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Cancer Research

GFP レンチ ウイルス導入オルガノイド培養患者由来大腸腫瘍によって生成される微小の高感度検出

doi: 10.3791/57374 Published: June 14, 2018

Summary

CRC の PDX 由来器官毛細細胞に緑色蛍光タンパク質 (GFP) レンチ ウイルス粒子の効率的な伝達のためのプロトコルを示す本普及のひと大腸癌の高感度検出 (CRC) 細胞組織を植民地化をできるように、ステレオ蛍光顕微鏡による観察で、受信者のマウスに注入する前に。

Abstract

ひと大腸癌 (CRC) 治療の現在の進歩、にもかかわらずいくつかの根本的な治療法は、CRC の後期段階の効果的です。前臨床モデルとして老舗ひと癌細胞および腫瘍モデルが開発されている多くのトランスジェニック マウスを用いた腫瘍異種移植マウス モデルこの臨床の課題を克服。彼らは人間の癌の特徴を部分的に模倣が、ひと悪性腫瘍の浸潤・転移などの重要な側面を要約する失敗多くの場合。したがってより良い人間の crc の悪性進展を表す代替モデルが待望の。

本患者の解剖学的 CRC 小片の皮下注入による患者由来腫瘍異種移植片 (PDXs) の生成を紹介します。PDXs が開発し、病理組織学的患者に CRC のようなコロン。ただし、いくつかの自発的な微小は PDX モデルで影響を受ける臓器の断面を従来の検出です。遠隔臓器に転移普及の検出を容易にする文化でコロン PDXs から腫瘍における細胞を抽出し、高度免疫不全の合図/市-scid IL2Rγ への注入前に GFP レンチを使って感染null(NOG) マウス。注入がん PDX 派生 CRC 器官毛細細胞一貫してフォーム原発腫瘍陽性 GFP の受信者マウスで。また、gfp の植民地、特に蛍光顕微鏡による検出これらのマウスの肺に微小転移を自発的に開発。また、CRC オルガノイドの脾内注入はよく肝植民地化を生成します。一緒に取られて、これらの調査結果は、マルチ ステップ プロセス中に視覚的に検出する CRC の PDX の派生器官毛細細胞を GFP 標識呼ぶ転移カスケードを示します。記述されていたプロトコルには、人間の CRC の PDXs と GFP レンチ ウイルス粒子によって導入対応する CRC 器官毛細細胞の三次元培養の確立が含まれます。

Introduction

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大腸がん (CRC) は、がん死亡世界中1の 2 番目の主要な原因です。進行期疾患患者の慣習的な療法への不十分な応答では、Crc を根本的に治すための試みの非効率を示します。効果的な治療法を開発し、様々 な臨床癌のマウスモデル Crc の特徴を模倣するが設けられています。各種 CRC 細胞株は、その利便性と操作の容易さのため腫瘍異種移植片を生成するため広く使用されています。癌細胞の長期培養ただし、多くの場合それによって信頼性の低い成果と臨床薬で重要な制限の結果が特定のカルチャ条件下ではかなり増殖、一意のセルの人口の選択は、します。開発。

生体外で培養されることがなく患者由来腫瘍異種移植片 (PDXs) は患者2,3,4から解剖学的生体 CRC の動物モデルへの注入によっても生成されています。PDXs は、主要な病理組織学的特徴を概説として広く認識されて、遺伝子変異はもともと由来されていた患者の腫瘍の存在します。また、患者由来の腫瘍オルガノイド クラスターは密接に元の腫瘍5,6の生物学的特性を模倣する 3 D の条件の下で文化によって確立された腫瘍細胞から成り立っています。これらの腫瘍 organoids も高スループットの薬剤のスクリーニング、により設計された5パーソナライズされた治療法適用。ただし、著しく異種 CRC 集団が腫瘍内に存在すると見なされます質量。特定 CRC 集団が選択的に増殖し、PDX と腫瘍オルガノイドの通路の生体内および生体外でのシリーズの間にそれぞれ展開します。これもできる全体的な遺伝子発現プロファイルと変更は、影響を受ける Crc のエピ/遺伝的状態により親の crc 値が最小の類似に 。

