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Cancer Research

GFP Lentivirus 불리고 Organoids 환자 파생 결 장 종양에서 경작에 의해 생성 된 Micrometastases의 고감도 검출

doi: 10.3791/57374 Published: June 14, 2018

Summary

있도록 매우 민감한 탐지 목표 인간의 대 장 암 (CRC) 세포 조직 정착, 우리 여기 PDX 파생 CRC organoid 셀에 녹색 형광 단백질 (GFP) lentiviral 입자의 효율적인 변환에 대 한 프로토콜을 표시 스테레오-형광 현미경 관찰 받는 쥐로 그들의 주입에의 사전

Abstract

인간의 대 장 암 (CRC) 치료에 현재 진보에도 불구 하 고 몇 가지 근본적인 치료는 CRC의 늦은 단계에 대 한 효과적입니다. 전 임상 모델으로 오래 된 인간의 암 세포 선 및 종양 모델 개발 되었습니다 많은 유전자 변형 마우스를 사용 하 여 종양이 종이 식 마우스 모델이 임상 문제를 극복 한다 그들은 부분적으로 인간의 carcinomas의 기능을 모방 하지만 종종 내 습 및 전이 포함 하 여 인간 악성의 주요 측면 정리를 하지. 따라서, 더 나은 인간 CRC에 악성 진행을 대표 하는 대체 모델은 오랫동안 기다려온 되었습니다.

우리는 여기 작은 CRC 조각 수술 환자에서 해 부의 피하 주입에 의해 종양 환자 파생 xenografts (PDXs)의 생성을 보여줍니다. 콜론 PDXs 개발 하 고 histopathologically 환자에 CRC를 닮은. 그러나, 몇 가지 자연 micrometastases는 PDX 모델에 영향을 받는 먼 기관의 기존 횡단면에서 감지. 먼 장기에 전이성 보급의 탐지를 촉진 하기 위하여 우리는 문화에서 콜론 PDXs에서 종양 organoid 세포를 추출 하 고 GFP lentivirus 매우 immunodeficient 끄 덕/시-scid IL2Rγ에 주입 하기 전에 그들을 감염null (노 그) 쥐. Orthotopically 주입 PDX 파생 CRC organoid 세포 지속적으로 양식 기본 종양 긍정적인 GFP에 대 한 받는 사람 쥐에서. 또한, 자발적으로 식민지 GFP 표현 특히 형광 현미경 검사 법에 의해 이러한 쥐의 폐에서 감지 micrometastatic 개발. 또한, CRC organoids의 intrasplenic 주입 자주 간 식민지를 생성합니다. 함께 찍은, 이러한 결과 다단계 프로세스 동안 시각적으로 감지 되도록 PDX 파생 CRC organoid 셀 GFP 표시 되 나 침공 전이 캐스케이드 나타냅니다. 설명된 프로토콜 GFP lentiviral 입자에 의해 불리고 해당 CRC organoid 셀의 3D 문화와 인간의 CRC의 PDXs의 설립을 포함 한다.

Introduction

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대 장 암 (CRC)은 암 사망 세계1의 두 번째 주요 원인. 고급 단계 질병을 가진 환자의 일반적인 치료에 부족 한 응답 CRCs를 근본적으로 치료 하는 시도의 무효를 나타냅니다. 더 효과적인 치료 접근을 개발 하기 위해 Crc의 특성을 모방 하는 암의 다양 한 전 임상 마우스 모델 설립 되었습니다. 다양 한 CRC 셀 라인 생성 종양 xenografts 그들의 편 및 조작의 용이성 때문에 널리 사용 되어 왔습니다. 그러나, 암 세포 선의 장기 문화는 다양 한 독특한 세포 인구 꽤 특정 문화 조건 하에서 증식을 함으로써 신뢰할 수 없는 결과 및 전 임상 약에서 중요 한 제한의 결과로 종종 발생 개발입니다.

되지 않고 교양 생체 외에서, 종양 환자 파생 xenografts (PDXs) 또한 인간의 CRC 조직 수술 환자2,,34에서 해 부의 동물 모델에 이식 하 여 생성 된. PDXs는 업과 주요 histopathological 기능으로 널리 인식 되 고 유전 변경 원래에서 파생 된 환자의 종양에 존재. 또한, 종양 환자에서 파생 된 organoids 구성 종양 세포 클러스터 밀접 하 게 원래 종양5,6의 생물 학적 속성을 유사 3D 조건 문화에 의해 설립 되었다. 이러한 종양 organoids 또한 설계5맞춤된 치료를 함으로써 높은 처리량 마약 검사에 적용 했다. 그러나, 현저 하 게 다른 유형의 CRC 인구 간주 됩니다 종양 내의 질량. 특정 CRC 인구 수 선택적으로 증식 한 PDX와 종양 organoids의 구절의 vivo에서 그리고 생체 외에서 시리즈 중 각각 확장 합니다. 이 또한 수 있습니다 전체 진 식 프로필과 피/유전 상태를 변경 하려면 영향을 받는 CRCs의 그로 인하여 부모의 CRC에 최소한의 닮 았에서 결과.

