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Cancer Research

Rilevamento ad alta sensibilità dei Micrometastases generati da GFP trasdotte Lentivirus Organoids coltivate da un tumore del Colon paziente-derivato

doi: 10.3791/57374 Published: June 14, 2018

Summary

Per consentire la rivelazione altamente sensibile del cancro colorettale umano diffondere cellule (CRC), colonizzando tessuti, mostriamo qui un protocollo per la trasduzione efficiente delle particelle lentivirali proteina fluorescente verde (GFP) in cellule di organoid PDX-derivato CRC prima del loro iniezione nel destinatari topi, con osservazione al microscopio stereo-fluorescenza.

Abstract

Malgrado gli avanzamenti correnti nel trattamento del cancro umano del colon-retto (CRC), poche terapie radicali sono efficaci per la fine delle fasi di CRC. Per superare questa sfida clinica, modelli murini dello xenotrapianto di tumore utilizzando consolidate linee cellulari umane di carcinoma e molti modelli di topi transgenici con i tumori sono stati sviluppati come modelli preclinici. Essi parzialmente imitare le caratteristiche di carcinoma umani, ma spesso non riescono a riassumere gli aspetti principali delle malignità umane, compreso l'invasione e metastasi. Così, modelli alternativi che meglio rappresentano la progressione maligna in CRC umana hanno lungamente attesa.

Per l'impianto sottocutaneo di piccoli frammenti CRC sezionato chirurgicamente da un paziente mostreremo qui generazione degli xenotrapianti del tumore di derivazione paziente (PDXs). Il colon PDXs sviluppare e histopathologically assomigliano il CRC nel paziente. Tuttavia, pochi i micrometastases spontanei sono rilevabili in sezioni convenzionali degli organi commoventi distanti nel modello PDX. Per facilitare l'individuazione di disseminazione metastatica in organi distanti, abbiamo estratto le cellule del tumore organoid dalla PDXs del colon nella cultura e li infettato da lentivirus GFP prima dell'iniezione in altamente immunodeficienti Shi-NOD/scid IL2Rγnull Topi (NOG). Orthotopically iniettato PDX-derivato CRC organoid cellule costantemente forma tumori primari positiva per GFP in topi destinatari. Inoltre, spontaneamente sviluppando micrometastatico colonie che esprimono GFP in particolare vengono rilevati nei polmoni di questi topi mediante microscopia a fluorescenza. Inoltre, intrasplenic iniezione di CRC organoids produce frequentemente colonizzazione epatica. Presi insieme, questi risultati indicano GFP-etichettato di cellule CRC PDX-derivato organoid essere visivamente rilevabili durante un processo a più stadi definito la cascata di invasione-metastasi. I protocolli descritti includono l'istituzione di PDXs di CRC umana e cultura 3D delle corrispondenti cellule CRC organoid microlavorata in particelle lentivirali GFP.

Introduction

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Il cancro colorettale (CRC) è la seconda causa principale di morti di cancro in tutto il mondo1. La risposta insufficiente a terapie convenzionali dei pazienti con malattia in stadio avanzato indica l'inefficacia dei tentativi di curare radicalmente CRCs. Per sviluppare approcci terapeutici più efficaci, sono stati istituiti vari modelli del mouse preclinici di cancro che imitano le caratteristiche del CRC. Varie linee cellulari CRC sono stati ampiamente usati per generare gli xenotrapianti del tumore a causa della loro convenienza e facilità di manipolazione. Coltura a lungo termine di linee cellulari del cancro, tuttavia, è spesso causa di selezione di popolazioni di cellule uniche che sono abbastanza proliferativa in una condizione di determinate impostazioni cultura, quindi con conseguente risultati inaffidabili e limitazioni cruciale nella droga preclinico sviluppo.

Senza essere coltivate in vitro, xenotrapianti paziente-derivato del tumore (PDXs) inoltre sono stati generati tramite impianto in modelli animali di tessuti umani CRC chirurgicamente dissecati da pazienti2,3,4. PDXs sono ampiamente riconosciuti come ricapitolare le principali caratteristiche istopatologiche e alterazioni genetiche originariamente presentano nei tumori dei pazienti da cui sono stati derivati. Inoltre, tumore di derivazione paziente organoids composta di cellula tumorale, i cluster sono stati stabiliti dalla cultura in condizioni 3D che imitato molto attentamente le proprietà biologiche dei tumori originale5,6. Questi organoids del tumore sono state applicate anche per lo screening di stupefacenti ad alta produttività, consentendo in tal modo terapie personalizzate essere progettato5. Tuttavia, popolazioni di CRC marcatamente eterogenee sono presupposti per essere presenti all'interno di un tumore massa. Popolazioni particolari di CRC potrebbero selettivamente proliferare ed espandersi durante della serie in vivo e in vitro dei passaggi dei organoids PDX e tumore, rispettivamente. Ciò potrebbe consentire anche i profili di espressione genica globale e status epi/genetico del CRCs interessato al cambiamento, quindi con conseguente minima somiglianza con il CRC dei genitori.