患者由来 CRC organoids と非癌性のひと大腸発癌性突然変異の組み合わせは、ひと腫瘍細胞の浸潤・転移の特徴を調査するため採用されている港に設計から抽出したもの6,7,8,9。ただし、自然転移を生じた患者由来の CRC の同所性同種移植免疫不全マウスの非常に低い発生率困難になっているを含む転移の翼列の多段階の過程を研究するローカル侵略、intravasation、血流、血管外漏出および遠隔臓器4,10の植民地化で輸送。微小転移として 2 mm の腫瘍細胞の沈着によって表される、CRC オルガノイドの患者由来によって形成される、セクション マウスの実験モデルで影響を受ける臓器からの病理組織学的解析でしばしば見過ごされています。自発的な微小の可視化もされている最小限生体内で効率的に受信者のマウスに注入する前に腫瘍における細胞に蛍光マーカーを導入の難しさのため。本研究で我々 プロトコルを開発した受信者マウスへの注入の前に 3 D 培養 PDX 派生 CRC 器官毛細細胞に GFP のレンチ ウイルスを効率的に変換し、高感度検出のステレオ蛍光顕微鏡を用いた、異なるフォームの微小器官の植民地化。

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Protocol

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患者提供書面によるインフォームド コンセントとプロジェクトは、順天堂大学医学部の研究倫理委員会で承認されました。マウスの実験は、順天堂医学部の動物研究倫理委員会で承認されました。

1. 免疫不全マウスにおける CRC PDXs の確立

図 1 aに CRC PDXs (ステップ 1) を確立するための実験の手順のとおりです。

  1. 患者からすぐに、腫瘍の外科的切除後プライマリ CRC 組織を準備します。
  2. 洗浄穏やかな攪拌数回 30 mL の氷冷滅菌リン酸による主な CRC 組織 50 mL の円錐管に緩衝生理食塩水 (PBS) 氷の上保管してください。
  3. 滅菌ピンセットを使用して 10 cm シャーレにティッシュを置き、滅菌はさみを使用して可能な限り広範囲壊死部分を削除、一個 (サイズ 5 mm3 x 5 x 5) に腫瘍組織を切って滅菌のかみそりの刃を使用しています。
    注: 壊死部分は、白く、柔らかく、周辺地域よりももっと砕けやすい。
  4. 6 ウェル プレートに氷冷滅菌 PBS の 2 mL の滅菌ピンセットを用いた腫瘍の小片を置きます。
  5. 6 週齢 NOD/市-scid IL2Rγ null (NOG) 高度免疫不全マウス胚-無料特定病原体-無料条件下で繁殖します。
  6. 小動物吸入麻酔装置を用いたイソフルラン吸入とマウスを麻酔し、70% エタノールで皮膚を消毒します。通常の率と呼吸の深さと適切な anesthetization のつま先ピンチ反射の不在を保証します。目に獣医軟膏は、麻酔下で眼球の乾燥を防ぐため、オプションです。
  7. 乾熱滅菌を使用してすべての手術器具を滅菌して受信者マウスにおける創感染を防ぐためにすべてのプロシージャのためのこれらのツールを使用します。
  8. 研究室のベンチに腹臥位で麻酔下のマウスを置きます。滅菌はさみを使用して組織の移植への皮下ポケットを生成する受信者のマウスの右と左の側面の下の部分に小さな切開を行います。腹膜の膜を穿刺しないように注意してください。この手順を少し出血があるはずです。
  9. 優しくディップ上記は人工細胞外マトリックスの 50 μ L に腫瘍の断片を用意して、右と左皮下ポケットの下の部分に移植します。
  10. 傷の切開部を縫合は外科的処置を受けているマウスのクリップします。癌移植腫瘍組織が皮膚の下切開からいくつかの距離であることを確認します。
    注: に従って手術を最小限に抑え、手術後の痛みや感染症のための治療投与ない今回。
  11. 暖かいパッドの上にマウスを置くし、十分な意識が回復するまで胸骨側臥位を維持します。完全に回復し、4 本の脚に座ることが、マウスが彼らのホームのケージに返されます。捕食を防ぐためには、同じ檻の中の動物の非作動で繁殖できないようにします。
  12. 縫合漏れチェックし、マウスが安定した状態で外科的治療群で、次の日であることを確認します。病気の兆候をマウスをチェックし、キャリパーを採用、週に一度各マウスにおける腫瘍の大きさを測定します。