환자에서 파생 된 CRC organoids와 noncancerous 인간 결 장 종양 돌연변이의 조합 또한 종양 침입과 전이 에 의해 궁 행 하는 인간의 종양 세포의 특징을 조사 하기 위해 고용 되었습니다 하버 설계에서 추출 6,7,,89. 그러나, immunodeficient 쥐로 orthotopic 이식 환자에서 파생 된 CRC에서에서 발생 하는 자연 스러운 전이의 발생률이 매우 낮은 했다 포함 하는 침략 전이 캐스케이드의 다단계 과정을 공부 하기 어려운 지역 내 습, intravasation, 혈 류, 넘쳐 흐름 및 먼 장기4,10의 식민지에서 전송. Micrometastasis로 ≤2 m m의 종양 세포 증 착에 의해 표현, CRC organoids 환자에서 파생 된에 의해 형성 된, 실험 마우스 모델에 영향을 받는 먼 장기에서 섹션의 histopathological 분석에 간과. 자연 스러운 micrometastases의 시각화 최소한의 비보에 효율적으로 받는 쥐로 그들의 주입 전에 종양 organoid 세포에 형광 마커를 도입의 어려움으로 인해 되었습니다. 이 연구에서 우리가 개발을 효율적으로 PDX 파생 CRC organoid 셀 받는 쥐로 주입에 앞서 3D 문화에 GFP lentivirus transduce 매우 민감한 탐지를 허용 하는 프로토콜의 스테레오-형광 현미경 검사 법, 고용 그들의 양식 micrometastases에 다른 장기 식민지

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Protocol

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환자 서 면된 동의 제공 하 고 프로젝트 준 텐도 대학의 학부의 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 마우스 실험 동물 연구 윤리 위원회의 준 텐도 학부의에 의해 또한 승인 되었다.

1. Immunodeficient 마우스에 CRC PDXs의 설립

CRC PDXs (1 단계) 구축을 위한 실험적인 절차 그림 1A에 설명 되어 있습니다.

  1. 환자에서 종양의 외과 절제술 후 즉시 기본 CRC 티슈를 준비 합니다.
  2. 워시 차가운 멸 균 인산 염의 30 mL에 여러 번 부드러운 동요에 의해 기본 CRC 조직 50 mL 원뿔 튜브에 식 염 수 (PBS)를 버퍼링 되 고 얼음에 그것을 유지.
  3. 조직에 멸 균 핀셋을 사용 하 여 10 cm 배양 접시, 회 저 성 영역을 광범위 하 게 가능한 멸 균가 위를 사용 하 여 제거 놓고 작은 조각 (크기에서 5 m m3 x 5 x 5) 고체 종양 조직을 잘라 살 균 면도날을 사용 하 여.
    참고: 회 저 성 영역은 종종 하얀, 부드럽고 주변 지역 보다 더 어렵다면입니다.
  4. 6-잘 접시에 얼음 처럼 차가운 살 균 PBS의 2 개 mL의 멸 균 핀셋을 사용 하 여 종양의 작은 조각을 놓으십시오.
  5. 6 주 오래 끄 덕/시-scid IL2Rγ null (노 그) 높은 immunodeficient 마우스 세균-무료 및 특정 병원 체-무료 조건 하에서 번 식.
  6. 쥐와 isoflurane 흡입 작은 동물 흡입 마 취 장치를 사용 하 여 anesthetize 하 고 70% 에탄올으로 피부를 소독. 정상적인 속도 호흡의 깊이 적절 한 anesthetization에 대 한 발가락 핀치 반사의 부재를 보장. 눈에 수 의사 연 고 마 취에서 안구 건조를 방지 하는 옵션입니다.
  7. 건 열 살 균을 사용 하 여 모든 수술 도구를 소독 하 고 모든 절차에 대 한 이러한 도구를 사용 하 여 받는 사람 마우스에 상처 감염을 방지 하기 위해.
  8. 실험실 벤치에 발생 하기 쉬운 위치에 마 취 마우스를 놓습니다. 살 균가 위를 사용 하 여 조직 이식에 대 한 피하 주머니를 생성 하는 받는 사람 마우스의 오른쪽과 왼쪽 측면의 하단 부분에 작은 절 개를 확인 합니다. 알아서 하지 찔린 복 막. 이 절차와 함께 작은 출혈 이어야 한다.
  9. 부드럽게 위의 인공 세포 외 매트릭스의 50 µ L로 종양 조각 준비와 다음 오른쪽과 왼쪽 피하 주머니의 하단 부분에 그들을 이식.
  10. 봉합 상처 절 개 수술 절차를 겪고 쥐 클립. 이식된 종양 조직을 피부 절 개에서 어떤 거리에 위치 하는 것을 확인 하십시오.
    참고: 수술 절차를 최소화 하는 것에 따라 아무 치료 수술 후 통증 및 감염에 대 한이 연구에서 관리 되었다.
  11. 따뜻한 패드에 마우스를 놓고 충분 한 의식 복원 될 때까지 sternal 기댄 위치를 유지 합니다. 일단 완벽 하 게 복구 하 고 모든 4 개의 다리에 앉아서 수, 쥐 자신의 집 새 반환 수 있습니다. 포식을 방지 하기 위해, 동일한 장에 비 운영 동물 사육을 허용 하지 않습니다.
  12. 봉합 누설에 대 한 확인 하 고 생쥐는 안정 된 상태에서 수술 치료 그룹에서 다음 날 확인. 질병의 징후에 대 한 마우스를 확인 하 고 고용 캘리퍼스 일주일에 한 번, 각 마우스에서 종양 크기를 측정.

2입니다. 마우스에서 CRC PDXs의 해 부

CRC PDXs (2 단계)의 해 부에 대 한 실험 절차는 그림 1B에 설명 되어 있습니다.