Paziente-derivati organoids CRC e quelli estratti da noncancerous colon umano progettato per harbor combinazioni di mutazioni oncogeniche sono state impiegate anche per indagare le caratteristiche delle cellule umane del tumore esemplificate da invasione del tumore e metastasi 6,7,8,9. Tuttavia, la bassissima incidenza di metastasi spontanea derivanti dall'impianto di orthotopic del paziente-derivato CRC in topi immunodeficienti, ha reso difficile studiare il processo multifasico della cascata invasione-metastasi che include locali invasione, intravasation, trasporto nella circolazione sanguigna, lo stravaso e colonizzazione di organi distanti4,10. Micrometastasi come rappresentato dalla deposizione delle cellule del tumore di ≤ 2 mm, formano da paziente-derivati organoids CRC, sono stato spesso trascurato su analisi istopatologica delle sezioni da organi colpiti distanti in modelli sperimentali murini. Visualizzazione dei micrometastases spontaneo è stato anche minima in vivo a causa della difficoltà di introdurre in modo efficiente marcatori fluorescenti nelle cellule organoid del tumore prima del loro iniezione nel destinatari topi. In questo studio, abbiamo sviluppato un protocollo efficiente trasduce lentivirus GFP nelle cellule di organoid CRC PDX-derivato in 3D cultura prima dell'iniezione in topi destinatari e per consentire di rivelazione altamente sensibile, che impiegano microscopia stereo-fluorescenza, della loro colonizzazione di diversi organi a forma i micrometastases.

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Protocol

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Il paziente fornito il consenso informato scritto e il progetto è stato approvato dal comitato etico di ricerca della facoltà di medicina dell'Università di Juntendo. Gli esperimenti del mouse sono stati approvati dal comitato etico di ricerca animale della facoltà di medicina Juntendo.

1. istituzione del CRC PDXs in topi immunodeficienti

Procedure sperimentali per stabilire PDXs CRC (passaggio 1) sono descritti nella Figura 1A.

  1. Preparare il tessuto primario di CRC subito dopo resezione chirurgica del tumore dal paziente.
  2. Lavare il tessuto primario di CRC di movimentazione delicata parecchie volte in 30 mL di fosfato sterile ghiacciato tampone salino (PBS) in una provetta conica da 50 mL e tenerlo sul ghiaccio.
  3. Posizionare il tessuto su una piastra Petri 10cm con pinzette sterili, rimuovere le aree necrotiche ampiamente possibili utilizzando forbici sterili e tagliare i tessuti del tumore solido a piccoli pezzi (5 x 5 x 5 mm3 dimensioni) utilizzando lame di rasoio sterile.
    Nota: Le zone necrotiche sono spesso più bianca, più morbido e più friabile rispetto alle aree circostanti.
  4. Posto i pezzi piccoli di tumore con pinzette sterili in 2 mL di PBS sterile ghiacciata su una piastra a 6 pozzetti.
  5. Razza 6 mouse week-old IL2Rγ Shi-NOD/scid (NOG) null altamente immunodeficienti condizioni libero libero e specifico patogenogerme.
  6. Anestetizzare i topi con inalazione isoflurane utilizzando il dispositivo di anestesia per inalazione animale piccolo e disinfettare la pelle con etanolo al 70%. Assicurare il tasso normale e la profondità della respirazione e l'assenza di un riflesso di pizzico di punta per corretto amputate. Unguento veterinario sugli occhi è un'opzione, per prevenire la secchezza oculare mentre sotto anestesia.
  7. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici mediante sterilizzazione a calore secco e quindi utilizzare questi strumenti per tutte le procedure per prevenire le infezioni di ferita in topi destinatari.
  8. Posizionare il mouse anestetizzato in posizione prona su banco di laboratorio. Praticare una piccola incisione sulla parte inferiore dei fianchi destro e sinistro del mouse destinatario per generare tasche sottocutanee per l'impianto di tessuto usando forbici sterili. Fare attenzione a non per forare la membrana peritoneale. Ci dovrebbe essere piccolo sanguinamento con questa procedura.
  9. Immergere delicatamente sopra preparato frammenti di tumore in 50 µ l di matrice extracellulare artificiale e impiantarli poi nelle parti inferiori delle tasche sottocutanee destra e sinistra.
  10. Sutura l'incisione con clip di ferita nei topi sottoposti a procedure chirurgiche. Assicurarsi che i tessuti del tumore impiantato si trovano ad una certa distanza dall'incisione sotto la pelle.
    Nota: In conformità riducendo al minimo le procedure chirurgiche, nessun trattamento per dolore post-operatorio e l'infezione sono stato amministrato in questo studio.
  11. Posizionare il mouse su un pad caldo e mantenere la posizione di decubito sternale fino al ripristino della coscienza sufficiente. Una volta completamente recuperati e in grado di sedersi su tutte e quattro le gambe, i topi possono essere restituiti alla loro casa gabbie. Per evitare la predazione, non consentono l'allevamento con animali non operati nella stessa gabbia.
  12. Controllare eventuali perdite di sutura e confermare che i topi sono in condizioni stabili il giorno successivo, nel gruppo trattato chirurgicamente. Controllare i topi per i segni della malattia e misurare le dimensioni del tumore in ogni mouse, una volta a settimana, che impiegano pinze.

2. dissezione di CRC PDXs dai topi

Procedure sperimentali per la dissezione di CRC PDXs (passaggio 2) sono illustrate in Figura 1B.

