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Cancer Research

GFP Lentivirus द्वारा उत्पंन Micrometastases के उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने-transduced एक मरीज से व्युत्पंन Organoids बृहदांत्र ट्यूमर

doi: 10.3791/57374 Published: June 14, 2018

Summary

के लिए अत्यधिक संवेदनशील का पता लगाने की अनुमति मानव कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) कोशिकाओं बस्तियां ऊतकों, हम इस के साथ साथ एक प्रोटोकॉल दिखाने के कुशल transduction के लिए हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) lentiviral कणों में PDX-व्युत्पन्न सीआरसी organoid कोशिकाओं प्राप्तकर्ता चूहों में उनके इंजेक्शन से पहले, स्टीरियो-प्रतिदीप्ति सूक्ष्म अवलोकन के साथ.

Abstract

मानव कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) उपचार, कुछ कट्टरपंथी चिकित्सा में वर्तमान अग्रिम के बावजूद सीआरसी के देर चरणों के लिए प्रभावी रहे हैं । इस नैदानिक चुनौती, ट्यूमर xenograft माउस मॉडल लंबे समय से स्थापित मानव कार्सिनोमा सेल लाइनों और ट्यूमर के साथ कई ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग कर काबू पाने के लिए नैदानिक मॉडल के रूप में विकसित किया गया है । वे आंशिक रूप से मानव कार्सिनोमा की सुविधाओं की नकल है, लेकिन अक्सर आक्रमण और मेटास्टेसिस सहित मानव द्रोह के प्रमुख पहलुओं दोहराऊंगा असफल । इस प्रकार, वैकल्पिक मॉडल है कि बेहतर मानव सीआरसी में घातक प्रगति का प्रतिनिधित्व लंबे समय की प्रतीक्षा की गई है ।

हम इस के साथ साथ रोगी की पीढ़ी दिखाने के ट्यूमर xenografts (PDXs) द्वारा शल्य चिकित्सा एक मरीज से विच्छेदित छोटे सीआरसी टुकड़े के चमड़े के नीचे आरोपण । बृहदांत्र PDXs विकसित और histopathologically रोगी में सीआरसी सदृश । हालांकि, कुछ सहज micrometastases PDX मॉडल में प्रभावित सुदूर अंगों के पारंपरिक पार वर्गों में detectable हैं । दूर के अंगों में मेटास्टेटिक प्रसार का पता लगाने की सुविधा के लिए, हम संस्कृति में बृहदांत्र PDXs से ट्यूमर organoid कोशिकाओं को निकाले और उंहें GFP lentivirus के लिए उच्च immunodeficient मंजूरी में इंजेक्शन के लिए पहले से संक्रमित/शि-scid IL2Rγअशक्त (नोग) चूहे । Orthotopically इंजेक्शन PDX-व्युत्पन्न सीआरसी organoid कोशिकाओं लगातार प्राथमिक ट्यूमर प्राप्तकर्ता चूहों में GFP के लिए सकारात्मक रूप में । इसके अलावा, सहज micrometastatic GFP व्यक्त कालोनियों के विकास विशेष रूप से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा इन चूहों के फेफड़ों में पाया जाता है । इसके अलावा, सीआरसी organoids के intrasplenic इंजेक्शन अक्सर यकृत औपनिवेशीकरण पैदा करता है । एक साथ ले लिया, इन निष्कर्षों GFP-लेबल PDX-व्युत्पंन सीआरसी organoid कोशिकाओं नेत्रहीन एक multistep प्रक्रिया के दौरान पता लगाने के लिए आक्रमण मेटास्टेसिस झरना शब्द संकेत मिलता है । वर्णित प्रोटोकॉल मानव सीआरसी के PDXs की स्थापना और इसी सीआरसी organoid कोशिकाओं GFP lentiviral कणों द्वारा transduced के 3 डी संस्कृति शामिल हैं ।

Introduction

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कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) कैंसर दुनिया भर में1की मौत का दूसरा प्रमुख कारण है । उंनत चरण रोग के साथ रोगियों के पारंपरिक उपचार के लिए अपर्याप्त प्रतिक्रिया मौलिक इलाज सीआरसी के प्रयास की कारगरता को इंगित करता है । अधिक प्रभावी चिकित्सीय दृष्टिकोण विकसित करने के लिए, कैंसर के विभिंन नैदानिक माउस मॉडल है कि सीआरसी की विशेषताओं की नकल की स्थापना की गई है । विभिन्न सीआरसी सेल लाइनों व्यापक रूप से उनकी सुविधा और हेरफेर में आसानी के कारण ट्यूमर xenografts उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । कैंसर सेल लाइनों की लंबी अवधि के संस्कृति, तथापि, अक्सर अद्वितीय कोशिका आबादी के चयन का कारण बनता है कि एक विशेष संस्कृति हालत के तहत काफी प्रफलन हैं, जिससे अविश्वसनीय परिणाम और नैदानिक दवा में महत्वपूर्ण सीमाओं में जिसके परिणामस्वरूप विकास.

इन विट्रो मेंकिया जा रहा बिना, रोगी-ट्यूमर xenografts (PDXs) भी मानव सीआरसी के ऊतकों के पशु मॉडल में आरोपण द्वारा उत्पंन किया गया है शल्य चिकित्सा2,3,4रोगियों से विच्छेदित । PDXs व्यापक रूप से recapitulating प्रमुख histopathological सुविधाओं और आनुवंशिक परिवर्तन मूलतः रोगियों जिसमें से वे प्राप्त किए गए के ट्यूमर में मौजूद के रूप में मांयता प्राप्त कर रहे हैं । इसके अलावा, रोगी-ट्यूमर कोशिका समूहों से बना organoids से व्युत्पंन 3 डी शर्तों के तहत संस्कृति द्वारा स्थापित किया गया है कि बारीकी से मूल ट्यूमर के जैविक गुण5,6नकल उतारा । ये ट्यूमर organoids भी उच्च प्रवाह दवा स्क्रीनिंग के लिए लागू किए गए, जिससे व्यक्तिगत चिकित्सा5डिजाइन किया जा करने की अनुमति । हालांकि, स्पष्ट रूप से विषम सीआरसी आबादी एक ट्यूमर के भीतर जन उपस्थित माना जाता है । विशेष रूप से सीआरसी आबादी चुनिंदा पैदा करना और vivo में और इन विट्रो में PDX और ट्यूमर organoids, क्रमशः के मार्ग की श्रृंखला के दौरान विस्तार हो सकता है । यह भी समग्र जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल और महामारी/प्रभावित सीआरसी की आनुवंशिक स्थिति को बदलने की अनुमति है, जिससे माता पिता के सीआरसी के लिए ंयूनतम समानता में जिसके परिणामस्वरूप हो सकता है ।