  1. 종양 크기는 일반적으로 약 1-3 개월에서 ~ 1 c m3 를 피하 성장 하는 것을 허용 한다.
  2. 와 isoflurane 흡입 작은 동물 흡입 마 취 장치를 사용 하 여 마우스를 anesthetize 하 고 70% 에탄올으로 피부를 소독.
  3. 실험실 벤치에 발생 하기 쉬운 위치에 마우스를 놓습니다. Incise 피부, 종양을 노출 하 고 조심 스럽게 멸 균가 위를 사용 하 여 종양에서 피부를 분리. 종양을 제거한 후 10 cm 배양 접시에 배치 하 고 어떤 조잡 한 괴 지역은 종양에서 다음 5 mL의 PBS로 두번 씻어.
    참고: 회 저 성 영역은 종종 하얀, 부드럽고 주변 지역 보다 더 어렵다면입니다.
  4. 얼음에 종양을 놓고 서로 다른 응용 프로그램 1) CRC organoid, 문화 2) 이식 보조 마우스, 3) 조직학 시험으로를 포함 하 여 4) 동결 및 종양 조각 저장 4 부분으로 동등 하 게 분할 합니다.
    1. CRC organoids의 생성에 대 한 고체 종양 조직을 살 균 PBS의 1 mL를 포함 하는 6 cm 배양 접시에 놓습니다. (3 단계) 처리까지 얼음에 조직 유지.
    2. 인간의 CRC에 대 한 PDX 모델을 설정 하기 위해 보조 마우스에 신선한 CRC PDXs 통로. 작은 조각 (크기에서 5 m m3 x 5 x 5) 종양 조직을 잘라 살 균 면도날을 사용 하 고 부드럽게 인공 세포 외 매트릭스의 50 µ L로이 조직 파편을 찍어. 그런 다음 1.8-1.11 단계에서 설명한 대로 노 그 마우스의 오른쪽과 왼쪽 피하 주머니의 하단 부분에이 파편을 이식.
    3. 조직학 분석, 2 일 동안 실 온에서 15 mL 원뿔 튜브에 10% 중립 버퍼링된 말린의 5 mL 샘플 수정 했다.
    4. Cryopreservation, 작은 조각 (크기에서 5 m m3 x 5 x 5)으로 종양 조직을 잘라 고 부드럽게 솔루션 1-1.5 mL cryovial 튜브에서 동결 세포의 500 µ L로 샘플을 찍어. 그런 다음-80 ° C 냉장고 관 전송.

3. CRC Organoid 문화에 대 한 셀 서 스 펜 션에 PDXs의 추출

CRC PDXs (3 단계)의 분리에 대 한 실험 절차는 그림 1B에 설명 되어 있습니다.

  1. 장소는 위의 (2.4.1 단계) 준비 종양 10 cm 배양 접시에 파편.
  2. 살 균 면도날을 사용 하 여 파편을 말하다 고 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS)의 8 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브로 그들을 전송-Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 콜라 효소 주식의 80 µ L ( 재료의 표참조).
  3. 튜브를 단단히 닫고 parafilm 누설을 방지 하기 위해와 모자를 포장 합니다. 부드럽게 2 h 37 ° c.에 대 한 선동 세포 현 탁 액에 다진된 종양 조각 해리, 하 Note는 아직 소화 되지 않은 조직의 튜브에 남아 있는 많은 조각 있을 것입니다.
  4. 4 ° C에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 튜브 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 10%의 10 mL를 사용 하 여 셀 펠 릿 해결 FCS-DMEM 세포 현 탁 액을 만들기 위해.
  5. 소화 되지 않은 조직 파편을 제거, 세포 현 탁 액 50 mL 원뿔 튜브에 설정 40 µ m 셀 스 트레이너를 사용 하 여 두 번을 필터링. 다음, 원심 분리기 통해 흐름 300 x g 에서 4 ° c.에서 5 분 상쾌한을 제거 하 고 얼음에 펠 릿을 유지.

4. 인공 세포 외 기질에 교양 CRC Organoids 세대

콜론 PDXs (4 단계)의 CRC organoid 문화에 대 한 실험 절차는 그림 1B에 설명 되어 있습니다.

  1. PDX 파생 CRC organoids ( 테이블의 자료, "CRC organoid 문화 매체" 참조)에 대 한 적합 한 문화 매체를 설정 미디어 이전 인간의 콜론 organoids11에 대 한 설명.
  2. 인공 세포 외 매트릭스의 150 µ L을 적용 ( 재료의 표참조) 당 얼음 12-잘 접시에 잘 고 다음 37 ° C, 5% CO2 배양 기는 젤을 공고히 하에 30-60 분 동안 품 어.
  3. 단계에서 3.5 CRC organoid 문화 매체와 (4.1 단계)에서 조정 3 x 105 셀/mL을 달성 하기 위해 5 %fcs 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. 그런 다음, 인공 세포 외 매트릭스 코팅 접시에 준비 단계 4.2에서에서 매체의 1 mL 씨. 37 ° C에서 5%에서 밤새 품 어 그리고 CO2. 셀 서 스 펜 션의 단일 세포 및 다세포 클러스터 부착 세포의 (그룹)를 포함 하 여 종양 세포의 수를 세는 hemocytometer를 사용 합니다.
    참고: 5 %FCS이 연구에서 콜라의 잔여 효소 활동을 풀기 위해 사용 됩니다.
  4. 신중 하 게 문화 매체를 수집, 부동 1.5 mL로 인공 세포 외 매트릭스 코팅 접시에서 분리 된 셀을 포함 하 여 다음 날에 튜브를 원심 1400 x g 5 분에 원심. 그리고 제거는 상쾌한 다시 얼음에 인공 세포 외 매트릭스의 70 µ L에 펠 릿을 일시 중단 합니다.
  5. CRC 세포 생존 능력을 증가 하는 종양 세포를 포함 하 인공 세포 외 기질 종양 organoid 세포 인공 세포 외 매트릭스 코팅 판에 부착 하 고 37 ° C, 5% CO2 배양 기 공고히 하에 30 분 동안 품 어에 오버레이 인공 세포 외 매트릭스 코팅입니다. 다음, 품 어 그것의 37 ° C에서 1% fcs CRC organoid 세포 배양 매체 1 mL와 함께 아래 5% CO2.
  6. 둘째 날 모든 문화 매체를 변경 합니다. CRC organoids 매체 작성, 그것 매일 매체를 변경 하는 데 필요한 될 수 있습니다.