  1. Consentire il tumore a crescere per via sottocutanea a ~ 1 cm3 dimensioni, che di solito prende circa 1 – 3 mesi.
  2. Anestetizzare il mouse con inalazione isoflurane utilizzando il dispositivo di anestesia per inalazione animale piccolo e disinfettare la pelle con etanolo al 70%.
  3. Posizionare il mouse in posizione prona su banco di laboratorio. Incidere la pelle, esporre il tumore e staccare con cura la pelle dal tumore usando forbici sterili. Dopo aver rimosso il tumore, posto su un 10cm di Petri e rimuovere eventuali regioni grossolanamente necrotici del tumore, quindi sciacquare due volte con 5 mL di PBS.
    Nota: Le zone necrotiche sono spesso più bianca, più morbido e più friabile rispetto alle aree circostanti.
  4. Mettere il tumore sul ghiaccio e dividere in parti uguali in almeno 4 parti per diverse applicazioni tra cui 1) la cultura di organoid CRC, 2) trapianto in topi secondari, 3) istologico e 4) di congelamento e la conservazione dei frammenti del tumore.
    1. Per la generazione dei organoids CRC, posizionare il tessuto del tumore solido su una piastra Petri 6 cm contenente 1 mL di PBS sterile. Mantenere il tessuto sul ghiaccio fino al procedimento (passaggio 3).
    2. Per stabilire il modello PDX per CRC umano, passaggio il fresco PDXs CRC in un mouse secondario. Tagliare il tessuto del tumore in piccoli pezzi (5 x 5 x 5 mm3 dimensioni) utilizzando lame di rasoio sterile e immergere delicatamente questi frammenti di tessuto in 50 µ l di matrice extracellulare artificiale. Quindi, impiantare questi frammenti nelle parti inferiori delle tasche sottocutanee destra e sinistra del mouse NOG, come descritto al punto 1.8 – 1.11.
    3. Per l'analisi istologica, fissare i campioni in 5 mL di formalina tamponata al 10% neutra in una provetta conica da 15 mL a temperatura ambiente per 2 giorni.
    4. Per la crioconservazione, tagliare il tessuto del tumore in piccoli pezzi (5 x 5 x 5 mm3 dimensioni) e immergere delicatamente i campioni in 500 µ l di soluzione in 1 – 1,5 mL cryovial provette di congelamento delle cellule. Quindi, il tubo di trasferimento di un congelatore a-80 ° C.

3. estrazione di PDXs nella sospensione cellulare per la cultura di Organoid CRC

Procedure sperimentali per la dissociazione di CRC PDXs (passaggio 3) sono illustrate in Figura 1B.

  1. Posto sopra (punto 2.4.1) preparato tumore frammenti su una piastra di Petri di 10 cm.
  2. Tritare i frammenti utilizzando lame di rasoio sterile e trasferirli in una provetta conica da 15 mL contenente 8 mL di siero fetale di vitello 10% (FCS)-Medium (DMEM dell'Aquila per volta di Dulbecco) con 80 µ l di brodo di enzima collagenasi (Vedi Tabella materiali).
  3. Chiudere saldamente la provetta e avvolgere il tappo con parafilm per evitare perdite. Per dissociare i frammenti di tumore macinate in una sospensione cellulare, agitare delicatamente per 2 ore a 37 ° C. Si noti che ci saranno ancora molti frammenti di tessuto non digerito restanti nel tubo.
  4. Centrifugare la provetta a 300 x g per 5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Risolvere il pellet cellulare utilizzando 10 mL di 10% FCS-DMEM per rendere la sospensione cellulare.
  5. Per eliminare i detriti dei tessuti non digerito, filtrare la sospensione cellulare due volte utilizzando il filtro di cella di 40 µm impostato su una provetta conica da 50 mL. Poi, centrifugare il flusso continuo a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e tenere la pallina sul ghiaccio.

4. generazione della Organoids CRC coltivate sulla matrice extracellulare artificiale

Procedure sperimentali per la coltura di organoid CRC della PDXs del colon (passaggio 4) sono illustrate in Figura 1B.

  1. Stabilire un terreno di coltura adatto per il organoids CRC PDX-derivati (Vedi Tabella materiali, "il terreno di coltura organoid CRC") che impiegano supporti precedentemente descritti per umano del colon organoids11.
  2. Applicare 150 µ l di matrice extracellulare artificiale (Vedi Tabella materiali) per bene su un piatto di 12-pozzetti su ghiaccio e incubare per 30-60 minuti a 37 ° C, 5% CO2 incubatore per solidificare il gel.
  3. Sospendere il pellet cellulare da passo 3.5 con il terreno di coltura organoid CRC (dal punto 4.1) con 5% FCS per ottenere regolazione a 3 x 105 cellule/mL. Allora, seed 1 mL di terreno sulla artificiale extracellulare rivestite con matrice piastra preparata al punto 4.2. e incubare per una notte a 37 ° C inferiore al 5% di CO2. Utilizzare un emocitometro per conteggiare il numero di cellule del tumore compreso unicellulari e pluricellulari mazzi (un gruppo di cellule aderenti) in sospensione delle cellule.
    Nota: 5% FCS è utilizzato per placare l'attività enzimatica residua della collagenosi in questo studio.
  4. Raccogliere con cura il terreno di coltura, tra cui le cellule che hanno staccato dalla artificiale piastra rivestite con matrice extracellulare, in un 1,5 mL di galleggiamento Centrifugare la provetta il giorno seguente ed e centrifugare a 1.400 x g per 5 min. Quindi, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 70 µ l di matrice extracellulare artificiale sul ghiaccio.
  5. Per aumentare la vitalità cellulare CRC, sovrapposizione di tumore delle cellule contenenti artificiale matrice extracellulare sul tumore organoid cellule fissato alla piastra di rivestite con matrice extracellulare artificiale ed incubare per 30 min in un 37 ° C, 5% CO2 incubatore a solidificare il rivestimento di matrice extracellulare artificiale. Quindi, viene quindi incubato con 1 mL di terreno di coltura cellulare organoid CRC con 1% FCS a 37 ° C inferiore 5% CO2.
  6. Cambiare il terreno di coltura ogni secondo giorno. Il CRC organoids riempire il mezzo, potrebbe essere necessario cambiare il mezzo ogni giorno.

