narkotika utvikling.
Uten å være kulturperler i vitro, har pasient-avledede svulst xenografts (PDXs) også blitt generert av implantasjon i dyremodeller av menneskelig CRC vev kirurgisk dissekert pasienter2,3,4. PDXs er anerkjent som recapitulating histopathological hovedfunksjonene og genetiske endringer opprinnelig stede i svulster av pasientene som de var avledet. Videre består pasient-avledede svulst organoids av svulst celle klynger ble etablert av kultur under 3D forhold som tett etterlignet biologiske egenskapene til den opprinnelige svulster5,6. Disse svulst organoids ble også brukt til høy gjennomstrømming narkotikarelaterte screening, og dermed slik at personlig terapi for å være utformet5. Imidlertid markert heterogene CRC bestander antas for å være til stede i en svulst masse. Bestemt CRC befolkninger kan selektivt spre og utvide under den i vivo og i vitro rekke passasjer PDX og tumor organoids, henholdsvis. Dette kan også tillate samlede genet uttrykket profiler og epi/genetisk statusen for den berørte CRC endre, og dermed resulterer i minimal likhet med foreldrekontroll CRC.
Pasient-avledede CRC organoids og de Hentet fra noncancerous menneskelige kolon konstruert til harbor kombinasjoner av kreftfremkallende mutasjoner har også vært ansatt å undersøke kjennemerkene til menneskelig kreftceller eksemplifisert ved svulst invasjon og metastasering 6,7,8,9. Men har svært lave forekomsten av spontane metastasering fremkommer fra orthotopic implantering av pasient-avledede CRC i immunodeficient mus, gjort det vanskelig å studere må prosessen med invasjonen-metastasering kaskade som inkluderer lokale invasjon, intravasation, transport i blodet, bloduttredelse og kolonisering av fjerne organer4,10. Micrometastasis som representeres av svulst celle deponering av ≤2 mm, dannet av pasient-avledede CRC organoids har ofte blitt oversett på histopathological analyse av inndelinger fra berørte fjerne organer i eksperimentell musen modeller. Visualisering av spontan micrometastases har også vært minimal i vivo på grunn av vanskelighetene med effektivt presenterer fluorescerende markører i organoid kreftceller før deres injeksjon i mottakerens mus. I denne studien vi utviklet en protokoll å effektivt transduce GFP lentivirus i PDX-avledet CRC organoid celler i 3D kultur før injeksjon i mottakerens mus og å tillate svært følsom oppdagelsen, ansette stereo-fluorescens mikroskopi, av deres koloniseringen av ulike organer til skjemaet micrometastases.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pasienten gitt skriftlig samtykke og prosjektet ble godkjent av forskning etikk av Juntendo-University fakultet. Musen eksperimentene ble også godkjent av dyr forskning Ethics Committee of Juntendo fakultet.
1. etablering av CRC PDXs i Immunodeficient mus
Eksperimentell prosedyrer for å etablere CRC PDXs (trinn 1) er beskrevet i figur 1A.
- Forberede den primære CRC vev umiddelbart etter kirurgisk fjerning av svulsten fra pasienten.
- Vask primære CRC vev av mild agitasjon flere ganger i 30 mL av iskalde sterilt fosfat bufret saltvann (PBS) i et 50 mL konisk rør og holde det på is.
- Plasser vev på en 10 cm Petriskål ved hjelp av sterile pinsett, fjerne nekrotisk områdene så mye som mulig med sterilt saks og klippe solid tumor vev til små biter (5 x 5 x 5 mm3 i størrelse) bruker sterilt barberblad.
Merk: Necrotic områder er ofte hvitere, mykere og mer basert enn de omkringliggende områdene. - Plassere små biter av svulst ved hjelp av sterile pinsett i 2 mL iskald sterilt PBS på en 6-vel plate.
- Rase 6 uke gamle NIKK/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) svært immunodeficient mus under bakterie-gratis og bestemt patogen-gratis forhold.
- Bedøve mus med isoflurane innånding bruker små dyr innånding anestesi enheten og rense huden med 70% etanol. Sikre det normal hastighet og dybden av åndedrett og fravær av en tå knipe refleks for riktig anesthetization. Veterinæren salve på øynene er et alternativ, for å hindre okulær tørrhet under anestesi.