5. 세대 및 GFP Lentiviral 입자의 농축

생성 및 GFP lentiviral 입자 (5 단계)의 우라늄 농축 실험 절차는 그림 1C에 설명 되어 있습니다.

  1. 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 중간 포함 10% fcs HEK293T 셀 문화 및 6 10 cm 요리 (요리 당 2 x 106 셀) 다음 transfection 절차에 대 한 준비.
  2. 접시 당 transfection, 500 µ L DMEM transfection 시 약 PRRL GFP 벡터 (5 µ g)12 의 20 µ L pCMV-VSV-G (1 µ g) 등 살 균 1.5 ml에서 pCMV dR8.2 dvpr (5 µ g), 두 개의 lentiviral 포장 플라스 미드를 포함 하는 혼합물의 준비 microtube입니다. 20 분 동안 실내 온도에 혼합물을 유지 하 고 각 10 cm 요리에 오버레이 그리고 18 h에 대 한 그들을 품 어.
  3. 매체를 제거, 각 요리에 신선한 10% FCS RPMI 1640 매체의 5 mL을 추가 하 고 떠나 24 시간 동안 서.
  4. 50 mL 원심 분리기 관으로 각 접시에서 조절된 매체를 수집 하 고 하룻밤 30 mL 4 ° C에서 매체의 총 저장. 각 요리에 신선한 RPMI 1640의 5 mL을 추가 하 고 떠나 24 시간 동안 서.
  5. 50 mL 원심 분리기 튜브와 유지, 얼음에 매체의 총, 30 ml에서에 각 접시에서 조절된 매체를 수집 합니다. 그런 다음, 셀을 삭제 합니다.
  6. 60 mL (5.4-5.5 단계)에서 매체의 세포를 제거 하 고 ultracentrifugation에 대 한 12 5 mL 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜브이 수량을 분할 하는 0.45 μ m 필터를 통해 필터링.
  7. 진동 물통 회전자를 사용 하 여 바이러스를 집중, 원심 ( 재료의 표참조) 4 ° c.에 1.5 h 85,327 x g 에서
  8. 매체를 즉시 제거. 집중된 바이러스 펠 릿을 해결 하려면 영양소 햄의 혼합물 F-12 (F12)의 250 µ L 장소 / 12의 각각에서 FCS 없이 DMEM 매체 튜브와 하룻밤 4 ° C에서 그것을 유지. 펠 렛의 바이러스는 종종 표시 되지 않습니다.
  9. 부드럽게 매체 수집의 집중 5 x GFP lentivirus, 아마도 108 시험 단위 (TU/mL) 당 GFP lentiviral 입자를 포함 한 총 3 mL를 플라스틱. 그런 다음, 최대 1 년-80 ° C에서 살 균 조건 하에서 (를 포함 하 여 튜브 당 250 µ L) 12 1.5 mL microtubes를 저장. 많은 작은 aliquots 여러-동결 해 동 주기를 피하기 위해 원래 솔루션의 준비.

6. GFP Lentiviral 입자와 교양 인공 세포 외 기질에 CRC Organoid 셀 라벨

GFP lentivirus (6 단계)와 CRC organoid 셀 라벨에 대 한 실험 절차는 그림 1C에 설명 되어 있습니다.