2. マウスから CRC PDXs の郭清

図 1 bに CRC PDXs (ステップ 2) の解剖の実験プロシージャのとおりです。

  1. 皮下のサイズは、通常約 1-3 ヶ月かかります 〜 1 cm3に成長する腫瘍を許可します。
  2. 小動物吸入麻酔装置を用いたイソフルラン吸入とマウスを麻酔し、70% エタノールで皮膚を消毒します。
  3. 研究室のベンチにうつ伏せにマウスを配置します。皮膚を切開、腫瘍を公開し、慎重に滅菌はさみを使用して腫瘍から皮膚をデタッチします。腫瘍を除去した後 10 cm シャーレの上に置き、腫瘍から任意のひどく壊死領域を削除、5 mL の PBS で 2 回すすいでください。
    注: 壊死部分は、白く、柔らかく、周辺地域よりももっと砕けやすい。
  4. 氷の上腫瘍を置き、4) 凍結と 1)、CRC 培養、2) 3) 病理セカンダリ マウスへの移植を含むさまざまなアプリケーションや腫瘍のフラグメントのストレージの少なくとも 4 つの部分にそれを均等に分割します。
    1. CRC オルガノイドの世代、1 mL の滅菌 PBS を含む 6 cm シャーレに腫瘍組織を配置します。(ステップ 3) を処理するまで氷の上のティッシュを維持します。
    2. 人間の CRC の PDX のモデルを確立するには、セカンダリ マウスに新鮮な CRC PDXs の通路します。小さな断片 (サイズは 5 mm3 x 5 x 5) に腫瘍組織を切断滅菌のかみそりの刃を使用し、優しく人工細胞外マトリックスの 50 μ L にこれらの組織片を浸し。1.8-1.11 の手順で説明するよう、NOG マウスの右と左皮下ポケットの下の部分にこれらの断片をインプラントします。
    3. 組織学的解析のため 2 日間室温で 15 mL の円錐管に 10% 中性緩衝ホルマリン 5 mL のサンプルを修正します。
    4. 凍結、小さな断片 (サイズは 5 mm3 x 5 x 5) に腫瘍組織を切断し、サンプルを浸し軽く凍結 1-1.5 mL クリオバイアル管内溶液セルを 500 μ l 添加します。その後、チューブを-80 ° C のフリーザーに転送します。

3、CRC 培養の細胞懸濁液に PDXs の抽出

図 1 bに CRC PDXs (ステップ 3) の解離過程の実験の手順のとおりです。

  1. 場所上記 (ステップ 2.4.1) 準備された腫瘍の 10 cm のシャーレの断片します。
  2. 滅菌のかみそりの刃を使用してフラグメントをミンチし、10% ウシ胎仔血清 (FCS) 8 mL を含む 15 mL の円錐管に転送-コラゲナーゼ酵素株式の 80 μ L でダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) (材料の表を参照してください)。
  3. チューブをしっかりと閉じるし、漏れを防ぐためにパラフィルムでキャップをラップします。細胞懸濁液にみじん切りにした腫瘍の断片を分離するには、37 ° C で 2 時間静かに攪拌します。まだあること、チューブに残って未消化の組織の多数のフラグメントに注意してください。
  4. 4 ° C で 5 分間 300 x gでチューブを遠心、上清を取り外します。10% の 10 mL を使用して細胞ペレットを解決する FCS-DMEM に細胞懸濁液を作る。
  5. 未消化組織破片を除去するために二度 50 mL の円錐管に設定 40 μ m セル ストレーナを使用して細胞懸濁液をフィルターします。フロースルー 4 ° C で 5 分間 300 × gで遠心分離します。上澄みを除去し、氷の上のペレットを維持します。

4. 人工細胞外マトリクス上で培養した CRC オルガノイドの生成

図 1 bの中のコロン PDXs (ステップ 4)、CRC 培養の実験プロシージャのとおりです。

  1. (テーブルの材料、「CRC organoid 培」参照) PDX 派生 CRC organoids に適した培を確立人間コロン organoids11前述のメディアを採用します。
  2. 人工細胞外マトリックスの 150 μ L を適用 (材料の表を参照してください) あたり 12 ウェル プレート氷の上にも、37 ° C、5% CO2インキュベーター、ジェルを固めるために 30-60 分の間孵化させなさいそれ。
  3. ステップ 3.5 から CRC organoid 培養液に (手順 4.1) から 3 × 105セル/mL に調整を達成するために 5% の FCS と細胞ペレットを中断します。その後、プレート上に人工細胞外マトリックス コート 4.2 の手順で作製した培地 1 mL をシードします。37 ° C 未満 5% で一晩インキュベートと CO2。細胞懸濁液に単細胞と多細胞クラスター (付着性のセルのグループ) を含む腫瘍細胞の数を数えて診断を使用します。
    注: この研究でコラゲナーゼの残存酵素活性をクエンチする 5% の FCS が使用されます。
  4. 慎重に培養液を収集し、次の日にチューブを遠心し、5 分 1,400 × gで遠心浮遊 1.5 mL に人工の細胞外マトリックス コート プレートからデタッチした細胞を含みます。上澄みを除去し、氷の上の人工細胞外マトリックスの 70 μ L で再ペレットを中断します。
  5. CRC 細胞生存率を高めるため腫瘍細胞を含む人工細胞外マトリックス腫瘍における細胞人工細胞外マトリクス コーティング プレートに取り付け、5% CO2インキュベーターを固めるため、37 ° C で 30 分間インキュベートにオーバーレイします。人工細胞外マトリクス コーティング。その後、孵化させなさいそれ 37 ° C で 1% の FCS と CRC 器官毛細細胞培養液の 1 ml 未満 5% CO2.
  6. すべての 2 日目培養培地を変更します。CRC オルガノイドを埋める媒体、媒体を毎日変更する必要なある可能性があります。