- Sterilisere alle kirurgiske verktøy å bruke tørr sterilisering og deretter bruke disse verktøyene for alle prosedyrer for å hindre sårinfeksjoner i mottakerens mus.
- Plassere bedøvet musen i en utsatt posisjon på laboratoriebenken. Lag et lite innsnitt på nedre deler av høyre og venstre flankene på mottakeren å generere subkutan lommer for vev implantering med sterilt saks. Ta vare ikke for å punktere peritoneal membran. Det bør være blødning med denne fremgangsmåten.
- Forsiktig dukkert ovenfor forberedt svulst fragmenter til 50 µL av kunstige ekstracellulær matrix og deretter implantat dem i nedre deler av høyre og venstre subkutan lommer.
- Sutur av såret med såret klipp i mus gjennomgår kirurgiske prosedyrer. Kontroller at implantert tumor vev ligger et stykke fra innsnitt under huden.
Merk: I henhold til minimere kirurgiske prosedyrer, ingen behandlinger for post-kirurgiske smerte og infeksjon ble gitt i denne studien. - Plasser musen på en varm pute og opprettholde sternal tilbakelent posisjon til tilstrekkelig bevissthet er gjenopprettet. Når fullstendig gjenopprettet og kunne sitte på alle fire, kan mus returneres til burene sine hjem. For å hindre predasjon, Tillat ikke avl med ikke-opererte dyr i samme buret.
- Se etter suture lekkasje og bekrefte at mus er i stabil tilstand dagen i gruppen kirurgisk behandlet. Sjekk mus for underskriver av lidelsen og måle tumor størrelse i hver mus, ukentlig, ansette calipers.
2. Disseksjon av CRC PDXs fra mus
Eksperimentell prosedyrer for Disseksjon av CRC PDXs (trinn 2) er beskrevet i figur 1B.
- At svulsten å vokse subcutaneously ~ 1 cm3 i størrelse, som vanligvis tar ca 1-3 måneder.
- Bedøve musen med isoflurane innånding bruker små dyr innånding anestesi enheten og rense huden med 70% etanol.
- Plass musen i en utsatt posisjon på laboratoriebenken. Incise huden, utsette svulsten og forsiktig ta huden fra svulsten med sterilt saks. Etter fjerning av svulsten, plassere den på en 10 cm Petriskål fjerne ingen grovt nekrotisk områder fra svulsten, og skyll to ganger med 5 mL PBS.
Merk: Necrotic områder er ofte hvitere, mykere og mer basert enn de omkringliggende områdene. -
Plasser svulst på is og dele det like i minst 4 deler for forskjellige programmer inkludert 1) CRC organoid kultur, 2) transplantasjon i sekundære mus, 3) histologiske eksamen og 4) frysing og lagring av svulst fragmenter.
- For generasjon av CRC-organoids, plasserer du solid tumor vev på en 6 cm Petriskål som inneholder 1 mL steril PBS. Holde vev på is til behandling (trinn 3).
- For å etablere PDX modell for menneskelig CRC, passasje av fersk CRC-PDXs i en sekundær mus. Kuttet tumor vev i små biter (5 x 5 x 5 mm3 i størrelse) bruker sterilt barberblad og forsiktig dyppe disse vev fragmenter i 50 µL av kunstige ekstracellulær matrix. Deretter implantatet disse fragmentene i nedre deler av høyre og venstre subkutan lommene NOG museklikk, som beskrevet i trinn 1.8-1.11.
- For histologiske analyse, fikse prøvene i 5 mL av 10% nøytral bufrede formalin i et 15 mL konisk rør ved romtemperatur for 2 dager.
- For kryonisk bevaring, kuttet tumor vev i små biter (5 x 5 x 5 mm3 i størrelse) og forsiktig dyppe prøvene i 500 µL av cellen frysing løsning i 1-1,5 mL cryovial rør. Deretter overføre røret til-80 ° C fryser.
3. utvinning av PDXs i celle suspensjon for CRC Organoid kultur
Eksperimentell prosedyrer for av CRC PDXs (trinn 3) er beskrevet i figur 1B.