  1. CRC organoids 단계 7-10 일에 대 한 간섭 없이 성장 하 고 기계적으로 살 균 세포 스 크레이 퍼를 사용 하 여 그들을 수확 1.5 mL microtube에 그들을 전송 4.6에서에서 준비 하실 수 있습니다.
    참고: CRC organoids 문화에서 성장 환자에서 원래 종양의 성격에 따라 달라 집니다. 새로운 인공 세포 외 매트릭스 코팅 12-잘 접시에 1:2 분할 비율에 전송 하기 전에 60-70% 합류에 그들을 유지 하 여 CRC organoids의 전면에 자라 난을 피하십시오.
  2. 1400 x g에서 3 분 동안 microtube 원심, 문화 매체를 제거 하 고 부드러운 두 드려서 PBS의 500 µ L에서 셀 펠 릿을 해결 합니다.
  3. 1400 x g 에서 3 분 동안 microtube 원심 고 PBS를 제거 합니다.
  4. 부착 CRC organoids 해리를 분해의 세포 분리 솔루션의 500 µ L을 추가 하 고 셀에 collagenolytic 효소 튜브에 작은 부드러운 두 드려서 그것을 혼합. 그런 다음 실 온에서 10 분 동안 정착 관 둡니다.
  5. 1%의 추가 500 µ L로 세포 현 탁 액을 아주 부드럽게 플라스틱 대략 세포 분열을 여러 번에 1.5 mL microtube FCS DMEM. 가혹한 pipetting으로 CRC organoids에서 단일 세포의 생성은 현저 하 게 세포 생존 능력을 감소 시킨다. 따라서, 매우 부드럽게 1.5 mL microtube에 pipetting으로 세포 현 탁 액에서 시각적으로 감지 세포의 질량을 떠나 필수적 이다.
  6. 1400 x g 3 분 세포 현 탁 액을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
  7. 5 x GFP lentivirus 주식의 100 µ L의 혼합 셀 펠 릿을 해결 (> 108 화/mL) 5 x 105 의 농도를 조정 하려면 부드러운 드려서 1.5 mL microtube에 CRC organoid 문화 매체의 400 µ L 해리 500 µ L 당 종양 세포와 . (단계 4.3) 위에서 설명한 대로 세포 현 탁 액에 단일 셀 및 셀 그룹을 포함 하는 종양 세포의 수를 세는 hemocytometer를 사용 합니다.
  8. 4.2 단계에서 설명한 대로 인공 세포 외 매트릭스 코팅 12-잘 접시를 준비 합니다. 그런 다음, 접시에 6.7 단계에서 세포 현 탁 액의 500 µ L를 놓고 두고 37 ° C에 18 h 미만 5% CO2.
  9. 1.5 mL 원심 분리 관으로 인공 세포 외 매트릭스 코팅 접시에서 분리 떠 있는 세포와 매체를 수집 합니다. 1400 x g 에서 원심 다음는 상쾌한을 제거 하 고 다시 얼음에 인공 세포 외 매트릭스의 70 µ L에 펠 릿을 중단.
  10. CRC 세포 생존 능력을 증가, 단계 4.5에서에서 설명 된 종양 세포를 포함 하 인공 세포 외 매트릭스 인공 세포 외 매트릭스 코팅 12-잘 접시에, 연결 된 종양 organoids에 오버레이 합니다. 다음으로, 37 ° C, 5% CO2 배양 기 인공 세포 외 매트릭스 코팅을 공고히 하 고 그 문화 그것은 37 ° C에서 1% fcs CRC organoid 문화 매체의 1 mL와 함께 아래 5%에에서 30 분 동안 접시를 품 어 CO2.
  11. 거의 100%의 GFP 양성 lentiviral 입자 ( 그림 2A참조)의 높은 titer의 사용을 확인 하는 형광 현미경에서 감염 후 3 일에서 세포를 관찰 합니다.
  12. 확장 받는 사람 쥐로 주입에 앞서 세포 성장에 7-10 일의 기간에 대 한 CRC organoids 문화.

7. 받는 사람 마우스에 GFP 표시 된 CRC Organoids에 의해 전이의 발생

CRC GFP 표시 organoids (7 단계)를 사용 하 여 전이의 세대에 대 한 실험 절차는 그림 1C에 설명 되어 있습니다.