5 世代と GFP レンチ ウイルス粒子の濃縮

実験プロシージャの生成と GFP レンチ ウイルス粒子 (手順 5) の濃縮は、図 1のとおりです。

  1. ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 媒体含む 10 %fcs と HEK293T 細胞の培養と以下の導入手順 6 の 10 cm 皿 (皿あたり 2 x 10 の6セル) を準備します。
  2. 一皿 transfection のため準備 PRRL GFP ベクトル (5 μ g)12 DMEM でトランスフェクション試薬の 20 μ L と pCMV VSV G (1 μ g)、滅菌 1.5 mL で pCMV dR8.2 dvpr (5 μ g) など、2 つのレンチ ウイルス包装プラスミドを含む混合物の 500 μ Lマイクロ チューブ。20 分間室温で混合物を維持し、それぞれ 10 cm 皿の上にオーバーレイ 18 h のそれらを孵化させなさい。
  3. メディアを取り出して、それぞれの料理に新鮮な 10% FCS RPMI 1640 培地 5 mL を追加、24 時間立っているのままに。
  4. 各皿から 50 mL の遠心管に馴化培地を収集し、一晩 4 ° C で媒体の 30 mL の合計を格納します。それぞれの料理に新鮮な RPMI 1640 の 5 mL を追加し、24 h のために立つのまま。
  5. 50 mL の遠心管において氷の上媒体の合計、30 mL 各皿から馴化培地を収集します。その後、細胞を破棄します。
  6. セルを削除し、遠心の 12 の 5 mL ポリプロピレン製遠心管にこの量を分割 0.45 μ m のフィルターを通して (ステップ 5.4 から 5.5) から中の 60 mL をフィルターします。
  7. ウイルスを集中する遠心分離機のスイング バケツの回転子を使用して (材料表参照) 85,327 x g 4 ° C で 1.5 h で
  8. 培地をすぐに削除します。濃縮ウイルス ペレットを解決する栄養ハムの混合物 F-12 (F12) の 250 μ L/12 の各 FCS なし DMEM 培地管し、一晩 4 ° C でそれを維持します。ウイルス ペレットがしばしば表示されることに注意してください。
  9. 優しく集中 5 x GFP レンチ ウイルス株のおそらく 108変換単位 (TU/mL) と GFP レンチ ウイルス粒子を含む計 3 mL を収集するために媒体をピペットします。その後、-80 ° C、年までに無菌条件下で 12 1.5 mL のマイクロ チューブ (管あたり 250 μ L を含む) を保存します。複数の-の凍結融解のサイクルを避けるために元のソリューションの多くの小さい因数を準備します。