- Sted ovenfor (trinn 2.4.1) forberedt svulsten fragmenter på en 10 cm Petriskål.
- Hakke fragmenter bruker sterilt barberblad og overføre dem til en 15 mL konisk rør som inneholder 8 mL av 10% fosterets kalv serum (FCS)-Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM) med 80 µL av collagenase enzym lager (se Tabell for materiale).
- Lukk røret tett og vikle lue med parafilm å hindre lekkasje. For å distansere hakket svulst fragmenter i cellen suspensjon, rist det forsiktig i 2t på 37 ° C. Merk at det fortsatt vil være mange fragmenter av ufordøyd vev i røret.
- Sentrifuge røret på 300 x g i 5 min på 4 ° C og fjerne nedbryting. Løse cellen pellet bruker 10 mL av 10% FCS-DMEM å gjøre cellen suspensjon.
- For å eliminere ufordøyd vev rusk, filtrere celle suspensjon to ganger bruker 40 µm celle silen på en 50 mL konisk rør. Deretter sentrifuge gjennomflytsenhet på 300 x g i 5 min på 4 ° C. Fjern nedbryting og holde pellet på is.
4. generasjon av CRC Organoids kultivert på kunstig ekstracellulær Matrix
Eksperimentell prosedyrer for CRC organoid kultur kolon PDXs (trinn 4) er beskrevet i figur 1B.
- Etablere en kultur medium egnet for PDX-avledet CRC organoids (se Tabell for materiale, "CRC organoid kultur medium") ansette medier tidligere beskrevet for menneskelig kolon organoids11.
- Bruke 150 µL av kunstige ekstracellulær matrix (se Tabell for materiale) per godt på en 12-vel plate på is og deretter ruge det for 30-60 minutter i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator å størkne geléer.
- Suspendere celle pellet fra trinn 3,5 med CRC organoid kultur medium (fra trinn 4.1) med 5% FCS å oppnå justering 3 x 105 celler/mL. Deretter frø 1 mL av mediet på kunstig ekstracellulær matrix-belagt platen i trinn 4.2. og ruge over natten på 37 ° C under 5% CO2. Bruke en hemocytometer for å telle antall kreftceller inkludert enkeltceller og flercellet klynger (en gruppe av tilhenger celler) i celle suspensjon.
Merk: 5% FCS brukes å slukke gjenværende enzymatiske aktiviteten til collagenase i denne studien. - Samle nøye kultur medium, inkludert flytende celler som har løsrevet fra den kunstige ekstracellulære matrix-belagt platen, i en 1,5 mL sentrifuge tube dagen og sentrifuge det 1400 x g i 5 min. Deretter fjerne nedbryting og å avbryte pellet 70 µL av kunstige ekstracellulær matrix på is.
- For å øke CRC celle levedyktighet, overlegg i svulst celle inneholder kunstige ekstracellulær matrix på svulst organoid celler knyttet til kunstig ekstracellulær matrix-belagt plate og ruge i 30 min på en 37 ° C, 5% CO2 inkubator å størkne kunstig ekstracellulær matrix belegget. Deretter ruge det med 1 mL av CRC organoid celle kultur medium med 1% FCS ved 37 ° C under 5% CO2.
- Endre kultur medium hver annen dag. Som CRC-organoids fyller medium, kan det bli nødvendig å endre medium daglig.
5. generasjon og berikelse av GFP Lentiviral partikler
Eksperimentell prosedyrer for generasjon og berikelse av GFP lentiviral partikler (trinn 5) er beskrevet i figur 1 c.
- Kultur HEK293T celler med Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 middels inneholder 10% FCS og forberede seks 10 cm retter (2 x 106 celler per fat) hva fremgangsmåten.
- For hva per fat, forberede 500 µL av blandingen inkludert 20 µL av transfection reagensen i DMEM med en PRRL-GFP vektor (5 µg)12 og to lentiviral emballasje plasmider, som pCMV-VSV-G (1 µg) og pCMV-dR8.2 dvpr (5 µg), i en bakteriefri 1.5 mL microtube. Holde blandingen ved romtemperatur for 20 min og legge den til hver av de 10 cm rettene og ruge dem 18 h.
- Fjerne mediet, legge 5 mL av fersk 10% FCS-RPMI 1640 medium til hver rett, og la stå for 24 timer.