  1. 세포 현 탁 액에 GFP 표시 된 CRC organoids 해리, 기계적으로 살 균 세포 스 크레이 퍼를 사용 하 여 그들을 수확 하 고 (단계 6.1) 위에서 설명한 대로 1.5 mL microtube에 그들을 전송 합니다.
  2. 1400 x g에서 3 분 동안 microtube 원심, 문화 매체를 제거 하 고 부드러운 두 드려서 PBS의 500 µ L에서 셀 펠 릿을 해결 합니다.
  3. 1400 x g 에서 3 분 동안 microtube 원심 고 PBS를 제거 합니다.
  4. 오버레이 셀 펠 렛 튜브에서에 세포 분리 솔루션의 500 µ L와 부드러운 두 드려서 섞는다. (단계 6.4) 위에서 설명한 다음, 효소 부착 CRC organoids 해리를 실 온에서 10 분을 위한 혼합물 서를 둡니다.
  5. 1%의 추가 500 µ L로 세포 현 탁 액을 아주 부드럽게 플라스틱 약 (단계 6.5) 위에서 설명한 대로, 세포를 해리를 여러 번에 1.5 mL microtube FCS DMEM. 가혹한 pipetting으로 CRC organoids에서 단일 세포의 생성은 현저 하 게 세포 생존 능력을 감소 시킨다. 따라서, 세포의 질량 세포 현 탁 액에서 시각적으로 감지 여 남길 1.5 mL microtube에 pipetting 매우 부드럽게.
  6. 1400 x g 3 분 세포 현 탁 액을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
  7. CRC PDXs의 자발적 전이 마우스 모델을 설정할:
    1. 세포 현 탁 액 마우스 당 50% 인공 세포 외 매트릭스와 PBS의 50 µ L에서 5 x 105 셀을 포함 하 여 준비 합니다. 사용 하기 전에 얼음에 현 탁 액을 유지 합니다. 4.3 단계에서 표시 된 대로 암 세포를 세는 hemocytometer를 사용 합니다.
    2. 와 isoflurane 흡입 작은 동물 흡입 마 취 장치를 사용 하 여 마우스를 anesthetize 하 고 1.6 단계에서 표시 된 대로 70% 에탄올, 피부 소독.
    3. 실험실 벤치에 부정사 위치에 그 노 그 마우스를 놓습니다. 멸 균 핀셋으로 직장 점 막을 잡고 부드럽게 항문 그것을 꺼내. 다음, 즉시 주입 세포 현 탁 액 단계 7.7.1 주사기를 사용 하 여 마우스의 직장 submucosa에서에서 준비 (바늘 크기: 22 G). 정기적으로, 그룹 당 4-6 마우스는 결과 평가 하는 데 사용 됩니다.
  8. CRC PDXs의 실험적인 전이 모델을 설정할:
    1. CRC organoid 셀 서 스 펜 마우스 당 PBS의 50 µ L 4 x 104 의 세포 등을 준비 합니다. 사용 하기 전에 얼음에 현 탁 액을 유지 합니다. hemocytometer를 사용 하 여 암 세포 (단계 4.3) 계산에 대 한.
    2. 와 isoflurane 흡입 작은 동물 흡입 마 취 장치를 사용 하 여 마우스를 anesthetize 하 고 1.6 단계에서 표시 된 대로 70% 에탄올, 피부 소독.
    3. 실험실 벤치에 발생 하기 쉬운 위치에 마 취 노 그 마우스를 놓습니다. 왼쪽된 측면의 아래 부분에 작은 절 개를 만들고 조심 스럽게 멸 균가 위 핀셋을 사용 하 여 비장을 폭로 하는 복을 잘라. 멸 균 핀셋으로 비장에 연결 된 지방 조직 파악 한 다음 비장에 세포 현 탁 액 (위에서, 준비 단계 8.1)의 50 µ L를 천천히 주입 합니다. 세포 현 탁 액 비장에서 외부 유출 없이 적절 하 게 주입 될. 정기적으로, 그룹 당 4 마우스는 결과 평가 하는 데 사용 됩니다.
  9. 모든 마우스 따뜻한 패드에 수술 후 놓고 1.11 단계에서 설명한 대로 충분 한 의식 복원 될 때까지 sternal 휴식 위치에 유지 합니다. 쥐가 완전히 복구 하 고, 일단 자신의 집 새에 그들을 반환 합니다. 포식을 방지 하기 위해, 동일한 장에 비 운영 동물 사육을 허용 하지 않습니다.
  10. 봉합 누설에 대 한 확인 하 고 쥐가 살아, 수술 치료 그룹에서 다음 날 확인. 질병 및 측정 종양 크기, 캘리퍼스, 모든 마우스는 일주일에 한 번에 고용의 흔적에 대 한 마우스를 확인 하십시오.
  11. 주입 후 (최대 2.5 개월 기간)에 대 한 자발적 전이 실험 전이 (1 개월)을 감지 하는 쥐를 관찰 합니다.
  12. 마 취 및 지정된 일에 자 궁 경부 전위를 통해 쥐를 희생. 기본 종양과 간, 폐를 포함 하 여 다양 한 조직 해 부. 해 부 종양 및 장기 10 cm 배양 접시에 얼음 처럼 차가운 PBS의 5 mL에 놓고 얼음에 그들을 저장 합니다.
  13. 셀을 검출 GFP-긍정적인 CRC organoid, 해 부 조직 스테레오-형광 현미경으로 관찰 합니다. CCD 카메라와 함께 이미지를 수집 하 고 표준 이미지 처리 소프트웨어를 사용 하 여 준비.

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Representative Results

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주 대 장 선 암으로 알맞게 차별화 된 진단 TNM 분류, 단계 IIIa, 수술 후 화학요법 뒤와 76 년 오래 된 여성에서 수술로 절제 된 했다. 기본 CRC 셀 immunohistochemically carcinoembryonic 항 원, 기-67, 팬 cytokeratin 및 E-cadherin 긍정적인 스테인드. 절제 종양의 조각도 피하 콜론 PDX 모델 생성 노 그 쥐에 이식 했다. CRC organoid 셀이이 마우스에 피하 개발 했다 결 장 PDX에서 조직 문화에 대 한 다음 추출 되었다. CRC organoids 지속적으로 인공 세포 외 기질에 구절의 시리즈 중 다세포 클러스터를 형성 할 수 있었다. 우리가 높은 감도와 CRC organoid 셀의 비보에 탐지를 허용 하는 마우스 모델을 개발 하려고으로 종양 organoids 조직학 및 유전자 환자5,6에서 기본 종양의 성격을 반영, 동안 전이성 보급. 이 목표를 달성 하기 위해 CRC organoids GFP lentivirus, 그로 인하여 결과 매우 밝은 GFP (그림 2A)을 보여주는 거의 모든 organoids에 감염 되었습니다. 이러한 organoids orthotopically 주입 그리고 intrasplenically 형광 현미경 먼 장기에 GFP-긍정적인 세포의 이전 보조 노 그 쥐로 했다. 우리는 모든 4 개의 마우스 검사 (그림 2B, 왼쪽)에서 orthotopic 사이트에서 GFP-긍정적인 기본 종양의 형성을 관찰. 또한, 미세한 전이 orthotopic 주사 (그림 2B, 중) 후 2.5 개월에 검사 하는 3 중 4 쥐의 폐에서 발견 됐다. 또한, 간 전이 intrasplenic 주입 주사 (그림 2B, 오른쪽) 후 1 개월에 검사 하는 모든 4 개의 마우스에 대 한 응답에서 관찰 되었다.

함께 찍은, 이러한 결과 나타냅니다 PDX 파생 CRC organoid 셀에 고해상도 GFP 형광 자발적인 micrometastases와 그 때 받는 사람에 도입 먼 장기에 실험적으로, 개발에 그들의 탐지를 허용 한다 마우스입니다. 목표 PDX 파생 CRC organoids에서 vivo에서 의 고감도 검출이 또한 종양 전이의 생물학 연구 뿐만 아니라 임상 설정에서 타겟된 요법을 개발 하기 위한 다양 한 모델을 제공 합니다.