6. CRC 器官毛細細胞 GFP レンチ ウイルス粒子培養人工細胞外マトリックスへのラベリング

GFP レンチ ウイルス (手順 6) の CRC 器官毛細細胞をラベルの実験プロシージャは、図 1のとおりです。

  1. 4.6 7-10 日間の干渉なしで育つと機械的に無菌細胞スクレーパーを使用してそれらを収穫し、1.5 mL マイクロ チューブにそれらを転送する準備した CRC オルガノイドを許可します。
    注: CRC オルガノイド培養での成長は、患者から元の腫瘍の性質に依存します。新しい人工細胞外マトリックス コート 12 ウェル プレートに 1:2 の分割比率で転送する前に 60-70% の合流点でそれらを維持、CRC オルガノイドの増殖を回避します。
  2. 1,400 x gで 3 分のマイクロ チューブを遠心培養培地を削除し、穏やかな軽くたたくことによって 500 μ L の PBS で細胞ペレットを解決します。
  3. 1,400 x gで 3 分のマイクロ チューブを遠心し、PBS を除去します。
  4. 付着性 CRC オルガノイドを分離するには、蛋白の細胞剥離溶液を 500 μ l 添加とコラーゲン分解酵素のセルにチューブのペレットし穏やかな軽くたたくことによってミックスします。その後、室温で 10 分間のために解決する管を残します。
  5. 非常に優しく 1% の追加の 500 μ L で細胞懸濁液をピペット約セルを分離するに 1.5 mL のマイクロ チューブに数回 FCS DMEM。過酷なピペッティングによる CRC organoids から単一細胞の細胞生存率を著しく軽減します。したがって、1.5 mL マイクロ チューブに分注非常に穏やかで視覚的に細胞懸濁液中に検出の細胞塊のままに不可欠です。
  6. 1,400 x gで 3 分の細胞懸濁液を遠心分離し、上清を削除します。
  7. 5 x GFP レンチ ウイルス ストックの 100 μ L の混合物と細胞ペレットを解決 (> 108 TU/mL) と 400 μ L 5 x 10 の5の濃度を調整する穏やかな軽くたたくことによって 1.5 mL マイクロ チューブに CRC organoid 培養液 500 μ L あたり腫瘍細胞.(ステップ 4.3) 上記細胞懸濁液、単一セル、セルのグループを含む腫瘍細胞の数を数えて診断を使用します。
  8. 4.2 の手順で説明されているように、人工細胞外マトリックス コート 12 ウェル プレートを準備します。手順 6.7 プレート上で作製した細胞懸濁液 500 μ L を配置し、それを残す 37 ° C で 18 時間未満 5% CO2
  9. 1.5 mL 遠心チューブに人工細胞外マトリクス コーティング プレートから分離浮遊細胞の培地を収集します。1,400 × gで遠心、上清を除去し、氷の上の人工細胞外マトリックスの 70 μ L でペレットを再停止します。
  10. CRC 細胞生存率を上げるには、4.5 の手順で説明するよう腫瘍細胞を含む人工細胞外マトリックスに人工細胞外マトリックス コート 12 ウェル プレートに接続されている腫瘍オルガノイドをオーバーレイします。次に、人工細胞外マトリクス コーティングを固めるし、文化それ 37 ° C で 1% の FCS と CRC organoid 培養液 1 ml 未満 5% 5% CO2インキュベーター、37 ° C で 30 分間プレートをインキュベート CO2
  11. (図 2 a参照) レンチ ウイルス粒子の高価の使用によるほぼ 100 %gfp 陽性を確認する蛍光顕微鏡下で感染 3 日後の細胞を観察します。
  12. 受信者のマウスへの注入の前に細胞の成長を拡大する 7-10 日間の期間の CRC オルガノイドの文化.

7. 受信者マウスにおける GFP 標識 CRC Organoids で転移の世代

GFP 標識 CRC organoids (ステップ 7) を使用して転移の発生の実験プロシージャの図 1のとおりです。

  1. 細胞懸濁液に GFP 標識 CRC オルガノイドを分離するに機械的に無菌細胞スクレーパーを使用してそれらを収穫し、(ステップ 6.1) 上記 1.5 mL のマイクロ チューブにそれらを転送します。
  2. 1,400 x gで 3 分のマイクロ チューブを遠心培養培地を削除し、穏やかな軽くたたくことによって 500 μ L の PBS で細胞ペレットを解決します。
  3. 1,400 x gで 3 分のマイクロ チューブを遠心し、PBS を除去します。
  4. 管内細胞ペレットに細胞剥離液 500 μ L をオーバーレイし、穏やかなタップでそれをミックスします。(手順 6.4) 上記のよう、酵素によって付着性 CRC オルガノイドを分離する室温で 10 分間混合発色を残します。
  5. 非常に優しく 1% の追加の 500 μ L で細胞懸濁液をピペット (ステップ 6.5) 上記約細胞を分離するに 1.5 mL のマイクロ チューブに数回 FCS DMEM。過酷なピペッティングによる CRC organoids から単一細胞の細胞生存率を著しく軽減します。1.5 mL マイクロ チューブに分注非常に穏やかで視覚的に細胞懸濁液中に検出の細胞塊をしたがって、残します。
  6. 1,400 x g で 3 分の細胞懸濁液を遠心分離し、上清を削除します。
  7. CRC PDXs の自然転移マウスモデルを確立。
    1. マウスあたり 50% 人工細胞外マトリックスで 50 μ L の PBS で 5 x 10 の5セルを含む細胞懸濁液を準備します。使用する前に氷の懸濁液を維持します。4.3 の手順で示されているように、癌細胞をカウントするため、検定を使用します。
    2. 小動物吸入麻酔装置を用いたイソフルラン吸入とマウスを麻酔し、1.6 の手順で示されているように、70% エタノールで皮膚を消毒します。
    3. 研究室のベンチに仰臥位で NOG マウスを置きます。滅菌ピンセットで直腸粘膜をつかみ、そっと肛門から引き出します。その後、すぐに細胞懸濁液の注射器を使ってマウスの直腸粘膜下にステップ 7.7.1 で準備を注入 (針のサイズ: 22 G)。日常的に、グループあたり 4-6 マウスは、結果を評価する使用されます。
  8. CRC PDXs の実験的転移モデルの確立。
    1. CRC 器官毛細細胞懸濁液マウスあたり 50 μ L の PBS の 4 x 10 の4セルなどを準備します。使用する前に氷の懸濁液を維持します。がん細胞 (ステップ 4.3) をカウントするため、検定を使用します。
    2. 小動物吸入麻酔装置を用いたイソフルラン吸入とマウスを麻酔し、1.6 の手順で示されているように、70% エタノールで皮膚を消毒します。
    3. 研究室のベンチに腹臥位で麻酔の NOG マウスを置きます。左のわき腹の下の部分に小さな切開を行い、慎重に滅菌はさみとピンセットを使用して脾臓を公開する腹膜を切ってください。滅菌ピンセットで脾臓に付着した脂肪組織を把握し、ゆっくりと脾臓に細胞懸濁液 (準備ステップ 8.1 では上記のように、) の 50 μ L を注入します。特定の細胞懸濁液を脾臓からの外側への漏洩をせず適切に注入します。日常的に、グループごとの 4 匹は、結果を評価する使用されます。
  9. 手術後暖かいパッドのすべてのマウスを置き、1.11 の手順で説明するように十分な意識が回復するまで胸骨側臥位で維持します。マウスは完全に回復して、一度ホーム檻に戻します。捕食を防ぐためには、同じ檻の中の動物の非作動で繁殖できないようにします。
  10. 縫合の漏れを確認し、次の日、マウスが生きている、外科的治療群であることを確認します。週に一度のすべてのマウスで、キャリパーを採用、病気と対策の腫瘍サイズの印をマウスを確認してください。
  11. 注入後 (2.5 ヶ月間の期間) の自然転移と実験転移 (1 ヶ月) を検出するマウスを観察します。
  12. 麻酔と示された日に頚部転位を介してマウスを犠牲に。原発腫瘍や肝臓、肺など様々 な組織を解剖します。5 mL の 10 cm シャーレに氷冷 PBS に切り裂かれた腫瘍と臓器を配置し、氷の上保管します。
  13. GFP 陽性 CRC 器官毛細細胞を検出するためには、ステレオ蛍光顕微鏡下で切り裂かれたティッシュを観察します。CCD カメラで画像を取得し、標準的な画像処理ソフトウェアを使用して準備します。