रोगी-सीआरसी organoids और oncogenic उत्परिवर्तनों के बंदरगाह संयोजन के लिए इंजीनियर गैर कैंसर मानव बृहदांत्र से निकाले गए भी ट्यूमर आक्रमण और मेटास्टेसिस द्वारा उदाहरण मानव ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान की जांच करने के लिए नियोजित किया गया है 6,7,8,9. तथापि, सहज मेटास्टेसिस रोगी के orthotopic आरोपण से उत्पंन होने वाली बहुत कम घटना-immunodeficient चूहों में सीआरसी व्युत्पंन, यह मुश्किल आक्रमण की multistep प्रक्रिया-मेटास्टेसिस झरना है कि स्थानीय शामिल अध्ययन करने के लिए बनाया गया है आक्रमण, intravasation, खून में परिवहन, extravasation और सुदूर अंगों की औपनिवेशीकरण4,10. Micrometastasis ≤ 2 मिमी के ट्यूमर सेल जमाव, रोगी द्वारा गठित सीआरसी organoids द्वारा प्रतिनिधित्व के रूप में, अक्सर प्रयोगात्मक माउस मॉडल में प्रभावित दूर अंगों से वर्गों के histopathological विश्लेषण पर अनदेखी की गई है । सहज micrometastases के दृश्य भी कुशलता से ट्यूमर organoid कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट मार्करों प्राप्तकर्ता चूहों में अपने इंजेक्शन से पहले शुरू करने की कठिनाई के कारण vivo में कम किया गया है । इस अध्ययन में, हम कुशलता से एक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए PDX में transduce GFP lentivirus-3 डी संस्कृति में सीआरसी organoid कोशिकाओं प्राप्तकर्ता चूहों में इंजेक्शन से पहले और अत्यधिक संवेदनशील का पता लगाने की अनुमति देने के लिए, स्टीरियो-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी को रोजगार, उनके विभिन्न अंगों की औपनिवेशीकरण के लिए फार्म micrometastases.

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Protocol

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रोगी को लिखित सूचित सहमति प्रदान की गई और इस परियोजना को Juntendo विश्वविद्यालय के फैकल्टी ऑफ मेडिसिन की अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. Juntendo फैकल्टी ऑफ मेडिसिन की एनिमल रिसर्च एथिक्स कमेटी द्वारा भी माउस प्रयोगों को मंजूरी दी गई ।

1. Immunodeficient चूहों में सीआरसी PDXs की स्थापना

सीआरसी PDXs (चरण 1) की स्थापना के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं चित्रा 1aमें उल्लिखित हैं ।

  1. रोगी से ट्यूमर के सर्जिकल लकीर के तुरंत बाद प्राथमिक सीआरसी ऊतक तैयार करते हैं ।
  2. कोमल आंदोलन द्वारा प्राथमिक सीआरसी ऊतक धो बर्फ के 30 मिलीलीटर में ठंड बाँझ फॉस्फेट एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में खारा (पंजाब) बफर और बर्फ पर रखने के लिए ।
  3. एक 10 सेमी पेट्री डिश पर ऊतक प्लेस बाँझ चिमटी का उपयोग कर, के रूप में बड़े पैमाने पर बाँझ कैंची का उपयोग कर के रूप में संभव है और छोटे टुकड़े करने के लिए ठोस ट्यूमर ऊतकों में कटौती (5 x 5 x 5 मिमी आकार में3 ) बाँझ उस्तरा ब्लेड का उपयोग.
    नोट:-आस-पास के क्षेत्रों की तुलना में अक्सर रंगहीन क्षेत्र नरम और अधिक friable होते हैं ।
  4. 6-वेल प्लेट पर बर्फ ठंडा बाँझ पंजाबियों के 2 मिलीलीटर में बाँझ चिमटी का उपयोग ट्यूमर के छोटे टुकड़े रखें ।
  5. नस्ल 6 सप्ताह पुरानी मंजूरी/शि-scid IL2Rγ अशक्त (नोग) रोगाणु मुक्त और विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त शर्तों के तहत अत्यधिक immunodeficient चूहों ।
  6. isoflurane साँस लेना के साथ चूहों Anesthetize छोटे जानवर साँस लेना संज्ञाहरण डिवाइस का उपयोग और ७०% इथेनॉल के साथ त्वचा को संक्रमित. सामांय दर और श्वसन की गहराई और उचित anesthetization के लिए एक पैर की अंगुली चुटकी पलटा के अभाव आश्वासन देता हूं । आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम एक विकल्प है, जबकि संज्ञाहरण के तहत आंख सूखापन को रोकने के लिए ।
  7. सभी शल्य चिकित्सा उपकरण सूखी गर्मी नसबंदी का उपयोग कर निष्फल और फिर प्राप्तकर्ता चूहों में घाव संक्रमण को रोकने के लिए सभी प्रक्रियाओं के लिए इन उपकरणों का उपयोग करें ।
  8. प्रयोगशाला पीठ पर प्रवण स्थिति में anesthetized माउस रखें । प्राप्तकर्ता माउस के दाएं और बाएं पार्श्वों के निचले भागों पर एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए ऊतक आरोपण बाँझ कैंची का उपयोग करने के लिए चमड़े के नीचे जेब पैदा करते हैं । ध्यान रखना पेरिटोनियल झिल्ली को छिन्न-भिन्न नहीं करना. इस प्रक्रिया के साथ थोड़ा रक्तस्राव होना चाहिए ।
  9. धीरे कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स के ५० µ एल में ऊपर तैयार ट्यूमर टुकड़े डुबकी और फिर उंहें सही और बाएं चमड़े के नीचे की जेब के निचले भागों में प्रत्यारोपण ।
  10. सर्जिकल प्रक्रियाओं के दौर से गुजर चूहों में घाव क्लिप के साथ चीरा टांका । प्रत्यारोपित ट्यूमर के ऊतकों त्वचा के नीचे चीरा से कुछ दूरी पर स्थित हैं कि सुनिश्चित करें ।
    नोट: शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं को कम करने के अनुसार, के बाद शल्य चिकित्सा दर्द और संक्रमण के लिए कोई उपचार इस अध्ययन में प्रशासित रहे थे ।
  11. एक गर्म पैड पर माउस प्लेस और स्टर्नल लेटा हुआ स्थिति बनाए रखने जब तक पर्याप्त चेतना बहाल है । एक बार पूरी तरह से बरामद और सभी चार पैरों पर बैठ कर, चूहे अपने घर पिंजरों को लौट सकता है । predation को रोकने के लिए, एक ही पिंजरे में गैर संचालित पशुओं के साथ प्रजनन की अनुमति नहीं है ।
  12. टांका रिसाव के लिए जांच करें और चूहों की पुष्टि करते हैं कि अगले दिन स्थिर हालत में हैं, शल्य चिकित्सा में इलाज समूह । बीमारी के लक्षण के लिए चूहों की जाँच करें और प्रत्येक माउस में ट्यूमर के आकार को मापने, एक बार एक सप्ताह, कैलिपर्स को रोजगार.