Figure 1
그림 1: 노 그 쥐에 GFP lentivirus 표시 PDX 파생 CRC organoids에 의해 전이의 세대의 도식 대표. 노 그 쥐 (1 단계)로 피하 CRC 조직의 작은 조각 (A) 이식 수술 환자에서 해 부 CRC 조직의 조각으로 잘라 되었고 노 그 쥐에 피하 이식. 사우스 캐롤라이나: 피하 주입. (B) 세대의 CRC organoids PDXs (2-4 단계)에서 해리. 개발 된 CRC xenografts 다진된 (2 단계) 그리고 콜라 (3 단계)를 포함 한 문화 매체를 포함 하는 15 mL 튜브로 전송. 느린 동요와 보육, 후 CRC 세포 현 탁 액 필터링된 (3 단계) 했다. 다음, organoid 세포 현 탁 액 CRC organoid 매체에는 인공 세포 외 매트릭스 코팅 접시에 시드 되었고 CO2 인큐베이터 (4 단계)에서 밤새 껏 알을 품. 인공 세포 외 매트릭스에 부착 된 CRC organoid 셀 추가 인공 세포 외 매트릭스 코팅도 있었고 CO2 인큐베이터 (4 단계)에서 알을 품을. 사우스 캐롤라이나: 피하 주입. (C) 세대의 CRC organoids 받는 사람 쥐 (5-7 단계)로 사출 채용 전에 GFP lentiviral 입자에 의해 불리고. GFP lentiviral 입자는 높은 titer (5 단계)에서 생성 했다. 인공 세포 외 기질에 성장 하는 PDX 파생 CRC organoids 직접 셀 스 크레이 퍼와 수확 그리고 microtube (6 단계)로 전송. 원심, 후 셀 펠 릿 PBS에 다시 중단 했다. 세포 현 탁 액은 centrifuged와 셀 펠 릿 해리 했다. 다음, CRC organoid 세포 현 탁 액 인공 세포 외 매트릭스 코팅 CO2 인큐베이터 (6 단계)에서 하룻밤 접시에 CRC organoid 문화 매체에 GFP 바이러스 재고와 알을 품는. 인공 세포 외 매트릭스에 부착 된 CRC organoid 셀 추가 인공 세포 외 매트릭스 코팅 되었고 인공 세포 외 매트릭스 코팅 (6 단계)을 공고히 하는 CO2 인큐베이터에서 알을 품을. CRC organoids 다음 세포 성장 (6 단계) 확장을 7-10 일의 기간에 대 한 교양 했다. 자발적인 전이 모델 개발, 해리 5 x 105 CRC organoid 셀 50% 인공 세포 외 매트릭스와 PBS의 50 µ L에 GFP로 표시 노 그 쥐 (7 단계)로 orthotopically는 주입 했다. 실험적인 전이 모델을 생성 하려면 4 x 104 CRC organoid 셀 PBS의 50 µ L에 GFP와 표시 intrasplenically 노 그 쥐 (7 단계)로 주입 했다. 구약: orthotopic 주입 윙하: intrasplenic 주입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: GFP High-resolution 시각화에서 감지 교양 GFP 표시 된 CRC organoids, 기본 종양 및 micrometastases. (A) 거의 교양된 CRC organoids의 100%는 GFP 긍정적인. 이미지를 스테레오-형광 현미경을 사용 하 여 점령 했다. 눈금 막대 = 250 µ m. (B) 기본 종양과 폐와 간 micrometastases에 GFP 양성. 해리 GFP 표현 CRC organoid 세포 현 탁 액 노 그 쥐의 직장 submucosa (구약 사출)에 주입 했다. 종양 세포의 대다수는 1 차 종양에 GFP에 대 한 긍정적인 표시 됩니다. GFP-긍정적인 micrometastases (화살표로 표시) 폐를 정착도 표시 됩니다. 또한, GFP-긍정적인 micrometastases 간 (화살표로 표시), 감지 세포 현 탁 액이 생쥐에 (윙하 주)을 주입 했다 intrasplenically 때. 눈금 막대 = 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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CRC PDX 모델 기본 종양의 성장 연구에 널리 고용은, 비록이 모델 인지 종양 전이 조사에 적용 또한 되지 아직 되었습니다 완전히 해명 했습니다. 자연 스러운 전이 간, 다양 한 보고 콜론 PDX 모델4,10의 폐에서 거의 감지 했다. 높은 감도 가진 micrometastases를 감지, 우리는 GFP lentiviral 입자 PDX 파생 CRC organoids 그들의 orthotopic 받는 쥐로 정 맥 주사 이전에 시험에 대 한 프로토콜을 개발 했다. 주의 우리 수 있었다이 방법은 CRC organoid 파생 된 micrometastases의 매우 민감한 탐지 수 보여 먼 장기에 자발적으로 그리고 실험적으로, 둘 다 형성.

프로토콜 내에서 중요 한 단계는 부드럽게 passaging 시리즈 동안 CRC organoids를 pipetting으로 인공 세포 외 매트릭스에 anoikis의 유도 없이 그대로 회전 타원 체 형성을 유지 포함 됩니다. 높은 titer lentivirus 입자 ultracentrifugation에 의해 집중의 준비도는 거의 100 %GFP 양성 CRC organoids. 의 달성을 위해 중요 하다 또한, GFP 표시 된 CRC organoids 받는 사람 쥐로 주입 10-14 일 이내는 것이 좋습니다. 감염 후 CRC organoids의 확장에 대 한 지나치게 오랜 기간 약하게 GFP 표현 organoids의 선택을 부탁 수 있습니다.