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Representative Results

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中分化と診断された大腸癌は、TNM 分類、ステージ IIIa、術後化学療法で 76 歳女性から外科切除されていた。プライマリ CRC 細胞免疫組織化学的染色陽性癌胎児性抗原、Ki 67、汎サイトケラチン、E-カドヘリン。腫瘍の部分はまた皮下コロン PDX モデルを生成する NOG マウスに移植されました。CRC 器官毛細細胞はこれらのマウスの皮下に成長したコロン PDX から培養し抽出されました。CRC organoids 一貫して人工細胞外マトリックスへの通路のシリーズの間に多細胞のクラスターの形成が可能であった。感度が高い CRC 器官毛細細胞の生体内で検出できるマウス モデルの開発を試みた腫瘍 organoids 組織学的および遺伝的患者5,6から原発腫瘍の性質を反映して、中に転移の普及。この目標を達成するために CRC organoids は GFP レンチ ウイルス、それによって非常に明るい GFP (図 2 a) を示すほぼすべてオルガノイドの結果に感染していた。これら organoids いたがんを注入し、蛍光顕微鏡下で遠隔臓器に GFP 陽性細胞の検出前にセカンダリの NOG マウスに intrasplenically。(図 2 b、左) を検討したすべての 4 マウスの同所性同種サイトで GFP 陽性原発性腫瘍の形成を観察した.また、同所性同種注射 (図 2 b,中央) 後 2.5 ヶ月で 4 人のうち 3 マウスの肺に微小転移が見つかりました。さらに、脾内注入 (図 2 b右) 注射後 1 ヶ月で検討したすべての 4 つのマウスへの応答で肝転移を認めた.

一緒に取られて、これらの調査結果示す CRC の PDX 由来器官毛細細胞の高解像度の GFP 蛍光の自発的微小と受信者に導入されたときに遠く離れた臓器に実験的に開発されたもので、検出できます。マウス.普及 PDX 派生 CRC オルガノイドの生体内でこの高感度検出は、腫瘍転移の生物学を勉強するためのみならず、臨床設定で目標とされた療法を開発するための汎用的なモデルを提供しています。