2. चूहों से सीआरसी PDXs का विच्छेदन

सीआरसी PDXs (चरण 2) के विच्छेदन के लिए प्रायोगिक प्रक्रियाएं चित्रा 1bमें उल्लिखित हैं ।

  1. ट्यूमर की अनुमति दें के लिए चमड़े के नीचे विकसित करने के लिए ~ 1 सेमी3 आकार में है, जो आमतौर पर लगभग 1-3 महीने लगते हैं ।
  2. isoflurane साँस लेना के साथ माउस Anesthetize छोटे जानवर साँस लेना संज्ञाहरण डिवाइस का उपयोग और ७०% इथेनॉल के साथ त्वचा को संक्रमित.
  3. प्रयोगशाला पीठ पर प्रवण स्थिति में माउस रखें । त्वचा Incise, ट्यूमर का पर्दाफाश और ध्यान से बाँझ कैंची का उपयोग ट्यूमर से त्वचा को अलग । ट्यूमर को हटाने के बाद, यह एक 10 सेमी पेट्री पकवान पर जगह और ट्यूमर से किसी भी निहायत ही गल क्षेत्रों को हटा दें, तो पंजाब के 5 मिलीलीटर के साथ दो बार कुल्ला ।
    नोट:-आस-पास के क्षेत्रों की तुलना में अक्सर रंगहीन क्षेत्र नरम और अधिक friable होते हैं ।
  4. बर्फ पर ट्यूमर प्लेस और इसे समान रूप से विभाजित 1 सहित विभिंन अनुप्रयोगों के लिए 4 भागों में) सीआरसी organoid संस्कृति, 2) माध्यमिक चूहों में ट्रांसप्लांटेशन, 3) ऊतकवैज्ञानिक परीक्षा और 4) ठंड और ट्यूमर टुकड़े का भंडारण ।
    1. सीआरसी organoids की पीढ़ी के लिए, एक 6 सेमी पेट्री बाँझ पंजाबियों की 1 मिलीलीटर युक्त पकवान पर ठोस ट्यूमर ऊतक जगह है । (चरण 3) प्रसंस्करण जब तक बर्फ पर ऊतक रखें ।
    2. मानव सीआरसी के लिए PDX मॉडल की स्थापना, एक माध्यमिक माउस में ताजा सीआरसी PDXs पारित । छोटे टुकड़ों में ट्यूमर ऊतक काट (5 x 5 x 5 मिमी आकार में3 ) बाँझ उस्तरा ब्लेड का उपयोग और धीरे कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स के ५० µ एल में इन ऊतक टुकड़े डुबकी. फिर, चरण 1.8-1.11 में वर्णित के रूप में सही और बाएं चमड़े के नीचे जेब नोग माउस के निचले भागों में इन टुकड़ों प्रत्यारोपण ।
    3. ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए, 2 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 10% तटस्थ बफर formalin के 5 मिलीलीटर में नमूनों को ठीक करें ।
    4. cryopreservation के लिए, छोटे टुकड़ों में ट्यूमर ऊतक काट (5 x 5 x 5 मिमी आकार में3 ) और धीरे 1 में ५०० µ एल में सेल ठंड समाधान के नमूने डुबकी-1.5 मिलीलीटर cryovial ट्यूबों । फिर, एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के लिए ट्यूब स्थानांतरण ।

3. सीआरसी Organoid संस्कृति के लिए सेल निलंबन में PDXs का निष्कर्षण

सीआरसी PDXs (चरण 3) के पृथक्करण के लिए प्रायोगिक प्रक्रियाएं चित्रा 1bमें उल्लिखित हैं ।

  1. इसके बाद के संस्करण (कदम 2.4.1) एक 10 सेमी पेट्री डिश पर ट्यूमर टुकड़े तैयार प्लेस ।
  2. बाँझ उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर टुकड़े कीमा और उंहें एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में स्थानांतरण 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) के 8 मिलीलीटर-Dulbecco है संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) collagenase एंजाइम स्टॉक के ८० µ एल के साथ (देखें सामग्री की तालिका) ।
  3. ट्यूब कसकर बंद करें और रिसाव को रोकने के लिए parafilm के साथ टोपी लपेटें । सेल सस्पेंशन में कीमा बनाया हुआ ट्यूमर अंशों को अलग कर देना करने के लिए, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इसे धीरे से उत्तेजित करें । ध्यान दें कि अभी भी ट्यूब में शेष अपच ऊतक के कई टुकड़े हो जाएगा ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक और supernatant हटा दें । सेल सस्पेंशन को हल करने के 10 मिलीलीटर 10% FCS-DMEM का उपयोग कर सेल निलंबन ।
  5. अपच ऊतक मलबे को खत्म करने के लिए, एक ५० एमएल शंकु ट्यूब पर सेट ४० µm सेल छलनी का उपयोग कर दो बार सेल निलंबन फिल्टर । फिर, प्रवाह के माध्यम से कम 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर । supernatant निकालें और बर्फ पर गोली रखो ।

4. सीआरसी Organoids कृत्रिम Extracellular मैट्रिक्स पर संस्कृति की पीढ़ी

सीआरसी organoid संस्कृति के बृहदांत्र PDXs (चरण 4) के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं आंकड़ा 1bमें उल्लिखित हैं ।

  1. एक संस्कृति PDX-व्युत्पन्न सीआरसी organoids के लिए उपयुक्त माध्यम की स्थापना ( सामग्री की तालिकादेखें, "सीआरसी organoid संस्कृति माध्यम") मीडिया पहले मानव बृहदांत्र organoids11के लिए वर्णित रोजगार ।
  2. लागू करें १५० कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स के µ एल ( सामग्री की तालिकादेखें) पर अच्छी तरह से एक 12 बर्फ पर प्लेट अच्छी तरह से और फिर यह एक ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 मशीन में 30-60 मिनट के लिए मशीन जैल जमना के लिए ।
  3. सेल गोली से ३.५ सीआरसी organoid संस्कृति मध्यम (४.१ कदम से) के साथ 5% FCS समायोजन प्राप्त करने के लिए 3 x 105 कोशिकाओं/ उसके बाद, मध्यम के बीज 1 मिलीलीटर कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स लेपित प्लेट ४.२ चरण में तैयार पर । और 5% सह2के तहत ३७ ° c पर रातोंरात मशीन । कक्ष निलंबन में एकल कक्ष और कोशिकीय क्लस्टर (अनुयाई कक्षों का एक समूह) सहित ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या की गणना के लिए एक hemocytometer का उपयोग करें ।
    नोट: 5% FCS इस अध्ययन में collagenase के अवशिष्ट एंजाइमी गतिविधि बुझाने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  4. ध्यान से संस्कृति माध्यम इकट्ठा, अस्थाई कोशिकाओं है कि कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स लेपित प्लेट से अलग है सहित, एक १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में अगले दिन पर और यह 5 मिनट के लिए १,४०० x g पर केंद्रापसारक । फिर, supernatant निकालें और बर्फ पर कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स के ७० µ एल में गोली फिर से निलंबित ।
  5. सीआरसी सेल व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए, ट्यूमर सेल कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स से जुड़ी ट्यूमर organoid कोशिकाओं पर extracellular मैट्रिक्स-लेपित प्लेट और एक ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 मशीन में 30 मिनट के लिए गर्मी से युक्त ओवरले कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स कोटिंग । फिर, यह 5% CO2के अंतर्गत ३७ ° c पर 1% FCS के साथ सीआरसी organoid सेल संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ मशीन
  6. संस्कृति माध्यम को हर दूसरे दिन बदलें । जैसे-जैसे सीआरसी organoids मीडियम को भरते हैं, वैसे-वैसे रोजाना इसमें बदलाव जरूरी हो सकता है ।