노 그 쥐의 직장 submucosa CRC organoids 주입 하지 비록 아마도 열 등 한 베 나 정 맥을 통해 간으로는 폐로 그들의 전이성 보급을 보여주었다. 간 전이 저절로 생성, 개복 술으로 콜론에 CRC organoids의 주입 필요13일 것 이다.

B 세포 림프 종 발생률은 때때로 노 그 immunodeficient 쥐 인간 환자14엡 스타인-바 oncovirus 감염, 림프 톨을 포함 하 여 조직 이식에 증가. 그것은 그러므로 합리적인는 immunohistochemistry carcinoembryonic antigen cytokeratin 20 등 인간의 CRC 셀 표식을 사용 하 여 결정 여부 신흥 종양 이식된 인간의 CRC에서 발생 하는 것이 좋습니다.

우리만 한 환자에서 파생 된 CRC organoids, 조사로 환자의 큰 숫자에서 더 많은 샘플 미래에 우리의 연구 결과 일반화 하기 위하여 시험 되어야 할 것 이다. 경우는 이식 PDX 파생 CRC organoids 표시 orthotopic 사이트에서 최소한의 성장 및 거의 먼 사이트에서 양식 전이 수 사관 다른 환자에서 파생 된 PDXs에서 CRC organoids 추출 고려 하는 격려 된다.

이 방법으로 달성 하는 GFP 표시 된 micrometastasis의 매우 민감한 탐지 장려 우리 뿐만 아니라 더 macrometastasis는 실질의 형성 하는 micrometastasis의 전환에 관한 여러 해결 되지 않은 생물 학적 문제를 조사 하 전이성 식민과 수집 약물 저항의 뿐만 아니라 전 임상 모델 PDX-베어링 동물을 채용 하 여 새로운 항 암 약의 신진대사를 평가 대 한 틈새.

GFP 기반 FACS-정렬 생활의 epigenetic 및 metabolomic 프로필의 종양의 유전자 식의 단일 세포 기반 시험 수 있도록 잠재력이 또한 CRC organoids 기본 및 먼 사이트에서 추출. 이러한 연구 결과 CRC organoids의 전이성 보급 기본 분자 메커니즘의 잘 발생할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 관심의 잠재적인 충돌 있다.

Acknowledgments

이 일 준 텐도 대학 영 탐정 수상 (2013, 2014, 2015) 요, 공동 프로젝트 수상 (2013 및 2014) K. M.에 의해 지원 되었다 고 교육, 문화, 스포츠, 과학에서 과학 연구에 대 한 원조를 부여 하 고 기술, 일본 (Y. K.을 16 K 15625 및 16 K 15598 밀리에). 우리는 특히 유용한 토론 및 기술 지원에 대 한 부의 Coloproctological 수술 및 분자 병 리의 모든 구성원에 게 감사입니다. 우리 또한 orthotopic 이식 마우스 및 박사에 대 한 수술 절차에 관대 한 기술 지도 대 한 박사 히로유키 곤노 (하 마마 츠 대학 학교 의학) 및 박사 히데키 기타지마 (국제 대학 보건 및 복지)을 감사합니다. 에 대 한 기술적인 조언 수행 종양 organoid 문화 요시타카 마 (치 바 암 센터)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions
wound clips
2×10mm
Natsume manufacturing, Japan #C-21-S Autoclave before use
Hamilton syringe
needle size:22 gauge
Tokyo Science, Japan Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS.
6-well plate BMBio #92006
12-well plate BMBio #92412
15ml conical tube Sumitono Bakelite MS-57150
50ml conical tube Sumitomo Bakelite MS-57500
microtube Eppendorf #0030120086 Autoclave before use
Hemocytometer Erma #03-202-1
40μm cell strainer Corning #352340
Matrigel basement membrane matrix Corning #354234 Store aliqupts at -20°C.
Place on ice until use
Collagenase type 1 Sigma #C1030 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year
Accutase Innovate Cell Technologies #5V2623A Store at 4°C.
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ Gibco #10565018 Store at 4°C. Warm at 37°C before use
Cell banker 1plus ZENOAQ #628 Store at 4°C. Use within 1 month
Penicillin Gibco #15140122 Store at 4°C. Use within 1 month
Streptomycin Gibco #15140122 Store at 4°C. Use within 1 month
hEGF PEPROTECH #AF-100-15 Store at -20°C. Add to medium on same day as use
Y27632, a ROCK inhibitor Wako #253-00591 Store at -20°C. Add to medium on
same day as use
Culture medium Gibco DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin.
Store at 4°C. Use within 1 month.
CRC organoid culture medium
with 1% or 5% FCS
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor.
Store at 4°C. Use within 1 month.
the FuGENE 6 transfection regent Roche 11814 443001
Minisart 0.45 µm filter Sartorius stedim 17598-K
5 ml polypropylene centrifuge tubes Beckman Coulter 326819
PRRL-GFP vector Gift from Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-VSV-G Gift from Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvpr Gift from Dr. Robert A. Weinberg
the SW55Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter
a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope Zeiss

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References

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GFP Lentivirus 불리고 Organoids 환자 파생 결 장 종양에서 경작에 의해 생성 된 Micrometastases의 고감도 검출
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Okazawa, Y., Mizukoshi, K., Koyama, Y., Okubo, S., Komiyama, H., Kojima, Y., Goto, M., Habu, S., Hino, O., Sakamoto, K., Orimo, A. High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor. J. Vis. Exp. (136), e57374, doi:10.3791/57374 (2018).More

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