5. generazione e arricchimento delle particelle lentivirali GFP

Procedure sperimentali per la generazione e l'arricchimento delle particelle lentivirali GFP (passo 5) sono descritti nella Figura 1.

  1. Cultura di HEK293T cellule con Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Media contenente 10% FCS e preparare sei piatti 10 cm (2 x 106 cellule per piatto) per la seguente procedura di trasfezione.
  2. Per la transfezione per ogni piatto, preparare 500 µ l della miscela tra cui 20 µ l di reagente di transfezione in DMEM con un PRRL-GFP vector (5 µ g)12 e due plasmidi lentivirali imballaggio, quali pCMV-VSV-G (1 µ g) e pCMV-dR8.2 dvpr (5 µ g), in una sterile mL 1,5 microprovetta. Mantenere la miscela a temperatura ambiente per 20 minuti e poi sovrapporre su ognuno dei piatti 10 cm e li Incubare per 18 h.
  3. Rimuovere il mezzo, aggiungere 5 mL di terreno di nuovo 10% FCS-RPMI 1640 ad ogni piatto e lasciare riposare per 24 h.
  4. Raccogliere il medium condizionato da ogni piatto in una provetta da centrifuga 50ml e memorizzare un totale di 30 mL di terreno a 4 ° C durante la notte. Aggiungere 5 mL della fresca RPMI 1640 su ogni piatto e lasciare riposare per 24 h.
  5. Raccogliere il medium condizionato da ogni piatto in una provetta da centrifuga 50ml e mantenere, in totale, 30 mL di terreno sul ghiaccio. Quindi, eliminare le celle.
  6. 60 mL di terreno (dal punto 5.4 – 5.5) filtrare su filtro da 0,45 µm per rimuovere le cellule e dividere questa quantità in dodici provette da centrifuga in polipropilene da 5 mL per ultracentrifugazione.
  7. Per concentrare il virus, centrifugare utilizzando un rotore oscillante (Vedi Tabella materiali) a 85.327 x g per 1,5 h a 4 ° C.
  8. Rimuovere immediatamente il mezzo. Per risolvere il pellet di virus concentrati, mettere 250 µ l di miscela di F-12 di nutrienti prosciutto (F12) / medium DMEM senza FCS in ognuno dei dodici tubi e mantenerlo durante la notte a 4 ° C. Si noti che il pellet di virus è spesso invisibile.
  9. Pipettare delicatamente il mezzo per raccogliere 3 mL di concentrato stock lentivirus della x GFP 5, in totale, di cui presumibilmente le particelle lentivirali GFP con 10 unità di trasduzione di8 ml (TU/mL). Quindi, è possibile memorizzare le microprovette da 1,5 mL dodici (tra cui 250 µ l per provetta) in condizioni sterili a-80 ° C per fino a un anno. Preparare tante piccole aliquote della soluzione originale per evitare più cicli di scongelamento freeze.

6. etichettatura delle cellule Organoid CRC con GFP particelle lentivirali coltivate sulla matrice extracellulare artificiale

Procedure sperimentali per l'etichettatura delle cellule di organoid CRC con lentivirus GFP (passaggio 6) sono descritti nella Figura 1.