5. GFP Lentiviral कणों का सृजन और संवर्धन

GFP lentiviral कणों के उत्पादन और संवर्धन के लिए प्रायोगिक प्रक्रियाएं (स्टेप 5) चित्रा 1Cमें उल्लिखित हैं ।

  1. रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टिट्यूट (RPMI) १६४० मध्यम से 10% FCS युक्त संस्कृति HEK293T कोशिकाओं और निम्नलिखित अभिकर्मक प्रक्रिया के लिए ६ १० सेमी व्यंजन (डिश प्रति 2 x 106 कोशिकाओं) तैयार करते हैं ।
  2. डिश के प्रति अभिकर्मक के लिए, तैयार ५०० µ l सहित मिश्रण के 20 µ l को DMEM में अभिकर्मक रिएजेंट के साथ एक PRRL-GFP वेक्टर (5 µ G)12 और दो lentiviral पैकेजिंग plasmids, जैसे pCMV-VSV-g (1 µ g) और pCMV-dr 8.2 dvpr (5 µ g), में एक बाँझ १.५ mL microtube । 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण रखें और फिर यह 10-मुख्यमंत्री पकवानों में से प्रत्येक पर ओवरले और 18 एच के लिए उन्हें मशीन ।
  3. मध्यम निकालें, प्रत्येक डिश के लिए ताजा 10% FCS-RPMI १६४० मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें, और 24 घंटे के लिए खड़े छोड़ दें ।
  4. एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में प्रत्येक डिश से वातानुकूलित माध्यम लीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम के 30 मिलीलीटर रात भर की कुल की दुकान । प्रत्येक डिश पर ताजा RPMI १६४० के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 24 घंटे के लिए खड़े छोड़ दें ।
  5. एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में प्रत्येक डिश से वातानुकूलित माध्यम लीजिए और रखने के लिए, कुल, बर्फ पर मध्यम के 30 मिलीलीटर । फिर, कक्षों को छोड़ें ।
  6. मध्यम के ६० मिलीलीटर फ़िल्टर (से कदम 5.4-5.5) एक ०.४५ µm फिल्टर के माध्यम से कोशिकाओं को हटाने और बारह में इस मात्रा में विभाजित 5 मिलीलीटर के लिए ultracentrifugation ट्यूबों ट्यूब केंद्रापसारक ।
  7. वायरस ध्यान केंद्रित करने के लिए, उंहें एक झूलते बाल्टी रोटर का उपयोग कर केंद्रापसारक ( सामग्री की तालिकादेखें) में ८५,३२७ x जी के लिए १.५ 4 डिग्री सेल्सियस पर एच ।
  8. तुरंत माध्यम निकालें । को हल करने के लिए केंद्रित वायरस गोली, जगह २५० µ एल के पोषक है हैम मिश्रण एफ 12 (F12)/DMEM मध्यम FCS के बिना बारह ट्यूबों में से प्रत्येक में और इसे बनाए रखने 4 ° c रातोंरात । ध्यान दें कि वायरस गोली अक्सर अदृश्य है ।
  9. धीरे से मध्यम पिपेट के 3 मिलीलीटर इकट्ठा करने के लिए केंद्रित 5x GFP lentivirus शेयर, कुल में, शायद GFP lentiviral कणों सहित 108 transducing इकाइयों के प्रति एमएल (टू/एमएल) । फिर, बारह १.५ मिलीलीटर microtubes (प्रति ट्यूब २५० µ एल सहित) की दुकान में बाँझ शर्तों के तहत-८० ° c एक वर्ष तक के लिए । एकाधिक फ्रीज-गल चक्र से बचने के लिए मूल समाधान के कई छोटे aliquots तैयार करें ।

6. GFP Lentiviral कणों के साथ सीआरसी Organoid कोशिकाओं के लेबल कृत्रिम Extracellular मैट्रिक्स पर संस्कृति

GFP lentivirus (चरण 6) के साथ सीआरसी organoid कोशिकाओं लेबलिंग के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं चित्रा 1Cमें उल्लिखित हैं ।