- Samle betinget mediet fra hver rett inn i et 50 mL sentrifuge rør og lagre opp til 30 mL av middels på 4 ° C over natten. Legge til 5 mL av de ferske RPMI 1640 på hver rett og la stå for 24 timer.
- Samle betinget mediet fra hver rett i en 50 mL sentrifuge rør og holde, totalt, 30 mL av mediet på is. Deretter forkaste cellene.
- Filtrere 60 mL av medium (fra trinn 5.4-5.5) gjennom et 0,45 µm-filter for å fjerne celler og dele dette antallet i tolv 5 mL polypropylen sentrifuge rør for ultracentrifugation.
- Å konsentrere seg virus, sentrifuge dem ved hjelp av en svingende bøtte rotor (se Tabell for materiale) 85,327 x g for 1,5 t på 4 ° C.
- Umiddelbart fjerne mediet. Løse konsentrert virus pellets, plassere 250 µL av næringsstoffer Ham blanding F-12 (F12) / DMEM medium uten FCS i hver av de tolv rør og opprettholde den på 4 ° C over natten. Merk at viruset pellets er ofte usynlig.
- Pipetter forsiktig medium å samle 3 mL konsentrert 5 x GFP lentivirus aksjen, totalt, formodentlig inkludert GFP lentiviral partikler med 108 transducing enheter per mL (TU/mL). Oppbevar deretter de tolv 1,5 mL microtubes (inkludert 250 µL per tube) under sterile forhold ved-80 ° C i opptil ett år. Forberede mange små dele den originale løsningen å unngå flere fryse-tøvær sykluser.
6. merking av CRC Organoid celler med GFP Lentiviral partikler kultivert på kunstig ekstracellulær Matrix
Eksperimentell prosedyrer for merking CRC organoid cellene med GFP lentivirus (trinn 6) er beskrevet i figur 1 c.
- Tillate CRC organoids i trinn 4.6 vokse uten forstyrrelser for 7-10 dager og høste dem mekanisk sterilt celle skraper og deretter overføre dem til en 1,5 mL microtube.
Merk: Veksten av CRC organoids i kultur, avhenger av innholdet i den opprinnelige tumorer fra pasienter. Unngå overvekst av CRC-organoids ved å opprettholde dem på 60-70% samløpet før overføre i 1:2 delt forholdet på en ny kunstig ekstracellulær matrix-belagt 12-vel tallerken. - Sentrifuge microtube for 3 min 1400 x g, fjerne kultur medium og løse cellen pellet i 500 µL av PBS av milde tappe.
- Sentrifuge microtube for 3 min 1400 x g og eliminere PBS.
- Hvis du vil oppheve tilknytningen av tilhenger CRC-organoids, Legg 500 µL av en celle avdeling løsning av proteolytisk og collagenolytic enzymer til cellen pellets i røret og bland det med milde tappe. Så, la rør for å betale for 10 min ved romtemperatur.
- Svært forsiktig Pipetter celle suspensjon med en ekstra 500 µL av 1% FCS-DMEM flere ganger i en 1,5 mL microtube til omtrent distansere cellene. Generasjon av enkeltceller fra CRC-organoids av harde pipettering reduserer markert celle levedyktighet. Derfor er det viktig å forlate massen av celler visuelt synlig i cellen suspensjon av svært forsiktig pipettering i en 1,5 mL microtube.
- Sentrifuge celle suspensjon for 3 min 1400 x g og fjerne nedbryting.
- Løse cellen pellets med en blanding av 100 µL av 5 x GFP lentivirus lager (> 108 TU/mL) og 400 µL av CRC organoid kultur medium i en 1,5 mL microtube av milde tappe justere til en konsentrasjon av 5 x 105 dissosiert kreftceller per 500 µL . Bruke en hemocytometer for å telle antall kreftceller, inkludert enkeltceller og grupper av celler i cellen suspensjon, som beskrevet ovenfor (trinn 4.3).
- Forberede en kunstig ekstracellulær matrix-belagt 12-vel plate, som beskrevet i trinn 4.2. Deretter plasserer 500 µL av cellen suspensjon i trinn 6,7 på tallerkenen og la den 18 h på 37 ° C under 5% CO2.