  1. Consentire il CRC organoids preparata al punto 4.6 di crescere senza interferenze per 7 – 10 giorni e raccoglierle meccanicamente con una spatola sterile cella e poi trasferirli in una microprovetta 1,5 mL.
    Nota: La crescita dei organoids CRC nella cultura dipende dalla natura dei tumori originale dai pazienti. Evitare la crescita eccessiva dei organoids CRC, mantenendo loro confluenza di 60 – 70% prima del trasferimento a un rapporto di 1:2 divisione sul nuovo extracellulare artificiale rivestite con matrice 12-pozzetti piatto.
  2. Centrifugare la provetta per 3 min a 1.400 x g, rimuovere il terreno di coltura e risolvere il pellet cellulare in 500 µ l di PBS di picchiettando.
  3. Centrifugare la provetta per 3 min a 1.400 x g ed eliminare PBS.
  4. Per dissociare il organoids CRC aderente, aggiungere 500 µ l di una soluzione di distacco delle cellule di proteolitico e collagenolytic enzimi alla cella della pallina nel tubo e mescolano con un tocco delicato. Quindi, lasciare i tubi a stabilirsi per 10 min a temperatura ambiente.
  5. Pipettare molto delicatamente la sospensione cellulare con un ulteriori 500 µ l di 1% FCS-DMEM più volte in una microprovetta 1,5 mL circa dissociare le cellule. Generazione di cellule singole dalla organoids CRC pipettando duro riduce notevolmente la vitalità cellulare. Quindi, è essenziale per lasciare la massa delle cellule visivamente rilevabili in sospensione delle cellule pipettando delicatamente in una microprovetta 1,5 mL.
  6. Centrifugare la sospensione cellulare per 3 min a 1.400 x g e rimuovere il surnatante.
  7. Risolvere il pellet cellulare con una miscela della 100 µ l di brodo di lentivirus 5 x GFP (> 108 TU/mL) e 400 µ l di terreno di coltura organoid CRC in una microprovetta 1,5 mL di picchiettando per regolare ad una concentrazione di 5 x 105 dissociato le cellule del tumore a 500 µ l . Utilizzare un emocitometro per conteggiare il numero delle cellule del tumore, tra cui cellule singole e gruppi di cellule in sospensione delle cellule, come descritto in precedenza (punto 4.3).
  8. Preparare un artificiale extracellulare matrice 12-pozzetti lamiera verniciata, come descritto al punto 4.2. Quindi, posizionare 500 µ l di sospensione cellulare preparata al punto 6.7 sulla piastra e lasciarlo per 18 h a 37 ° C inferiore 5% CO2.
  9. Raccogliere il mezzo con le cellule flottante staccate dalla piastra rivestite con matrice extracellulare artificiale in una provetta di centrifugazione di 1,5 mL. E centrifugare a 1.400 x g e quindi rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 70 µ l di matrice extracellulare artificiale sul ghiaccio.
  10. Per aumentare la vitalità cellulare CRC, sovrapposizione tumore contenenti cellule artificiali matrice extracellulare sul tumore organoids fissato artificiale extracellulare rivestite con matrice 12-pozzetti la piastra, come descritto al punto 4.5. Successivamente, incubare la piastra per 30 min in un 37 ° C, 5% CO2 incubatore per solidificare il rivestimento di matrice extracellulare artificiale e cultura quindi di con 1 mL di terreno di coltura organoid CRC con 1% FCS a 37 ° C inferiore 5% CO2.
  11. Osservare le cellule in 3 giorni dopo l'infezione con un microscopio a fluorescenza per confermare la positività GFP a quasi 100% a causa dell'uso di un alto titolo di particelle lentivirali (Vedi Figura 2A).
  12. Per periodi di 7 – 10 giorni per espandere la crescita delle cellule prima dell'iniezione in topi destinatari della coltura il organoids CRC.

7. generazione di metastasi da CRC GFP-etichettata Organoids in topi destinatari

Procedure sperimentali per la generazione delle metastasi utilizzando la GFP-etichettata CRC organoids (passaggio 7) sono descritti nella Figura 1.

  1. Per dissociare il organoids CRC GFP-etichettata nella sospensione cellulare, raccoglierle meccanicamente con una spatola sterile cellulare e trasferirli in una microprovetta 1,5 mL, come descritto in precedenza (punto 6.1).
  2. Centrifugare la provetta per 3 min a 1.400 x g, rimuovere il terreno di coltura e risolvere il pellet cellulare in 500 µ l di PBS di picchiettando.
  3. Centrifugare la provetta per 3 min a 1.400 x g ed eliminare PBS.
  4. 500 µ l della soluzione di distacco delle cellule sul pellet e nel tubo di sovrapposizione e mescolarlo con un tocco delicato. Quindi, lasciare la condizione di miscela per 10 min a temperatura ambiente enzimaticamente dissociare l'aderente organoids CRC, come descritto in precedenza (punto 6.4).
  5. Pipettare molto delicatamente la sospensione cellulare con un ulteriori 500 µ l di 1% FCS-DMEM più volte in una microprovetta 1,5 mL circa di dissociare le cellule, come descritto in precedenza (punto 6.5). Generazione di cellule singole dalla organoids CRC pipettando duro riduce notevolmente la vitalità cellulare. Così, lascia la massa delle cellule visivamente rilevabili in sospensione delle cellule pipettando delicatamente in una microprovetta 1,5 mL.
  6. Centrifugare la sospensione cellulare per 3 min a 1.400 x g e rimuovere il surnatante.
  7. Per stabilire un modello murino di metastasi spontanea di CRC PDXs:
    1. Preparare una sospensione di cellule tra cui 5x105 cellule in 50 µ l di PBS con 50% matrice extracellulare artificiale per topo. Mantenere la sospensione sul ghiaccio prima dell'uso. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule tumorali, come indicato al punto 4.3.
    2. Anestetizzare un mouse con inalazione isoflurane utilizzando il dispositivo di anestesia per inalazione animale piccolo e disinfettare la pelle con etanolo al 70%, come indicato al punto 1.6.
    3. Posizionare il mouse NOG in posizione supina sul banco di laboratorio. Afferrare la mucosa rettale con pinzette sterili ed estrarlo delicatamente l'ano. Quindi, iniettare immediatamente la sospensione cellulare preparata al punto 7.7.1 nel submucosa rettale del mouse usando una siringa (dimensione dell'ago: 22 G). Ordinariamente, 4 – 6 topi per ogni gruppo sono utilizzati per valutare i risultati.
  8. Per stabilire un modello di metastasi sperimentale di CRC PDXs:
    1. Preparare una sospensione di cellule di organoid CRC compreso 4 x 104 cellule in 50 µ l di PBS per topo. Mantenere la sospensione sul ghiaccio prima dell'uso. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule tumorali (punto 4.3).
    2. Anestetizzare un mouse con inalazione isoflurane utilizzando il dispositivo di anestesia per inalazione animale piccolo e disinfettare la pelle con etanolo al 70%, come indicato al punto 1.6.
    3. Posizionare il mouse NOG anestetizzato in posizione prona su banco di laboratorio. Praticare una piccola incisione sulla parte inferiore del fianco sinistro e poi tagliare il peritoneo per esporre accuratamente la milza utilizzando pinzette e forbici sterili. Afferrare il tessuto grasso attaccato alla milza con pinzette sterili, quindi iniettare lentamente 50 µ l di sospensione cellulare (preparata come sopra, passo 8.1) nella milza. Essere certi che la sospensione cellulare viene iniettata in modo appropriato senza perdite verso l'esterno, dalla milza. Ordinariamente, 4 topi per ogni gruppo sono utilizzati per valutare i risultati.
  9. Posizionare tutti i topi su un pad caldo dopo l'intervento chirurgico e mantenere in posizione di decubito sternale fino al ripristino della coscienza sufficiente, come descritto al punto 1.11. Una volta che i topi hanno pienamente recuperato, restituirli alla loro casa gabbie. Per evitare la predazione, non consentono l'allevamento con animali non operati nella stessa gabbia.
  10. Controllare eventuali perdite di sutura e confermare che i topi sono vivi, nel gruppo trattato chirurgicamente, il giorno successivo. Controllare i topi per i segni di malattia e misura dimensioni del tumore, che impiegano pinze, in tutti i topi una volta a settimana.
  11. Osservare topi per rilevare metastasi sperimentale (1 mese) e la metastasi spontanea (per periodi fino a 2,5 mesi) dopo l'iniezione.
  12. Sacrificare i topi tramite anestesia e dislocazione cervicale nei giorni indicati. Sezionare i tumori primari e vari tessuti, compreso il fegato ed i polmoni. Posizionare i tumori dissecati ed organi in 5 mL di PBS ghiacciato su un 10cm di Petri e memorizzarli sul ghiaccio.
  13. Per rilevare le cellule GFP-positive CRC organoid, osservare i tessuti dissecati sotto un microscopio stereo-fluorescenza. Acquisire immagini con una telecamera CCD e preparare utilizzando il software di elaborazione dell'immagine standard.