  1. सीआरसी organoids चरण ४.६ में तैयार करने की अनुमति 7 के लिए हस्तक्षेप के बिना हो जाना-10 दिन और फसल उंहें यांत्रिक एक बाँझ सेल खुरचनी का उपयोग कर और फिर उंहें एक १.५ मिलीलीटर microtube में स्थानांतरण ।
    नोट: संस्कृति में सीआरसी organoids की वृद्धि रोगियों से मूल ट्यूमर की प्रकृति पर निर्भर करता है । सीआरसी organoids के अधिक विकास से बचें, उंहें बनाए रखने के द्वारा 60-70% संगम से पहले एक नया कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स पर एक 1:2 विभाजन अनुपात में स्थानांतरण-लेपित 12-अच्छी तरह से थाली ।
  2. १,४०० x जीमें 3 मिनट के लिए microtube केंद्रापसारक, संस्कृति माध्यम को हटाने और ५०० µ में सेल गोली के समाधान के कोमल दोहन से पंजाबियों के एल ।
  3. १,४०० x जी में 3 मिनट के लिए microtube केंद्रापसारक और पंजाबियों को खत्म ।
  4. अनुयाई सीआरसी organoids अलग कर देना करने के लिए, ट्यूब में सेल गोली करने के लिए proteolytic और collagenolytic एंजाइमों के एक सेल टुकड़ी समाधान के ५०० µ एल जोड़ें और यह कोमल दोहन से मिश्रण । फिर, ट्यूबों के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए व्यवस्थित छोड़ दें ।
  5. बहुत धीरे पिपेट एक अतिरिक्त ५०० µ एल के साथ सेल निलंबन 1% FCS-DMEM कई बार एक १.५ मिलीलीटर microtube में मोटे तौर पर कोशिकाओं अलग कर देना । कठोर pipetting द्वारा सीआरसी organoids से एकल कोशिकाओं की पीढ़ी स्पष्ट रूप से कोशिका व्यवहार्यता कम कर देता है । इस प्रकार, यह एक १.५ मिलीलीटर microtube में बहुत धीरे pipetting द्वारा सेल निलंबन में नेत्रहीन detectable कोशिकाओं के द्रव्यमान छोड़ने के लिए आवश्यक है ।
  6. १,४०० x जी पर 3 मिनट के लिए सेल निलंबन केंद्रापसारक और supernatant हटा दें ।
  7. 5x GFP lentivirus स्टॉक के १०० µ एल का एक मिश्रण के साथ सेल गोली को हल (> 108 मं/एमएल) और ४०० µ एल में सीआरसी organoid संस्कृति माध्यम के एक १.५ मिलीलीटर microtube कोमल दोहन द्वारा 5 x 105 असंबद्ध ट्यूमर कोशिकाओं प्रति ५०० µ की एकाग्रता को समायोजित करने के लिए l . ऊपर वर्णित (चरण ४.३) के रूप में कक्ष निलंबन में एकल कक्षों और कक्षों के समूहों सहित, ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या की गणना के लिए एक hemocytometer का उपयोग करें ।
  8. एक कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स-लेपित 12-well प्लेट, चरण ४.२ में वर्णित के रूप में तैयार करें । फिर, जगह ५०० µ एल सेल निलंबन की थाली पर ६.७ चरण में तैयार है और यह 18 एच के लिए छोड़ ३७ ° c के तहत 5% CO2
  9. फ्लोटिंग एक १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स लेपित प्लेट से अलग कोशिकाओं के साथ माध्यम ले लीजिए । यह १,४०० x जी पर केंद्रापसारक और फिर supernatant निकालें और फिर से ७० µ एल में गोली निलंबित कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स की बर्फ पर ।
  10. सीआरसी सेल व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए, ट्यूमर सेल युक्त कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स पर कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स-लेपित 12-well प्लेट, के रूप में वर्णित के रूप में ४.५ कदम से जुड़े ट्यूमर organoids । अगले, एक ३७ ° c, 5% co2 मशीन में 30 मिनट के लिए थाली मशीन कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स कोटिंग जमना और फिर यह 1% FCS के साथ सीआरसी organoid संस्कृति मध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ संस्कृति ३७ ° c के तहत 5% co2
  11. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत संक्रमण के बाद 3 दिनों में कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए लगभग १००% GFP धनात्मकता की पुष्टि करने के लिए lentiviral कणों की एक उच्च titer के उपयोग के कारण ( चित्रा 2aदेखें).
  12. संस्कृति सीआरसी organoids 7 की अवधि के लिए-10 दिन कोशिका वृद्धि प्राप्तकर्ता चूहों में इंजेक्शन से पहले का विस्तार करने के लिए ।

7. GFP द्वारा मेटास्टेसिस की पीढ़ी-लेबल सीआरसी Organoids में प्राप्तकर्ता चूहों

GFP-बला सीआरसी organoids (चरण 7) का उपयोग कर मेटास्टेसिस के उत्पादन के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं चित्रा 1Cमें उल्लिखित हैं ।

  1. सेल सस्पेंशन में GFP-लेबल सीआरसी organoids अलग कर देना करने के लिए, उन्हें यांत्रिक एक बाँझ सेल खुरचना का उपयोग कर फसल और उन्हें एक १.५ मिलीलीटर microtube में हस्तांतरण, जैसा कि ऊपर वर्णित (चरण ६.१).
  2. १,४०० x जीमें 3 मिनट के लिए microtube केंद्रापसारक, संस्कृति माध्यम को दूर करने, और ५०० µ में सेल गोली के समाधान के कोमल दोहन से पंजाबियों के एल ।
  3. १,४०० x जी में 3 मिनट के लिए microtube केंद्रापसारक और पंजाबियों को खत्म ।
  4. ट्यूब में सेल गोली पर सेल टुकड़ी समाधान के ५०० µ एल ओवरले और यह कोमल दोहन से मिश्रण । तो, enzymatically अलग कर देना अनुयाई सीआरसी organoids के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए खड़े मिश्रण छोड़, जैसा कि ऊपर वर्णित (६.४ कदम) ।
  5. बहुत धीरे पिपेट एक अतिरिक्त ५०० µ एल के साथ सेल निलंबन 1% FCS-DMEM के कई बार एक १.५ मिलीलीटर microtube में मोटे तौर पर कोशिकाओं को अलग कर देना, जैसा कि ऊपर वर्णित (चरण ६.५) । कठोर pipetting द्वारा सीआरसी organoids से एकल कोशिकाओं की पीढ़ी स्पष्ट रूप से कोशिका व्यवहार्यता कम कर देता है । इस प्रकार, सेल निलंबन में नेत्रहीन detectable कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर एक १.५ मिलीलीटर microtube में बहुत धीरे से pipetting छोड़ दें ।
  6. १,४०० x जी पर 3 मिनट के लिए सेल निलंबन केंद्रापसारक और supernatant हटा दें ।
  7. सीआरसी PDXs के एक सहज मेटास्टेसिस माउस मॉडल स्थापित करने के लिए:
    1. प्रति माउस ५०% कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स के साथ पंजाब के ५० µ एल में 5 एक्स 105 कोशिकाओं सहित एक सेल सस्पेंशन तैयार करें । उपयोग करने से पहले बर्फ पर निलंबन बनाए रखें । कैंसर कोशिकाओं की गिनती के लिए एक hemocytometer का प्रयोग करें, के रूप में ४.३ कदम में संकेत दिया ।
    2. Anesthetize isoflurane सांस लेना के साथ एक चूहा छोटे जानवर सांस लेना संज्ञाहरण डिवाइस का उपयोग कर और ७०% इथेनॉल के साथ त्वचा को संक्रमित, के रूप में १.६ कदम में संकेत दिया ।
    3. नोग माउस को प्रयोगशाला पीठ पर लापरवाह स्थिति में रखें । गुदा म्यूकोसा बाँझ चिमटी के साथ समझ और धीरे से इसे बाहर निकाल । फिर, तुरंत एक सिरिंज (सुई आकार: 22 ग्राम) का उपयोग कर माउस के गुदा म्यूकोसा में कदम 7.7.1 में तैयार सेल निलंबन इंजेक्षन. नियमित रूप से, 4 – प्रति समूह 6 चूहों के परिणामों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है ।
  8. सीआरसी PDXs का प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल स्थापित करने के लिए:
    1. माउस प्रति पंजाब के ५० µ एल में 4 एक्स 104 कोशिकाओं सहित एक सीआरसी organoid सेल सस्पेंशन तैयार करें । उपयोग करने से पहले बर्फ पर निलंबन बनाए रखें । कैंसर कोशिकाओं की गिनती के लिए एक hemocytometer का प्रयोग करें (चरण ४.३) ।
    2. Anesthetize isoflurane सांस लेना के साथ एक चूहा छोटे जानवर सांस लेना संज्ञाहरण डिवाइस का उपयोग कर और ७०% इथेनॉल के साथ त्वचा को संक्रमित, के रूप में १.६ कदम में संकेत दिया ।
    3. प्रयोगशाला पीठ पर प्रवण स्थिति में anesthetized नोग माउस रखें । बाएँ पार्श्व के निचले हिस्से पर एक छोटा सा चीरा बनाओ और फिर ध्यान से बाँझ कैंची और चिमटी का उपयोग तिल्ली का पर्दाफाश करने के लिए आँख में कटौती । वसा को बाँझ चिमटी के साथ तिल्ली से जुड़ी ऊतक समझ, फिर धीरे सेल निलंबन के ५० µ एल सुई (ऊपर के रूप में तैयार, ८.१ चरण) तिल्ली में. सेल निलंबन उचित बिना जावक रिसाव, तिल्ली से इंजेक्शन है कि निश्चित हो । नियमित रूप से, प्रति समूह 4 चूहों परिणामों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है ।
  9. सर्जरी के बाद एक गर्म पैड पर सभी चूहों प्लेस और पर्याप्त चेतना बहाल है जब तक एक स्टर्नल लेटा हुआ स्थिति में बनाए रखने, चरण १.११ में वर्णित के रूप में. एक बार चूहों पूरी तरह से बरामद किया है, उंहें अपने घर पिंजरों को वापस । predation को रोकने के लिए, एक ही पिंजरे में गैर संचालित पशुओं के साथ प्रजनन की अनुमति नहीं है ।
  10. टांका रिसाव के लिए जांच करें और पुष्टि करते है कि चूहे जीवित हैं, शल्य चिकित्सा उपचार समूह में, अगले दिन । बीमारी के लक्षण और ट्यूमर के आकार को मापने के लिए चूहों की जांच करें, कैलिपर्स रोजगार, सभी चूहों में एक बार एक सप्ताह.
  11. चूहों का निरीक्षण करने के लिए सहज मेटास्टेसिस का पता लगाने (अप करने के लिए २.५ महीने की अवधि के लिए) और प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस (1 महीने) इंजेक्शन के बाद.
  12. संकेत दिन पर संज्ञाहरण और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से चूहों कुर्बानी । काटना प्राथमिक ट्यूमर और जिगर और फेफड़ों सहित विभिन्न ऊतकों । 10 सेमी पेट्री डिश पर आइस-कोल्ड पंजाब के 5 मिलीलीटर में विच्छेदित ट्यूमर और अंगों को रखें और उन्हें बर्फ पर स्टोर करें ।
  13. GFP-सकारात्मक सीआरसी organoid कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, एक स्टीरियो-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत विच्छेदित ऊतकों का निरीक्षण । एक सीसीडी कैमरे के साथ छवियों का अधिग्रहण और मानक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर तैयार करते हैं ।