Figure 1
図 1: NOG マウスで GFP レンチ ウイルスの付いた PDX 派生 CRC organoids で転移の生成の概略図(A)注入 CRC 組織の小片の皮下 NOG マウス (ステップ 1)。患者から解剖学的 CRC 組織は、粉々 にカットされ、NOG マウスに皮下注入します。サウスカロライナ: 皮下注入。(B) CRC 生成 organoids PDXs (ステップ 2-4) から分離しました。開発された CRC 異種移植片みじん切り (手順 2)、コラゲナーゼ (ステップ 3) を含む培養液を含む 15 mL チューブに転送。低速攪拌の後、CRC 細胞懸濁液はフィルター (ステップ 3) をだった。その後、CRC organoid 中器官毛細細胞懸濁液だった人工細胞外マトリクス コーティング プレート上にシードし、CO2インキュベーター (ステップ 4) で夜通し孵化します。人工細胞外マトリクスに接続されている CRC 器官毛細細胞も追加の人工細胞外マトリックスでコーティングされ CO2インキュベーター (ステップ 4) で培養しました。サウスカロライナ: 皮下注入。(C) CRC 生成 organoids 受信者マウス (ステップ 5-7) 注入を採用する前にレンチ ウイルス粒子を GFP で導入します。高価 (手順 5) では、GFP のレンチ ウイルス粒子が生成されます。人工細胞外マトリクス上に成長した CRC の PDX 派生 organoids 直接細胞スクレーパーで収穫されマイクロ チューブ (手順 6) に転送。遠心分離の後、細胞ペレットは PBS に再懸濁。細胞懸濁液が遠心分離し、細胞ペレットは分離しました。次いで、CRC 器官毛細細胞懸濁液は, CO2インキュベーター (手順 6) で一晩人工細胞外マトリクス コーティング プレートに CRC organoid 培地の GFP ウイルス ストック。人工細胞外マトリクスに接続されている CRC 器官毛細細胞追加人工細胞外マトリックスでコーティング, 人工細胞外マトリクス コーティング (手順 6) を固めるため CO2インキュベーターで孵化します。CRC オルガノイド培養、細胞増殖 (手順 6) を展開する 7-10 日間の期間。自然転移モデルを開発するには、解離 5 x 105 CRC 器官毛細細胞 50% 人工細胞外マトリックスで 50 μ L の PBS で中断 GFP でラベル付けは NOG マウス (ステップ 7) にがんを注入しました。実験的転移モデルを生成するには、4 x 104 CRC 器官毛細細胞 50 μ L の PBS で GFP でラベル付けは NOG マウス (ステップ 7) に intrasplenically 注入しました。旧約: 同所性同種注入インフォメーションシス テムズ: 脾内注入。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: GFP 高分解能可視化で検出された培養 GFP 標識 CRC organoids、原発腫瘍と微小。(A)ほぼ培養 CRC オルガノイドの 100% が GFP 陽性。画像は、ステレオ蛍光顕微鏡を用いて捕獲されました。スケール バー = 250 μ m。 (B)原発腫瘍と肺と肝臓の微小 GFP 陽性。解離の gfp 発現する CRC 器官毛細細胞懸濁液は、NOG マウスの直腸粘膜 (旧約サンプラジュ) に注入されました。腫瘍細胞の大半が原発の腫瘍で GFP 陽性と表示されます。GFP 陽性微小肺 (矢印で示されます) を植民地化も示されます。肝臓 (矢印によって示されます)、また、GFP 陽性微小が検出されたとき細胞懸濁液では、マウスに (インフォメーションシス テムズ サンプラジュ) が注入された intrasplenically。スケール バー = 500 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

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原発腫瘍の成長を研究する CRC PDX モデルが広く採用されているがこのモデルがまた腫瘍の転移を調査対象かどうかはまだ解明されていない完全に。自発転移は肝臓や肺の様々 な報告された PDX コロン モデル4,10でかろうじて検出可能も。微小を高感度に検出、PDX 派生 CRC オルガノイドの同所性同種および受信者マウスに静脈注射する前に GFP レンチ ウイルス粒子を伝達するためのプロトコルを開発しました。注記のうち、ことができましたこのメソッドにより、CRC organoid 由来微小の高感度検出を遠く離れた臓器に自発的に実験的に、両方を加工します。

Passaging シリーズの間に CRC オルガノイドを軽くピペッティングしてアノイーキス人工細胞外マトリックスへの誘導することがなくそのままスフェロイドの形成を維持するプロトコルの中で重要なステップが含まれます。遠心によって濃縮高価レンチ ウイルス粒子の調製もほぼ 100 %gfp 陽性の CRC organoids.を達成するために重要です。また、GFP 標識 CRC organoids 受信者マウス 10 – 14 日以内注入されることをお勧めします。感染後 CRC オルガノイドの拡張のための過度に長い期間弱 gfp 発現するオルガノイドの選択を支持する可能性があります。

CRC オルガノイドの NOG マウスの直腸の粘膜下への注入は下大静脈を介して、肝臓にも肺に転移性の普及を示した。肝転移を自発的に生成するには、開腹手術と大腸に CRC オルガノイドの注入は必要な13になります。

B 細胞リンパ腫の発生率が人間の患者14からのエプスタイン バール oncovirus に感染しているリンパ球を含む組織注入 NOG マウスで機会に増加することに注意してください。したがって、ことは癌胎児性抗原などサイトケラチン 20 の人間 CRC セル マーカーを用いた免疫組織化学を実行することによって決定される新たな腫瘍が注入された人間 CRC に属すかどうかをお勧めするが妥当です。