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Representative Results

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Un adenocarcinoma colorettale primario diagnosticato come moderatamente differenziato era stato resecato chirurgicamente da una femmina di 76 anni con classificazione di TNM, Stadio IIIa, seguita da chemioterapia post-operatoria. Il primario CRC cellule immunohistochemically macchiato il positivo per l'antigene carcinoembryonic, Ki-67, vaschetta-cytokeratin e caderina. Pezzi del tumore resecato anche per via sottocutanea sono stati impiantati nei topi NOG per generare il modello PDX del colon. CRC organoid cellule poi sono state estratte per coltura tissutale dal PDX del colon che si era sviluppato per via sottocutanea in questi topi. Il CRC organoids erano capaci di costantemente formando aggregati multicellulari durante una serie di passaggi sulla matrice extracellulare artificiale. Come organoids tumore istologicamente e geneticamente riflettono la natura dei tumori primari da pazienti5,6, abbiamo cercato di sviluppare un modello di topo che avrebbe permesso la rilevazione in vivo di cellule CRC organoid con alta sensibilità durante la disseminazione metastatica. Per raggiungere questo obiettivo, CRC organoids sono stati infettati con lentivirus GFP, quindi con conseguente quasi tutti organoids risultati molto luminoso GFP (Figura 2A). Questi organoids erano poi iniettati orthotopically e intrasplenically nei topi NOG secondari prima della rilevazione delle cellule GFP-positive in organi distanti sotto un microscopio a fluorescenza. Abbiamo osservato la formazione di tumori primari di GFP-positivi presso il sito di orthotopic in tutti e quattro i topi esaminato (Figura 2B, sinistra). Inoltre, metastasi microscopiche sono state trovate nei polmoni dei topi di tre su quattro ha esaminati a 2,5 mesi dopo iniezioni di orthotopic (Figura 2B, medio). Inoltre, le metastasi del fegato sono state osservate in risposta all'iniezione intrasplenic in tutti i quattro topi esaminati a 1 mese dopo le iniezioni (Figura 2B, destra).

Presi insieme, questi risultati indicano che ad alta definizione GFP fluorescenza su cellule di organoid PDX-derivato CRC consente loro rilevazione micrometastases spontaneo sia in quelli sviluppati sperimentalmente, in organi distanti, quando introdotto nel destinatario topi. Il rilevamento ad alta sensibilità del diffondere CRC PDX-derivato organoids in vivo offre anche un modello versatile, non solo per studiare la biologia delle metastasi del tumore, ma anche per lo sviluppo di terapie mirate in ambito preclinico.