- Samle mediet med flytende celler løsrevet fra kunstig ekstracellulær matrix-belagt platen i en 1,5 mL sentrifugering rør. Sentrifuge det 1400 x g og deretter fjerne nedbryting og å avbryte pellet 70 µL av kunstige ekstracellulær matrix på is.
- For å øke CRC celle levedyktighet, overlappe den svulst celle inneholder kunstige ekstracellulære matrisen på svulst organoids knyttet til kunstig ekstracellulær matrix-belagt 12-vel platen, som beskrevet i trinn 4.5. Deretter ruge platen i 30 minutter i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator å stivne kunstig ekstracellulær matrix belegget og deretter kultur det med 1 mL av CRC organoid kultur medium med 1% FCS ved 37 ° C under 5% CO2.
- Merke celler når 3 dager etter smitte under fluorescens mikroskop å bekrefte nesten 100% GFP positivitet skyldes bruk av en høy titer lentiviral partikler (se figur 2A).
- Kultur CRC-organoids i perioder av 7-10 dager å utvide cellevekst før injeksjon i mottakerens mus.
7. generasjon metastaser av GFP-merket CRC Organoids i mottakerens mus
Eksperimentell prosedyrer for generering av metastaser bruker GFP-merket CRC organoids (trinn 7) er beskrevet i figur 1 c.
- Hvis du vil oppheve tilknytningen GFP-merket CRC-organoids i celle suspensjon, høste dem mekanisk sterilt celle skraper og overføre dem til en 1,5 mL microtube, som beskrevet ovenfor (trinn 6.1).
- Sentrifuge microtube for 3 min 1400 x g, fjerne kultur medium og løse cellen pellet i 500 µL av PBS av milde tappe.
- Sentrifuge microtube for 3 min 1400 x g og eliminere PBS.
- Overlegg 500 µL av cellen avdeling løsningen på cellen pellet i røret og bland det med milde tappe. Så, la blandingen stå for 10 min ved romtemperatur å distansere enzymatisk tilhenger CRC organoids, som beskrevet ovenfor (trinn 6,4).
- Svært forsiktig Pipetter celle suspensjon med en ekstra 500 µL av 1% FCS-DMEM flere ganger i en 1,5 mL microtube til omtrent distansere cellene, som beskrevet ovenfor (trinn 6.5). Generasjon av enkeltceller fra CRC-organoids av harde pipettering reduserer markert celle levedyktighet. Dermed forlate massen av celler visuelt synlig i cellen suspensjon av svært forsiktig pipettering i en 1,5 mL microtube.
- Sentrifuge celle suspensjon for 3 min 1400 x g og fjerne nedbryting.
-
Å etablere en spontan metastasering musemodell CRC PDXs:
- Forberede en celle suspensjon inkludert 5 x 105 celler i 50 µL av PBS med 50% kunstig ekstracellulær matrix per musen. Opprettholde suspensjon på is før bruk. Bruke en hemocytometer for opptelling kreftceller, som angitt i trinn 4.3.
- Bedøve mus med isoflurane innånding bruker små dyr innånding anestesi enheten og rense huden med 70% etanol, som vist i trinn 1.6.
- Plass NOG musen i supine posisjon på laboratoriebenken. Forstå endetarms mucosa med sterilt pinsett og trekk det forsiktig ut av anus. Deretter umiddelbart injisere celle suspensjon i trinn 7.7.1 inn i endetarmen submucosa musen bruker en sprøyte (p: 22 G). Rutinemessig, brukes 4-6 mus per gruppe til å evaluere resultatene.
-
Å etablere en eksperimentell metastasering modell av CRC PDXs:
- Forberede en CRC organoid celle suspensjon inkludert 4 x 104 celler i 50 µL av PBS per musen. Opprettholde suspensjon på is før bruk. Bruke en hemocytometer for opptelling kreftcellene (trinn 4.3).
- Bedøve mus med isoflurane innånding bruker små dyr innånding anestesi enheten og rense huden med 70% etanol, som vist i trinn 1.6.