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Representative Results

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एक प्राथमिक कोलोरेक्टल ग्रंथिकर्कटता का निदान के रूप में मामूली विभेदित किया गया शल्य चिकित्सा टीएनएम वर्गीकरण, स्टेज IIIa, पोस्ट ऑपरेटिव कीमोथेरेपी के बाद के साथ एक ७६ वर्षीय महिला से संप्रदाय । प्राथमिक सीआरसी कोशिकाओं immunohistochemically carcinoembryonic प्रतिजन, Ki-६७, पैन-cytokeratin और ई cadherin के लिए सकारात्मक दाग । संप्रदाय ट्यूमर के टुकड़े भी थे चमड़े के नीचे नोग चूहों में प्रत्यारोपित करने के लिए बृहदांत्र PDX मॉडल उत्पंन करते हैं । सीआरसी organoid कोशिकाओं तो बृहदांत्र PDX जो इन चूहों में चमड़े के नीचे विकसित किया था से ऊतक संस्कृति के लिए निकाले गए थे । सीआरसी organoids लगातार कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स पर मार्ग की एक श्रृंखला के दौरान कोशिकीय क्लस्टर बनाने में सक्षम थे । ट्यूमर organoids histologically के रूप में और आनुवंशिक रूप से5,6रोगियों से प्राथमिक ट्यूमर की प्रकृति को प्रतिबिंबित, हम उच्च संवेदनशीलता के साथ सीआरसी organoid कोशिकाओं का पता लगाने में vivo की अनुमति होगी कि एक माउस मॉडल विकसित करने की कोशिश की मेटास्टेटिक प्रसार के दौरान । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, सीआरसी organoids GFP lentivirus से संक्रमित थे, जिससे लगभग सभी organoids बहुत उज्ज्वल GFP (चित्रा 2a) दिखा में जिसके परिणामस्वरूप । इन organoids तो एक GFP माइक्रोस्कोप के तहत दूर अंगों में प्रतिदीप्ति-सकारात्मक कोशिकाओं का पता लगाने के लिए पहले माध्यमिक नोग चूहों में orthotopically और intrasplenically इंजेक्शन थे. हम सभी चार चूहों की जांच में orthotopic साइट पर GFP-सकारात्मक प्राथमिक ट्यूमर के गठन मनाया (चित्रा बीएक, वाम) । इसके अलावा, सूक्ष्म मेटास्टेसिस चार चूहों के orthotopic इंजेक्शन के बाद २.५ महीने में जांच की तीन के फेफड़ों में पाए गए (चित्रा बी, मध्य) । इसके अलावा, जिगर मेटास्टेसिस सभी चार चूहों में इंजेक्शन के बाद 1 महीने में जांच की intrasplenic इंजेक्शन के जवाब में मनाया गया (चित्रा 2 बी, सही) ।

एक साथ ले लिया, इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि उच्च संकल्प GFP प्रतिदीप्ति PDX-व्युत्पन्न सीआरसी organoid कोशिकाओं पर दोनों सहज micrometastases में उनके पता लगाने की अनुमति देता है और प्रयोग विकसित उन, सुदूर अंगों में, जब प्राप्तकर्ता में पेश चूहे इस उच्च प्रसार PDX- vivo में सीआरसी organoids व्युत्पंन की संवेदनशीलता का पता लगाने भी एक बहुमुखी मॉडल न केवल ट्यूमर मेटास्टेसिस के जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए प्रदान करता है, लेकिन यह भी के लिए नैदानिक सेटिंग में लक्षित चिकित्सा विकसित करने के लिए ।