Figure 1
Figura 1: rappresentazione schematica della generazione delle metastasi dal PDX-derivato CRC organoids etichettati con lentivirus GFP in topi NOG. (A) impianto di piccoli pezzi di tessuto del CRC sottocute nei topi NOG (passaggio 1). Il tessuto CRC sezionato chirurgicamente dal paziente era tagliato a pezzetti e impiantato sottocute nei topi NOG. s.c.: l'impianto sottocutaneo. (B) generazione di CRC organoids dissociato da PDXs (passaggio 2 – 4). Xenotrapianti CRC sviluppati sono stata macinata (passaggio 2) e trasferito in una provetta da 15 mL contenente il terreno di coltura compreso collagenosi (passaggio 3). Dopo incubazione con agitazione lenta, la sospensione di cella CRC era filtrata (passaggio 3). Quindi, la sospensione cellulare organoid nel medium organoid CRC era seminata su una piastra rivestita con matrice extracellulare artificiale e incubata durante la notte in un incubatore a CO2 (passaggio 4). Le cellule di organoid CRC attaccate alla matrice extracellulare artificiale erano anche rivestite con ulteriore matrice extracellulare artificiale e incubate in un incubatore a CO2 (passaggio 4). s.c.: l'impianto sottocutaneo. (C) generazione di CRC organoids microlavorata in particelle lentivirali GFP prima che impiegano iniezione nei topi destinatari (passo 5 – 7). Le particelle lentivirali GFP sono state generate ad un alto titolo (passo 5). Il PDX-derivato CRC organoids cresciuta sulla matrice extracellulare artificiale direttamente sono state raccolte con un raschietto di cella e trasferito in una microprovetta (passaggio 6). Dopo centrifugazione, il pellet cellulare è stato risospeso in PBS. La sospensione cellulare è stata centrifugata e il pellet cellulare è stato dissociato. Quindi, la sospensione di eritrociti organoid CRC è stata incubata con stock di virus GFP nel terreno di coltura organoid CRC sulla piastra rivestite con matrice extracellulare artificiale durante la notte in un incubatore a CO2 (passaggio 6). Le cellule di organoid CRC attaccate alla matrice extracellulare artificiale erano rivestite con ulteriore matrice extracellulare artificiale e incubate in un incubatore a CO2 a solidificare il rivestimento di matrice extracellulare artificiale (passaggio 6). Il CRC organoids quindi sono state coltivate per periodi di 7 – 10 giorni per espandere la crescita delle cellule (passaggio 6). Per sviluppare un modello di metastasi spontanea, le cellule CRC dissociate organoid 5x105 etichettate con GFP sospeso in 50 µ l di PBS con 50% matrice extracellulare artificiale erano iniettate orthotopically nei topi NOG (passaggio 7). Per generare un modello sperimentale di metastasi, cellule di 4 x 104 CRC organoid etichettate con GFP in 50 µ l di PBS sono state iniettate intrasplenically nei topi NOG (passaggio 7). o.t.: iniezione di orthotopic, i.s.: iniezione intrasplenic. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: visualizzazione ad alta risoluzione di GFP rilevato coltivate GFP-etichettato CRC organoids, tumori primari e i micrometastases. (A) quasi 100% dei organoids CRC coltivate sono GFP positivo. Le immagini sono state catturate utilizzando un microscopio stereo-fluorescenza. Barra della scala = 250 µm. (B) GFP-positività nel tumore primario e micrometastasi nei polmoni e nel fegato. Sospensione delle cellule che esprimono GFP CRC organoid dissociata è stata iniettata nel submucosa rettale (o.t. inj.) dei topi NOG. La maggior parte delle cellule del tumore è indicata per essere positive per GFP nel tumore primario. Sono indicati anche i micrometastases GFP-positive colonizzando i polmoni (indicati da una freccia). Inoltre, vengono rilevati i micrometastases GFP-positive nel fegato (indicato da una freccia), quando la sospensione cellulare intrasplenically è stata iniettata (i.s. iniezione) in topi. Barra della scala = 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Anche se il modello di CRC PDX è stato ampiamente impiegato per studiare la crescita del tumore primario, se questo modello è applicabile anche ad indagare la metastasi del tumore non è ancora stato completamente delucidato. Le metastasi spontanee erano anche a mala pena rilevabile nel fegato e polmoni di vari segnalati del colon PDX modelli4,10. Per rilevare i micrometastases con alta sensibilità, abbiamo sviluppato un protocollo per trasdurre particelle lentivirali GFP in PDX-derivato CRC organoids prima del loro orthotopic e iniezioni endovenose in topi destinatari. Di nota, eravamo in grado di dimostrare che questo metodo consente di rivelazione altamente sensibile di CRC micrometastases organoid-derivato, sia formando spontaneamente e sperimentalmente, in organi distanti.

Fasi critiche all'interno del protocollo includono mantenendo la formazione della sferoide intatto senza induzione di anoikis sulla matrice extracellulare artificiale pipettando delicatamente il organoids CRC durante la serie passaging. La preparazione delle particelle lentivirali alto titolo concentrato mediante ultracentrifugazione è anche importante per il raggiungimento della positività GFP quasi il 100% di CRC organoids. Inoltre, si raccomanda che il CRC GFP-etichettata organoids essere iniettato entro 10 – 14 giorni in topi destinatari. Eccessivamente lunghi periodi per l'espansione dei organoids CRC dopo infezione possono favorire la selezione dei organoids che esprimono GFP debolmente.

L'iniezione di organoids CRC nel submucosa rettale dei topi NOG ha mostrato loro disseminazione metastatica nei polmoni, anche se non nel fegato, presumibilmente attraverso la vena cava inferiore. Per generare le metastasi del fegato spontaneamente, iniezione di CRC organoids in due punti con la laparotomia sarebbe richiesto13.