- Plassere bedøvet NOG musen i en utsatt posisjon på laboratoriebenken. Lag et lite innsnitt på den nedre delen av venstre flanke og skjær peritoneum å avsløre nøye milten sterilt saks og pinsett. Forstå fettvev knyttet til milten med sterilt pinsett, deretter langsomt injisere 50 µL av cellen suspensjon (forberedt som ovenfor trinn 8.1) i milten. Være sikker på at cellen suspensjon injiseres riktig uten ytre lekkasje, fra milten. Rutinemessig, brukes 4 mus per gruppe til å evaluere resultatene.
- Plassere alle mus på en varm pute etter operasjonen og vedlikehold i sternal tilbakelent posisjon til tilstrekkelig bevissthet er gjenopprettet, som beskrevet i trinn 1.11. Når mus er helt friske, returnere dem til deres hjem burene. For å hindre predasjon, Tillat ikke avl med ikke-opererte dyr i samme buret.
- Se etter suture lekkasje og bekrefte at mus er i live, i gruppen kirurgisk behandlet neste dag. Sjekk mus for tegn på sykdom og måle svulst størrelser, ansette calipers, i alle mus en gang i uken.
- Observere mus å oppdage spontan metastasering (i perioder opptil 2,5 måneder) og eksperimentelle metastasering (1 måned) etter injeksjon.
- Ofre musene via anestesi og cervical forvridning på de angitte dagene. Dissekere primære svulster og ulike vev som leveren og lungene. Plasser dissekert svulster og organer i 5 mL av iskalde PBS på en 10 cm Petriskål og lagre dem på isen.
- For å oppdage GFP-positive CRC organoid celler, observere dissekert vev under stereo-fluorescens mikroskop. Hente bilder med CCD kamera og forberede bruke bildebehandling programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En primær colorectal adenocarcinoma diagnostisert som moderat differensiert hadde vært kirurgisk resected fra en 76 år gammel kvinne med TNM-klassifisering, scenen IIIa, etterfulgt av postoperativ kjemoterapi. Den primære CRC celler immunohistochemically farget positivt for carcinoembryonic antigen, Ki-67, pan-cytokeratin og E-cadherin. Stykker av resected svulsten var også subcutaneously implantert i NOG mus å generere kolon PDX modellen. CRC organoid celler ble deretter pakket ut av vev kultur fra kolon PDX som hadde utviklet subcutaneously i disse musene. CRC-organoids var i stand til å konsekvent dannet multicellular klynger under en rekke passasjer på kunstig ekstracellulær matrix. Som tumor organoids histologisk og genetisk gjenspeiler innholdet i primære svulster pasienter5,6, forsøkte vi å utvikle en musemodell som ville tillate i vivo påvisning av CRC organoid celler med høy følsomhet under metastatisk formidling. For å oppnå dette målet, var CRC organoids infisert med GFP lentivirus, og dermed resulterer i nesten alle organoids viser svært lyse GFP (figur 2A). Disse organoids var så injisert orthotopically og intrasplenically til sekundære NOG mus før oppdagelsen av GFP-positive celler i fjerne organer under fluorescens mikroskop. Vi observerte dannelsen av GFP-positive primære svulst på webområdet orthotopic i alle fire mus undersøkt (figur 2B, venstre). Videre ble mikroskopiske metastaser funnet i lungene til tre av fire mus undersøkt på 2,5 måneder etter orthotopic injeksjoner (figur 2B, midten). Videre ble leveren metastaser observert i respons til intrasplenic injeksjon i alle fire mus undersøkt på 1 måned etter injeksjoner (figur 2B, høyre).
Sammen indikerer disse resultatene høy oppløsning GFP fluorescens på PDX-avledet CRC organoid celler at gjenkjenningen både spontan micrometastases og utviklet eksperimentelt, i fjerne organer, da introdusert i mottakeren mus. Denne høy følsomhet oppdagelsen for formidle PDX-avledet CRC organoids vivo tilbyr også et allsidig modell ikke bare for å studere biologi av svulst metastasering, men også for utvikling av målrettet terapi i innstillingen preklinisk.