Figure 1
चित्रा 1: PDX द्वारा मेटास्टेसिस की पीढ़ी के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व-सीआरसी organoids lentivirus चूहों में GFP नोग के साथ लेबल व्युत्पंन । (एक) सीआरसी ऊतक के छोटे टुकड़ों के नोग चूहों में चमड़े के आरोपण (चरण 1) । सीआरसी ऊतक शल्य चिकित्सा रोगी से विच्छेदित टुकड़ों में काटा गया था और नोग चूहों में चमड़े से प्रत्यारोपित । एस॰सी॰: चमड़े के नीचे आरोपण । (ख) PDXs से सीआरसी organoids असंबद्ध की पीढ़ी (चरण 2 – 4) । विकसित सीआरसी xenografts (चरण 2) भरती थे और एक 15 मिलीलीटर collagenase (चरण 3) सहित संस्कृति माध्यम युक्त ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया । धीमी गति से आंदोलन के साथ मशीन के बाद, सीआरसी सेल निलंबन (चरण 3) छान रहा था । फिर, सीआरसी organoid माध्यम में organoid सेल निलंबन एक कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स लेपित प्लेट पर वरीयता प्राप्त था और एक सह2 मशीन (चरण 4) में रातोंरात गर्मी । सीआरसी organoid कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स से जुड़ी कोशिकाओं को भी अतिरिक्त कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स के साथ लेपित थे और एक सह2 मशीन में मशीन (4 कदम) । एस॰सी॰: चमड़े के नीचे आरोपण । (ग) सीआरसी organoids transduced की पीढ़ी GFP lentiviral कणों द्वारा प्राप्तकर्ता चूहों में इंजेक्शन रोजगार से पहले (चरण 5-7) । GFP lentiviral कण एक उच्च titer (चरण 5) में उत्पन्न हुए थे । PDX-व्युत्पंन सीआरसी कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स पर उगाया organoids सीधे एक सेल खुरचनी के साथ काटा गया और एक microtube (6 कदम) में स्थानांतरित कर रहे थे । केंद्रापसारक के बाद, सेल गोली फिर से पंजाब में निलंबित कर दिया गया था । सेल निलंबन केंद्रापसारक था और सेल गोली असंबद्ध था । फिर, सीआरसी organoid सेल निलंबन GFP वायरस स्टॉक के साथ सीआरसी organoid संस्कृति मध्यम में कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स पर एक सह2 मशीन में रात भर लेपित थाली (6 कदम) के साथ मशीन था । सीआरसी organoid कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स से जुड़ी कोशिकाओं को अतिरिक्त कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स के साथ लेपित और एक सह2 मशीन में मशीन कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स कोटिंग (6 कदम) जमना था । सीआरसी organoids तो 7 की अवधि के लिए संस्कृति थे-10 दिनों के लिए सेल विकास (6 कदम) का विस्तार । एक सहज मेटास्टेसिस मॉडल विकसित करने के लिए, असंबद्ध 5 एक्स 105 सीआरसी organoid कोशिकाओं ५०% के साथ पंजाब के ५० µ एल में निलंबित GFP के साथ लेबल कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स orthotopically चूहों में नोग इंजेक्शन थे (चरण 7). एक प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल, 4 x 104 सीआरसी organoid कोशिकाओं के उत्पंन करने के लिए ५० µ में GFP के साथ लेबल पंजाबियों के intrasplenically चूहों में नोग इंजेक्शन थे (7 कदम) । थेटर: orthotopic इंजेक्शन, i.s.: intrasplenic इंजेक्शन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: GFP विज़ुअलाइज़ेशन का उच्च संकल्प GFP-लेबल सीआरसी organoids, प्राथमिक ट्यूमर और micrometastases में पाया गया । (क) लगभग १००% कल्चरल सीआरसी organoids के GFP पॉजिटिव हैं. छवियों एक स्टीरियो-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया. स्केल बार = २५० µm. (ख) फेफड़ों और यकृत में प्राथमिक ट्यूमर और micrometastases में GFP-धनात्मकता. असंबद्ध GFP-व्यक्त सीआरसी organoid सेल निलंबन inj चूहों के गुदा उप म्यूकोसा (थेटर नोग.) में इंजेक्ट किया गया था । ट्यूमर कोशिकाओं के बहुमत प्राथमिक ट्यूमर में GFP के लिए सकारात्मक होने के लिए दिखाए जाते हैं । GFP-पॉजिटिव micrometastases बस्तियां फेफड़ों (एक तीर से संकेत) भी दिखाए जाते हैं । इसके अलावा, GFP-सकारात्मक micrometastases जिगर में पाए जाते है (एक तीर से संकेत), जब सेल निलंबन intrasplenically इंजेक्शन (i.s. inj.) चूहों में किया गया । स्केल बार = ५०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

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Discussion

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हालांकि सीआरसी PDX मॉडल व्यापक रूप से प्राथमिक ट्यूमर के विकास का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है, क्या इस मॉडल भी जांच ट्यूमर के लिए लागू है मेटास्टेसिस अभी तक पूरी तरह से आविर्भाव नहीं किया गया है । सहज मेटास्टेसिस भी बमुश्किल जिगर और फेफड़ों के विभिंन बृहदांत्र PDX मॉडल4,10की रिपोर्ट में detectable थे । उच्च संवेदनशीलता के साथ micrometastases का पता लगाने के लिए, हम PDX में transducing GFP lentiviral कणों के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित-सीआरसी organoids से पहले orthotopic व्युत्पंन और प्राप्तकर्ता चूहों में नसों में इंजेक्शन । नोट के, हम बताते है कि इस विधि सीआरसी organoid-व्युत्पंन micrometastases के अत्यधिक संवेदनशील पता लगाने की अनुमति देता है, दोनों सहज और प्रयोग, दूर के अंगों में बनाने में सक्षम थे ।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम धीरे organoids श्रृंखला के दौरान सीआरसी passaging pipetting द्वारा कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स पर anoikis की प्रेरण बिना बरकरार अंडाकार आकृति गठन बनाए रखने शामिल हैं । ultracentrifugation द्वारा केंद्रित उच्च titer lentivirus कणों की तैयारी सीआरसी organoids के लगभग १००% GFP धनात्मकता को प्राप्त करने के लिए भी महत्वपूर्ण है इसके अलावा, यह सिफारिश की है कि GFP-organoids सीआरसी लेबल में 10 के भीतर इंजेक्शन हो-14 दिन प्राप्तकर्ता चूहों में । अधिक सीआरसी organoids के विस्तार के लिए लंबी अवधि के संक्रमण के बाद कमजोर GFP-व्यक्त organoids के चयन एहसान कर सकते हैं ।