Nota che l'incidenza dei linfomi a cellule B è aumentato in occasione in topi immunodeficienti NOG impiantati con tessuti compreso i linfociti, infettati con oncovirus Epstein-Barr, da pazienti umani14. È quindi ragionevole a consigliare che se i tumori emergenti provengono dal CRC umano impiantato determinata eseguendo immunohistochemistry usando gli indicatori delle cellule CRC umani, quali l'antigene carcinoembryonic e il cytokeratin 20.

Come abbiamo studiato CRC organoids derivato da un solo paziente, più campioni da gran numero di pazienti avrebbero bisogno di essere esaminato per generalizzare i nostri risultati in futuro. Se l'impiantato PDX-derivato CRC organoids mostrano crescita minima presso il sito di orthotopic e raramente formare metastasi ai luoghi distanti, gli investigatori sono incoraggiati a considerare estrazione CRC organoids da diverse PDXs paziente-derivato.

La rivelazione altamente sensibile di GFP-etichettato micrometastasi raggiunto con questo metodo ci incoraggia non solo di approfondire diverse questioni irrisolte biologiche per quanto riguarda la transizione di micrometastasi al macrometastasis, formazione del stromal nicchia per l'acquisizione della resistenza ai farmaci, ma anche di valutare i efficacies di nuovi farmaci anti-cancro impiegando animali PDX-cuscinetto come modelli preclinici e colonizzazione metastatica.

La GFP FACS-ordinamento basato di vivere organoids CRC estratte da siti primari e distanti anche ha il potenziale per consentire singoli esami basati su cellule delle espressioni geniche, come pure i profili epigenetici e metabolomica, di un tumore. Tali risultati potrebbero portare alla delucidazione dei meccanismi molecolari alla base di disseminazione metastatica dei organoids CRC.

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Disclosures

Gli autori non hanno nessun potenziali conflitti di interesse a divulgare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal Juntendo University Young Investigator Award (2013, 2014 e 2015) per anni, il Joint Project Award (2013 e 2014) a K. M. e concede in aiuti per la ricerca scientifica dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e Tecnologia, Giappone (16K 15625 a K. Y. e 16K 15598 al Mahatma Gandhi). Siamo particolarmente grati a tutti i membri del dipartimento di chirurgia Coloproctological e patologia molecolare per utili discussioni e supporto tecnico. Ringraziamo anche Dr. Hiroyuki Konno (Hamamatsu University Schoolof Medicine) e Dr. Hideki Kitajima (Università internazionale di salute e benessere) per indicazioni tecniche generosa nelle procedure chirurgiche per l'impianto di orthotopic in topi e Dr. Yoshitaka Hippo (Chiba Cancer Center) per consigli tecnici su come eseguire la cultura di tumore organoid.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions
wound clips
2×10mm
Natsume manufacturing, Japan #C-21-S Autoclave before use
Hamilton syringe
needle size:22 gauge
Tokyo Science, Japan Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS.
6-well plate BMBio #92006
12-well plate BMBio #92412
15ml conical tube Sumitono Bakelite MS-57150
50ml conical tube Sumitomo Bakelite MS-57500
microtube Eppendorf #0030120086 Autoclave before use
Hemocytometer Erma #03-202-1
40μm cell strainer Corning #352340
Matrigel basement membrane matrix Corning #354234 Store aliqupts at -20°C.
Place on ice until use
Collagenase type 1 Sigma #C1030 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year
Accutase Innovate Cell Technologies #5V2623A Store at 4°C.
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ Gibco #10565018 Store at 4°C. Warm at 37°C before use
Cell banker 1plus ZENOAQ #628 Store at 4°C. Use within 1 month
Penicillin Gibco #15140122 Store at 4°C. Use within 1 month
Streptomycin Gibco #15140122 Store at 4°C. Use within 1 month
hEGF PEPROTECH #AF-100-15 Store at -20°C. Add to medium on same day as use
Y27632, a ROCK inhibitor Wako #253-00591 Store at -20°C. Add to medium on
same day as use
Culture medium Gibco DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin.
Store at 4°C. Use within 1 month.
CRC organoid culture medium
with 1% or 5% FCS
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor.
Store at 4°C. Use within 1 month.
the FuGENE 6 transfection regent Roche 11814 443001
Minisart 0.45 µm filter Sartorius stedim 17598-K
5 ml polypropylene centrifuge tubes Beckman Coulter 326819
PRRL-GFP vector Gift from Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-VSV-G Gift from Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvpr Gift from Dr. Robert A. Weinberg
the SW55Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter
a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope Zeiss

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Rilevamento ad alta sensibilità dei Micrometastases generati da GFP trasdotte Lentivirus Organoids coltivate da un tumore del Colon paziente-derivato
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Okazawa, Y., Mizukoshi, K., Koyama, Y., Okubo, S., Komiyama, H., Kojima, Y., Goto, M., Habu, S., Hino, O., Sakamoto, K., Orimo, A. High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor. J. Vis. Exp. (136), e57374, doi:10.3791/57374 (2018).More

Okazawa, Y., Mizukoshi, K., Koyama, Y., Okubo, S., Komiyama, H., Kojima, Y., Goto, M., Habu, S., Hino, O., Sakamoto, K., Orimo, A. High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor. J. Vis. Exp. (136), e57374, doi:10.3791/57374 (2018).

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