Figur 1: skjematisk fremstilling av generasjon av metastaser av PDX-avledet CRC organoids merket med GFP lentivirus i NOG mus. (A) implantering av små biter av CRC vev subcutaneously i NOG mus (trinn 1). CRC vevet kirurgisk dissekert fra pasienten var skåret i stykker og implantert subcutaneously i NOG mus. SC: subkutan implantasjon. (B) generasjon av CRC organoids skilt fra PDXs (trinn 2-4). De utviklede CRC-xenografts var hakket (trinn 2) og overført til en 15 mL tube som inneholder kultur medium inkludert collagenase (trinn 3). Etter inkubasjon med langsom agitasjon var CRC celle suspensjon filtrerte (trinn 3). Deretter ble organoid celle suspensjon i CRC organoid medium sådd på en kunstig ekstracellulær matrix-belagt plate og ruges over natten i en CO2 inkubator (trinn 4). CRC organoid cellene knyttet til kunstig ekstracellulær matrix var også belagt med ekstra kunstig ekstracellulær matrix og ruges i en CO2 inkubator (trinn 4). SC: subkutan implantasjon. (C) generasjon av CRC organoids transduced av GFP lentiviral partikler før ansette injeksjon i mottakerens mus (trinn 5 – 7). GFP lentiviral partikler ble generert på en høy titer (trinn 5). PDX-avledet CRC organoids dyrket på kunstig ekstracellulær matrix var direkte høstet med cellen skraper og overført til en microtube (trinn 6). Etter sentrifugering var celle pellet re suspendert i PBS. Cellen suspensjonen var centrifuged og celle pellet var atskilt. Deretter ble CRC organoid celle suspensjon inkubert med GFP virus lager i CRC organoid kultur medium på kunstig ekstracellulær matrix-belagt tallerkenen overnatter i en CO2 inkubator (trinn 6). CRC organoid cellene knyttet til kunstig ekstracellulær matrix var belagt med ekstra kunstig ekstracellulær matrix og ruges i en CO2 inkubator å størkne kunstig ekstracellulær matrix belegget (trinn 6). CRC-organoids ble så kultivert for perioder av 7-10 dager å utvide cellevekst (trinn 6). For å utvikle en spontan metastasering modell, ble dissosiert 5 x 105 CRC organoid cellene merket med GFP suspendert i 50 µL av PBS med 50% kunstig ekstracellulær matrix injisert orthotopically i NOG mus (trinn 7). Vil generere en eksperimentell metastasering modell, ble 4 x 104 CRC organoid celler merket med GFP i 50 µL av PBS injisert intrasplenically i NOG mus (trinn 7). OT: orthotopic injeksjon, er: intrasplenic injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: med høy oppløsning av GFP visualisering oppdaget i kulturperler GFP-merket CRC organoids, primære svulster og micrometastases. (A) nesten 100% av kultivert CRC organoids er GFP positive. Bildene ble tatt med en stereo-fluorescens mikroskop. Skala bar = 250 µm. (B) GFP-positivitet i primære svulst og micrometastases i lungene og leveren. Avstand GFP-uttrykke CRC organoid celle suspensjon ble sprøytet inn i endetarmen submucosa (OT inj.) NOG mus. Fleste av kreftceller er vist å være positivt for GFP i den primære svulsten. GFP-positive micrometastases kolonisere lungene (angitt med en pil) vises også. Videre er GFP-positive micrometastases registreres i leveren (angitt med en pil), når cellen suspensjon ble intrasplenically injisert (is inj.) i mus. Skala bar = 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om CRC PDX modellen har vært viden ansatt å studere primære tumor vekst, om denne modellen er også gjelder undersøker svulst metastasering har ennå ikke fullt utredet. Spontan metastaser var knapt synlig i leveren og lungene ulike rapporterte kolon PDX modeller4,10. For å oppdage micrometastases med høy følsomhet, utviklet vi en protokoll for transducing GFP lentiviral partikler i PDX-avledet CRC organoids før deres orthotopic og intravenøs injeksjoner i mottakerens mus. Av notatet var vi kunne vise at denne metoden tillater svært følsom påvisning av CRC organoid-avledet micrometastases, danner både spontant og eksperimentelt, i fjerne organer.