1 つだけ患者から派生した CRC オルガノイドを調べた、患者数より多くのサンプル、将来的に我々 の調査結果を一般化する検討する必要があります。場合は植え付けられた PDX 派生 CRC organoids 表示同所性同種サイトで最低限の成長とほとんどフォーム遠隔部位に転移捜査官別患者由来の PDXs から CRC オルガノイドの抽出を検討することをお勧めします。

この方法で達成される GFP 標識微小転移の検出感度は macrometastasis、形成、間質への微小転移の移行に関するいくつかの未解決生物の問題をさらに調査するだけではなく私たちを奨励します。転移の植民地化および前臨床モデルとして PDX 軸受け動物を用いた新規抗悪性腫瘍薬の効能を評価にも薬剤耐性の獲得のためのニッチ。

GFP 基づかせていた FACS-並べ替え生活のプライマリおよび遠いサイトから抽出した CRC organoids 腫瘍のエピジェネティックなとメタボロームのプロファイルと同様に、遺伝子発現の単一細胞を用いた試験を許可する可能性があります。このような結果は、CRC オルガノイドの転移普及の基礎となる分子メカニズムの解明にも可能性があります。

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Disclosures

著者はある潜在的な利益相反を開示します。

Acknowledgments

この作品、順天堂大学若手研究者賞 (2013、2014、2015) y. o.、K. M. に共同プロジェクト受賞 (2013、2014) によって支えられた、教育省、文化、スポーツ、科学研究のための援助を与えると技術、日本 (Y ・ K に 16 K 15625 と m. g. に 16 K 15598)。特に有益な議論と技術サポート Coloproctological 外科、分子病理のすべてのメンバーに感謝しています。我々 はまたマウスと Dr に同所性同種移植の手術の技術ガイダンスについて寛大な今野弘之博士 (浜松大学医学部) と博士秀樹北島 (国際医療大学・福祉) をありがとうございます。孝カバ (千葉県がんセンター)、腫瘍培養の実行に関する技術的なアドバイスをします。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions
wound clips
2×10mm
Natsume manufacturing, Japan #C-21-S Autoclave before use
Hamilton syringe
needle size:22 gauge
Tokyo Science, Japan Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS.
6-well plate BMBio #92006
12-well plate BMBio #92412
15ml conical tube Sumitono Bakelite MS-57150
50ml conical tube Sumitomo Bakelite MS-57500
microtube Eppendorf #0030120086 Autoclave before use
Hemocytometer Erma #03-202-1
40μm cell strainer Corning #352340
Matrigel basement membrane matrix Corning #354234 Store aliqupts at -20°C.
Place on ice until use
Collagenase type 1 Sigma #C1030 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year
Accutase Innovate Cell Technologies #5V2623A Store at 4°C.
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ Gibco #10565018 Store at 4°C. Warm at 37°C before use
Cell banker 1plus ZENOAQ #628 Store at 4°C. Use within 1 month
Penicillin Gibco #15140122 Store at 4°C. Use within 1 month
Streptomycin Gibco #15140122 Store at 4°C. Use within 1 month
hEGF PEPROTECH #AF-100-15 Store at -20°C. Add to medium on same day as use
Y27632, a ROCK inhibitor Wako #253-00591 Store at -20°C. Add to medium on
same day as use
Culture medium Gibco DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin.
Store at 4°C. Use within 1 month.
CRC organoid culture medium
with 1% or 5% FCS
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor.
Store at 4°C. Use within 1 month.
the FuGENE 6 transfection regent Roche 11814 443001
Minisart 0.45 µm filter Sartorius stedim 17598-K
5 ml polypropylene centrifuge tubes Beckman Coulter 326819
PRRL-GFP vector Gift from Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-VSV-G Gift from Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvpr Gift from Dr. Robert A. Weinberg
the SW55Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter
a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope Zeiss

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References

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GFP レンチ ウイルス導入オルガノイド培養患者由来大腸腫瘍によって生成される微小の高感度検出
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Okazawa, Y., Mizukoshi, K., Koyama, Y., Okubo, S., Komiyama, H., Kojima, Y., Goto, M., Habu, S., Hino, O., Sakamoto, K., Orimo, A. High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor. J. Vis. Exp. (136), e57374, doi:10.3791/57374 (2018).More

Okazawa, Y., Mizukoshi, K., Koyama, Y., Okubo, S., Komiyama, H., Kojima, Y., Goto, M., Habu, S., Hino, O., Sakamoto, K., Orimo, A. High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor. J. Vis. Exp. (136), e57374, doi:10.3791/57374 (2018).

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