नोग चूहों के गुदा म्यूकोसा में सीआरसी organoids के इंजेक्शन फेफड़ों में उनके मेटास्टेटिक प्रसार दिखाया, जिगर में नहीं, हालांकि, संभवतः अवर वेना कावा के माध्यम से. जिगर मेटास्टेसिस उत्पंन करने के लिए सहज, laparotomy के साथ बृहदांत्र में सीआरसी organoids के इंजेक्शन13की आवश्यकता होगी ।

ध्यान दें कि बी सेल लिंफोमा के घटना के अवसर पर है नोग immunodeficient चूहों में वृद्धि हुई लिम्फोसाइटों सहित ऊतकों के साथ प्रत्यारोपित, Epstein से संक्रमित-बर्र oncovirus, मानव रोगियों से14. इसलिए यह अनुशंसा करना उचित है कि क्या उभरते ट्यूमर प्रत्यारोपित मानव सीआरसी से उत्पंन immunohistochemistry मानव सीआरसी ऐसे carcinoembryonic प्रतिजन और cytokeratin 20 के रूप में सेल मार्कर, का उपयोग कर प्रदर्शन द्वारा निर्धारित किया जाएगा ।

जैसा कि हम केवल एक मरीज से व्युत्पंन सीआरसी organoids की जांच की, रोगियों की बड़ी संख्या से अधिक नमूने के लिए भविष्य में हमारे निष्कर्षों का सामांय जांच की आवश्यकता होगी । यदि प्रत्यारोपित PDX-व्युत्पन्न सीआरसी organoids orthotopic साइट पर कम से कम वृद्धि दिखाने के लिए और शायद ही कभी दूर साइटों पर मेटास्टेसिस फार्म, जांचकर्ताओं को विभिंन रोगी से सीआरसी organoids निकालने पर विचार PDXs व्युत्पंन प्रोत्साहित किया जाता है ।

GFP का अत्यधिक संवेदनशील पता लगाने-इस विधि के साथ प्राप्त micrometastasis लेबल हमें प्रोत्साहित करने के लिए न केवल आगे कई अनसुलझी जैविक macrometastasis के लिए micrometastasis के संक्रमण के बारे में मुद्दों की जांच करने के लिए, stromal के गठन मेटास्टेटिक औपनिवेशीकरण और दवा प्रतिरोध के अधिग्रहण के लिए आला है, लेकिन यह भी PDX-नैदानिक मॉडल के रूप में असर जानवरों को रोजगार से उपंयास विरोधी कैंसर दवाओं के efficacies का मूल्यांकन करने के लिए ।

GFP आधारित FACS-प्राथमिक और सुदूर स्थलों से निकाले गए सीआरसी organoids के रहने की छंटाई भी क्षमता के लिए एक कोशिका जीन के भाव के आधार पर परीक्षाओं की अनुमति है, साथ ही साथ epigenetic और metabolomic प्रोफाइल, एक ट्यूमर की । इस तरह के निष्कर्षों को अच्छी तरह से आणविक सीआरसी organoids के मेटास्टेटिक प्रसार तंत्र के elucidation के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों के हित का कोई संभावित विरोध प्रकट नहीं होता.

Acknowledgments

इस काम के लिए Juntendo विश्वविद्यालय के युवा अन्वेषक पुरस्कार (२०१३, २०१४ और २०१५) के लिए Y.O., संयुक्त परियोजना पुरस्कार (२०१३ और २०१४) के लिए के. एम., और अनुदान में सहायता के लिए शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान मंत्रालय से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए समर्थन किया गया और प्रौद्योगिकी, जापान (16K15625 से वाई. के. और 16K15598 को M.G.). हम Coloproctological सर्जरी और उपयोगी चर्चा और तकनीकी सहायता के लिए आणविक विकृति विभाग के सभी सदस्यों के लिए विशेष रूप से आभारी हैं । हम भी डॉ हिरोयुकी Konno (हमामात्सू विश्वविद्यालय Schoolof मेडिसिन) और डॉ हिडेकी Kitajima (स्वास्थ्य और कल्याण के अंतरराष्ट्रीय विश्वविद्यालय) चूहों में orthotopic आरोपण के लिए शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं में उदार तकनीकी मार्गदर्शन के लिए धन्यवाद और डॉ. Yoshitaka हिप्पो (चिबा कैंसर सेंटर) ट्यूमर organoid संस्कृति प्रदर्शन पर तकनीकी सलाह के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions
wound clips
2×10mm
Natsume manufacturing, Japan #C-21-S Autoclave before use
Hamilton syringe
needle size:22 gauge
Tokyo Science, Japan Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS.
6-well plate BMBio #92006
12-well plate BMBio #92412
15ml conical tube Sumitono Bakelite MS-57150
50ml conical tube Sumitomo Bakelite MS-57500
microtube Eppendorf #0030120086 Autoclave before use
Hemocytometer Erma #03-202-1
40μm cell strainer Corning #352340
Matrigel basement membrane matrix Corning #354234 Store aliqupts at -20°C.
Place on ice until use
Collagenase type 1 Sigma #C1030 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year
Accutase Innovate Cell Technologies #5V2623A Store at 4°C.
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ Gibco #10565018 Store at 4°C. Warm at 37°C before use
Cell banker 1plus ZENOAQ #628 Store at 4°C. Use within 1 month
Penicillin Gibco #15140122 Store at 4°C. Use within 1 month
Streptomycin Gibco #15140122 Store at 4°C. Use within 1 month
hEGF PEPROTECH #AF-100-15 Store at -20°C. Add to medium on same day as use
Y27632, a ROCK inhibitor Wako #253-00591 Store at -20°C. Add to medium on
same day as use
Culture medium Gibco DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin.
Store at 4°C. Use within 1 month.
CRC organoid culture medium
with 1% or 5% FCS
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor.
Store at 4°C. Use within 1 month.
the FuGENE 6 transfection regent Roche 11814 443001
Minisart 0.45 µm filter Sartorius stedim 17598-K
5 ml polypropylene centrifuge tubes Beckman Coulter 326819
PRRL-GFP vector Gift from Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-VSV-G Gift from Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvpr Gift from Dr. Robert A. Weinberg
the SW55Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter
a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope Zeiss

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References

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GFP Lentivirus द्वारा उत्पंन Micrometastases के उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने-transduced एक मरीज से व्युत्पंन Organoids बृहदांत्र ट्यूमर
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Okazawa, Y., Mizukoshi, K., Koyama, Y., Okubo, S., Komiyama, H., Kojima, Y., Goto, M., Habu, S., Hino, O., Sakamoto, K., Orimo, A. High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor. J. Vis. Exp. (136), e57374, doi:10.3791/57374 (2018).More

Okazawa, Y., Mizukoshi, K., Koyama, Y., Okubo, S., Komiyama, H., Kojima, Y., Goto, M., Habu, S., Hino, O., Sakamoto, K., Orimo, A. High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor. J. Vis. Exp. (136), e57374, doi:10.3791/57374 (2018).

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