Avgjørende skritt i protokollen inkludere opprettholde intakte formet formasjon uten induksjon av anoikis på den kunstige ekstracellulære matrisen ved forsiktig pipettering CRC-organoids under passaging serien. Utarbeidelse av høy titer lentivirus partikler konsentrert av ultracentrifugation er også viktig for å oppnå det nesten 100% GFP positivitet av CRC organoids. Dessuten anbefales det at GFP-merket CRC organoids injiseres i 10-14 dager i mottakerens mus. Svært lange perioder for utvidelse av CRC-organoids etter smitte kan favorisere utvalg av svakt GFP-uttrykke organoids.
Injeksjon av CRC organoids inn i endetarmen submucosa NOG mus viste deres metastatisk spredning til lungene, men ikke i leveren, antagelig gjennom den underlegne vena cava. Vil generere leveren metastaser spontant, ville injeksjon av CRC organoids inn i tykktarmen med laparotomy være nødvendig13.
Merk at forekomsten av B-celle lymfomer er noen ganger økt NOG immunodeficient mus implantert med tissues inkluderer lymfocytter, infisert med Epstein Barr oncovirus, menneskelige pasienter14. Det er derfor rimelig å anbefale at om nye tumorer kommer fra implantert menneskets CRC bestemmes ved å utføre immunohistochemistry med menneskelige CRC celle markører, som carcinoembryonic antigen og cytokeratin 20.
Da vi undersøkte CRC organoids avledet fra bare én pasient, må flere prøver fra større antall pasienter undersøkes for å generalisere våre funn i fremtiden. Hvis den implanterte PDX-avledet CRC organoids Vis minimal vekst på orthotopic stedet og sjelden skjemaet metastaser på fjerntliggende områder, etterforskere oppfordres til å vurdere utpakking CRC organoids fra forskjellige pasient-avledede PDXs.
Svært følsomme gjenkjenning av GFP-merket micrometastasis oppnådd med denne metoden oppfordrer oss ikke bare til å undersøke nærmere flere uløste biologiske problemer angående overgangen av micrometastasis til macrometastasis, dannelsen av den stromal nisje for metastatisk kolonisering og oppkjøp av resistens, men også å vurdere efficacies av romanen anti-kreft narkotika ansette PDX-bærende dyr som prekliniske modeller.
GFP-baserte FACS-sorteringen av levende CRC organoids Hentet fra primær og fjerntliggende områder har potensial til å tillate enkelt celle-baserte undersøkelser av genet uttrykkene, samt epigenetic og metabolomic profiler, en svulst. Slike funn kan også føre til utviklingen av molekylære mekanismer underliggende metastatisk formidling av CRC-organoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen mulige interessekonflikter avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Juntendo University unge etterforsker prisen (2013, 2014 og 2015) yo, felles prosjekt prisen (2013 og 2014) til K. M., og gir i støtte til forskning fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og Teknologi, Japan (16K 15625 å Y. K. og 16K 15598 til M.G.). Vi er spesielt takknemlig for alle medlemmer av Institutt for Coloproctological kirurgi og molekylære patologi for nyttig diskusjoner og kundestøtte. Vi takker også Dr. Hiroyuki Konno (Hamamatsu University School medisin) og Dr. Hideki Kitajima (International University for helse og velferd) for sjenerøs teknisk veiledning i kirurgiske prosedyrer for orthotopic implantasjon til mus og Dr. Yoshitaka Hippo (Chiba Cancer Center) for tekniske råd om utføre svulst organoid kultur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
References
- Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Aparicio, S., Hidalgo, M., Kung, A. L. Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models. Nat Rev Cancer. 15 (5), 311-316 (2015).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clin Cancer Res. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Fujii, M., et al. A Colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2357-E2364 (2017).
- O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nat Biotechnol. 35 (6), 577-582 (2017).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nat Biotechnol. 35 (6), 569-576 (2017).
- Kuo, T. H., et al. Liver colonization competence governs colon cancer metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (26), 12085-12089 (1995).
- Onuma, K., et al. Genetic reconstitution of tumorigenesis in primary intestinal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (27), 11127-11132 (2013).
- Onder, T. T., et al. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Res. 68 (10), 3645-3654 (2008).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am J Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Fujii, E., et al. Characterization of EBV-related lymphoproliferative lesions arising in donor lymphocytes of transplanted human tumor tissues in the NOG mouse. Exp Anim. 63 (3), 289-296 (2014).
